專利名稱：：抗丙型肝炎病毒的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的疫苗制劑，它們的生產(chǎn)方法及其在醫(yī)藥中的應(yīng)用。從GB2220211(Ribi)中已知3脫-O-?；?單磷酰脂A，就其化學(xué)意義上說(shuō)，它是3脫-O-?；?單磷酰脂A與4，5或6酰化鏈的混合物，由RibiImmunochemMontana制備。3脫-O-?；?單磷酰脂A的優(yōu)選形式公開(kāi)于國(guó)際專利申請(qǐng)No.92/116556中。QS21是得自南美樹(shù)種QuillajaSaponariaMolina樹(shù)皮皂苷的Hplc純化的無(wú)毒級(jí)分，其生產(chǎn)方法公開(kāi)于(作為QA21)US專利No.5,057,540中。水包油乳劑本身是本
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已知的，已被建議用作佐劑組合物(EPO399843)。丙型肝炎病毒描述于EP-A-0318216。丙型肝炎病毒的特殊抗原蛋白被稱為核心蛋白，被描述于例如Delisse等，肝臟病學(xué)雜志(J.Hepatology)，1991；13(Suppl.4)S20-S23(基因型1b)，丙型肝炎病毒的特殊包膜蛋白被稱為E1和E2，被描述于例如Grakoui等，(J.Virology)67，1385-1395；Spacte等，1992，病毒學(xué)(Virology)188，819-830；Matsumia等，病毒學(xué)雜志(J.Virology)66，1425-1431，和Kohara等，1992，病毒遺傳學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)73，2313-2318。至今已被鑒定的大多數(shù)HCV基因型描述于OkamotoHiroaki和MishiroShunji，Intervirology，1994，3768以及下列等等。本發(fā)明提供了含有QS21，3脫-O-?；?單磷酰脂A(3D-MPL)水包油乳劑的疫苗組合物，其中水包油乳劑具有下列組分如角鯊烯的可代謝的油類，α生育酚和吐溫80，和至少一種選自下列組中的免疫原(a)丙型肝炎病毒的核心蛋白或其免疫原性的衍生物，以及(b)丙型肝炎病毒的包膜蛋白或其免疫原性的衍生物。術(shù)語(yǔ)“免疫原性的衍生物”包含任何分子，如內(nèi)部施用于人之后，保留了誘導(dǎo)對(duì)此蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答能力的蛋白質(zhì)的截短或其他衍生物。通過(guò)氨基酸的加入，缺失，替換，或重排或通過(guò)對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾可制備這種其他衍生物。通過(guò)表達(dá)適當(dāng)?shù)幕蚱位蛲ㄟ^(guò)肽合成，例如使用Merrifield合成(肽，第2冊(cè)，學(xué)術(shù)出版社，NY，第3頁(yè))可制備能用于制備亞單位疫苗的蛋白質(zhì)的免疫原性片段。本發(fā)明的免疫原性衍生物可以是雜合的，即為含有附加序列的融合多肽，所述序列攜有其他免疫原的一個(gè)和多個(gè)表位。另外，本發(fā)明的免疫原性衍生物可以與載體多肽或另一個(gè)載體融合，所述載體具有免疫刺激特性，如佐劑存在的情況下，或另外還加強(qiáng)了對(duì)蛋白質(zhì)或其衍生物的免疫應(yīng)答，或可用于表達(dá)，純化或配制蛋白質(zhì)或其衍生物。本發(fā)明還涉及使用常規(guī)連接劑如戊二醛與大分子化學(xué)綴合的HCV蛋白或其免疫原性的衍生物(Geerlings等，(1988)免疫學(xué)方法雜志(J，Immunol.Methods)，106，239-244)。通過(guò)在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述蛋白質(zhì)或其衍生物的DNA并回收產(chǎn)物，然后任選地制備其衍生物可制備適用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)和其免疫原性的衍生物。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)，如通過(guò)D.M.Roberts等人在Biochemistry1985，24，5090-5098中描述的酶連接法，通過(guò)化學(xué)合成，體外酶聚合反應(yīng)或通過(guò)這些技術(shù)的聯(lián)合可以合成含有這種編碼序列的DNA分子。使用如DNA聚合酶I(Klenow片段)的DNA聚合酶，在含有所需的核苷三磷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP的適當(dāng)緩沖液中，在10℃-37℃的溫度下，一般在50ml或更小的體積中的體外酶聚合反應(yīng)。使用如T4DNA連接酶的DNA連接酶，在如0.05MTris(pH7.4)，0.01MMgCl2，0.01M二硫蘇糖醇，1mM亞精胺，1mMATP和0.1mg/ml牛血清白蛋白的適當(dāng)緩沖液中，在4℃至室溫的溫度下，一般在50ml或更小的體積中進(jìn)行DNA片段的酶連接。通過(guò)常規(guī)的磷酸三酯，亞磷酸酯或亞磷酰胺化學(xué)，使用如基因片段的化學(xué)和酶學(xué)合成-實(shí)驗(yàn)手冊(cè)‘ChemicalandEnzymaticSynthesisofGeneFragments-AlaboratoryManual’(ed.H.G.GassenandA.Lang)，VerlagChemie，Weinheim(1982)或其他科學(xué)出版物，如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat，和R.C.Titmas，核酸研究(NucleicAcidResearch)，1982，10，6243；B.S.SproatandW.Bannwarth，TetrahedronLetters，1983，24，5771；M.D.MatteucciandM.H.Caruthers，TetrahedronLetters，1980，21，719；M.D.MatteucciandM.H.Caruthers，美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志(JoumaloftheAmericanChemicalSociety)，1981，103，3185；S.P.Adams等，美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志(JournaloftheAmericanChemicalSociety)，1983，105，661；N.D.Sinha，生物材料雜志(J.Biemat，)J.McMannus，andH.Koester，核酸研究(NucleicAcidsResearch)，1984，12，4539；andH.Koester，核酸研究(NucleicAcidsResearch)，1984，12，4539；andH.W.D.Matthes等，EMBOJournal，1984，3，801中描述的那些固相技術(shù)可進(jìn)行DNA聚合物或片段的化學(xué)合成。