專利名稱：多體的重組尿素酶疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療螺桿菌感染的方法和組合物。
螺桿菌是螺形、革蘭氏陰性細(xì)菌的一個屬，它們定居在哺乳動物的胃腸道中。其中好幾個種定居在胃里，特別引人注意的有幽門螺桿菌、H.heilmanii、貓螺桿菌和鼬鼠螺桿菌。雖然幽門螺桿菌是最常見的與人類感染相關(guān)的一個種，但H.heilmann和貓螺桿菌也已發(fā)現(xiàn)能感染人類，只是感染發(fā)生率低于幽門螺桿菌。
螺桿菌感染在發(fā)達(dá)國家超過成人人口的50％，在發(fā)展中國家及太平洋周邊國家?guī)缀踹_(dá)100％，使它成為全世界人類的最流行傳染病之一。盡管與螺桿菌感染相關(guān)的臨床胃十二指腸疾病一般在原始感染之后幾年甚至幾十年后才出現(xiàn)，但在所有受幽門螺桿菌感染的個體內(nèi)均引起慢性胃部炎癥。幽門螺桿菌是大多數(shù)人類胃潰瘍和慢性淺表性(B型)胃炎的致病因素。幽門螺桿菌感染還與胃粘膜萎縮、胃腺癌、及胃非何杰金氏淋巴瘤有關(guān)(見，例如，Blaser《傳染病雜志》161卷626-633頁，1990年；Scolnick等人《傳染原疾病》1卷294-309頁，1993年；Coodwin等人，《幽門螺桿菌的生物學(xué)和臨床實踐》CRC出版社，BocaRaton FL 465頁，1993年；Northfield等人“幽門螺桿菌”《感染》Kluwer Acad.Pub.，Dordrecht，178頁，1994年)。
發(fā)明概述我們已顯示，含有多體的重組螺桿菌尿素酶的疫苗組合物能有效防止和治療螺桿菌感染。此外，我們已顯示，含有幽門螺桿菌尿素酶和一種粘膜佐劑，并聯(lián)合一種抗生素及一種鉍鹽的組合物在治療螺桿菌感染時比單獨使用這些組分的任何一種，或使用任意三者之組合或少于三者之組合都更為有效。
因此，在第一個方面，本發(fā)明的特征在于一種疫苗，它用于誘導(dǎo)出患病個體(如患病的人)對螺桿菌(如幽門螺桿菌)的免疫應(yīng)答，這種患病個體可以是(a)目前尚未感染螺桿菌但有將被感染的危險(此時誘導(dǎo)“保護(hù)性”免疫應(yīng)答)，或(b)已被螺桿菌感染(此時誘導(dǎo)的是“治療性”免疫應(yīng)答)的。這種疫苗含有重組、無酶活性的螺桿菌(如幽門螺桿菌)尿素酶多體復(fù)合物，以及一種藥用載體或稀釋劑(如，無菌水或濃度為2％(重量/體積比)的蔗糖溶液)。該疫苗可含有的這種多體復(fù)合物可能包括8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位，也可能包括6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位，還可能包括4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位，或者包括它們的混合物。另外，該疫苗可能包含一種粘膜佐劑，如腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的不耐熱腸毒素(LT)，霍亂毒素(CT)，艱難桿菌毒素，或它們的喪失毒性但仍保留佐劑活性的亞單位或衍生物(如，一個片段，突變子，或類毒素)，或其混合物。例如，可使用含有艱難桿菌毒素A的794個羧基端氨基酸的片段(見，如Dove等人，出處同上，關(guān)于艱難桿菌毒素A的序列)。而且，該重組、無酶活性的螺桿菌尿素酶的多體復(fù)合物可能是先凍干再用到本發(fā)明的疫苗中。
第二方面，本發(fā)明的特征在于一種在病體內(nèi)(如病人)誘導(dǎo)對螺桿菌(如幽門螺桿菌)的保護(hù)性和/或治療性粘膜免疫應(yīng)答的方法。在該方法中，含有有效致敏劑量的重組無酶活性螺桿菌(如幽門螺桿菌)尿素酶多體復(fù)合物的組合物被施用到病體的粘膜表面(如口腔或鼻內(nèi)表面，或經(jīng)諸如肛門栓劑形式施用到直腸表面)。該組合物可能包含一種多體復(fù)合物，后者可以包含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位，也可以包含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位，也可以包含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位，或者包含它們的混合物。該組合物可能在未用諸如碳酸氫鈉進(jìn)行胃中和的情況下用藥。
除了重組、無酶活性螺桿菌尿素酶多體復(fù)合物外，該方法中所用的組合物可能還包含一種粘膜佐劑。如該組合物可能包含腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的不耐熱腸毒素(LT)，霍亂毒素(CT)，艱難桿菌毒素，或其失去毒性但仍有佐劑活性的亞單位或衍生物(如有佐劑活性的片段、突變子，或類毒素)，或其混合物。例如可使用含有艱難桿菌毒素A的794個羧基端氨基酸的片段(見于如Dove等，出處同上，關(guān)于艱難桿菌毒素A的序列)。且組合物中的重組、無酶活性螺桿菌尿素酶多體復(fù)合體可能是先凍干再應(yīng)用于此方法中。
第三方面，本發(fā)明的特征在于一種用于治療病體中(如人)螺桿菌(如幽門螺桿菌)感染的組合物，該組合物含有(a)一種螺桿菌(如幽門螺桿菌)抗原(如尿素酶)，及(b)一種抗生素，一種抗分泌劑，一種鉍鹽，或它們的一種組合形式。可用于該組合物的螺桿菌尿素酶抗原的一個例子是含有如上所述的重組、無酶活性螺桿菌尿素酶多體復(fù)合物的抗原。可使用的其它螺桿菌抗原包括，例如Hsp A、Hsp B、Alp A、Alp B、Clp B，及由單克隆抗體IgG 50所識別的抗原(見下)。該組合物可能還包含一種粘膜佐劑(如粘膜佐劑的聯(lián)合形式)，就象上文中列舉的那些粘膜佐劑。
該組合物中可能含有的抗生素包括但不限于羥氨芐青霉素、甲基紅霉素、四環(huán)素、滅滴靈和紅霉素；可能含有的鉍鹽有，如次檸檬酸鉍和次水楊酸鉍?？赡茉诮M合物中包含的抗分泌劑是，如質(zhì)子泵抑制劑(如奧美拉唑、蘭索拉唑和邦托拉唑)，H2受體拮抗劑(如雷尼替丁、西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁、尼扎替丁和羅沙替丁)，以及前列腺素類似物(如米索前列腺素(misoprostil)或恩前列腺素)。
最后一個方面，本發(fā)明的特征在于一種用于治療病體(如病人)的螺桿菌(如幽門螺桿菌)感染的方法。在該方法中，一種組合物被施用于病體內(nèi)，該組合物包含(a)一種螺桿菌(如幽門螺桿菌)抗原(如上文列舉的抗原)，及(b)一種抗生素，一種抗分泌劑，一種鉍鹽，或它們的組合。任一種標(biāo)準(zhǔn)用藥方式，或幾種標(biāo)準(zhǔn)方式的某一組合形式都可應(yīng)用于此方法中。例如，可使用粘膜給藥(如在口腔或鼻內(nèi)表面用藥，或用諸如肛門栓劑之類的方式在直腸表面用藥)。該方法中施用于粘膜表面的組合物可能還包含一種粘膜佐劑(或粘膜佐劑的一種聯(lián)合形式)，如象上文所述的那些粘膜佐劑。本方法中組合物里含有的抗生素、鉍鹽及抗分泌因子均如上所述。
“疫苗”指包含至少一種抗原(如來自致病性微生物，象幽門螺桿菌的抗原)的組合物，其中，當(dāng)將該組合物施用于病體時，能誘發(fā)或增強對該抗原的免疫應(yīng)答，而這種免疫應(yīng)答能有效防止疾病(如由微生物感染引起的疾病)，或治療已存在的疾病。
“有效致敏劑量”指某種抗原(如重組、無酶活性螺桿菌尿素酶多體復(fù)合物，或上文列舉的其他抗原中任一種)施用于諸如病人的病體中時能有效地誘發(fā)免疫應(yīng)答(如體液免疫應(yīng)答或粘膜免疫應(yīng)答)的量。
“螺桿菌”指螺桿菌屬的任一種細(xì)菌，尤其指感染人的螺桿菌(如幽門螺桿菌)。“尿素酶”指催化尿素轉(zhuǎn)化成氫氧化銨和二氧化碳的一種酶(如幽門螺桿菌尿素酶)。
“多體復(fù)合物”指多肽(如尿素酶多肽)的一種大分子復(fù)合物。這些多肽在復(fù)合體中的聯(lián)接可能通過諸如共價鍵(如二硫鍵)、氫鍵、及離子鍵等多種分子間相互作用來完成。
“粘膜佐劑”指一種化合物(如一種免疫調(diào)節(jié)物)，它能非特異性地刺激或增強粘膜免疫應(yīng)答(如產(chǎn)生IgA抗體)。在致免疫組合物中聯(lián)合施用粘膜佐劑有利于對組合物中抗原的粘膜免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。
“抗生素”指來自真菌或細(xì)菌的抑制其他微生物生長的化合物。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點從以下的詳述和權(quán)利要求書里將是顯而易見的。
詳述首先對附圖進(jìn)行描述附1圖示了克隆自pSCP1的2.5kb PCR產(chǎn)物的限制酶圖譜。圖譜上方的數(shù)字指的是將BL1的第一個堿基對(bp)作為第1號核苷酸的各核苷酸位置。ureA及ureB基因的所在位置以及這些基因的轉(zhuǎn)錄方向均顯示在圖上。限制性酶切位點的位置均顯示在基因下方。每種限制酶名稱后面的數(shù)字指該酶所識別序列中第一個堿基對的位置。
圖2是表達(dá)質(zhì)粒pORV214的遺傳圖譜。ureA及ureB基因均表示為帶箭頭的空心框。實心箭頭和實心框分別代表T7啟動子和終止子序列。細(xì)線代表pBR322 DNA。質(zhì)粒上的噬菌體及質(zhì)粒復(fù)制起點均用大陰影箭頭顯示，分別指示為“f1起點”及“ori”，圖中還指明了DNA合成的方向。編碼卡那霉素抗性(kan)和乳糖抑制物(lac I)的基因均顯示為陰影框。用于克隆PCR產(chǎn)物的BamHI和EcoRI位點也顯示在圖上。在代表lacI、ureA、ureB和kan基因的各框內(nèi)的箭頭指示了轉(zhuǎn)錄的方向。
圖3是編碼ureA和ureB基因的幽門螺桿菌基因座及來自pORV214的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(SEQ ID NO1)的核苷酸序列的圖解。推斷的ureA的氨基酸序列(SEQ ID NO2)和ureB的氨基酸序列(SEQ IDNO3)均示于DNA序列之上。序列左邊的數(shù)字相應(yīng)于核苷酸位置，而序列右邊的數(shù)字則指示氨基酸位置。相應(yīng)于PCR引物的序列在其下方劃線，用于克隆PCR產(chǎn)物的BamHI和EcoRI位點均已指出。推斷的轉(zhuǎn)錄起始點(G)和轉(zhuǎn)錄方向均用箭頭顯示。核糖體結(jié)合點(RBS)已示出。調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始(T7啟動子和lac操縱子)和終止的序列均在下面劃線并標(biāo)記出來。
圖4示用分析型大小排阻HPLC分析重組尿素酶的結(jié)果。
圖5是一系列圖形，顯示了細(xì)菌量與用重組幽門螺桿菌尿素酶和霍亂毒素(CT)免疫的小鼠的血清IgA，血清IgG，及糞便IgA抗體水平之比。
圖6是一系列圖，顯示了細(xì)菌量與用重組幽門螺桿菌尿素酶和腸產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱毒素免疫的小鼠的血清IgA、血清IgG，及糞便IgA抗體水平之比。
圖7是一份圖表，顯示了用于比較鼻內(nèi)和口服途徑免疫接種重組尿素酶的實驗程序。
圖8是一系列圖，顯示了在按圖7中表示的程序處理過的小鼠組中血清IgG(血清G)，血清IgA(血清A)，糞便IgA(糞便A)及唾液IgA(SalA)的水平。
圖9是一個表，顯示了用于比較鼻內(nèi)和胃內(nèi)途徑免疫接種重組尿素酶的實驗程序。


圖10是一系列圖，顯示了對根據(jù)圖9的程序處理的小鼠進(jìn)行尿素酶測試的結(jié)果。
圖11是一個圖，顯示了經(jīng)鼻內(nèi)途徑施用重組尿素酶(10μg)和CT(5μg)在防止貓螺桿菌感染中至少等效于經(jīng)口服途徑給予重組尿素酶(25μg)和CT(10μg)。
圖12是一個圖，顯示了用重組尿素酶加10μg LT免疫接種小鼠減弱了或消除了已有的貓螺桿菌感染。當(dāng)這些動物再用貓螺桿菌感染時，它們能抵抗攻擊，受到保護(hù)。
圖13是一份圖，顯示了用重組幽門螺桿菌尿素酶和CT一起，或用CT單獨進(jìn)行治療性免疫接種4周和10周后，小鼠的平均抗體應(yīng)答。
圖14是一份圖，顯示了免疫小鼠和未免疫小鼠在用貓螺桿菌感染之前，以及之后的一定間隔階段，胃粘膜中能分泌IgA抗體的細(xì)胞數(shù)。
圖15是一份圖，顯示了事先用重組幽門螺桿菌尿素酶和CT免疫接種的小鼠體內(nèi)貓螺桿菌感染的排除率?？寺reA和ureB基因編碼尿素酶的結(jié)構(gòu)基因，ureA和ureB，已被克隆(Clayton等人，《核酸研究》1990年18卷362頁；Labigne等人，《細(xì)菌學(xué)雜志》1991年173卷1920-1931頁)，由這些基因編碼的重組尿素酶已純化(Hu等人，《感染與免疫》1992年60卷2657-2666頁)。為了能用于本發(fā)明，尿素酶克隆自幽門螺桿菌的一株臨床分離株(CPM630)，該株得自一份臨床樣品，后者由倫敦大學(xué)St.Bartholomew’s醫(yī)學(xué)院的SoadTabaqchali博士提供。CPM630株的基因組DNA文庫已在λ噬菌體載體EMBL3中制備。噬菌斑用免抗螺桿菌尿素酶多克隆抗體來篩選活性，分離到一個單活性噬菌斑。該克隆子有一個17kb的Sal I酶切片段，該片段編碼ureA和ureB基因。將此17kb片段亞克隆至pUC18，得到的質(zhì)粒命名為pSCP1。一個2.7kb的TaqI片段也被亞克隆(所得質(zhì)粒為pTCP3)并完全測序。該2.7kb Taq I片段編碼ureA和ureB。
引物BL1(CGG GAT CCA CCT TGA TTG CGT TAT GTC T；SEQID NO4)和BL2(CGG AAT TCA GGA TTT AAG GAA GCG TTG；SEQ ID NO5)被用于從pSCP1中擴(kuò)增并克隆一個2.5kb片段。BL1和BL2對應(yīng)于GenBank登記號M60398的核苷酸2605-2624(BL1引物)和EMBL登記號X17079的核苷酸2516-24998(BL2引物)。2.5kb片段PCR產(chǎn)物的限制性酶切圖譜顯示在圖1中。該2.5kb片段包含ureA和ureB的全長編碼區(qū)，以及位于ureA上游的來自幽門螺桿菌的翻譯起始信號。重組尿素酶的表達(dá)已純化并含有編碼ureA和ureB的基因的2.5kb PCR片段被EcoRI和BamHI消化后，插入表達(dá)載體pET24+(Novagen，Madison，Wisconsin)以產(chǎn)生質(zhì)粒pORV214(圖2)。pET24+包括colE1復(fù)制起點，用于修補單鏈的絲狀噬菌體(f1)復(fù)制起點，以及卡那霉素抗性基因Tn903。此片段被插入T7啟動子下游，后者能啟動尿素酶基因轉(zhuǎn)錄。乳糖操縱子(lacO)序列存在于T7啟動子和克隆位點之間，以使尿素酶基因誘導(dǎo)型表達(dá)。T7轉(zhuǎn)錄終止序列位于克隆位點下游。載體還包括乳糖抑制物基因(lacI)以確保對表達(dá)的完全抑制。載體中出現(xiàn)的其他序列均衍生自pBR322，后者提供了用于載體構(gòu)建的基本骨架。
