專利名稱：經(jīng)修飾的抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗生物素蛋白類型的分子，它在結(jié)合位點的酪氨酸殘基被修飾，已知該酪氨酸殘基對與生物素的結(jié)合起著關(guān)鍵作用。這種被修飾的抗生物素蛋白在特定條件下仍可與生物素或生物素化的配體結(jié)合，但在改變這些條件后，如高pH值或與生物素競爭，已結(jié)合的生物素部分或生物素化的配體即被除去。本發(fā)明因而提供了一種用于抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的可逆形式的抗生物素蛋白，從而“校正”用于不同目的，即用于需要破壞抗生物素蛋白-生物素復(fù)合體的高變性條件下，抗生物素蛋白的一個重要缺陷。這些需要解離抗生素蛋白-生物素復(fù)合體的劇烈條件通常使生物素化的組分的生物活性不可逆地喪失，從而使其在隨后的使用中不穩(wěn)定。
抗生物素蛋白(來源于卵白)和抗生蛋白鏈菌素(來源于Streptomyces avidinii)是兩種相關(guān)的蛋白質(zhì)，它們與生物素的結(jié)合具有相似的解離常數(shù)，約為10-15M(Green，1975)。除與生物素結(jié)合外，它們的許多物理性質(zhì)十分相似。例如，它們都是由四個非共價連接的相同的亞基形成，每一個亞基具有一個單一的生物素結(jié)合位點。亞基的Mr值也非常接近。而且，這兩種蛋白質(zhì)序列中的幾個小片段是保守的，特別是兩個Trp-Lys(色氨酸-賴氨酸)片段存在于大約相同的位點(Argarana et al.，1986)。我們以前曾證實(Gitlin etal.，1987，1988a)兩種蛋白質(zhì)中一些賴氨酸殘基和色氨殘基參與了生物素的結(jié)合(Gitlin et al.，1988b)。最近證實，抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素兩者顯示出相同的三維折疊，并且大多數(shù)結(jié)合位點的殘基是相同的或相似的(Weber et al.，1989)。兩種蛋白與生物素分子形成的結(jié)合位點的幾何構(gòu)型和連鍵確實非常相似。
雖然具有這些相似性，這兩種蛋白之間也存在一些差異。抗生物素蛋白是一種具有二硫鍵橋的糖蛋白，含有兩個甲硫氨酸殘基，而抗生蛋白鏈菌素沒有被糖化并缺乏含硫的氨基酸鍘鏈。另一個顯著差異是在酪氨酸的含量上?？股锼氐鞍變H有一個酪氨酸殘基(Tyr-33)，而抗生蛋白鏈菌素在22、43、54、60、83和96位含有6個酪氨酸殘基。有趣的是，抗生物素蛋白中僅有的酪氨酸殘基所處區(qū)域含有的序列與抗生蛋白鏈菌素中的一個酪氨酸殘基所處區(qū)域的序列相同(在Thr-Gly-Thr-Tyr片段中的Tyr-43)。這一酪氨酸殘基在生物素結(jié)合位點中占據(jù)一個突出的位置，該酪氨酸羥基的化學(xué)修飾可導(dǎo)致抗生物素蛋白分子的不可逆失活(Gitlin et al.，1990)。
每一個抗生物素蛋白單體結(jié)合一個生物素分子。這種結(jié)合的獨特特征當然是形成抗生物素蛋白-生物素復(fù)合體的強度和特異性。所產(chǎn)生的親和常數(shù)，抗生物素蛋白約為1.6×1015M-1，抗生蛋白鏈菌素約為2.5×1013M-1(Green，1990)，是已知一種蛋白質(zhì)和一種有機配體中的最高的。這么高的強度使得生物素不能從結(jié)合位點逃逸，即使處于各種劇烈條件下，例如，室溫下高濃度變性劑的條件下，如6M鹽酸胍，3M硫氰酸胍，8M尿素，10％β-巰基乙醇或10％十二烷基硫酸鈉。在低pH(1.5)用鹽酸胍或在變性劑或洗滌劑的存在時加熱(＞70℃)的聯(lián)合作用下，該蛋白質(zhì)變性，生物素從遭破壞的結(jié)合位點釋放出。
抗生物素蛋白識別生物素主要是在其分子的脲基(類似尿素)環(huán)部位?？股锼氐鞍椎慕Y(jié)合部位與該維生素戊酸側(cè)鏈的含硫環(huán)之間的作用強度很低。生物素含羧基側(cè)鏈與抗生物素蛋白之間相對弱的相互作用意味著前者可被化學(xué)修飾并與多種生物活性物質(zhì)相連，所產(chǎn)生的生物素衍生物或共軛物部分仍可與抗生物素蛋白相互作用。反過來，抗生物素蛋白可與許多其它分子衍生化，即與各種類型的“探針”或報道基團衍生化。