通過(guò)使用如G.Winter等，自然(Nature)1982，299，756-758或Zoller和Smith1982；核酸研究(Nucl，AcidsRes)，10，6487-6500所述的那些常規(guī)方法定點(diǎn)突變，或如Chan和Smith在核酸研究(Nucl.AcidsRes.)，1984，12，2407-2419或G.Winteretal在生物化學(xué)會(huì)通訊(Biochem.Soc.Trarns.)，1984，12，224-225所述的缺失突變可制備編碼突變體的DNA聚合物。重組技術(shù)描述于Maniatis等，MolecularCloning-ALaboratoryManual；ColdSpringHarbor，1982-1989。具體地說(shuō)，可使用下列步驟制備本發(fā)明所用的蛋白質(zhì)或免疫原性的衍生物i)制備可復(fù)制或整合的表達(dá)載體，所述載體能在宿主細(xì)胞中表達(dá)含有可編碼所述蛋白質(zhì)或其免疫原性的衍生物的核苷酸序列的DNA聚合物；ii)用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；iii)在允許表達(dá)所述DNA聚合物的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)；和iv)回收所述蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語(yǔ)‘轉(zhuǎn)化’是指通過(guò)使用如基因工程(GeneticEngineering)；Eds.S.M.Kingsman和A.J.Kingsman；Blackwell科學(xué)出版社；Oxford，England，1988所述的常規(guī)技術(shù)，用適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒或病毒載體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染或感染將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。下文將使用術(shù)語(yǔ)‘經(jīng)轉(zhuǎn)化的’或‘轉(zhuǎn)化子’表示含有和表達(dá)感興趣的外源基因的所得宿主細(xì)胞。通過(guò)裂解與宿主細(xì)胞相容的載體以提供具有完整復(fù)制子的線性DNA片段，在連接條件下，將所述線性片段與一個(gè)或多個(gè)DNA分子以及編碼所需產(chǎn)物的所述線性片段連接能制備可復(fù)制的表達(dá)載體。因此，在所需載體的構(gòu)建過(guò)程中可制備或形成DNA聚合物。載體的選擇部分由宿主細(xì)胞決定，所述宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的，適當(dāng)?shù)妮d體包括質(zhì)粒，噬菌體，粘粒和重組病毒?？赏ㄟ^(guò)如上文提到的Maniatis等人所述的方法，常規(guī)地用適當(dāng)?shù)拿笇?duì)DNA進(jìn)行限制，聚合和連接可制備能復(fù)制的表達(dá)載體。通過(guò)在轉(zhuǎn)化條件下用能復(fù)制的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可制備重組宿主細(xì)胞。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化條件是常規(guī)的，被描述于例如上文提到的Maniatis等或“DNA克隆”Vol.II，D.M.Glovered.，Irl出版公司，1985中。轉(zhuǎn)化條件的選擇取決于宿主細(xì)胞。因此，可用CaCl2溶液(Cohen等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Nat.Acad.Sci.)，1973，69，2110)或用含有RbCl，MnCl2，醋酸鉀和甘油的混合物的溶液，再用3-[N-嗎啉代]-丙烷-磺酸，RbCl和甘油處理如大腸桿菌的細(xì)菌宿主。通過(guò)載體DNA的與CaCl2共-沉淀于細(xì)胞上可轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在允許DNA聚合物表達(dá)的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可按常規(guī)進(jìn)行，例如上文提到的Maniatisetal和“DNA克隆”有述。因此，優(yōu)選給細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)成分并在低于45℃的溫度下培養(yǎng)。根據(jù)宿主細(xì)胞，通過(guò)常規(guī)方法回收產(chǎn)物，因此，當(dāng)宿主細(xì)胞是如大腸桿菌的細(xì)菌時(shí)，可用物理，化學(xué)或酶學(xué)的方法裂解之并從所得裂解物中分離蛋白質(zhì)產(chǎn)物。當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，一般從營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)或無(wú)細(xì)胞提取物中分離產(chǎn)物。常規(guī)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)包括選擇性沉淀，吸收層析和包括單克隆抗體親和柱的親和層析。優(yōu)選宿主細(xì)胞為大腸桿菌。本發(fā)明具體的一方面提供了含有HCV核心蛋白或其免疫原性的衍生物的新的化合物，所述核心蛋白與含外源表位的多肽融合。多肽優(yōu)選為流感病毒的蛋白質(zhì)，如NS1蛋白或其免疫原性的衍生物。編碼這種新化合物的DNA，含有所述DNA的載體，被所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及它們?cè)谏a(chǎn)所述新化合物中的用途構(gòu)成了本發(fā)明要求的另一方面。本發(fā)明的疫苗是IgG2a產(chǎn)生和THl細(xì)胞反應(yīng)的潛在刺激劑。由于已知TH1反應(yīng)對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的影響，因而這是有利的。