初始連接混合物用于轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2方法制備的XL1-Blue(Stratagene LaJolla，CA)，該初始連接混合物包括2.5kb的PCREcoRI-BamHI片段和用EcoRI及Bam HI消化過的pET24+載體。XL1-Blue是一株不表達(dá)T7 RNA聚合酶的大腸桿菌(E.coli)菌株?？箍敲顾鼐渲苯佑肞CR篩選。PCR中用到尿素酶特異性引物。來自幾個陽性克隆子的質(zhì)粒DNA用Qiagen mimspin柱(Qiagen，Chatsworth，CA)抽提并經(jīng)正確的限制酶切圖譜確認(rèn)。
純化的pORV214 DNA用于轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2方法制備的大腸桿菌BL21-DE3(Novagen，Madison，Wisconsin)。BL21-DE3是經(jīng)λ噬菌體DE3溶原化而產(chǎn)生的一株大腸桿菌B株，而DE3是在lanUV5啟動子控制下編碼T7 RNA聚合酶的重組噬菌體。BL21缺失在lon和ompT蛋白酶，及hsdSB限制/修飾系統(tǒng)和dcm DNA甲基化方面是缺陷型。從抗卡那霉素菌落中用Qiagen minispin柱制備出DNA并用BamHI和EcoRI進(jìn)行限制酶分析進(jìn)行篩選，以證實質(zhì)粒的存在。尿素酶的表達(dá)通過用SDS-PAGE和Western印跡檢查BL21-DE3(pORV214)的細(xì)胞裂解物來評價。一些陽性克隆子有著正確的限制性核酸內(nèi)切酶消化圖譜并表達(dá)了尿素酶。
一個包含pORV214的單克隆被選擇出，置于含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板中生長，收獲并貯于-80℃含50％甘油的LB中。從甘油貯藏樣品中取出一份置于含卡那霉素的LB平板上生長，挑選一個單菌落，接種到含卡那霉素的LB肉湯培養(yǎng)基上，就制備出了一個研究用細(xì)胞庫。上述肉湯培養(yǎng)物長至OD600為1.0，沉淀，再重新懸浮于等體積的含50％甘油的LB中。然后這些研究用細(xì)胞庫(RCB)等分試樣(100μl)貯存于-80℃。用來自研究用細(xì)胞庫的一個單菌落按類似方法制備一個主細(xì)胞庫(MCB)，用來自MCB的一個單菌落制備出一個商品化工作細(xì)胞庫(MWCB)。
MCB和MWCB細(xì)胞有活力，抗卡那霉素，并表現(xiàn)出正常E.coli菌落的形態(tài)。T7 RNA聚合酶的表達(dá)和λ噬菌體的溶原性用本領(lǐng)域熟知的適當(dāng)測試證實。經(jīng)測定，尿素酶在MCB細(xì)胞和MWCB細(xì)胞中的表達(dá)可被IPTG誘導(dǎo)，測定方法是檢查在有IPTG存在時生長的培養(yǎng)物，并在SDS-PAGE上分析來自這些細(xì)胞培養(yǎng)物的裂解產(chǎn)物。隨溫育時間的延長，MCB細(xì)胞和MWCB細(xì)胞所產(chǎn)生的60kD和29kD的蛋白(分別為ureB和ureA)也增多。
質(zhì)粒DNA從MCB細(xì)胞和MWCB細(xì)胞中分離出來，用限制酶分析、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)及DNA序列分析進(jìn)行測試以證實質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，MCB細(xì)胞包含一個具有適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶消化圖譜的質(zhì)粒，該圖譜中不存在質(zhì)粒的缺失或重排。同樣地，pSCP1的RFLP指紋和MCB細(xì)胞、MWCB細(xì)胞中質(zhì)粒DNA的RFLP指紋沒有差別，說明尿素酶基因在克隆過程中或在細(xì)胞庫制備時并未產(chǎn)生可以檢測到的(＞50bp)的缺失或重排。
ureA和ureB的編碼區(qū)，以及分離自MCB細(xì)胞的質(zhì)粒的啟動子區(qū)和終止區(qū)序列，均已測序。測序反應(yīng)使用雙脫氧循環(huán)測序試劑盒(Di-Deoxy Cycle Sequence Kit)和熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸依照廠商說明(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行。具有預(yù)期蛋白質(zhì)序列的ureA和ureB的基因序列，推測的蛋白序列以及兩側(cè)區(qū)域的DNA序列均顯示在圖3中。重組尿素酶的大規(guī)模生產(chǎn)所用的發(fā)酵罐均按改進(jìn)程序洗凈并滅菌。培養(yǎng)基含24g/l酵母浸出汁，12g/l胰蛋白胨，6-15g/l甘油，均溶于RO/DI水中。因pORV214在不存在抗生素時很穩(wěn)定，故大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)基中未加抗生素。抑泡劑被加入培養(yǎng)基，各單元適當(dāng)滅菌。
為了在40升的發(fā)酵罐中生產(chǎn)，復(fù)蘇一小瓶MWCB細(xì)胞，并接種至一個含有1升LB肉湯(1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸出汁，1％NaCl)，不含抗生素的4升搖瓶中。37℃振蕩培養(yǎng)16-24小時。接種物再轉(zhuǎn)入含有上述生產(chǎn)培養(yǎng)基的40升發(fā)酵罐(工作體積為30升)中。發(fā)酵在通氣并攪拌的狀態(tài)下進(jìn)行，直至經(jīng)OD600測得的細(xì)胞密度約為8-10。異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)隨后加入其中，直至終濃度為0.1mM，誘導(dǎo)16-24小時。離心收獲細(xì)胞，濕糊狀細(xì)胞沉淀被等分后裝入聚丙烯貯藏管內(nèi)-80℃保存。為進(jìn)行400升規(guī)模的生產(chǎn)(其中工作體積300升)，40升容器內(nèi)的接種物和培養(yǎng)物按上述制備。當(dāng)40升容器內(nèi)OD600達(dá)到近5.0時，用于接種至400升發(fā)酵罐中。此培養(yǎng)物再溫育至OD600達(dá)到8-10。培養(yǎng)物再經(jīng)誘導(dǎo)，收獲，并保存，均如上述。此過程比40升的過程需要多出2-3代。重組幽門螺桿菌尿素酶的純化由上述發(fā)酵過程產(chǎn)生的細(xì)胞管從貯備中取出，室溫復(fù)蘇，重新懸浮于20mM磷酸鈉/1mM EDTA緩沖液(pH 6.8)中。這些重新懸浮的細(xì)胞經(jīng)加壓擠過一個窄口(Microfluidizer cell Disruptor)時破裂。破裂的細(xì)胞4℃離心沉淀細(xì)胞碎片，而含有可溶解尿素酶的上清被收集起來。
向細(xì)胞上清中加3M氯化鈉溶液至終濃度為0.1M。DEAE-Sepharose層析柱在20mM磷酸鈉/1mM EDTA中平衡后，將上清過柱，收集過柱液以備進(jìn)一步處理。將過柱液在20mM磷酸鈉/1mM EDTA(pH 6.8)中用截留100kD的膜透析過濾以去除低分子量雜質(zhì)并減小離子強度。
該物質(zhì)再次在已于20mM磷酸鈉/1mM EDTA中平衡好的DEAE-Sepharose柱上通過。棄去過柱液，柱子用20mM磷酸鈉/1mM EDTA(pH 6.8)洗一次。結(jié)合在柱子上的物質(zhì)用約三倍柱體積的0.1MNaCl/1mM β-巰基乙醇洗脫。對結(jié)合的尿素酶通過洗脫緩沖液的體積和流速控制其有效洗脫。
這種部分純化的尿素酶再用25mM Tris-HCl(pH 8.6)透析過濾，并過Q-Sepharose柱。柱子用同樣的緩沖液以約2倍柱體積洗脫，收集包含高純度的尿素酶的過柱液。然后濃縮經(jīng)Q-Sepharose步驟所得的過柱液并在含2％蔗糖的注射用水(WFI)(pH 7.5)中透析過濾。純化的重組幽門螺桿菌尿素酶的抗原性和亞單位組成的鑒定為比較重組的與天然的幽門螺桿菌尿素酶的抗原性和亞單位組成，將天然的幽門螺桿菌尿素酶純化并用作抗原以生產(chǎn)多克隆抗尿素酶抗體，以及單-特異性多克隆抗-ureA，抗-ureB，及抗尿素酶全酶的抗體。
天然幽門螺桿菌尿素酶用改良的Hu和Mobley方法(《感染與免疫1990年58卷992-998頁)純化。幽門螺桿菌株ATCC 43504(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)在Mueller-Hmton瓊脂(Difco實驗室，Detroit，MI)上生長，該瓊脂中包含5％綿羊紅細(xì)胞(CraneLabs，Syracuse，NY)和抗生素(5μg/ml三甲氧芐氨嘧啶，10μg/ml萬古霉素和10U/ml硫酸多粘菌素B)(TVP，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。瓊脂平板在37℃7％CO290％濕度下溫育3-4天，離心收獲細(xì)菌。細(xì)菌重新懸浮于含蛋白酶抑制劑的水或20mM磷酸鹽，1mM EDTA，1mM β-巰基乙醇(pH 6.8)溶液中，超聲破碎并離心澄清。澄清后的上清與3M氯化鈉混合至氯化鈉終濃度為0.15M，然后過DEAE-Sepharose柱(Fast Flow)。收集過柱的活性尿素酶，在Filtron Macrosep 100離心過濾單位中濃縮，再過Superose-12或Superdex 200大小排阻層析柱。大小排阻層析用Pharmacia FPLC預(yù)裝柱進(jìn)行。將含尿素酶活性的各部分集中，濃縮，再在Pharmacia Mono-Q Sepharose預(yù)裝柱上經(jīng)FPLC陰離子交換層析純化。結(jié)合在柱上的尿素酶用氯化鈉梯度洗脫。集中有尿素酶活性的各部分并用Filtron公司的Macrosep 100離心過濾器濃縮。在幾批樣品中，用Superose-12柱上分析利用大小排阻FPLC實現(xiàn)最終純化。
用純化的天然幽門螺桿菌尿素酶免疫3只雌性新西蘭白兔制備出抗幽門螺桿菌尿素酶的多克隆抗血清。動物事先抽血證實非免疫狀態(tài)后，用在完全弗氏佐劑中的150μg尿素酶皮下免疫接種。第27和45天后再分別皮下接種加強免疫一次，每次劑量為150μg，均聯(lián)合不完全弗氏佐劑。用針對純化尿素酶的ELISA和Western印跡證實有免疫應(yīng)答后，動物被放血。血液經(jīng)4℃凝集過夜，離心收集血清。用(50％)硫酸銨沉淀4℃過夜提純血清IgG。沉淀重新懸浮于PBS并透析除去硫酸銨。發(fā)現(xiàn)每只動物的IgG抗尿素酶效價是1∶107，集中來自三只動物的抗體。測得蛋白濃度為17.3mg/ml。制備各0.2ml的等分試樣并且貯存于-80℃。
經(jīng)過在第0天給5只小鼠皮下注射在完全弗氏佐劑中的10μg天然重組酶全酶制備抗幽門螺桿菌尿素酶全酶的鼠多克隆腹水(“MPA3”)。在第10天和17天加強免疫小鼠。在第24天抽血以證實有了抗尿素酶的免疫應(yīng)答，再在第26天加強一次。在第28天小鼠腹膜內(nèi)注射S180肉瘤細(xì)胞。在第31天最后一次腹膜內(nèi)加強注射劑量為10μg的尿素酶，7天后收集腹水。
腹水室溫置2小時后4℃置16小時；渦旋打碎凝塊，10,000rpm離心10分鐘除去。塑料管中4℃過夜后，腹水形成堅固的凝塊。攪勻，用PBS稀釋5倍，再經(jīng)10,000rpm離心10分鐘重新澄清。收集36ml稀釋的腹水，以300μl的等分試樣凍存在-20℃。Western印跡分析證實該抗體與ureA和ureB亞單位反應(yīng)。ELISA試驗中抗尿素酶的終點滴度為1∶300,000。
抗幽門螺桿菌ureA的鼠多克隆腹水(“MPA4”)制備方法如下從SDS-PAGE凝膠上經(jīng)電洗脫分離到天然的幽門螺桿菌尿素酶ureA亞單位，再給小鼠皮下注射即可?？箄reA腹水制備的后續(xù)步驟同上述抗全酶抗體的制備。
從SDS-PAGE凝膠上電洗脫分離到天然ureB，對小鼠皮下注射就制備出抗天然幽門螺桿菌ureB亞單位的小鼠多克隆腹水(“MPA6”)。后續(xù)制備抗ureB腹水的步驟如上文所述的抗全酶抗體的制備。
MAB71是一種抗貓螺桿菌尿素酶的IgA單克隆抗體，它識別B亞單位上的一種保護(hù)性表位。該抗體的制備如Czinn等人在《疫苗雜志》1993年11卷6期637-642頁所述，產(chǎn)生它的雜交瘤細(xì)胞系保存在ATCC且指定的保存號為HB 11514。上述各抗體均用于鑒定純化的重組幽門螺桿菌尿素酶的Western印跡實驗。重組尿素酶的SDS-PAGE分析和Western印跡分析重組尿素酶先在還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE(12.5％)進(jìn)行分析。有2條主要的蛋白帶(29kD和60kD)及幾條較輕帶(約38kD)均較明顯。為鑒別這些電泳帶中的蛋白質(zhì)，用上述抗尿素酶和抗尿素酶亞單位的抗體進(jìn)行Western印跡，60kD蛋白與MPA3(抗尿素酶全酶)和MPA6(抗ureB)反應(yīng)，但不與MPA4(抗ureA)反應(yīng)。29kD蛋白與MPA3(抗尿素酶全酶)及MPA4(抗ureA)反應(yīng)，但不與MPA6(抗ureB)反應(yīng)。較輕的38kD帶與MPA3(抗尿素酶全酶)及MPA6(抗ureB)反應(yīng)，說明該蛋白是ureB的一部分。
在SDS-PAGE凝膠上能明顯看到2條微弱的高分子量(＞150kD)電泳帶。這兩條帶均能微弱地與既抗ureA又抗ureB的抗體反應(yīng)，說明一小部分重組尿素酶亞單位在所用條件下形成了抗巰基還原的共價結(jié)合單位?？捡R斯亮蘭染色后的凝膠中未發(fā)現(xiàn)其它蛋白帶。因此，在純化產(chǎn)物中測得的所有蛋白質(zhì)是ureA，ureB，或ureA或ureB的衍生物。