這正是抗生物蛋白-生物素技術(shù)的關(guān)鍵點(Wilchek和Bayer，1990)。這樣，實驗系統(tǒng)中的一種生物活性靶分子可用其生物素化對應(yīng)物(一種結(jié)合物)來“標記”，然后可將該產(chǎn)物與抗生物素蛋白作用，該抗生物素蛋白是與適當?shù)奶结樠苌锘幕蚬曹椈摹?br> 在抗生物素蛋白-生物素技術(shù)中卵白抗生物素蛋白的使用有時由于高堿性(pI～10.5)和抗生物素蛋白分子上糖部分的存在而受到限制，它可導(dǎo)致非特異性或不期望的反應(yīng)發(fā)生。近年來。細菌蛋白質(zhì)，抗生蛋白鏈菌素，在抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的許多應(yīng)用中很大程度上取代了卵白抗生物素蛋白。然而，抗生蛋白鏈菌素的缺點(成本高和不依賴生物素的細胞結(jié)合)使人們對將卵白抗生物素蛋白作為抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的標準用品重新有了興趣。為了這一目的，已制備出了相對于天然蛋白質(zhì)(和以前的它的衍生物)以及抗生蛋白鏈菌素的具有改良分子特性的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白，例如N-?；股锼氐鞍祝?，N-甲酰，N-乙酰和N-琥珀?？股锼氐鞍住＿@些抗生物素蛋白的衍生物降低了該蛋白質(zhì)的電荷，但它們都是通過與抗生物素蛋白的賴氨酸進行共價連接而制備的。而該游離氨基的封閉阻止了隨后的其它類型的共軛物的制備(即蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)共軛物，如抗生物素蛋白標記的酶)，這通常是通過用雙功能基試劑(如，戊二醛)與賴氨酸殘基進行交聯(lián)而制備的。
一種更為有用和有效的對賴氨酸修飾的替代方法是對精氨酸的修飾。這種情況下，蛋白質(zhì)的pI值被有效地降低，并且賴氨酸仍可用于隨后的交聯(lián)。以這種方式修飾的兩種不同的抗生物蛋白衍生物可通過商業(yè)途徑獲得。一種是ExtrAvidin，可以各種功能性衍生的或共軛的形式購自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。另一種NeutraLite AvidineTM(一種Belovo Chemicals，Bastogne，Belgium的產(chǎn)品)，它是額外修飾的，并可大量購得。
雖然卵白抗生物素蛋白pI值的降低解決了其中的一個問題，寡聚糖殘基的存在仍成為非特異性(不依賴生物素)相互作用的主要原因，這限制了它的應(yīng)用。將卵白抗生物素蛋白回復(fù)成為抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的標準用品有賴于糖基的去除。
從糖蛋白上去除糖基的可能性非常有限。通過化學(xué)方法或酶方法可能做到這一點。目前可以使用的化學(xué)方法，如使用HF或高碘酸鹽氧化，或者是破壞性大或者是效率低下。公知的酶方法，使用N-聚糖酶(Tarentino et al.，1984)，通常非常昂貴并且當使用常規(guī)方法時對于抗生物素蛋白不十分有效。最終，一種可行的去糖基化的方法建立了起來，所得產(chǎn)物隨后通過精氨酸進行了化學(xué)改性，這種產(chǎn)品的商標為NewtraLite AvidinTM(Belovo Chemicals)。
雖然有了這些改進，抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的一些應(yīng)用中的一個主要問題是這一結(jié)合不具有可逆性，并且在不使抗生物素蛋白變性或不使通過生物素橋已相連的生物材料被破壞或失活的情況下，難于在過程結(jié)束后分離到抗生素蛋白和生物素部分?；蛘撸瑥目股锼刂谐ケ黄茐幕蚴Щ畹牟牧蠈⑹怯欣?特別是對工業(yè)上的使用來說)，從而重新組成柱以便于生物素化組分的新樣品的吸附。
本發(fā)明的一個目的是提供經(jīng)修飾的抗生物素蛋白，它仍可與生物素結(jié)合并與應(yīng)用使用抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的方法中，其中方法的可逆性是必需的或是有利的。
在模型肽和蛋白質(zhì)中使用四硝基甲烷對酪氨酸殘基的硝化作用已有描述(Riordan et al.，1966；Sokolovsky et al.，1967)。在本發(fā)明人的一項前期工作中(Gitlin et al.，1989)，通過用四硝基甲烷(TNM)對溶解于9M尿素中的卵白抗生物素蛋白進行硝化作用而制備出了抗生物素蛋白的酪氨酸硝化衍生物。所產(chǎn)生的硝化-抗生物素蛋白是無活性的，即它不與生物素結(jié)合，這是由于硝化作用是以抗生物素蛋白的變性形式進行的(在尿素存在下)。由此制備的硝化-抗生物素蛋白完全無法用于抗生物素蛋白-生物素技術(shù)。