實(shí)際上在鼠中誘導(dǎo)IgG2a與這種免疫應(yīng)答有關(guān)。本發(fā)明的疫苗加強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)，當(dāng)靶抗原在細(xì)胞內(nèi)合成時(shí)，即在被病毒感染的過(guò)程中容易觀察到CTL的誘導(dǎo)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)蛋白酶裂解分離抗原產(chǎn)生的肽可進(jìn)入適當(dāng)?shù)募庸ね緩?，?dǎo)致與細(xì)胞膜上I類分子相關(guān)的呈遞。然而，一般來(lái)說(shuō)，預(yù)先形成的可溶性抗原不會(huì)到達(dá)此加工和呈遞途徑，不會(huì)產(chǎn)生I類限制的CTL。因此，常規(guī)的滅活疫苗在產(chǎn)生抗體和T輔助細(xì)胞反應(yīng)的同時(shí)，一般不誘導(dǎo)CTL介導(dǎo)的免疫力。兩種佐劑QS21和3D-MPL以及水包油乳劑的聯(lián)合可克服以重組蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗的嚴(yán)重局限，并誘導(dǎo)廣譜的免疫反應(yīng)。在某些系統(tǒng)中，3D-MPL和QS21以及水包油乳劑的聯(lián)合已經(jīng)能協(xié)同增強(qiáng)γ干擾素的產(chǎn)生。水包油乳劑另外可含有山梨糖醇酯85和/或卵磷脂。3脫-O-?；?單磷酰脂A的優(yōu)選形式公開(kāi)于國(guó)際專利申請(qǐng)No.92/116556中(SmithKlineBeechamBiologicalss.a.)。水包油乳劑可以單獨(dú)使用或與其他佐劑或免疫刺激劑一起使用。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了本文所述的可用于醫(yī)藥的疫苗。QS213D-MPL的比例典型地為1∶10至10∶1；優(yōu)選1∶5至5∶1，經(jīng)常實(shí)質(zhì)上為1∶1。最適協(xié)同作用的優(yōu)選范圍為2.5∶1至1∶13D-MPL∶QS21。對(duì)于給人施用的疫苗，其中存在的QS21和3D-MPL的范圍典型地為每劑量1μg-100μg，優(yōu)選為10μg-50μg。水包油乳劑典型地含有2-10％的角鯊烯，2-10％的α生育酚和0.3-3％的吐溫80，優(yōu)選角鯊烯α生育酚的比例等于或小于1，因?yàn)檫@可以提供更穩(wěn)定的乳劑，山梨糖醇酯85也可以以1％的水平存在，在一些情況下，本發(fā)明的疫苗進(jìn)一步含有穩(wěn)定劑是有利的。疫苗的制備一般描述于疫苗發(fā)展和新趨勢(shì)(NewTrendsandDevelopmentsinVaccines)，Voller等編，UniversityPark出版社，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。包入脂質(zhì)體膠囊的技術(shù)描述于例如Fullerton，U.S.專利4,235,877中。蛋白質(zhì)與大分子的綴合公開(kāi)于例如Likhite，U.S.專利4,372,945和Armoretal，U.S.專利4,474,757中。每一疫苗劑量中蛋白質(zhì)的量選定為在典型的疫苗中可誘導(dǎo)免疫保護(hù)反應(yīng)，而沒(méi)有顯著的有害的副作用的量。一般希望每一劑量含有1-1000μg蛋白質(zhì)，優(yōu)選2-100μg。通過(guò)涉及觀察受試者適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的一般性研究可確定特殊疫苗的最適量。首次免疫接種后，受試者可接受一或幾次有充分間隔的加強(qiáng)免疫接種。本發(fā)明的制劑既可用于預(yù)防也可用于治療目的。因此本發(fā)明的一個(gè)方面提供了治療方法，包括給病人施用有效量的本發(fā)明的疫苗。下列實(shí)施例將闡明本發(fā)明。實(shí)施例11.1重組HCV核心融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)質(zhì)粒pMG81是pMG27(Gross等1985，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)51015)的衍生物，其中i)裂解質(zhì)粒pAS1EH/801(Young等，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院桿(Proc.Natl.Acad.Sci.)806105)得到的流感病毒株A/PR/8/34的NS1編碼區(qū)的前81個(gè)密碼子被插入到pL啟動(dòng)子的下游和ii)氨芐青霉素抗性基因被來(lái)自轉(zhuǎn)座子Tn902的卡那霉素抗性基因取代，質(zhì)粒pMG81被用于表達(dá)融合蛋白NS1-Core。PCR擴(kuò)增丙型肝炎病毒基因型1b(Delisse等，1991.肝病學(xué)阿志(J.Hepathology)13，suppl.4S20-23)的HCV基因組序列，將其克隆到pUC12質(zhì)粒上得到質(zhì)粒TCM128-2。從TCM128-2中擴(kuò)增相應(yīng)于核心蛋白氨基酸2-166的核苷酸序列，在聚合酶鏈反應(yīng)過(guò)程中，在核心序列的5’和3’末端產(chǎn)生了NcoI和XbaI限制性位點(diǎn)以允許它插入質(zhì)粒pMG81的相同位點(diǎn)得到pRIT14129。pRIT14129含有融合蛋白NS1(flu)-核心(HCV)的編碼序列并表達(dá)序列1中所述的多肽。融合蛋白NS1(flu)-核心(HCV)的編碼序列示于序列2。序列3表示HCV基因型1a(H)的氨基酸序列1-1006。質(zhì)粒pRIT14129被導(dǎo)入E.coliAR58(Mott等，1985，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci)，8288)中，該菌含有λpL啟動(dòng)子的熱敏感性阻抑蛋白。在30℃下，補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件下，在20升發(fā)酵罐中培養(yǎng)重組細(xì)菌，通過(guò)將溫度升高至38-42℃來(lái)誘導(dǎo)NS1-核心蛋白的表達(dá)，然后收獲細(xì)胞并機(jī)械破碎之。1.2NS1-核心融合蛋白的純化通過(guò)制備性電泳以變性的形式純化抗原步驟1在含有蛋白酶抑制劑(1mMpefabloc，0.5mg/亮肽素，0.1％抑肽酶)的20mM磷酸鹽緩沖液，pH7中破碎(Rannie-2×14,500pi)細(xì)菌細(xì)胞。