濕的考馬斯亮蘭染過色的SDS-PAGE凝膠用Ultroscan XL激光密度計和Gel Scan XL軟件程序(Pharmacia-LKB Biotechnology，Piscataway NJ)掃描。密度測定法測得的數(shù)據(jù)與1∶1摩爾比的ureA∶ureB亞單位比一致，正如由天然幽門螺桿菌尿素酶的結(jié)構(gòu)所推測的那樣。在純化的尿素酶制品中ureA和ureB占總蛋白的95％以上。估計ureA+ureB的合并峰值平均為95.2％±1.2％。純化的重組尿素酶的分析型大小排阻HPLC已純化的重組尿素酶的純度和分子組成用分析型大小排阻高效液相層析來測定。層析用Beckman System Gold HPLC來完成，后者組成如下蠕動泵126，二極管排列雙波長檢測器168，System GoldSoftware V 7.11版，Progel-TSK G4000 SWXL柱(內(nèi)徑為5mm×30cm)(Beckman Instrumenats，Brea，Cal而rnia)，及Supel Co.提供的SWXL防護(hù)柱。層析時采用恒溶劑成分的洗脫條件，所用緩沖液為100mM磷酸鹽，100mM氯化鈉，pH 7.0。層析柱的校準(zhǔn)用Pharmacia-LKB的分子量標(biāo)志物進(jìn)行。
代表性的已純化的粗樣品經(jīng)HPLC分離后典型的圖形顯示在圖4中。純化的尿素酶產(chǎn)物顯示著在甲狀腺素(分子量669kD)和鐵蛋白(分子量440kD)的滯留時間之間有一個明顯的蛋白峰。經(jīng)系列層析估計出其大概分子量為550-600kD。該峰暫定名六體尿素酶。在不同批產(chǎn)品中此六體尿素酶的面積占總蛋白面積的至少70％。
還檢測到一個比較明顯的蛋白峰，其滯留時間較短(意即分子量較大些)。該峰面積在5-20％的范圍內(nèi)。這個分子量大于600kD的峰被命名為八體尿素酶。六體尿素酶加八體尿素酶峰總面積超過90％。
這兩個特性峰均被分離出來以備進(jìn)一步鑒定。將凍干的尿素酶復(fù)原后經(jīng)HPLC純化得到上述兩峰，將它們在4℃貯存超過一周。貯存期內(nèi)，八體尿素酶形式增多而六體尿素酶形式減少。兩峰分別用還原性SDS-PAGE和ELISA分析了與抗尿素酶的單克隆及多克隆抗體的反應(yīng)性。在SDS-PAGE上，兩峰均顯示類似比例的尿素酶A和尿素酶B帶。此外，在用多克隆抗尿素酶全酶抗體(MPA3)和單克隆抗尿素酶B抗體(MAB71)進(jìn)行ELISA時兩峰顯示出幾乎相同的免疫反應(yīng)性。重組尿素酶的酶活性(尿素水解活性)為調(diào)查重組尿素酶的酶活性用了三種方法先電泳再做尿素酶特異性銀染色，pH敏感性酚紅尿素肉湯試驗，及直接氨測定。尿素酶特異性銀染，如deLlano等人所述(《分析生物化學(xué)》1989年177卷37-40頁)，是基于尿素酶使尿素產(chǎn)生氨的反應(yīng)。該反應(yīng)導(dǎo)致局部pH值上升，從而促進(jìn)膠片的氧化還原反應(yīng)，最后產(chǎn)生金屬銀。僅用1.0μg樣品就測出天然的幽門螺桿菌尿素酶的酶活性，對比之下，20μg純化的重組尿素酶沒有酶活性。
本領(lǐng)域眾所周知的pH值敏感性酚紅尿素肉湯試驗是基于因尿素水解產(chǎn)生氨使pH值改變。試驗證實尿素酶活性與0.2μg/ml純化的幽門螺桿菌尿素酶一樣少。相反，純化重組尿素酶沒有尿素酶活性，甚至當(dāng)濃度高達(dá)750μg/ml時也是如此。
用Nessler’s試劑定量直接估計出了尿素酶催化尿素水解產(chǎn)生出的氨(Koch等人，《美國化學(xué)協(xié)會雜志》1924年46卷2066-2069頁)。天然幽門螺桿菌尿素酶的酶活性在1μg/ml濃度時可檢測出。純化的重組尿素酶濃度高達(dá)500μg/ml也測不出酶活性。
根據(jù)尿素酶特異性銀染色試驗，pH值敏感性酚紅尿素肉湯試驗和氨直接估計法的結(jié)果，重組尿素酶產(chǎn)物沒有可檢測到的尿素酶活性。純化的重組尿素酶的保護(hù)和治療功效貓螺桿菌-小鼠模型被用于測試重組幽門螺桿菌尿素酶在預(yù)防和治療螺桿菌感染中的功效。該模型中，細(xì)菌的胃部定居易于建立，并伴隨有胃部炎癥。這一動物模型是研究螺桿菌的一種成熟系統(tǒng)，已廣泛用于螺桿菌所致疾病的發(fā)病機理和治療的實驗研究(見，如Fox等人，《感染與免疫》1993年61卷2309-2315頁；Goodwin和Worsley《幽門螺桿菌生物學(xué)和臨床實踐》，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L，465頁，1993年)。幽門螺桿菌和貓螺桿菌尿素酶之間存在抗原性交叉反應(yīng)性，因此本發(fā)明中可以用人疫苗候選者重組幽門螺桿菌尿素酶(rUre)去免疫已感染或?qū)⒈回埪輻U菌攻擊的動物。
無菌小鼠和常規(guī)小鼠均易感于貓螺桿菌的感染，且形成終生的胃上皮感染，其特征是炎癥細(xì)胞的浸潤(Fox等人，前述)。劑量反應(yīng)研究指示，只經(jīng)口服104個貓螺桿菌攻擊后，100％的Swiss-Webster特異性無病原菌(SPF)小鼠被感染。除非另有特別說明，只用107這一單一劑量在治療性免疫之前感染小鼠或在預(yù)防性免疫之后攻擊小鼠。用大約103倍的該螺桿菌的感染劑量(I.D.90)進(jìn)行的攻擊說明對免疫的測試是嚴(yán)格的。胃感染試驗為檢測胃組織中的螺桿菌用了好幾種方法，包括測定胃尿素酶活性、組織學(xué)檢查及胃組織培養(yǎng)。胃尿素酶活性的測定既有定性(有或無)又有定量。在定性試驗中，胃從胃食管括約肌到幽門被縱向分成兩個半邊。其中一個縱剖塊，代表約1/4的胃，被置于1ml尿素肉湯(0.1g酵母浸出汁，0.091g磷酸單鉀，0.095g磷酸二鈉，20g尿素，及0.1g/l酚紅，pH 6.9)中。室溫溫育4小時后出現(xiàn)明顯的顏色變化(是因為尿素受酶催化而水解，產(chǎn)生氨，則pH值升高)，這說明有陽性結(jié)果。在定量試驗中，將全胃切片加入澄清的尿素肉湯中溫育4小時，測得550nm的吸光率就測出了尿素酶活性。該試驗可檢測至少1-2×104貓螺桿菌/0.1g胃組織。該試驗與用于人體樣品的商用尿素酶檢測試劑盒具有同樣的敏感性。而商用試劑盒已證實特異性相當(dāng)于活檢/組織學(xué)檢查的100％，而敏感性相當(dāng)于其90-92％(Szeto等人，Postgrad Med.J.1988年64卷935-936頁；Borromeo等人，《臨床病理學(xué)雜志》1987年40卷462-468頁)。
經(jīng)A550分光光度測定的定量胃尿素酶試驗比目測更敏感一點，還能估計感染的嚴(yán)重程度。陰性尿素酶試驗的臨界值定為未受攻擊/未被感染的小鼠平均A550以上2個標(biāo)準(zhǔn)差。陽性胃尿素酶試驗的臨界值定為未免疫/攻擊后小鼠平均A550以下2個標(biāo)準(zhǔn)差。低級別感染動物其試驗值介于陰性和陽性臨界值之間。目測尿素酶反應(yīng)的級別，測出了11/12(92％)的陽性標(biāo)本。
組織學(xué)檢查如下進(jìn)行用10％福爾馬林固定胃組織，再將其包埋進(jìn)石蠟，切片并用改進(jìn)的Warthin-Starry銀染法(Steiner’s染色；Garvey等人，《組織學(xué)技術(shù)》1985年8卷15-17頁)將貓螺桿菌染得可見，再經(jīng)蘇木精和伊紅染色來評價組織中的炎癥反應(yīng)。染過色的切片由經(jīng)驗豐富的病理學(xué)家在不知道標(biāo)本編號的情況下進(jìn)行檢查。
一種半定量分級系統(tǒng)被用于測定細(xì)菌數(shù)和炎癥強度。該系統(tǒng)是被廣為接受的Sydney系統(tǒng)的改進(jìn)版，后一系統(tǒng)用于人類胃炎的組織學(xué)鑒定(Price《胃腸道學(xué)與肝臟學(xué)》1991年6卷209-222頁)。全厚度粘膜切片受到檢查，以便查明炎癥強度(淋巴細(xì)胞、血漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量增加及出現(xiàn)淋巴濾泡)，并查明這些細(xì)胞浸潤的深度，分成0-4+的級別。對貓螺桿菌密度定級可這樣完成在幽門竇(或胃體，若特別說明的話)的完整縱向切片中計數(shù)有典型的螺旋形態(tài)的細(xì)菌數(shù)目。級別可根據(jù)看到的細(xì)菌數(shù)范圍來劃定(0為無細(xì)菌，1+為1-20個細(xì)胞，2+為21-50個細(xì)菌，3+為51-100個細(xì)菌，而4+為多于100個細(xì)菌)。免疫途徑本發(fā)明中給藥途徑對疫苗功效的影響在小鼠感染模型中進(jìn)行了檢查。6-8周齡雌性特異性無病原菌(SPF)Swiss-Webster小鼠用200μg重組幽門螺桿菌尿素酶(含或不含0.24M NaHCO3)免疫。同時對所有動物施用的還有作為粘膜佐劑的10μg霍亂毒素(CT)。胃內(nèi)(IG)免疫實施如下將0.5ml抗原通過20號注射針頭傳送給已麻醉的動物。口腔免疫實施如下將50μl抗原通過移液管頭傳至未麻醉動物的頰腔。至于腸胃外免疫，是使小鼠經(jīng)皮下接受10μg重組尿素酶。第一次皮下免疫接種時用的是弗氏完全佐劑，隨后的加強免疫中用的是弗氏不完全佐劑。對所有給藥途徑來說，均是每隔七天給予總共有四種劑量的疫苗。最末次接種二周后用107貓螺桿菌攻擊小鼠，攻擊二周后就驗尸。用尿素酶活性和組織學(xué)測定胃的貓螺桿菌感染。確定某只小鼠體內(nèi)有保護(hù)作用是通過尿素酶試驗陰性，以及通過組織學(xué)測得的細(xì)菌量為0或1+級。
口服和胃內(nèi)施用重組尿素酶提供了對抗貓螺桿菌攻擊的顯著保護(hù)作用(86-100％)(表1)?？谇唤o藥在有或無NaHCO3伴隨重組酶時均有效。胃內(nèi)給藥在有NaHCO3與重組酶共同使用時更有效。疫苗抗原的腸胃外注射作用最小。免疫小鼠比未免疫小鼠在受細(xì)菌攻擊后其胃組織中的細(xì)菌數(shù)顯著下降。口腔途徑免疫的小鼠體內(nèi)血清和分泌液中IgA抗體應(yīng)答最強。腸胃外免疫接種則未能誘發(fā)出IgA抗體。
表1重組幽門螺桿菌尿素酶經(jīng)粘膜而非腸胃外免疫后保護(hù)小鼠抵抗貓螺桿菌的攻擊
a 0.24M碳酸氫鈉與疫苗和佐劑同時使用。
b保護(hù)百分率(有0～1+級細(xì)菌量的小鼠數(shù)/所有受測試小鼠數(shù))。
*p＜0.01，F(xiàn)isher’s真實檢驗，與只給CT的小鼠相比。
在小鼠中檢查了免疫途徑對抗尿素酶抗體應(yīng)答的影響。Swiss-Webster小鼠每隔10天進(jìn)行免疫，一共免疫4次，方式用的是下列任一種1)口腔給予200μg重組純化幽門螺桿菌尿素酶及10μg CT(有或無NaHCO3)；2)胃內(nèi)給予200μg重組純化幽門螺桿菌尿素酶及10μgCT(有NaHCO3)；3)皮下給予帶弗氏佐劑的10μg重組純化幽門螺桿菌尿素酶。第4次接種一周后，檢查粘膜和血清的抗體應(yīng)答，方式是在包被有0.5μg天然幽門螺桿菌尿素酶的微滴板上做ELISA。血清樣品稀釋至1∶100，試驗測定尿素酶特異性IgA和IgG。新鮮糞便塊用蛋白酶抑制劑緩沖液(含5％脫脂干牛奶，0.2μM AEBSF，1μg/ml抑肽酶及10μM亮抑酶肽的PBS)提取，檢測其中抗尿素酶的IgA抗體。在某些實驗中，糞便抗體值被標(biāo)準(zhǔn)化為ELISA所測定的總IgA含量，即每份樣品中將尿素酶特異性糞便IgA表示為若干A405吸收單位/總IgAmg數(shù)。在氯胺酮麻醉下用毛果云香堿刺激后收集唾液標(biāo)本，稀釋至1∶5測尿素酶特異性IgA。
在有或無NaHCO3時經(jīng)口腔免疫的小鼠其抗體應(yīng)答未測出明顯區(qū)別，數(shù)據(jù)都集中以備分析。皮下給予抗原的小鼠形成了尿素酶特異性血清IgG，但血清和糞便IgA應(yīng)答的誘發(fā)只在抗原經(jīng)粘膜途徑(口腔或胃內(nèi))給予時出現(xiàn)。
不管經(jīng)口腔或是經(jīng)胃內(nèi)，只要是用尿素酶/CT免疫了的小鼠均用107貓螺桿菌攻擊。口腔或胃內(nèi)免疫后小鼠的攻擊前抗體水平相關(guān)于貓螺桿菌攻擊后組織學(xué)測得的細(xì)菌數(shù)(圖5)。盡管各只小鼠間IgA應(yīng)答很不一樣，但總的來說，具有較高的血清和糞便IgA水平的小鼠其細(xì)菌數(shù)減少。這些數(shù)據(jù)說明IgA在抑制感染和保護(hù)小鼠抗感染時有作用。對比之下，血清IgG抗體與保護(hù)作用無關(guān)。某些受到保護(hù)的小鼠體內(nèi)并未測到IgA抗體，而那些受攻擊后發(fā)展到4+級感染的小鼠體內(nèi)也未發(fā)現(xiàn)有高水平的抗尿素酶IgA。這些結(jié)果不僅支持了粘膜免疫應(yīng)答參與保護(hù)的說法，而且提示除糞便和血清IgA外另有免疫介質(zhì)對消除貓螺桿菌感染有效。
這些數(shù)據(jù)顯示i)保護(hù)性免疫必需經(jīng)粘膜免疫接種；ii)口腔免疫途徑的效果等同于，或更強于胃內(nèi)途徑；iii)要獲得有效的胃內(nèi)(而非口腔)免疫效果需用NaHCO3中和胃酸；和iv)腸胃外免疫不能刺激粘膜免疫或提供有效地對抗細(xì)菌攻擊的保護(hù)作用。免疫程序比較了幾種免疫接種程序以確定能誘發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的最佳免疫接種程序。用總量為100μg的重組尿素酶按表2所示程序分二、三或四次口服給藥來免疫Swiss-Webster小鼠。與重組尿素酶同時給予的還有粘膜佐劑CT(10μg)。根據(jù)定性的胃尿素酶試驗的評價，那些每周一次共四次接受了抗原的小鼠呈現(xiàn)出最高水平的保護(hù)作用。在那些于第0、7和21天共被給予三次抗原的小鼠體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有明顯的保護(hù)作用。分泌型IgA抗體應(yīng)答以那些按一周間隔共被給予四劑重組尿素酶的小鼠最高。根據(jù)保護(hù)率和抗體應(yīng)答，選擇最后一個程序以便進(jìn)一步改進(jìn)疫苗的治療和預(yù)防功效。
表2不同的口服免疫程序?qū)δ蛩孛敢呙绲念A(yù)防功效的影響
a每組小鼠均經(jīng)口腔免疫接種總劑量為100μg的重組幽門螺桿菌尿素酶，每次免疫均用到CT(10μg)，它懸浮于無菌雙蒸水中，作為粘膜佐劑，第6組在與第1組相同的程序內(nèi)只接受了CT，它被作為對照組。第4組和第5組比較了在前面兩次間隔為一周的免疫之后加強免疫所用劑量不同造成的影響。
b免疫完兩周后以107劑量的貓螺桿菌攻擊小鼠的保護(hù)百分率(被保護(hù)的小鼠數(shù)/參加測試的小鼠數(shù))。小鼠在攻擊二周后被處死，用定性胃尿素酶試驗測定保護(hù)作用。
*p＜0.05 Fisher’s真實試驗，是與只給予CT的小鼠比較的結(jié)果。