已制備出了125I-標記的抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素以用于分析用途。每一抗生物素蛋白亞基上的單一的酪氨酸殘基不是可很容易地進行碘化?？股锼氐鞍淄ㄟ^引入3-(對-羥苯基)丙酰基而使其具有對碘化作用的敏感性(氯胺T方法)，從而制備出含有所述基團的125I-標記的抗生物蛋白。125I-標記的Bolton-Hunter試劑也可用于標記抗生物素蛋白(Finn和Hofmann，1985)。用碘化方法(iodogenmethod)將抗生蛋白鏈菌素用Na125I碘化制備出了125I-抗生蛋白鏈菌素(Suter et al.，1988)。沒有標記的碘化的抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素截止目前尚未見報道。
用模型肽和蛋白質(zhì)，如核糖核酸酶A，將酪氨酸殘基進行氮化或胺化已有報道(Gorecki et al.，1971；Sokolovsky et al.，1967)。
本發(fā)明涉及生物素-結(jié)合的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白-類型的分子，它選自下列分子組(i)天然卵白抗生物素蛋白；(ii)重組抗生物素蛋白；(iii)抗生物素蛋白的去糖基化形式；(iv)細菌的抗生蛋白鏈菌素；(v)重組抗生蛋白鏈菌素；(vi)截斷的抗生蛋白鏈菌素；和(vii)在必需的酪氨酸殘基之外的位點被修飾的(i)-(vi)中的衍生物，其特征為，在所說生物素-結(jié)合的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型的分子中，在生物素-結(jié)合位點的該必需酪氨酸殘基的修飾方式使其pKa與相應(yīng)的沒有修飾的抗生物素類型分子中沒有被修飾的酪氨酸殘基的pKa相比被降低。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子在該抗生物素蛋白類型分子的必需酪氨酸殘基上具有一個或多個親電性和/或親核性基團，并且可用其中經(jīng)修飾的酪氨酸為下式的化合物來表示
其中，X1和X2各自是一個選自硝基，鹵素，NR1R2和-N＝NR3的原子團，其中R1和R2各自選自氫、C1-C8烷基和C1-C6羧?；?，和R3是被酸基取代的芳香基。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該抗生物素蛋白類型分子是在酪氨酸殘基上通過加入一個或多個親電基團而被修飾的。例如，抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素可通過酪氨酸殘基的硝化或鹵素化，優(yōu)選碘化，而被修飾，如

圖1所示(X1或X2為NO2或鹵素，優(yōu)選I)，從而將生物素-結(jié)合位點的酪氨酸殘基的pKa從10.5-12.5降至6.5-8.5，優(yōu)選降至約7.0。
抗生物素蛋白類型分子中的酪氨酸殘基的這種修飾包含有酪氨酸環(huán)上的鄰位(與羥基相鄰)加上一個或多個親電基團。作為經(jīng)修飾的抗生物素蛋白的這種類型的一個例子，使用了四硝基甲烷(TNM)對酪氨酸殘基進行硝化。已對所產(chǎn)生的含有硝基酪氨酸的抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素(下文分別稱作“硝基抗生物素”和“硝基抗生蛋白鏈菌素”)進行了深入研究，以尋找釋放生物素半分子或生物素化的配體，如生物素化的抗體、酶、核酸分子或細胞的相對溫和的條件。
在本發(fā)明中，抗生物素蛋白的硝化是在非變性條件下進行的，并且所產(chǎn)生的硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白鏈菌素在pH4時顯示出可與生物素化的配體有效和緊密地結(jié)合。當pH值上升至8時，生物素化的配體仍保留在柱上。然而，當pH值上升至10時，生物素化的配體即被釋放出來?；蛘撸诘蚿H值條件下(如在pH4至8的范圍中)，生物素化的配體可通過用游離生物素交換而釋放。硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白鏈菌素的這些特性提供了適用于多種用途的抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素的類型。按照本發(fā)明的方法，這些材料已被用于生物素化配體與硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白鏈菌素結(jié)合和隨后釋放的幾個實施例中，其中硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白鏈菌素被固定于瓊脂糖樹脂上；也被用于生物素化配體與硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白鏈菌素的結(jié)合和釋放的另一些實施例中，其中硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白鏈菌素被吸附于微量滴定板上。