步驟2以17,000g的轉(zhuǎn)速將裂解物離心25分鐘，在此階段，重組蛋白是不溶性的，應(yīng)在沉淀物中回收，用10mM磷酸鹽pH6.8，2MNaCl，4M尿素將沉淀物洗兩次；用10mM磷酸鹽pH6.8，0.15MNaCl洗三次，每次洗滌步驟后，以17,000g的轉(zhuǎn)速離心25分鐘，引入這些步驟是為了降低純化產(chǎn)物中內(nèi)毒素的含量。步驟3將洗過(guò)的沉淀物重新懸浮于SDS-PAGE還原性樣品緩沖液中，煮沸5分鐘，以27,000g的轉(zhuǎn)速再次離心25分鐘，然后上樣于12％聚丙烯酰胺凝膠以分離保留下來(lái)的蛋白質(zhì)(PrepCellequipment，Biorad)。步驟4在25mMTrispH8，200mM甘氨酸，0.1％SDS中將蛋白質(zhì)從凝膠中電洗脫下來(lái)；在0℃下用10％TCA沉淀，最后重懸浮于10mM磷酸鹽pH6.8，150mMNaCl，50mM十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)中。純化的抗原在27-30KD的范圍內(nèi)出現(xiàn)了兩條帶，兩條帶都能被抗NS1的單克隆抗體以及抗核心的特異性人單克隆抗體和兔多克隆抗體識(shí)別。1.3NSI-核心蛋白的佐劑配制制備了兩種佐劑制劑，每種含有下列水包油乳劑成分。SB265％的角鯊烯5％的生育酚0.4％的吐溫80；顆粒大小為500nmSB625％的角鯊烯5％的生育酚2.0％的吐溫80；顆粒大小為180nm1(a)乳劑SB62的制備(兩倍濃縮)將吐溫80溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中以得到于PBS中的2％溶液，將5gDLα生育酚和5ml角鯊烯徹底地旋渦混合以得到100ml兩倍濃縮的乳劑，加入90mlPBS/吐溫溶液并徹底混合，然后將所得乳劑通過(guò)注射器，最后使用M110S微液器使乳劑微液化，所得油滴的大小約為180nm。1(b)乳劑SB26的制備使用0.4％的吐溫80以相似的方法制備乳劑。1(c)以相似的方法制備表1所示的其他乳劑。1(d)融合蛋白/QS21/3DMPL/水包油制劑的制備。在1a)或b)或c)的乳劑中加入等倍體積的兩倍濃縮的融合蛋白(或20μg或100μg)并混合，將之與50μg/ml的3D-MPL和20μg/ml的QS21聯(lián)合得到最終的制劑，根據(jù)鹽含量和pH來(lái)設(shè)置緩沖液。實(shí)施例22.1重組E1E2寡聚蛋白的制備可從被重組痘苗病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備E1-E2HCV包膜蛋白的寡聚形式，所述病毒將HCV包膜序列表達(dá)成多聚蛋白，使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的技術(shù)將覆蓋HCV基因型1a(H)的氨基酸167-1006的多聚蛋白的編碼序列插入痘苗病毒載體，所得質(zhì)粒用于制備可導(dǎo)致在被感染的細(xì)胞中表達(dá)多聚蛋白的痘苗重組病毒，被表達(dá)的多蛋白被包含和保留在細(xì)胞內(nèi)。使用特殊的去污劑(Ralston等，1993，病毒學(xué)雜志(J.Virology)676753)使細(xì)胞提取物中的E1/E2蛋白復(fù)合物成為可溶性的，并從中純化E1-E2的寡聚形式(Dubuisson等1994，病毒學(xué)雜志(J.Virology)686147)。2.2疫苗制劑的制備以與實(shí)施例1中的配制相類似的方法制備寡聚E1E2的制劑。實(shí)施例3以與實(shí)施例1中的配制相類似的方法制備含有實(shí)施例1中的融合蛋白和實(shí)施例2中的E1E2寡聚體的制劑，所述兩種制劑含有50-100μg的每種蛋白質(zhì)。表1兩倍濃縮的載體</tables>序列11MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTL51GLDIETATRAGKQIVERILKEESDEALKMTMSTNPKPQRKTKRNTNRRPQ101DVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKARQ151PEGRAWAQPGYPWPLYGNEGMGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLG201KVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPPGGAARALAHGVRVLEDGVNYAT序列21GAATTCGTACCTAGATCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAA51ATAAATTCATATAAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTAT101CTCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATCA151GCAGGACGCACTGACCACCATGAAGGTGACGCTCTTAAAAATTAAGCCCT201GAAGAAGGGCAGCATTCAAAGCAGAAGGCTTTGGGGTGTGTGATACGAAA251CGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGCTGCCAATGTGCCAAT301CGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACCACCAAAGCTA351ACTGACAGGAGAATCCAGATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCG401CGCAGAGAAACAGGCTCAATGGAAAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGG451TAAGCGCAAAACCAGTTCCGAAAGATTTTTTTAACTATAAACGCTGATGG501AAGCGTTTATGCGGAAGAGGTAAAGCCCTTCCCGAGTAACAAAAAAACAA551CAGCATAAATAACCCCGCTCTTACACATTCCAGCCCTGAAAAAGGGCATC601AAATTAAACCACACCTTAAGGAGGATATAACATATGGATCCAAACACTGT651GTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTG701CAGACCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGAT751CAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGCACTCTTGGTCTGGACATCGAGAC801AGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAAGAAT851CCGATGAGGCACTTAAAATGAcCATGAGCACAAATCCTAAACCCCAAAGA901AAAACCAAACGTAACACCAACCGTCGCCCACAGGACGTTAAGTTCCCGGG951CGGTGGTCAGATCGTtGGTGGAGTTTACcTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCA1001GGTTGGGTGTGCGcGCGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGT1051GGAAGGCGACAgCCTATCCCCAAGGCTCGCCaGCCCGAGGGtAGGgCCTG1101GGCaCAGCCcGGGTATCCTTGGCCCCTCTATGGCAATGAGGGCaTGGGGT1151GGGCAGGATGGCTCCTGTCACCCCGCGGCTCcCGGCCTAGTTGGGGCCCC1201AcgGACCCCCGGCGTAGGTCGCGTAATTTGGGTAAGGTCATCGATACCCT1251cACgTGCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATTCCGCTCGTCGGCGCCC1301CCccAGGGGGCGCTGCCAGGGCCtTGGCACATGGTGTCCGGGTTCTGGAG1351GACGGCGTGAACTATGCAACAtaaTCTAGAATCGATAAGCTTCGACCGAT1401GCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCA1451TGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTA1501GGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCG1551CTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGC1601ACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGC1651GAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGT1701CTTGCTGGCGTTCGTCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTT1751CAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCGCAGCA1801ACTTGTCGCGCCAATCGAGCCATGTCGTCGTCAACGACCCCCCATTCAAG1851AACAGCAAGCAGCATTGAGAACTTTGGAATCCAGTCCCTCTTCCACCTGC1901TGACGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCC1951GGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGA2001TGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCC2051TAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCG2101GCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCT2151TGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGA2201CCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAA2251TTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCT2301TGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCG2351CATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCC2401TGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAG2451AATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAAC2501GTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGT2551AAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATC2601TGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATT2651AACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCA2701TCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGT2751TCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTAT2801CATTACCCCCATGAACAGAAATTCCCCCTTACACGGAGGCATCAAGTGAC2851CAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGA2901CATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCA2951GACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTG3001CCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCC3051CGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCC3101CGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAC3151CCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATC3201AGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCA3251CAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGC3301TCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCT3351CACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGG3401AAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGG3451CCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCAC3501AAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAG3551ATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGA3601CCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTG3651GCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGT3701TCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCT3751GCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGAC3801TTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTA3851TGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACA3901CTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC3951GGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAG4001CGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGAT4051CTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAAC4101GAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTT4151CACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTA4201TATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCA4251CCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCC4301CGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTG4351CTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCA4401ATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTT4451ATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTA4501GTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGTCGA4551CGGATCAGCCTCGAGGTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACT4601CATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCA4651CGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTT4701TTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGAT4751CCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCT4801CAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAAC4851AATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCC4901ATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATG4951GATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATC5001AGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGT5051TTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATG5101GTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCA5151TTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCG5201GGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAAT5251ATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGT5301TTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGC5351AATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG5401CGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTT5451GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATA5501ACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGA5551GTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCT5601CGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTA5651TTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG5701TTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTAC5751GCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGA5801GTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGG5851CAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTC5901ATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGC5951CTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCACCTCGAGG6001CTGATCCCCG序列31MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATR51KTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSP101RGSRPSWGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGAARA151LAHGVRVLEDGVNYATGNLPGCSFSIFLLALLSCLTVPASAYQVRNSSGL201YHVTNDCPNSSIVYEAADAILHTPGCVPCVREGNASRCWVAVTPTVATRD251GKLPTTQLRRHIDLLVGSATLCSALYVGDLCGSVFLVGOLFTFSPRRHWT301TQDCNCSIYPGHITGHRMAWDMMMNWSPTAALVVAQLLRIPQAIMDMIAG351AHWGVLAGIAYFSMVGNWAKVLVVLLLFAGVDAETHVTGGNAGRTTAGLV401GLLTPGAKQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSS451GCPERLASCRRLTDFAQGWGPISYANGSGHDERPYCWHYPPRPCGIVPAK501SVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWF551GCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIGGVGNNTLLCPTDCFRKHPEATYSRCGSG601PWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGE651RCDLEDRDRSELSPLLLSTTQWQVLPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQ701YLYGVGSSIASWAIKWEYVVLLFLLLADARVCSCLWMMLLISQAEAALEN751LVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLL801LALPQRAYALDTEVAASCGGVVLVGLMALTLSPYYKRYISWCMWWLQYFL851TRVEAQLHVWVPPLNVRGGRDAVILLMCVVHPILVFDITKLLLAIFGPLW901ILQASLLKVPYFVRVQGLLRICALARKIAGGHYVQMAIIKLGALTGTYVY951NHLTPLRDWAHNGLRDLAVAVEPVVFSRMETKLITWGADTAACGDIINGL1001PVSARR權(quán)利要求1.疫苗組合物，含有QS21；3脫-O-?；?單磷酰脂A(3D-MPL)；水包油乳劑，其中水包油乳劑具有下列組分可代謝的油類，α生育酚和吐溫80；和至少一種選自下列組中的免疫原(a)丙型肝炎病毒的核心蛋白或其免疫原性的衍生物，和(b)丙型肝炎病毒的包膜蛋白或其免疫原性的衍生物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中HCV蛋白或其免疫原性的衍生物與載體分子化學(xué)綴合。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的疫苗組合物，其中免疫原性的衍生物是融合多肽。4.根據(jù)權(quán)利要求3的疫苗組合物，其中融合多肽含有與流感病毒蛋白或其免疫原性的衍生物融合的HCV核心蛋白或其免疫原性的衍生物。5.根據(jù)權(quán)利要求4的疫苗組合物，其中流感病毒蛋白是NS1蛋白。6.化合物，含有與含外源表位的多肽融合的HCV核心蛋白或其免疫原性的衍生物。7.根據(jù)權(quán)利要求6的化合物，其中含外源表位的多肽是流感病毒蛋白或其免疫原性的衍生物。8.根據(jù)權(quán)利要求7的化合物，其中流感病毒蛋白是NS1蛋白。9.治療或預(yù)防HCV感染的方法，包括給有此需要的病人施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一個(gè)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一個(gè)的化合物。10.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一個(gè)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一個(gè)的化合物在制備用于預(yù)防或治療HCV感染的藥物中的用途。11.制備根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一個(gè)的組合物的方法，所述方法包括按所需比例混合其成分。12.制備根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一個(gè)的化合物的方法，所述方法包括在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述化合物的DNA并回收產(chǎn)物。13.編碼根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一個(gè)的化合物的DNA分子。14.含有權(quán)利要求13的DNA的重組載體。15.用權(quán)利要求14的化組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。全文摘要含有QS21,3脫－O－?；獑瘟柞Ｖ珹(3D－MPL),水包油乳劑的疫苗組合物,其中水包油乳劑具有下列組分:可代謝的油類,如角鯊烯,α生育酚和吐溫80,和至少一種選自下列組中的免疫原(a)丙型肝炎病毒的核心蛋白或其免疫原性的衍生物,以及(b)丙型肝炎病毒的包膜蛋白或其免疫原性的衍生物。文檔編號(hào)C12N15/62GK1189855SQ96195150公開(kāi)日1998年8月5日申請(qǐng)日期1996年6月20日優(yōu)先權(quán)日1996年6月20日發(fā)明者特里薩·卡比宗·席爾瓦,帕特里夏·M·莫明,納撒利·瑪麗-約瑟法·C·加肯申請(qǐng)人:史密斯克萊·比奇曼生物公司