不同免疫程序?qū)鼓蛩孛缚贵w產(chǎn)生的影響在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了檢查。用表2所述五種不同免疫程序之一對小鼠免疫，其抗體應(yīng)答受到檢測。每周一次用疫苗接種小鼠，第21天加強免疫，免疫了四次或兩次的小鼠可見明顯的保護(hù)作用。由以上兩種免疫程序之一免疫的小鼠還有著最高的平均免疫應(yīng)答。每周一次共四次接種疫苗的小鼠體內(nèi)血清IgG和唾液IgA水平最高。劑量-保護(hù)作用的關(guān)系將重組尿素酶劑量以不同劑量經(jīng)口服給予小鼠以決定免疫作用和保護(hù)作用所需的最小和最佳劑量。重組尿素酶按5、10、25、50和100μg的劑量經(jīng)口腔途徑給予每八只一組的小鼠，每次同時給予的還有溶于PBS的10μg CT?？乖恐芸诜淮危菜拇?。根據(jù)胃尿素酶試驗和組織學(xué)細(xì)菌量的結(jié)果，所有劑量組均發(fā)現(xiàn)具有對抗貓螺桿菌攻擊的顯著保護(hù)作用，且不同劑量組之間沒有顯著性差別(表3)。劑量反應(yīng)效應(yīng)清楚地表現(xiàn)在抗重組尿素酶的血清和粘膜抗體應(yīng)答中，其中100μg劑量水平的免疫應(yīng)答最強。
表3重組幽門螺桿菌尿素酶在5μg劑量或更多劑量時，保護(hù)小鼠抵抗貓螺桿菌的攻擊
A根據(jù)胃切片銀染檢查測得的保護(hù)百分率(每張切片上有0-20個細(xì)菌的小鼠數(shù)/受檢小鼠數(shù))*與假免疫對照組比較，F(xiàn)isher’s真實檢驗，p≤0.02。
重組尿素酶劑量對抗尿素酶抗體應(yīng)答的效應(yīng)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行檢查。Swiss-Webster小鼠經(jīng)口腔用分級劑量(0、5、10、25、50或100μg)的重組尿素酶加上10μg CT作粘膜佐劑進(jìn)行免疫。隨著所給的重組尿素酶量增加，血清、糞便和唾液中的IgA抗體應(yīng)答也增強。100μg劑量的重組尿素酶產(chǎn)生了最高抗體水平。
Swiss-Webster小鼠經(jīng)口腔用分級劑量(0、5、25或100μg)的重組尿素酶加上25μg腸產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱毒素(CT)作為粘膜佐劑進(jìn)行免疫。另有一組小鼠接受了25μg重組尿素酶和10μg作粘膜佐劑的CT，作為對照組。小鼠每7天口腔免疫一次共4次。最后一次免疫后10到13天收集血清、糞便和唾液，尿素酶特異性抗體水平用ELISA測定。用重組尿素酶和CT免疫的小鼠血清和分泌液的抗尿素酶抗體水平升高，有明顯的劑量反應(yīng)效應(yīng)。在這些小鼠中發(fā)現(xiàn)有強烈的唾液IgA抗體應(yīng)答。
小鼠按上述經(jīng)尿素酶和LT免疫后用107貓螺桿菌攻擊(見圖4)。經(jīng)尿素酶/LT免疫的小鼠用組織學(xué)檢測的細(xì)菌級數(shù)與攻擊前抗體的應(yīng)答相關(guān)(圖6)。各組中受到完全保護(hù)的(切片中細(xì)菌級數(shù)為0)和那些有較低級感染(切片細(xì)菌級數(shù)為1+級)的小鼠比有更嚴(yán)重感染的小鼠抗體水平更高。少數(shù)受保護(hù)小鼠未測到免疫應(yīng)答，提示除IgA抗體外另有免疫介質(zhì)在抗貓螺桿菌感染時發(fā)揮作用。
高劑量重組尿素酶誘發(fā)粘膜免疫應(yīng)答的能力檢查如下胃內(nèi)給予不加佐劑的1μg、200μg或5mg尿素酶。另一組小鼠胃內(nèi)用200μg尿素酶加10μg CT免疫作為對照組。末次免疫5到8天后收集血液、糞便和唾液。小鼠在末次免疫的10天后用107貓螺桿菌攻擊，又過14天處死。用胃組織中的尿素酶活性查明貓螺桿菌的感染。
經(jīng)ELISA測定，高劑量的重組尿素酶激發(fā)了尿素酶特異性血清IgG，但激發(fā)的粘膜抗體水平相對較低。出現(xiàn)尿素酶特異性血清IgG應(yīng)答的小鼠在貓螺桿菌攻擊時完全易感，說明血清IgG對保護(hù)無作用。
總之，上述各實驗研究了不同給藥途徑，不同給藥程序和不同的粘膜佐劑，所獲數(shù)據(jù)證實給予有效的粘膜佐劑時，口腔或胃內(nèi)給予相對較低劑量的重組尿素酶就能誘發(fā)分泌型IgA抗體和血清IgA及IgG的應(yīng)答。分泌型IgA有保護(hù)作用，而血清IgG應(yīng)答沒有保護(hù)作用。當(dāng)用組織切片細(xì)菌計數(shù)來測保護(hù)性時，有著較高IgA抗體效價的小鼠與只有較低的IgA抗體效價的小鼠相比，前者受到完全保護(hù)，或是感染顯著減輕。未測出IgA抗體水平的小鼠在攻擊后發(fā)生嚴(yán)重感染?？贵w應(yīng)答呈劑量依賴并隨給藥程序的不同選擇而變化。當(dāng)抗原劑量為100-200μg時獲得了最高抗體水平。按一周間隔給予4劑抗原為最佳免疫程序。另一種給藥途徑，鼻內(nèi)途徑，在后面進(jìn)行調(diào)查。鼻內(nèi)接種重組尿素酶Swiss-Webster小鼠口腔或鼻內(nèi)(IN)免疫接種重組尿素酶或福爾馬林固定的尿素酶?？乖妥魟┑挠昧俊⒔o藥途徑(IN或口腔)及免疫程序均示于圖7。福爾馬林固定的尿素酶(Form-ure)按以下程序制備(1)含1mg重組尿素酶的小瓶用150μl RO/DI水重配；(2)50μl福爾馬林(37％甲醛)用RO/DI水1∶1000稀釋后加入小瓶中(尿素酶終濃度為5mg/ml)；(3)小瓶置35℃溫育48小時。
IN+CT組比口腔+CT組的血清IgG、IgA、糞便IgA和唾液IgA的應(yīng)答要強，盡管口腔免疫所用的重組尿素酶和佐劑用量要更高(圖7和表4)。保護(hù)作用用尿素酶檢驗和測處死小鼠的胃組織上細(xì)胞級數(shù)的方法測定。當(dāng)用尿素酶檢驗法測定保護(hù)時，IN組100％保護(hù)，而口腔組僅80％?？谇幻庖叩?只小鼠有7只的胃組織為細(xì)菌陽性，而IN組只有1/10的小鼠為細(xì)菌陽性(見表4中第3組和第6組和圖8)。
在第二種試驗中，小鼠用重組尿素酶經(jīng)胃內(nèi)(IG)或鼻內(nèi)免疫，LT作為粘膜佐劑一起接種。(試驗和免疫接種程序的細(xì)節(jié)參見圖9)。該試驗中，盡管IG免疫所用的抗原和佐劑量較多，但是IN+LT組的血清IgG、血清IgA和唾液IgA應(yīng)答高于IG+LT組(圖10，及表5中的第4和第8組)。根據(jù)尿素酶檢驗測定，IN+LT組小鼠在貓螺桿菌攻擊時受到完全保護(hù)(實驗組10只小鼠被保護(hù)的為10只，而對照組9只小鼠被保護(hù)的只有3只)(見表5的第4和第5組)。
表4 鼻內(nèi)免疫接種重組尿素酶和霍亂毒素
表5鼻內(nèi)接種重組尿素酶和LT
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鼻內(nèi)免疫接種功效的進(jìn)一步證明示于圖11。簡而言之，該試驗顯示經(jīng)鼻內(nèi)途徑與CT(5μg)一起接種重組尿素酶(10μg)與經(jīng)口腔途徑與CT(10μg)一起接種重組尿素酶(25μg)在預(yù)防貓螺桿菌感染中至少具有同樣的效果。粘膜佐劑的選擇大腸桿菌不耐熱毒素(LT)是多亞單位毒素，與CT不論生化上還是免疫學(xué)上都密切相關(guān)，由于LT毒性小于CT，故實際用于人體的粘膜佐劑是LT(Walker和Clements，《疫苗研究》1993年2卷1-10頁)。
小鼠每周一次共4次經(jīng)口腔免疫接種總量為5μg、25μg或100μg的重組尿素酶及25μg重組LT(瑞士血清疫苗研究所，Berne，瑞士)。對照小鼠只接種LT或接種含CT的25μg尿素酶疫苗。第4次給藥2周后攻擊小鼠，攻擊2周后進(jìn)行尸檢。
在所有疫苗劑量的被免疫小鼠體內(nèi)，胃尿素酶試驗指示有顯著的針對感染的保護(hù)或抑制作用(表6)。組織學(xué)評價證實接受了少于5μg或5μg尿素酶及LT的小鼠體內(nèi)細(xì)菌數(shù)顯著減少。經(jīng)胃尿素酶試驗和組織學(xué)檢查測定保護(hù)作用直接相關(guān)于劑量，其中最強的保護(hù)作用由100μg重組尿素酶與LT共同用藥而產(chǎn)生?？贵w測定證實了劑量應(yīng)答關(guān)系，其中100μg劑量引起最強的粘膜免疫應(yīng)答。當(dāng)重組尿素酶以相當(dāng)劑量(25μg)用藥時，LT作為粘膜佐劑效果優(yōu)于CT。這些數(shù)據(jù)說明盡管CT增強了經(jīng)口腔給予重組尿素酶的粘膜免疫應(yīng)答，但LT是更好的粘膜佐劑，并因此比CT更優(yōu)選與重組尿素酶一起給藥。
表6大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)作為重組幽門螺桿菌尿素酶免疫的粘膜佐劑
a經(jīng)胃切片銀染后的細(xì)菌量測得的保護(hù)百分率(尿素酶試驗陰性或細(xì)菌量為0至1+級的小鼠數(shù)/受檢小鼠總數(shù))*假免疫對照組小鼠比較，F(xiàn)isher’s真實檢驗，p＜0.03。
為確定低劑量LT的佐劑活性，小鼠經(jīng)口腔以25μg重組尿素酶及1、5、10或25μg LT免疫。在所有LT劑量下觀察到相似的保護(hù)率和抗體的應(yīng)答。
另外還進(jìn)行了幾項研究以評價除CT和LT以外的其他佐劑，并確定能否通過單獨施用較高劑量的抗原而無需使用粘膜佐劑。霍亂毒素B亞單位(CTB)作為尿素酶免疫的粘膜佐劑與CT比較。根據(jù)胃尿素酶活性測定，當(dāng)用0.24M碳酸氫鈉中的200μg尿素酶與100μg CTB(Calbiochem，La Jolla，CA)一起經(jīng)胃內(nèi)給藥時未觀察到保護(hù)效應(yīng)，而同樣劑量的重組酶與10μg CT一起給藥卻獲得了100％的保護(hù)。
一種口腔活性的胞壁酰二肽半合成類似物，GMDP(N-乙酰葡糖胺酰-(b1-4)-N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺)按2、20和200μg的量與25μg尿素酶一起施用。結(jié)果沒有保護(hù)小鼠抵抗貓螺桿菌攻擊。
大劑量(200μg、1mg或5mg)重組尿素酶在有或無CT時經(jīng)胃內(nèi)給予小鼠，一周一次，共4次。胃內(nèi)途徑是必需的，因為高抗原劑量的體積超出了重復(fù)式口腔給藥能承受的限度，同時給予NaHCO3中和胃酸。每隔10天給藥一次共4次。末次免疫5至8天后收集血液、糞便和唾液。小鼠經(jīng)1×107貓螺桿菌攻擊，用胃組織中尿素酶活性確定感染。
缺少CT時，高抗原劑量未能提供抗貓螺桿菌攻擊的保護(hù)作用，而對照組在給予了200μg重組尿素酶和CT后顯著地受保護(hù)(表7)。無佐劑的高劑量重組尿素酶誘導(dǎo)了尿素酶特異性血清IgG。但血清、糞便和唾液IgA的應(yīng)答未出現(xiàn)或很弱。從給予5mg尿毒酶的小鼠體內(nèi)取樣編號后作組織學(xué)檢查，與未免疫動物比較未見細(xì)菌量或白細(xì)胞浸潤的差別。
表7粘膜佐劑使重組尿素酶引發(fā)的保護(hù)作用增強
a以血清(稀釋至1∶100)、糞便抽提物(稀釋至1∶20)或唾液(稀釋至1∶5)的A405單位數(shù)表示的平均(±SD)尿素酶特異性血清IgG或IgA水平。當(dāng)計算平均值包括4.0的數(shù)值(A405讀數(shù)的最大值)時，平均值表示為＞。
*與假免疫對照組相比，F(xiàn)isher’s真實檢驗，p＝0.005。貓螺桿菌胃炎小鼠的治療性免疫重組尿素酶疫苗在治療螺桿菌對小鼠感染中的功效檢查如下Balb/c小鼠胃內(nèi)感染107貓螺桿菌，4周后口腔給予總劑量為100μg的重組尿素酶和10μg的LT，一周一次共4次。對照組小鼠只接受LT(圖12)。
末次免疫4周后每組取10只小鼠尸檢，用定量胃尿素酶檢查螺桿菌感染的程度，10只Balb/c小鼠中有9只未出現(xiàn)感染，這是依據(jù)定量尿素酶試驗的測定，另一方面所有的對照組小鼠均被感染。
第4周，12只接受LT的小鼠和40只接受尿素酶+LT的小鼠用貓螺桿菌再感染。攻擊10周后，處死動物以便用定量尿素酶試驗確定感染的程度。根據(jù)胃尿素酶活性測得，9只給予尿素酶加LT但未受再次感染的小鼠中有5只仍沒有感染(57％)。所有12只經(jīng)LT處理后又被再次攻擊的小鼠均受到感染。40只接受尿素酶加LT，并再次受貓螺桿菌攻擊的小鼠中有37只(93％)受到保護(hù)。因為測得的胃尿素酶活性下降。該試驗顯示尿素酶接種不僅消除了已存在的螺桿菌感染，而且保護(hù)宿主抵抗再次感染。
14只免疫過的Swiss-Webster小鼠中有5只(36％)痊愈或感染減弱，而所有對照動物均被感染，只是實驗組與對照組之間感染率的差別不是很明顯(p＝0.26，F(xiàn)isher’s真實檢驗，雙尾)。Swiss-Webster小鼠的感染比Balb/c小鼠嚴(yán)重，因為測得的未免疫小鼠體內(nèi)平均胃尿素酶活性較高些(p＜0.0001，單側(cè)方差分析(one-way，ANOVA))，這也許能解釋為什么Swiss-Webster小鼠比Balb/c小鼠的治愈率低。人們已注意到不同株小鼠對貓螺桿菌的易感性有差別(Sakagami等人，《美國胃腸道雜志》1994年89卷1345頁)。
根據(jù)組織學(xué)評價，所有未免疫的Balb/c小鼠有著4+級感染(即＞100個細(xì)菌/切片)，而免疫小鼠第4周可見有43％其細(xì)菌級數(shù)下降。第10周時，6只中有4只尿素酶活性減弱，不過6只中只有1只細(xì)菌級數(shù)減少。螺桿菌治療中抗體的作用抗尿素酶抗體在螺桿菌治療中的作用，即從被感染小鼠體內(nèi)清除貓螺桿菌，通過首批用107貓螺桿菌感染的Balb/c小鼠進(jìn)行了檢查。感染4周后，小鼠口腔免疫200μg重組尿素酶加10μg CT。對照組小鼠只給10μg CT?？乖o予是一周一次，共4次。末次免疫后的4周和10周后處死小鼠，收集血清和糞便樣品以便做ELISA試驗。
感染了貓螺桿菌的小鼠產(chǎn)生了血清抗尿素酶IgG抗體，但未測出分泌型抗尿素酶IgA的應(yīng)答。而用尿素酶/CT免疫后仍感染了的動物存在較強的分泌型抗尿素酶IgA抗體應(yīng)答(圖13)。免疫過的小鼠中，維持感染狀態(tài)的和細(xì)菌級數(shù)減少的小鼠之間尿素酶特異性粘膜IgA水平?jīng)]有明顯差別。
這些數(shù)據(jù)說明貓螺桿菌感染并未激發(fā)分泌型抗尿素酶抗體應(yīng)答。這樣一來，對IgA抗體應(yīng)答的抑制可能就使貓螺桿菌能逃避免疫系統(tǒng)的清除。相反，對貓螺桿菌感染了的小鼠用重組酶和某種粘膜佐劑免疫就能產(chǎn)生強烈的粘膜抗尿素酶應(yīng)答，而這種應(yīng)答又與貓螺桿菌感染的清除相關(guān)?？孤輻U菌感染的保護(hù)作用與胃免疫應(yīng)答的相關(guān)性用小鼠感染模型所做的幾個試驗顯示，某些小鼠經(jīng)重組尿素酶疫苗接種后，缺乏可檢測的抗體應(yīng)答，或只有血清、唾液或糞便中的低水平抗體，但仍能產(chǎn)生抗感染性。因此直接在胃粘膜內(nèi)測免疫應(yīng)答，以確定是否存在與保護(hù)作用更精確相關(guān)的免疫應(yīng)答。