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及鹵素化的，優(yōu)選無標記碘化抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素。通過氯胺T方法對抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素中的酪氨酸殘基用KI進行碘化，產(chǎn)生一和/或二碘酪氨酸-抗生物素蛋白或-抗生蛋白鏈菌素，均顯示出是抗生物素蛋白的有效可逆形式。
本發(fā)明的又一個實施方案涉及在必需的酪氨酸殘基處被一個或多個選自NR1R2和-N＝NR3的親核基團修飾的抗生物素蛋白類型分子。
在本發(fā)明的偶氮衍生物中，即為其中X1和/或X2是-N＝NR3，R3是芳基，優(yōu)選碳環(huán)芳基，最優(yōu)選苯基，它們被一個選自羧基和一個諸如磷酸、胂酸或磺酸的無機酸殘基所取代。
根據(jù)本發(fā)明的偶氮衍生物是從相應(yīng)的對-氨基衍生物，如對-氨苯基胂酸，鄰氨基苯甲酸，對-氨基苯甲酸，對氨基苯磺酸和對-氨基磷酸，通過用NaNO2的重氮化作用以及所產(chǎn)生的重氮鹽與所選擇的抗生物素蛋白類型分子的反應(yīng)而制備的。
在本發(fā)明的氨基衍生物中，即是其中X1和/或X2是NR1R2，R1和R2各自選自H，烷基和?；?。該烷基優(yōu)選為一個C1-C8的直鏈或支鏈烷基，如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，己基，辛基。該?；鶅?yōu)選為一個C1-C6羧酸?；缫阴；?，丙酰基，丁?；?butiryl)，琥珀?；蚱S氧羰基。
本發(fā)明的氨基衍生物可通過用連二亞硫酸鈉Na2S2O4還原相應(yīng)的偶氮衍生物或通過用Na2S2O4還原相應(yīng)的硝基衍生物來制備，并且如果需要，該氨基可用標準方法進一步烷基化或?；?。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物蛋白類型的分子可用于抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的許多方面。
附圖簡要說明圖1示出制備本發(fā)明的酪基酸修飾的抗生物素-類型分子的反應(yīng)圖，并且顯示了它在使用抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的可逆方法中的應(yīng)用。
圖2顯示了作為四硝基甲烷(TNM)濃度(mM)函數(shù)的抗生物素蛋白的硝化水平(％)，如實施例1(i)所述。
圖3顯示了pH值對生物素化的牛血清白蛋白(BSA)與瓊脂糖-硝基-抗生物素蛋白樹脂相結(jié)合的效應(yīng)，如實施例2(i)所述。
圖4顯示了pH值對生物素化的堿性磷酸酶與含有吸附的硝基-抗生物素蛋白的微量滴定板相結(jié)合的效應(yīng)，如果實施例2(ii)所述。
圖5顯示了抗生物素蛋白(實心圓)和硝基抗生物素蛋白(空心圓)的生物素結(jié)合活性相比較的結(jié)果，如實施例2(iii)所述。
圖6顯示了pH-誘導(dǎo)的生物素化BSA從瓊脂糖-硝基-抗生物素蛋白樹脂的釋放，如實施例3(i)所述。
圖7顯示了pH-誘導(dǎo)的生物素化BSA從瓊脂糖-硝基-抗生蛋白鏈菌素樹脂的釋放，如實施例3(ii)所述。
圖8顯示了通過與游離的生物素的競爭，生物素化BSA從瓊脂糖-硝基-抗生物素蛋白的釋放，如實施例3(iii)所述。
圖9顯示生物素-誘導(dǎo)的作為pH值函數(shù)的生物素化BSA的洗脫，如實施例3(iv)所述。游離生物素被溶解于不同pH值的緩沖液中，范圍為從4到10。將沒有生物素的pH10時的洗脫作為對照。
圖10顯示生物素從硝基-抗生物素蛋白的生物素封閉位點的釋放，如實施例4所述。
圖11A-B顯示了生物素化BSA從硝基-抗生物素蛋白-瓊脂糖柱重復(fù)上樣和洗脫的結(jié)果，如實施例5所述。圖11A顯示了生物素化BSA同一種樣品在含有瓊脂糖-硝基-抗生物素蛋白樹脂的柱上的連續(xù)上樣(在pH4使用緩沖液A)和洗脫(在pH10使用緩沖液C)。圖11B顯示了洗脫出的級分的累積每周期具有基本上相同的蛋白質(zhì)結(jié)合和洗脫水平。
圖12顯示了在從全兔血清進行免疫球蛋白純化后生物素化蛋白質(zhì)A從含有瓊脂糖-硝基-抗生物素蛋白樹脂的釋放，如實施例6所述。
圖13顯示了從圖12柱所得樣品的SDS-PAGE圖泳道A，全兔血清(上樣的級分)；泳道B，柱洗脫液；泳道C，用緩沖液A，pH4的峰洗脫液；泳道D，用緩沖液C，pH10的峰洗脫液；泳道E，兔免疫球蛋白的商品制備物；泳道F，生物素化蛋白質(zhì)A標準物。
圖14顯示了pH值對生物素化辣根過氧化物酶從含有吸附的碘化抗生物素蛋白的微量滴定板上釋放的效應(yīng)，如實施例7所述。
本文所用術(shù)語“抗生物素類型分子”是指天然卵白糖蛋白抗生物素蛋白、抗生物素蛋白的去糖基形式、由選擇的鏈霉菌屬菌株(如Streptomyces avidinii)產(chǎn)生的細菌抗生蛋白鏈菌素、截短的抗生蛋白鏈菌素、重組抗生物素蛋白和重組抗生蛋白鏈菌素，以及天然的、去糖基化的和重組抗生物素蛋白的衍生物和天然的、重組的和截短的抗生蛋白鏈菌素的衍生物，這些衍生物是在必需酪氨酸之外被修飾的，例如，N-?；股锼氐鞍?，如N-乙酰、N-鄰苯二甲酰和N-琥珀?？股锼氐鞍祝约吧唐稥xtrAvidinTM和NeutraliteAvidinTM。
所有類型的抗生物素類型分子均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括天然的和重組的抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素以及衍生分子，如非糖基化的抗生物素蛋白，N-?；股锼氐鞍缀徒囟痰目股鞍祖溇?。這些材料的一部分可通過商業(yè)途徑獲得，如天然抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素，非糖基化的抗生物素蛋白，N-?；股锼氐鞍缀徒囟痰目股鞍祖溇?，或可通過公知的方法制備(參見Green，1990，制備抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素；Hiller et al.，1990，制備非糖基化的抗生物素蛋白；Bayer et al.，1990，制備抗生蛋白鏈菌素和截短的抗生蛋白鏈菌素)。重組抗生物素蛋白和重組抗生蛋白鏈菌素可通過標準的重組DNA技術(shù)來制備，如Chandra和Gray，1990描述的制備重組抗生物素蛋白的方法，和Argarana et al.，1986描述的制備重組抗生蛋白鏈菌素的方法。
在抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的應(yīng)用方法中，可與本發(fā)明的修飾過的抗生物素蛋白使用的“生物素化配體”是所需配體的生物素化形式，所需配體有例如蛋白質(zhì)，如抗體、酶、植物凝血素、或碳氫化合物以及糖結(jié)合物，如糖蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂、肝素、寡聚糖、或核酸，即DNA和RNA，或噬菌體、病毒、細菌和其它細胞，其中所說配體是與生物素或與其同系物、類似物或衍生物共價連接的。多種生物素化配體是可通過商業(yè)途徑獲得或可通過標準方法(參見，如，Bayer和Wilchek，1992a)制備。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素類型分子(主要為在結(jié)合位點酪氨酸殘基(見圖1)的一個或兩個鄰位修飾過的抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素的衍生物)適于用作與生物素半分子的可逆相互作用，從而提供了用于抗生素蛋白-生物素技術(shù)的新工具。
這些經(jīng)修飾抗生物素蛋白類型分子在溫和的條件下允許從固定化的鄰-苯酚-修飾的抗生物素蛋白類型分子上或從溶液中的包括經(jīng)修飾的抗生物素蛋白以及生物素化配體的可溶性復(fù)合物上除去游離的生物素和/或生物素化配體，如生物素化的酶或其它生物素化的生物活性材料。這種溫和條件可由過量濃度的生物素、高pH值，如pH10，相對低的非變性濃度的尿素、胍或硫氰酸鹽，熱和/或它們的組合而組成。在一優(yōu)選實施方案中，生物素或生物素化半分子從固定的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白上的除去是通過變化pH值，如將pH值提高到10，來進行的。在另一個優(yōu)選實施方案中，這一除去是通過加入過量的生物素，如，0.6mM生物素的溶液通過經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱以替代生物素化的組分而進行的。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白-類型分子適用于抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的任一方法中，尤其適用于其中抗生物素蛋白-生物素結(jié)合的可逆性是有利的方法中。例如，用于親和層析中以除去親和配體的可逆性固定化柱；除去固定化酶從而提供一種可逆性酶反應(yīng)物；破裂含有通過抗生物素蛋白橋而交聯(lián)的生物素化材料的溶液中的可溶性生物復(fù)合物；制備高親和性噬菌體文庫；用于細胞分離，從而便于存活或完整細胞與識別組分或配體(如抗體)一起從樹脂的釋放，或通過斷裂抗生物素蛋白橋而抵消這種細胞的凝集。