對胃粘膜中免疫應(yīng)答的評價方式是用免疫組織化學(xué)法測定鼠的腸道和胃組織中的IgA抗體及IgA陽性抗體分泌細(xì)胞。胃的各部分，包括幽門端十二指腸、胃竇、胃體及賁門均被封固在OCT混合物中，迅速冷凍，再制成冰凍切片。切片(7μm厚)在冷丙酮中固定，IgA陽性細(xì)胞的鑒別所用方法是用生物素標(biāo)記的單克隆抗IgA抗體染色，再用偶聯(lián)有生物素標(biāo)記的葡萄糖氧化酶的抗生物素蛋白(ABC-GO，VectorLaboratories，Burlmgame，CA)與之作用，然后以甲基綠負(fù)染。尿素酶特異性抗體分泌細(xì)胞(ASC)通過依次將切片與重組尿素酶、兔抗尿素酶、生物素標(biāo)記的驢抗兔Ig(Amersham，Arlmgton Heights，IL)，ABC-GO，TNBT和甲基綠溫育進(jìn)行鑒別。對照切片未與尿素酶或尿素酶加兔抗尿素酶一起溫育，目的是確定切片與驢源第二抗體的反應(yīng)性以及內(nèi)源性葡萄糖氧化酶活性本底。有兩種細(xì)胞，其一為產(chǎn)生抗貓螺桿菌ureB的單克隆IgA抗體(MAB71)的雜交瘤細(xì)胞，其二為產(chǎn)生與本實驗無關(guān)的抗呼吸道合胞病毒F糖蛋白的IgA單克隆抗體(HNK20)的雜交瘤細(xì)胞，將這兩種細(xì)胞的沉淀的冰凍切片分別作為陽性和陰性對照。
Swiss-Webster小鼠經(jīng)口腔免疫100μg重組尿素酶加佐劑(CT)，分四次完成，每周一次。對照小鼠只接受佐劑。每組3只小鼠在末次免疫后的第3、7、14或21天時分別作尸檢。從腸道上取下集合淋巴結(jié)(Peyer’s結(jié))，在40-70％的Percoll梯度上分離出固有層淋巴細(xì)胞(LPL)。IgA陽性B細(xì)胞用96孔濾板上的EUSPOT試驗檢測，板上包被了1μg/孔的重組尿素酶并用牛血清白蛋白封閉。10倍系列稀釋的LPL加入小孔中，起始孔有1×106細(xì)胞。IgA陽性ASC檢測如下加生物素標(biāo)記的抗小鼠IgA試劑，再加鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶，顯微鏡下計數(shù)陽性細(xì)胞。
末次免疫后僅3天就在腸固有層中用ELISPOT發(fā)現(xiàn)了抗尿素酶的IgA陽性ASC，第7天達(dá)到峰值，隨后開始減少(表8)。尿素酶特異性ASC代表了免疫組織化學(xué)所觀察到的全部IgA陽性細(xì)胞的10％左右。雙色免疫熒光顯微鏡觀察證實尿素酶特異性ASC也是IgA陽性。這些觀測結(jié)果證實口腔抗原刺激后，在腸粘膜水平上發(fā)生了強烈的抗尿素酶IgA應(yīng)答。該應(yīng)答的時間進(jìn)程和動力學(xué)類似于對其它口服疫苗的描述(Czerkinsky等人，《感染與免疫》1991年59卷996-1001頁；McGhee和Kyono，《傳染原人類疾病》1993年2卷55-73頁)。
表8口服重組尿素酶免疫后對于抗尿素酶IgA分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)動力學(xué)
a末次口服免疫后的天數(shù)。
b霍亂毒素。
c平行孔的平均值(孔內(nèi)含有來自3只不同小鼠的腸淋巴細(xì)胞)。
為確定IgA陽性細(xì)胞是否補充到胃粘膜中，如上述經(jīng)免疫組織化學(xué)檢查了口服免疫小鼠的胃。IgA陽性細(xì)胞在僅進(jìn)行了免疫的小鼠和對照小鼠的胃粘膜中其實并未出現(xiàn)，這說明胃部處于免疫“沉默”狀態(tài)，直至受螺桿菌攻擊來刺激它打破此狀態(tài)。
胃在已攻擊的免疫小鼠體內(nèi)作為免疫效應(yīng)器官的作用受到檢查。小鼠以一周間隔共4次口服總量為200μg的重組尿素酶及10μg的CT。對照小鼠只服CT。免疫一周后，攻擊小鼠。攻擊前及攻擊后第7、14、28、70和133天時對小鼠進(jìn)行尸檢。
攻擊前未發(fā)現(xiàn)IgA陽性ASC。攻擊后的所有間隔時間內(nèi)，IgA陽性細(xì)胞大量出現(xiàn)在免疫小鼠的胃粘膜中，第7天達(dá)峰值(圖14)。IgA陽性ASC數(shù)在未免疫(只給CT)小鼠體內(nèi)非常多，特別是在攻擊后的7-28天內(nèi)。IgA陽性ASC的解剖學(xué)定位也各不一樣，免疫鼠整個粘膜，在腸固有層中和胃體四周都具有細(xì)胞，但很少見于表皮之下。尿素酶特異性和IgA陽性的ASC揭示胃粘膜中絕大多數(shù)尿素酶特異性細(xì)胞均是IgA陽性的。
這些現(xiàn)象說明預(yù)先經(jīng)免疫接種致敏的鼠胃粘膜只有在貓螺桿菌抗原刺激后才變成免疫活化狀態(tài)。導(dǎo)致的組織應(yīng)答特點是快速、強烈、并持續(xù)補充IgA陽性B細(xì)胞，其中大多數(shù)是尿素酶特異性的。該應(yīng)答大大強于攻擊后免疫學(xué)上首次用于實驗的小鼠體內(nèi)的應(yīng)答。且IgA陽性細(xì)胞在免疫小鼠中的定位也不同于免疫學(xué)上首次用于實驗的小鼠，后者以貓螺桿菌攻擊，處于持續(xù)感染狀態(tài)。在胃粘膜中增強的IgA陽性ASC反應(yīng)表明由抗貓螺桿菌攻擊的免疫提供保護(hù)的基礎(chǔ)。這些數(shù)據(jù)與霍亂疫苗的有關(guān)研究一致，在后一研究中攻擊后數(shù)小時后內(nèi)觸發(fā)的記憶性免疫應(yīng)答足以提供保護(hù)(Lycke和Holmgren，《斯堪的納維亞免疫學(xué)雜志》(Scand.J.Immunol.)1987年25卷407-412頁)。胃免疫應(yīng)答與胃部所含細(xì)菌量的相關(guān)性胃組織免疫應(yīng)答與細(xì)菌感染之間的關(guān)系在結(jié)構(gòu)水平上得到解釋。Swiss-Webster小鼠用200μg重組尿素酶和10μg CT分4次每次間隔一周進(jìn)行免疫。末次免疫一周后，用107貓螺桿菌攻擊小鼠。在攻擊后第0、1、7、14、28、70和133天時處死小鼠，用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡檢查評價貓螺桿菌的定位。
攻擊后24小時內(nèi)，免疫鼠和非免疫鼠都有大量的貓螺桿菌分布在胃小凹的腔內(nèi)(圖15)。攻擊后7天內(nèi)，細(xì)菌從免疫小鼠中被清除，但仍大量出現(xiàn)在非免疫鼠的胃小凹和腔內(nèi)。細(xì)菌還與非免疫小鼠粘液分泌細(xì)胞的頂端膜有關(guān)。細(xì)菌從免疫鼠胃粘膜上的清除相關(guān)于胃組織中IgA陽性ASC和抗尿素酶ASC的出現(xiàn)。
這些結(jié)果提示了以下事件的順序1)對免疫鼠攻擊導(dǎo)致貓螺桿菌在胃上皮中短暫停留；2)非免疫鼠持續(xù)感染，而經(jīng)重組尿素酶免疫的小鼠在攻擊后第一周內(nèi)就從胃中清除了細(xì)菌；3)感染的清除相關(guān)于IgA陽性尿素酶特異性ASC向胃粘膜的補充。類似的機理可能成為慢性感染動物從胃粘膜清除細(xì)菌的原因，這些動物均接受治療性免疫。幽門螺桿菌不同株之間尿素酶的抗原保守性各種抗血清結(jié)合幽門螺桿菌的多種臨床分離株的能力受到檢驗?？寡灏∕PA3，一種制備成抗純化幽門螺桿菌尿素酶的超免疫兔血清，還有來自重組尿素酶免疫小鼠的血清和分泌物(胃引流紗布樣本及唾液)?？贵w制品用免疫印跡檢驗，可識別同源幽門螺桿菌菌株(Hp630)，ATCC 43504模式株，及5株臨床分離株，后者是從倫敦St.Bartholomew’s醫(yī)院近五年內(nèi)收治的潰瘍病人中分離得到的。
所有抗血清都識別所有幽門螺桿菌菌株的ureA和ureB亞單位，以及純化的天然和重組幽門螺桿菌尿素酶，天然和重組貓螺桿菌尿素酶，及天然鼬鼠螺桿菌尿素酶。此外，免疫小鼠胃切片和唾液中的尿素酶特異性IgA抗體可與所有幽門螺桿菌菌株的ureA和ureB以及異源性尿素酶反應(yīng)。對ureB的免疫識別強于對ureA的識別。假免疫小鼠未顯示出與任一種尿素酶亞單位有反應(yīng)。這些結(jié)果證明幽門螺桿菌表達(dá)了在抗原性水平上高度保守的尿素酶。因此，幽門螺桿菌菌株間抗原性的不同對于開發(fā)重組尿素酶疫苗并非有意義的因素。用于治療螺桿菌感染的聯(lián)合方法和組合物螺桿菌感染等胃十二指腸感染可以按如下方式處理口服給予疫苗抗原(如幽門螺桿菌尿素酶)和粘膜佐劑，同時還給予一種抗生素、一種抗分泌劑、一種鉍鹽、一種抗酸藥硫糖鋁，或它們的聯(lián)合形式。能與疫苗抗原和佐劑同時給予的這類化合物的實例有抗生素，包括諸如大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、quinolone青霉素，以及它們的衍生物(抗生素中可能用于本發(fā)明的具體實例包括羥氨芐青霉素、甲基紅霉素(clarithromycin)、四環(huán)素、滅滴靈、紅霉素、頭孢呋辛和紅霉素等)；抗分泌劑包括諸如H2-受體拮抗劑(如西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁、尼扎替丁和羅沙替丁，質(zhì)子泵抑制劑(如奧美拉唑、蘭索拉唑和邦托拉唑)，前列腺素類似物(如米索前列腺素和恩前列腺素)，以及抗膽堿能劑(如哌侖西平、替侖西平、甘珀酸和丙谷胺；還有鉍鹽，包括膠態(tài)次檸檬酸鉍、二檸檬酸三鉀鉍鹽、次水楊酸鉍、二檸檬肽(bicitropeptide)和pepto-bismol(見，如，Goodwin等人，《幽門螺桿菌的生物學(xué)和臨床實踐》CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L，366-395頁，1993年；Physician’s Desk Reference，49版，MedicalEconomics Data Production Company，Montvale，New Jersey，1995)。此外，包含有不止一種上文所列組分偶聯(lián)的化合物，如雷尼替丁與次檸檬酸鉍偶聯(lián)，也會被用到。
本發(fā)明的方法和組合物中所用的上列化合物的量對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是易于確定的。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也很容易設(shè)計出治療/免疫程序。如，非疫苗組分可以在第1-14天用藥，而疫苗抗原加佐劑可在第7、14、21和28天用藥。
除尿素酶外，其它螺桿菌抗原也可用于本發(fā)明有關(guān)聯(lián)合治療的方法和組合物中。例如，可使用螺桿菌熱休克蛋白A或B(HspA或HspB；WO 94/26901)，螺桿菌粘附脂蛋白A(AlpA；編碼AlpA的核苷酸序列示于SEQ ID NO6中。對應(yīng)的AlpA氨基酸序列示于SEQ IDNO7)，螺桿菌(如幽門螺桿菌)clpB(clpB由菌株XLOLR HP CP6的質(zhì)粒上插入片段編碼，該菌株保存于蘇格蘭Aberdeen的國家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏中心，指定為NCIMB登記號40748)，或由單克隆抗體IgG50識別的16-19kD螺桿菌抗原(IgG50得自雜交瘤細(xì)胞系#50-G6-B7，這一細(xì)胞株保存于ATCC并指定為ATCC登記號HB-11952)。此外，用Haas等人的轉(zhuǎn)座子穿梭誘變法鑒定的螺桿菌表面暴露或分泌抗原可在本發(fā)明中用作疫苗抗原(Haas等人，《基因》1993年130卷23-31頁；Haas等人，《胃十二指腸病理學(xué)和幽門螺桿菌第六屆專題討論會摘要》，Brussels，1993年9月21-25日，Odenbreit等人，內(nèi)臟，國際胃腸道學(xué)和肝臟學(xué)雜志，胃十二指腸病理學(xué)和幽門螺桿菌第八屆專題討論會摘要，Edinburgh，Scotland，1995年7月7-9日)。該方法中，克隆化的幽門螺桿菌基因在大腸桿菌中用轉(zhuǎn)座子插入誘變法誘變。這些失活基因經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化重新導(dǎo)入幽門螺桿菌。等位置換的結(jié)果產(chǎn)生相應(yīng)的幽門螺桿菌突變子。此方法的一種修改方法中所用轉(zhuǎn)座子攜帶blaM，它是β-內(nèi)酰胺酶基因的一種5′端截斷形式。用這個轉(zhuǎn)座子有利于標(biāo)記可編碼含引導(dǎo)肽的外運蛋白的基因，因而能直接選擇出帶有外運蛋白(如，細(xì)胞表面蛋白，象粘附素、細(xì)胞毒素及其他潛在的細(xì)胞表面毒力因子)突變的克隆，這些克隆均為疫苗抗原的主要候選物。除螺桿菌抗原外，非螺桿菌的胃十二指腸病原菌抗原也可用在防止和/或治療分別由這些病原菌引起的感染的方法和組合物中。本發(fā)明中也可用到含上列抗原的保護(hù)性和/或治療性表位的多肽片段。
本發(fā)明的方法和組合物中使用的佐劑包括粘膜佐劑，如大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、霍亂毒素、艱難桿菌毒素，或其衍生物(如片段，突變子，或有佐劑活性的類毒素)或聯(lián)合形式。如可使用含有艱難桿菌毒素A的794個羧基端氨基酸(如見，Dove等人，出處同上，關(guān)于艱難桿菌毒素A序列)的一種片段。本發(fā)明的組合物和方法中所用疫苗抗原和佐劑的量如上所述。
含有一種疫苗(幽門螺桿菌尿素酶+CT)、一種抗生素(羥氨芐青霉素及一種鉍鹽(pepto-bismol)的組合物對螺桿菌感染的治療效果見下文描述。小鼠螺桿菌感染的聯(lián)合治療在用大約107貓螺桿菌感染了一個月后，小鼠每天一次共14天用羥氨芐青霉素(1.5mg/30g小鼠)和/或pepto-bismol(0.2mg/30g小鼠)，和/或在第7、14、21和28天時給予一種含有100μg重組幽門螺桿菌尿素酶加5μg LT的疫苗組合物(見表9對所用到的聯(lián)合形式的描述)進(jìn)行治療。這些小鼠體內(nèi)的螺桿菌感染在末次處理(第28天)后的一周和四周后用定量胃尿素酶試驗(見上)測定。正如表9所示，最有效的治療方案(細(xì)菌清除率可達(dá)100％)包含了施用一種疫苗(尿素酶加LT)、一種抗生素(羥氨芐青霉素)和一種鉍鹽(pepto-bismol)。
表9貓螺桿菌感染已清除的小鼠百分?jǐn)?shù)治療周數(shù)1周 4羥氨芐青霉素60％ 40％pepto-bismol0％ 0％羥氨芐青霉素+pepto-bismol 80％ 40％疫苗70％ 40％疫苗+羥氨芐青霉素 89％ 56％疫苗+pepto-bismol ～70％疫苗+羥氨芐青霉素+pepto-bismol 100％(疫苗＝尿素酶+佐劑)鑒定病人以便施用重組幽門螺桿菌疫苗本發(fā)明的重組幽門螺桿菌尿素酶疫苗可以用于未感染者作為預(yù)防性措施，或用于已感染螺桿菌患者進(jìn)行抗菌治療。被選出預(yù)防性施用重組尿素酶的人包括任何一名有感染螺桿菌危險的人，這種危險的確定是基于年齡、地理分布或存在某種能使人易感染螺桿菌的狀況。感染的特別高危個體，或有可能被嚴(yán)重感染的人包括發(fā)展中國家的人、發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家的嬰幼兒和兒童、先天或人為胃酸pH值偏低者、潛水艇艇員以及軍人。
接受重組幽門螺桿菌尿素酶疫苗治療的病人包括那些有胃炎或其它可能與幽門螺桿菌感染有關(guān)的胃腸道疾病癥狀的人。與胃炎(一種胃粘膜炎癥)有關(guān)的臨床癥狀包括范圍廣泛的難以確診、又通常治療不當(dāng)?shù)陌Y狀，諸如消化不良、“心燒”消化不良和過度噯氣。在Sleisenger和Fordtran之間有一場關(guān)于胃炎的全面討論，發(fā)表在《胃腸道疾病》第4版第772-902頁，該書由賓夕法尼亞州費城的Sauders出版公司于1989年出版。
胃腸道紊亂的患者也可施用本發(fā)明的疫苗來進(jìn)行治療。胃腸道紊亂包括任何一種屬于人或其它哺乳動物胃腸道的疾病或其它紊亂。如胃腸道紊亂可包括未表現(xiàn)為胃粘膜潰瘍的紊亂(非潰瘍性胃腸道紊亂)，包括慢性或萎縮性胃炎、腸胃炎、非潰瘍性消化不良、食管反流病、胃功能紊亂和消化性潰瘍疾病(如胃和十二脂腸潰瘍)。消化性潰瘍包括食管、胃或十二指腸粘膜表面損傷的形成和潰瘍，而且通常表現(xiàn)出的特點是因消化性酸、胃蛋白酶或其它因素的作用使組織損失。另一方面，可將疫苗施用于無癥狀的人，特別是當(dāng)個體有可能受幽門螺桿菌攻擊或存在某種使個體易感的情況時。
螺桿菌的感染可方便地用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方法診斷，這些方法包括如血清學(xué)，13C呼吸檢測，和/或胃鏡檢查。用干人的純化重組尿素酶的制備配制重組尿素酶的程序包括將尿素酶與某種穩(wěn)定劑(如一種甘露糖醇)結(jié)合，并將制品冷凍干燥(即凍干)。該過程可防止因凝聚和碎裂所致降解。此外，凍干后制品可穩(wěn)定數(shù)月。導(dǎo)致不穩(wěn)定的過程包括在蛋白質(zhì)亞單位間形成二硫鍵，凍干可有效抑制這種過程。
最后一步純化后重組尿素酶被凍干。這種純蛋白制品(約4mg/ml)被置于2％蔗糖中透析，再將透析過的溶液移入凍干用小瓶。小瓶中的溶液可以(1)在液氮中冷凍，再置入凍千機內(nèi)，或(2)冷至4℃，再放入凍干機，在其中被凍至-40℃或更低溫度。凍干按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。凍千制品可用水重配。對病人用藥的方式重組幽門螺桿菌尿素酶被施用至病人粘膜表面，以刺激粘膜免疫應(yīng)答，從而對隨后的螺桿菌攻擊提供有效的保護(hù)作用，和/或有效地促進(jìn)對已有螺桿菌感染的清除。優(yōu)選給予重組尿素酶以激發(fā)粘膜免疫應(yīng)答，該應(yīng)答與抗尿素酶抗體的產(chǎn)生和/或淋巴細(xì)胞對胃粘膜的浸潤相關(guān)。重組尿素酶可被用于病人的任一種粘膜表面。優(yōu)選的粘膜表面有鼻內(nèi)、口腔和直腸粘膜(如用肛門栓劑)。除了用于單一粘膜表面外，本發(fā)明的疫苗還可應(yīng)用于粘膜表面的組合(如，口腔加直腸、口腔加鼻內(nèi)、或直腸加鼻內(nèi))?？谇挥盟帟r，優(yōu)選用藥方式為將疫苗吞服，但疫苗也可以漱口劑形式給予，從而刺激口腔粘膜表面免疫應(yīng)答，而無需將疫苗吞服。另一方面，以諸如滴眼液或眼內(nèi)植入的形式將疫苗用于眼的粘膜表面可產(chǎn)生全身性粘膜免疫應(yīng)答。
施用給病人作預(yù)防性治療或抗菌治療的重組幽門螺桿菌尿素酶所用劑量可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。一般來說，劑量為約10μg到1000mg重組幽門螺桿菌尿素酶，例如10mg到500mg，30mg到120mg，40mg到70mg，或60mg。
用于病人的重組幽門螺桿菌尿素酶不少于一劑，例如用至少兩劑、至少四劑或高達(dá)六劑甚至更多的總劑量。在末次免疫后間隔一周或兩周給予加強劑量的重組尿素酶較為理想，通常一個加強免疫劑量含有少于或等于初次給予的重組幽門螺桿菌尿素酶劑量。例如疫苗方案可以是分4劑使用，每次間隔一周。初始劑量和加強劑量可用在相同或不同的粘膜表面。就不同粘膜表面來說，例如口腔初始劑接下來可以是鼻內(nèi)或直腸的加強劑，鼻內(nèi)初始劑接下來可以是口腔或直腸的加強劑，或直腸初始劑接下來可以是口腔或鼻內(nèi)加強劑。
重組幽門螺桿菌尿素酶可與一種粘膜佐劑一同給藥。該粘膜佐劑可以是本領(lǐng)域已知適用于人的任一種佐劑。如，粘膜佐劑可以是霍亂毒素(CT)，腸產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱毒素(LT)，或CT或LT的保留有佐劑活性的一種衍生物、亞單位或片段。與重組幽門螺桿菌尿素酶一同使用的粘膜佐劑其量足以引發(fā)或增強粘膜免疫應(yīng)答，尤其是體液和/或粘膜免疫應(yīng)答。佐劑與重組尿素酶之比由本領(lǐng)域的技術(shù)人員用標(biāo)準(zhǔn)方法確定。例如，佐劑比例可以是1份佐劑比10份重組尿素酶。
在用重組幽門螺桿菌尿素酶之前可以用一種緩沖劑中和胃酸或提高胃酸的pH值。任何能有效提高胃酸pH并適合人用的緩沖劑都可以使用。例如，可用碳酸氫鈉緩沖劑、碳酸氫鉀緩沖劑和磷酸鈉緩沖劑。至于口腔給藥方式，疫苗可不含緩沖劑，即在給病人接種重組尿素酶疫苗之前或同時，不使用能有效影響胃酸pH的pH提升用緩沖劑化合物。
含有重組尿素酶的疫苗制劑可含有多種其他組分，包括穩(wěn)定劑、調(diào)味劑(加糖)，或當(dāng)疫苗用于抗菌治療時，包括其它能有效促進(jìn)感染性細(xì)菌的清除和/或消化的化合物。
用于預(yù)防性治療時，含有重組幽門螺桿菌尿素酶的疫苗可在接觸螺桿菌或該菌的感染建立之前任一時間使用。因該疫苗也可作抗菌治療，故若有臨界跡象或懷疑已存在螺桿菌感染(如無癥狀感染)時，也可毫無顧慮地使用該疫苗。
用疫苗作抗菌治療時，可在癥狀出現(xiàn)之前、期間或之后的任一時間給予重組幽門螺桿菌尿素酶，上述癥狀與螺桿菌感染或胃炎、消化性潰瘍或其它胃腸道紊亂有關(guān)。開始治療前可通過下述方法確證螺桿菌感染的診斷，但這并非是必需的，確證方法如13C呼吸檢驗、血清學(xué)、胃鏡、活檢或其它本領(lǐng)域已知的螺桿菌檢測法。免疫病人的進(jìn)程可用常規(guī)醫(yī)療評價方法監(jiān)測，即通過血清學(xué)、13C呼吸檢驗和/或胃鏡檢查篩選幽門螺桿菌感染。對人類使用重組幽門螺桿菌尿素酶的實施例一種疫苗組成如下在總體積15ml的水(內(nèi)含2％重量/體積比的蔗糖，pH 7.5)中含60mg重組幽門螺桿菌尿素酶，將該疫苗經(jīng)口腔給予病人。疫苗每周使用一次，一共4次。每天由病人記錄癥狀。為檢查副作用，醫(yī)生在使用疫苗期間每周一次，并在末次免疫的一周和1個月后進(jìn)行探訪。在血清和唾液中測量抗尿素酶抗體，末次免疫后第7天采集外周血監(jiān)測抗體分泌型細(xì)胞。序列表(1)一般資料(i)申請人OraVax，Inc.
(ii)發(fā)明名稱多體、重組尿素酶疫苗(iii)序列數(shù)7(iv)通訊地址(A)聯(lián)系人Fish &amp; Richardson P.C(B)街道225 Franklin Street(C)城市Boston(D)州MA(E)國家USA(F)郵編02110-2804(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朠CT/US96/---(B)申請日1996.4.23(C)類別(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/431,04 1(B)申請日1995.4.28(C)分類(vii)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?8/568,122(B)申請日1995.12.6(C)分類(viii)代理人/代理機構(gòu)資料(A)姓名Clark，Paul T(B)登記號30,162
(C)參考/備案號06132/020001(ix)電信資料(A)電話(617)542-5070(B)電傳(617)542-8906(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長度2735堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO1TAATACGACT CACTATAGGG GAATTGTGAG CGGATAACAA TTCATCCACC TTGATTGCGT 60TATGTCTTCA AGGAAAAACA CTTTAAGAAT AGGAGAATGA GATGAAACTC ACCCCAAAAG 120AGTTAGATAA GTTGATGCTC CACTACGCTG GAGAATTGGC TAAAAAACGC AAAGAAAAAG 180GCATTAAGCT TAACTATGTA GAAGCAGTAG CTTTGATTAG TGCCCATATT ATGGAAGAAG 240CGAGAGCTGG TAAAAAGACT GCGGCTGAAT TGATGCAAGA AGGGCGCACT CTTTTAAAAC 300CAGATGATGT GATGGATGGC GTGGCAAGCA TGATCCATGA AGTGGGTATT GAAGCGATGT 360TTCCTGATGG GACTAAACTC GTAACCGTGC ATACCCCTAT TGAGGCCAAT GGTAAATTAG 420TTCCTGGTGA GTTGTTCTTA AAAAATGAAG ACATCACTAT CAACGAAGGC AAAAAAGCCG 480TTAGCGTGAA AGTTAAAAAT GTTGGCGACA GACCGGTTCA AATCGGCTCA CACTTCCATT 540TCTTTGAAGT GAATAGATGC CTAGACTTTG ACAGAGAAAA AACTTTCGGT AAACGCTTAG 600ACATTGCGAG CGGGACAGCG GTAAGATTTG AGCCTGGCGA AGAAAAATCC GTAGAATTGA 660TTGACATTGG CGGTAACAGA AGAATCTTTG GATTTAACGC ATTGGTTGAT AGACAAGCAG 720ACAACGAAAG CAAAAAAATT GCTTTACACA GAGCTAAAGA GCGTGGTTTT CATGGCGCTA 780AAAGCGATGA CAACTATGTA AAAACAATTA AGGAGTAAGA AATGAAAAAG ATTAGCAGAA 840AAGAATATGT TTCTATGTAT GGTCCTACTA CAGGCGATAA AGTGAGATTG GGCGATACAG 900ACTTGATCGC TGAAGTAGAA CATGACTACA CCATTTATGG CGAAGAGCTT AAATTCGGTG 960GCGGTAAAAC CCTAAGAGAA GGCATGAGCC AATCTAACAA CCCTAGCAAA GAAGAGTTGG 1020ATTTAATTAT CACTAACGCT TTAATCGTGG ATTACACCGG TATTTATAAA GCGGATATTG 1080GTATTAAAGA TGGCAAAATC GCTGGCATTG GTAAAGGCGG TAACAAAGAC ATGCAAGATG 1140GCGTTAAAAA CAATCTTAGC GTAGGTCCTG CTACTGAAGC CTTAGCCGGT GAAGGTTTGA 1200TCGTAACGGC TGGTGGTATT GACACACACA TCCACTTCAT TTCACCCCAA CAAATCCCTA 1260CAGCTTTTGC AAGCGGTGTA ACAACCATGA TTGGTGGTGG AACCGGTCCT GCTGATGGCA 1320CTAATGCGAC TACTATCACT CCAGGCAGAA GAAATTTAAA ATGGATGCTC AGAGCGGCTG 1380AAGAATATTC TATGAATTTA GGTTTCTTGG CTAAAGGTAA CGCTTCTAAC GATGCGAGCT 1440TAGCCGATCA AATTGAAGCC GGTGCGATTG GCTTTAAAAT TCACGAAGAC TGGGGCACCA 1500CTCCTTCTGC AATCAATCAT GCGTTAGATG TTGCGGACAA ATACGATGTG CAAGTCGCTA 1560TCCACACAGA CACTTTGAAT GAAGCCGGTT GTGTAGAAGA CACTATGGCT GCTATTGCTG 1620GACGCACTAT GCACACTTTC CACACTGAAG GCGCTGGCGG CGGACACGCT CCTGATATTA 1680TTAAAGTAGC CGGTGAACAC AACATTCTTC CCGCTTCCAC TAACCCCACC ATCCCTTTCA 1740CCGTGAATAC AGAAGCAGAG CACATGGACA TGCTTATGGT GTGCCACCAC TTGGATAAAA 1800GCATTAAAGA AGATGTTCAG TTCGCTGATT CAAGGATCCG CCCTCAAACC ATTGCGGCTG 1860AAGACACTTT GCATGACATG GGGATTTTCT CAATCACCAG TTCTGACTCT CAAGCGATGG 1920GCCGTGTGGG TGAAGTTATC ACTAGAACTT GGCAAACAGC TGACAAAAAC AAGAAAGAAT 1980TTGGCCGCTT GAAAGAAGAA AAAGGCGATA ACGACAACTT CAGGATCAAA CGCTACTTGT 2040CTAAATACAC CATTAACCCA GCGATCGCTC ATGGGATTAG CGAGTATGTA GGTTCAGTAG 2100AAGTGGGCAA AGTGGCTGAC TTGGTATTGT GGAGTCCAGC ATTCTTTGGC GTGAAACCCA 2160ACATGATCAT CAAAGGCGGA TTCATTGCGT TAAGCCAAAT GGGCGATGCG AACGCTTCTA 2220TCCCTACCCC ACAACCGGTT TATTACAGAG