本發(fā)明也涉及與固相載體或基質(zhì)相連的本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素類型分子。現(xiàn)有技術(shù)中所用的任一種固相載體都是適用的，例如，但不限于，樹脂，微量滴定板，玻璃珠，磁珠等?？股锼氐鞍着c固相載體的連接可以是共價連接，也可以是非共價連接，并可用標準方法完成。在一優(yōu)選實施方案中，該經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子被固定于樹脂上，優(yōu)選瓊脂糖上，并且這樣獲得的瓊脂糖-硝基抗生物素蛋白親和樹脂可被倒入柱中以用于分離程序(Bayer和Wilchek，1992b)。在本說明書中，術(shù)語“抗生物素蛋白-瓊脂糖柱”表示含有固定于瓊脂糖樹脂上的本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素類型分子的柱。這種柱特別適用于分離程序。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，該經(jīng)修飾的抗生物素類型分子被連接于微量滴定板上。
在公知的親和層析方法中(它是所有親和方法的原型)，一種結(jié)合配體，如一種抗體或受體，被連接到固相支持物上，例如瓊脂糖上。這可通過將所說配體生物素化，并隨后通過抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素橋固定在瓊脂糖上而完成。然后將所得到的抗生物素蛋白瓊脂糖柱用作分離和純化可與所說生物素化配體相互作用的材料的工具。在很多情況下，將該生物素化配體從抗生物素蛋白瓊脂糖柱中分離出來將是有利的，或者是回收該配體本身(它可能是稀有的或貴重的)，或者將柱重新構(gòu)成以用于其它目的。這可通過使用一個含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子來完成，該抗生物素蛋白類型分子可固定生物素化配體，并最終可通過加入堿溶液(如緩沖液C，pH10)或加入過量的生物素(如任一pH值下0.6mM)從柱中除去。然后可將一種新類型的生物素化配體或者將又一批同一種生物素化配體加入到該重新構(gòu)成的抗生物素蛋白柱中。
該抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)已通過多種方法應(yīng)用于分離細胞。一種方法是使用可識別細胞表面分子(如表面抗原)的生物素化配體(如抗體)。該生物素化配體可通過抗生物素蛋白或抗生物蛋白鏈菌素橋被結(jié)合于柱上或其它類型的基質(zhì)上，如磁珠上?；蛘?，將一種混合細胞群體的懸浮液用生物素化配體處理，在溶液中使用抗生物素蛋白可將攜帶相互作用表面分子的細胞凝集。通常，這一方法用于簡單地從混合細胞群體中選擇地除去一種給定的細胞群體。一旦通過抗生物素蛋白被結(jié)合到基質(zhì)上或被凝集，可保持細胞完整性或存活性的方式難以將所產(chǎn)生的親和相互作用(即生物素化配體和表面分子之間，以及抗生物素蛋白和生物素之間)斷裂。例如，抗體和抗原之間相互作用的斷裂常常需要可破壞大部分細胞的條件，如低pH值。然而可回收到非-相互作用的細胞。為回收到被結(jié)合細胞群體，可使用一種含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子的柱，并且可使用一種含有生物素的溶液(例如在等滲條件下，如0.15M NaCl，pH7中的0.6mM生物素，或在一種適當?shù)慕M織培養(yǎng)基中的過量濃度的生物素)從柱中釋放細胞，或者使用同一種含有生物素的溶液將凝集的細胞打散。
固定化酶已大量應(yīng)用于食品、制藥和化學(xué)工業(yè)(Katchalsky-Katzir，1993)。應(yīng)用于酶反應(yīng)器系統(tǒng)的固定化酶的問題之一是酶或其基質(zhì)會逐漸老化。例如，酶被公認為是敏感的蛋白質(zhì)，它通常具有一定的半衰期，最終它們會由于使用或由于貯存而失話。對于工業(yè)應(yīng)用來說，當被結(jié)合的酶變廢以后，最好固定化基質(zhì)仍可被再次使用。因而通過加入堿溶液(如緩沖液C，pH10)或通過加入過量的生物素(如任何pH值下0.6mM)而除去失活的生物素化酶可重新構(gòu)成一種酶反應(yīng)器，該反應(yīng)器包括一種結(jié)合于一種柱上的生物素化酶，該柱含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子。然后可將新的一批生物素化酶加入到該重新構(gòu)成的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱上。