AAATGTTCGC TCATCATGGT AAAGCTAAAT 2280ACGATGCAAA CATCACTTTT GTGTCTCAAG CGGCTTATGA CAAAGGCATT AAAGAAGAAT 2340TAGGACTTGA AAGACAAGTG TTGCCGGTAA AAAATTGCAG AAATATCACT AAAAAAGACA 2400TGCAATTCAA CGACACTACT GCTCACATTG AAGTCAATCC TGAAACTTAC CATGTGTTCG 2460TGGATGGCAA AGAAGTAACT TCTAAACCAG CCAATAAAGT GAGCTTGGCG CAACTCTTTA 2520GCATTTTCTA GGATTTTTTA GGAGCAACGC TTCCTTAAAT CCTGAATTCG AGCTCCGTCG 2580ACAAGCTTGC GGCCGCACTC GAGCACCACC ACCACCACCA CTGAGATCCG GCTGCTAACA 2640AAGCCCGAAA GGAAGCTGAG TTGGCTGCTG CCACCGCTGA GCAATAACTA GCATAACCCC 2700TTGGGGCCTC TAAACGGGTC TTGAGGGGTT TTTTG 2735(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特征(A)長度238氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQ ID NO2Met Lys Leu Thr Pro Lys Glu Leu Asp Lys Leu Met Leu His Tyr Ala1 5 10 15Gly Glu Leu Ala Lys Lys Arg Lys Glu Lys Gly Ile Lys Leu Asn Tyr20 25 30Val Glu Ala Val Ala Leu Ile Ser Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg35 40 45Ala Gly Lys Lys Thr Ala Ala Glu Leu Met Gln Glu Gly Arg Thr Leu50 55 60Leu Lys Pro Asp Asp Val Met Asp Gly Val Ala Ser Met Ile His Glu65 70 75 80Val Gly Ile Glu Ala Met Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu Val Thr Val85 90 95His Thr Pro Ile Glu Ala Asn Gly Lys Leu Val Pro Gly Glu Leu Phe100 105 110Leu Lys Asn Glu Asp Ile Thr Ile Asn Glu Gly Lys Lys Ala Val Ser115 120 125Val Lys Val Lys Asn Val Gly Asp Arg Pro Val Gln Ile Gly Ser His130 135 140Phe His Phe Phe Glu Val Asn Arg Cys Leu Asp Phe Asp Arg Glu Lys145 150 155 160Thr Phe Gly Lys Arg Leu Asp Ile Ala Ser Gly Thr Ala Val Arg Phe165 170 175Glu Pro Gly Glu Glu Lys Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn180 185 190Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Arg Gln Ala Asp Asn195 200 205Glu Ser Lys Lys Ile Ala Leu His Arg Ala Lys Glu Arg Gly Phe His210 215 220Gly Ala Lys Ser Asp Asp Asn Tyr Val Lys Thr Ile Lys Glu225 230 235(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特征(A)長度566氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQ ID NO3Met Lys Lys Ile Ser Arg Lys Glu Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro Thr1 5 10 15Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu Ile Ala Glu Val20 25 30Glu His Asp Tyr Thr Ile Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly Gly35 40 45Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gln Ser Asn Asn Pro Ser Lys Glu50 55 60Glu Leu Asp Leu Ile Ile Thr Asn Ala Leu Ile Val Asp Tyr Thr Gly65 70 75 80Ile Tyr Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Ala Gly Ile85 90 95Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met Gln Asp Gly Val Lys Asn Asn Leu100 105 110Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val115 120 125Thr Ala Gly Gly Ile Asp Thr His Ile His Phe Ile Ser Pro Gln Gln130 135 140Ile Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met Ile Gly Gly Gly145 150 155 160Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg165 170 175Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn180 185 190Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala195 200 205Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp210 215 220Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys225 230 235 240Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly245 250 255Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala Ile Ala Gly Arg Thr Met His Thr260 265 270Phe His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys275 280 285Val Ala Gly Glu His Asn Ile Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr Ile290 295 300Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met Val305 310 315 320Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp325 330 335Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp340 345 350Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg355 360 365Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys370 375 380Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn Phe385 390 395 400Arg Ile Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala405 410 415His Gly Ile Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val Ala420 425 430Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn Met435 440 445Ile Ile Lys Gly Gly Phe Ile Ala Leu Ser Gln Met Gly Asp Ala Asn450 455 460Ala Ser Ile Pro Thr Pro Gln Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe Ala465 470 475 480His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn Ile Thr Phe Val Ser Gln485 490 495Ala Ala Tyr Asp Lys Gly Ile Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg Gln500 505 510Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn Ile Thr Lys Lys Asp Met Gln515 520 525Phe Asn Asp Thr Thr Ala His Ile Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr His530 535 540Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys Val545 550 555 560Ser Leu Ala Gln Leu Phe565(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長度28堿基對(B)類型核酸(C)鏈型二者(D)拓?fù)錁?gòu)型二者(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO4CGGGATCCAC CTTGATTGCG TTATGTCT 28(2)SEQ ID NO5資料(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)鏈型二者(D)拓?fù)錁?gòu)型二者(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO5CGGAATTCAG GATTTAAGGA AGCGTTG27(2)SEQ ID NO6資料(i)序列特征(A)長度1557堿基對(B)類型核酸(C)鏈型二者(D)拓引構(gòu)型二者(ii)分子類型cDNA(xi)序列表述SEQ ID NO6ATGATAAAAA AGAATAGAAC GCTGTTTCTT AGTCTAGCCC TTTGCGCTAG CATAAGTTAT 60GCCGAAGATG ATGGAGGGTT TTTCACCGTC GGTTATCAGC TCGGGCAAGT CATGCAAGAT 120GTCCAAAACC CAGGCGGCGC TAAAAGCGAC GAACTCGCCA GAGAGCTTAA CGCTGATGTA 180ACGAACAACA TTTTAAACAA CAACACCGGA GGCAACATCG CAGGGGCGTT GAGTAACGCT 240TTCTCCCAAT ACCTTTATTC GCTTTTAGGG GCTTACCCCA CAAAACTCAA TGGTAGCGAT 300GTGTCTGCGA ACGCTCTTTT AAGTGGTGCG GTAGGCTCTG GGACTTGTGC GGCTGCAGGG 360ACGGCTGGTG GCACTTCTCT TAACACTCAA AGCACTTGCA CCGTTGCGGG CTATTACTGG 420CTCCCTAGCT TGACTGACAG GATTTTAAGC ACGATCGGCA GCCAGACTAA CTACGGCACG 480AACACCAATT TCCCCAACAT GCAACAACAG CTCACCTACT TGAATGCGGG GAATGTGTTT 540TTTAATGCGA TGAATAAGGC TTTAGAGAAT AAGAATGGAA CTAGTAGTGC TAGTGGAACT 600AGTGGTGCGA CTGGTTCAGA TGGTCAAACT TACTCCACAC AAGCTATCCA ATACCTTCAA 660GGCCAACAAA ATATCTTAAA TAACGCAGCG AACTTGCTCA AGCAAGATGA ATTGCTCTTA 720GAAGCTTTCA ACTCTGCCGT AGCCGCCAAC ATTGGGAATA AGGAATTCAA TTCAGCCGCT 780TTTACAGGTT TGGTGCAAGG CATTATTGAT CAATCTCAAG CGGTTTATAA CGAGCTCACT 840AAAAACACCA TTAGCGGGAG TGCGGTTATT AGCGCTGGGA TAAACTCCAA CCAAGCTAAC 900GCTGTGCAAG GGCGCGCTAG TCAGCTCCCT AACGCTCTTT ATAACGCGCA AGTAACTTTG 960GATAAAATCA ATGCGCTCAA TAATCAAGTG AGAAGCATGC CTTACTTGCC CCAATTCAGA 1020GCCGGGAACA GCCGTTCAAC GAATATTTTA AACGGGTTTT ACACCAAAAT AGGCTATAAG 1080CAATTCTTCG GGAAGAAAAG GAATATCGGT TTGCGCTATT ATGGTTTCTT TTCTTATAAC 1140GGAGCGAGCG