同樣，可將細胞固定于經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱上，并用于基于細胞的反應(yīng)器系統(tǒng)。這種細胞可通過使用含有生物素的溶液(例如，等滲條件下(如0.15M NaCl，pH7)0.6mM，或在一種適當組織培養(yǎng)基中的這種過量濃度的生物素)而被除去，從而重新構(gòu)成該經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱。
在噬菌體文庫技術(shù)中，將一種結(jié)合配體(如，抗體，受體)連接于固相載體上，如微量滴定板上。這通常是通過將所說配體生物素化，并隨后通過抗生蛋白鏈菌素橋?qū)⑵涔潭ㄔ诎迳隙瓿傻摹Ｈ缓蠹尤虢z狀噬菌體(如M13)，這些噬菌體含有可與固定化的配體相互作用的表面肽，從而被結(jié)合至板上。非特異性結(jié)合的噬菌體可通過用中性的洗滌劑，如Tween 20(非離子型表面活性劑的商品名)，沖洗而被除去。通常隨后通過降低pH值將結(jié)合的噬菌體從板上釋放出來。pH值降低可斷裂固定化配體和噬菌體上表面肽之間的相互作用。這一方法的潛在問題之一是一些唑菌體可仍憑借非常高的親和作用而結(jié)合在板上。特別由于它們對生物素化配體高的親和力，這些噬菌體可能是所需的噬菌體。因而，通過使用本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素也通過加入堿性溶液(如緩沖液C，pH10)或通過加入過量的生物素(如任一pH值下的0.6mM)，高親和性的噬菌體即可與生物素化配體一起從微量滴定板上釋放下來。然后，該回收的結(jié)合于噬菌體上的高親和肽可通過隨后的細菌感染，和通過建立噬菌體文庫的方法而被富集(參見，例如，Scott，1992)。
基因富集和DNA分離可按照已知的方法(參見Wilchek和Bayer，1988)將生物素化DNA與本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子或經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱相復(fù)合而完成。過去，為了將生物素化DNA從復(fù)合物中游離出來，曾使用蛋白水解酶，例如蛋白酶K，來消化抗生物素蛋白。使用本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，可使用堿溶液(如緩沖液C，pH10)或通過加入過量的生物素(如0.6mM，任一pH值)來釋放生物素化的DNA。
生物感應(yīng)器是由一個具有特異性的生物感應(yīng)器件和一個可將一個生物事件轉(zhuǎn)換成一個可被進一步處理和定量的反應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能(即電化學(xué)的、光學(xué)的、熱量的或聲的)組成。生物配體可以是催化性的(如酶、細菌細胞、組織)或非催化性的(如抗體、受體、DNA)。這種檢測器依賴于相互作用組分之一在感應(yīng)表面上的固定，由此產(chǎn)生的完整生物感應(yīng)器的元件非常昂貴。過去，曾將抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)用作將這種配體固定到生物感應(yīng)器上的一般方法。用本發(fā)明的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白替代天然抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素的可能性提供了一種可逆類型的生物感應(yīng)器，這樣可節(jié)省費用并且便于使用。這樣，生物素化配體可通過經(jīng)修飾的抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素固定在生物感應(yīng)器上，當需要時，可使用堿溶液(如緩沖液C，pH10)或通過加入過量的生物素(如在任一所需pH值、離子強度等條件下，0.6mM)將生物素化配體游離。然后，生物感應(yīng)器的該經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子可被重新裝上同一種或不同種的生物素化配體。