TGGGCTTTAG ATCCACTCAA AATAATGTAG GGTTATACAC TTATGGGGTG 1200GGGACTGATG TGTTGTATAA CATCTTTAGC CGCTCCTATC AAAACCGCTC TGTGGATATG 1260GGCTTTTTTA GCGGTATCCA ATTAGCCGGT GAGACCTTCC AATCCACGCT CAGAGATGAC 1320CCCAATGTGA AATTGCATGG GAAAATCAAT AACACGCACT TCCAGTTCCT CTTTGACTTC 1380GGTATGAGGA TGAACTTCGG TAAGTTGGAC GGGAAATCCA ACCGCCACAA CCAGCACACG 1440GTGGAATTTG GCGTAGTGGT GCCTACGATT TATAACACTT ATTACAAATC AGCAGGGACT 1500ACCGTGAAGT ATTTCCGTCC TTATAGCGTT TATTGGTCTT ATGGGTATTC ATTCTAA 1557(2)SEQ ID NO7資料(i)序列特征(A)長度518氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)錁?gòu)型線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列表述SEQ ID NO7Met Ile Lys Lys Asn Arg Thr Leu Phe Leu Ser Leu Ala Leu Cys Ala1 5 10 15Ser Ile Ser Tyr Ala Glu Asp Asp Gly Gly Phe Phe Thr Val Gly Tyr20 25 30Gln Leu Gly Gln Val Met Gln Asp Val Gln Asn Pro Gly Gly Ala Lys35 40 45Ser Asp Glu Leu Ala Arg Glu Leu Asn Ala Asp Val Thr Asn Asn Ile50 55 60Leu Asn Asn Asn Thr Gly Gly Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ser Asn Ala65 70 75 80Phe Ser Gln Tyr Leu Tyr Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Pro Thr Lys Leu85 90 95Asn Gly Ser Asp Val Ser Ala Asn Ala Leu Leu Ser Gly Ala Val Gly100 105 110Ser Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Ser Leu Asn115 120 125Thr Gln Ser Thr Cys Thr Val Ala Gly Tyr Tyr Trp Leu Pro Ser Leu130 135 140Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Ile Gly Ser Gln Thr Asn Tyr Gly Thr145 150 155 160Asn Thr Asn Phe Pro Asn Met Gln Gln Gln Leu Thr Tyr Leu Asn Ala165 170 175Gly Asn Val Phe Phe Asn Ala Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Lys Asn180 185 190Gly Thr Ser Ser Ala Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ser Asp Gly195 200 205Gln Thr Tyr Ser Thr Gln Ala Ile Gln Tyr Leu Gln Gly Gln Gln Asn210 215 220Ile Leu Asn Asn Ala Ala Asn Leu Leu Lys Gln Asp Glu Leu Leu Leu225 230 235 240Glu Ala Phe Asn Ser Ala Val Ala Ala Asn Ile Gly Asn Lys Glu Phe245 250 255Asn Ser Ala Ala Phe Thr Gly Leu Val Gln Gly Ile Ile Asp Gln Ser260 265 270Gln Ala Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Asn Thr Ile Ser Gly Ser Ala275 280 285Val Ile Ser Ala Gly Ile Asn Ser Asn Gln Ala Asn Ala Val Gln Gly290 295 300Arg Ala Ser Gln Leu Pro Asn Ala Leu Tyr Asn Ala Gln Val Thr Leu305 310 315 320Asp Lys Ile Asn Ala Leu Asn Asn Gln Val Arg Ser Met Pro Tyr Leu325 330 335Pro Gln Phe Arg Ala Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asn Ile Leu Asn Gly340 345 350Phe Tyr Thr Lys Ile Gly Tyr Lys Gln Phe Phe Gly Lys Lys Arg Asn355 360 365Ile Gly Leu Arg Tyr Tyr Gly Phe Phe Ser Tyr Asn Gly Ala Ser Val370 375 380Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asn Asn Val Gly Leu Tyr Thr Tyr Gly Val385 390 395 400Gly Thr Asp Val Leu Tyr Asn Ile Phe Ser Arg Ser Tyr Gln Asn Arg405 410 415Ser Val Asp Met Gly Phe Phe Ser Gly Ile Gln Leu Ala Gly Glu Thr420 425 430Phe Gln Ser Thr Leu Arg Asp Asp Pro Asn Val Lys Leu His Gly Lys435 440 445Ile Asn Asn Thr His Phe Gln Phe Leu Phe Asp Phe Gly Met Arg Met450 455 460Asn Phe Gly Lys Leu Asp Gly Lys Ser Asn Arg His Asn Gln His Thr465 470 475 480Val Glu Phe Gly Val Val Val Pro Thr Ile Tyr Asn Thr Tyr Tyr Lys485 490 495Ser Ala Gly Thr Thr Val Lys Tyr Phe Arg Pro Tyr Ser Val Tyr Trp500 505 510Ser Tyr Gly Tyr Ser Phe51權(quán)利要求
1.一種用于在病人體內(nèi)誘導(dǎo)對螺桿菌的粘膜免疫應(yīng)答的疫苗，該疫苗包括a)重組、無酶活性的螺桿菌尿素酶多體復(fù)合物；及b)一種藥用載劑或稀釋劑。
2.權(quán)利要求1的疫苗，包括一種含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物，一種含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物及一種含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物，或它們的混合物。
3.權(quán)利要求1的疫苗，包括一種含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物，一種含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物及一種含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物。
4.權(quán)利要求1的疫苗，其中還包括一種粘膜佐劑。
5.權(quán)利要求1的疫苗，其中粘膜佐劑是腸產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、艱難桿菌毒素、它們的缺乏毒性但仍有佐劑活性的亞單位或衍生物，或它們的混合物。
6.權(quán)利要求4的疫苗，其中粘膜佐劑是腸產(chǎn)毒性大腸桿菌不耐熱腸毒素或它的失去毒性但保留佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
7.權(quán)利要求4的疫苗，其中粘膜佐劑是霍亂毒素或它的喪失毒性但保留佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
8.權(quán)利要求4的疫苗，其中粘膜佐劑是艱難桿菌毒素，或它的失去毒性但保留佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
9.權(quán)利要求8的疫苗，其中粘膜佐劑包括艱難桿菌毒素A的糖結(jié)合區(qū)。
10.權(quán)利要求1的疫苗，其中重組、無酶活性螺桿菌尿素酶的多體復(fù)合物已經(jīng)凍干。
11.權(quán)利要求1的疫苗，其中螺桿菌尿素酶是幽門螺桿菌尿素酶。
12.一種用于治療病人的胃十二指腸感染的組合物，該組合物包括(a)來自胃十二指腸病原菌的一種抗原，及(b)一種抗生素、一種抗分泌劑、一種鉍鹽，或它們的組合形式。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中胃十二指腸病原菌是螺桿菌。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中螺桿菌是幽門螺桿菌。
15.權(quán)利要求13的組合物，其中抗原是一種尿素酶。
16.權(quán)利要求13的組合物，其中抗原包括重組、無酶活性螺桿菌尿素酶的多體復(fù)合物。
17.權(quán)利要求13的組合物，包括一種含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物，一種含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物及一種含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物，或它們的混合物。
18.權(quán)利要求13的組合物，包括一種含8個尿素酶A亞單位和8個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物，一種含6個尿素酶A亞單位和6個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物及一種含4個尿素酶A亞單位和4個尿素酶B亞單位的多體復(fù)合物。
19.權(quán)利要求12的組合物，其中螺桿菌感染是幽門螺桿菌感染。
20.權(quán)利要求12的組合物，其中包括一種粘膜佐劑。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中粘膜佐劑是腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的不耐熱腸毒素、霍亂毒素、艱難桿菌毒素，或它們的失去毒性但仍有佐劑活性的亞單位或衍生物，或它們的混合物。
22.權(quán)利要求20的組合物，其中粘膜佐劑是腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的不耐熱腸毒素，或它的失去毒性但仍有佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
23.權(quán)利要求20的組合物，其中粘膜佐劑是霍亂毒素，或其失去毒性但仍有佐劑活性的一種亞單位或衍生物。
24.權(quán)利要求20的組合物，其中粘膜佐劑是艱難桿菌毒素，或其失去毒性但仍有佐劑活性的衍生物。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中粘膜佐劑包括艱難桿菌毒素A的糖結(jié)合區(qū)。
26.權(quán)利要求12的組合物，其中抗生素選自羥氨芐青霉素、甲基紅霉素、四環(huán)素、滅滴靈和紅霉素。
27.權(quán)利要求12的組合物，其中鉍鹽選自次檸檬酸鉍和次水楊酸鉍。
28.權(quán)利要求12的組合物，其中抗分泌劑是一種質(zhì)子泵抑制劑。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中質(zhì)子泵抑制劑選自奧美拉唑、蘭索拉唑和邦托拉唑。
30.權(quán)利要求12的組合物，其中抗分泌劑是一種H2受體拮抗劑。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中H2受體拮抗劑選自雷尼替丁、西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁和羅沙替丁。
32.權(quán)利要求12的組合物，其中抗分泌劑是一種前列腺素類似物。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中前列腺素類似物是米索前列腺素或恩前列腺素。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于預(yù)防和/或治療螺桿菌(如幽門螺桿菌)感染的方法和組合物。用于本發(fā)明的方法(該方法包括經(jīng)粘膜施用這些組合物)的本發(fā)明的組合物,包括含有存在于藥用載體或稀釋劑中的重組無酶活性螺桿菌尿素酶的多體復(fù)合物的組合物;和含有(a)一種螺桿菌抗原,及(b)一種抗生素,一種抗分泌劑,一種鉍鹽,或其聚合形式的組合物。
文檔編號C12N9/14GK1188416SQ96194986
公開日1998年7月22日 申請日期1996年4月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月25日
發(fā)明者C·K·李, T·P·莫納思, S·K·阿克爾曼, 小W·D·湯馬斯, G·索曼, H·克利叟斯, R·A·維爾茲, J·帕波, T·愛爾馬克, F·規(guī)拉克產(chǎn), H·哈加特, I·蘇斯曼 申請人:奧拉瓦克斯有限公司