本發(fā)明也提供了一種在使用抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的方法中回收抗生物素蛋白柱或生物素的方法，包括(i)將一種生物素化配體固定于含有連接在樹脂上的本發(fā)明經(jīng)修飾的抗生物蛋白類型分子的柱上；(ii)進行與這樣固定的生物素化配體所需的反應(yīng)或分離步驟；(iii)通過改變條件將該生物素化配體從固定的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱上除去；和(iv)回收該生物素化配體和/或該經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱供以后使用。生物素化配體可通過提高pH值、加熱、加入過量濃度的生物素、或低濃度的尿素、胍或硫氰酸酯、和/或它們的組合，從從固定化的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱上除去。在優(yōu)選的實施方案中，生物素化配體是通過將pH值提高到10，或通過加入0.6mM的生物素而從固定化的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱上除去。
本發(fā)明將通過下文非限定性實施例進行描述。
實施例材料和方法(i)材料。卵白抗生物素蛋白是由STC實驗室(Winnipeg，canada)或由Belovo Chemicals(Bastogne，Belgium)提供的?？股鞍祖溇厥菑腟treptomyces avidinii培養(yǎng)過濾物中使用改良的亞氨基生物素—瓊脂糖柱按照前述方法(Bayer et al.，1990)純化而來，瓊脂糖4B CL來自Parmacia(Uppsala，Sweden)。四硝基甲烷來自Fluka。蛋白質(zhì)A和牛血清白蛋白(BSA)來自Sigma Chemical Co.(St.louis，MO，USA)(ii)緩沖液緩沖液A50mM檸檬酸鹽-磷酸鹽，pH3-6；緩沖液B50mM Tris-HCl，pH7-9；和緩沖液C50mM碳酸鈉-HCl，pH10。
(iii)生物素化程序。將實施例中使用的蛋白質(zhì)和酶通過常規(guī)生物素化方法，使用前述的(Bayer和Wilchek，1990)生物素基琥珀酰亞氨酯(biotinyl N-hydroxysuccinimide ester，BNHS)進行生物素化。
(iv)抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素在瓊脂糖上的固定是通過如前文所述的溴化氰方法(Kohn和Wilchek，1984)進行的。
(v)酶測試。
(a)辣根過氧化物酶活性過氧化物酶活性是用2，2′連氮基-二(3-乙苯基-噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)作為底物確定的。底物溶液中包括每10ml緩沖液A中2.5mg底物，pH5，其中加入10μl30％過氧化氫。在420nm處測定顏色的形成。
(b)堿性磷酸酶活性是使用對硝基苯磷酸作為底物測定的。底物溶液包括溶解于10ml含有0.5mM MgCl2的1M二羥乙基胺(pHg.8)緩沖液中的10mg底物。在410nm處測定顏色的形成。
(vi)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是通過Bradford方法，使用抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素(如果合適的話)或BSA作為標準來測定的。
實施例1硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白鏈菌素的制備以及它們在瓊脂糖上的固定。
(i)硝基抗生物素蛋白的制備。將卵白抗生物素蛋白的樣品(在1ml 50mM Tris-緩沖液中5mg，pH8或以上)用不同濃度的四硝基甲烷(TNM)(0.5-5μl對應(yīng)于約5-50mM)，在23℃處理30分鐘。將樣品透析過夜，一次相對于1M NaCl，兩次相對于雙蒸水。樣品中被修飾的酪氨酸的量用氨基酸分析方法測定。如圖2所示，在修飾條件下，用大于20mM的試劑，達到了修飾的最高水平(約70％)，即平均抗生物素蛋白四聚體四個亞單位中的約三個好象被修飾。在下面實驗中，所使用的硝基抗生物素蛋白是使用2μl制備的。
(ii)硝基抗生蛋白鏈菌素的制備。由于抗生蛋白鏈菌素中每一亞單位中酪氨酸殘基數(shù)目較多，抗生蛋白鏈菌素(每1ml緩沖液2.5mg)是用高水平的四硝基甲烷(6μl相應(yīng)于約50mM)來進行硝化作用的。
(iii)固定于瓊脂糖上的硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白鏈菌素的制備。
(a)瓊脂糖4B CL的溴化氰活化。將40g流干的瓊脂糖4B CL先用水沖洗，然后用30％乙酮(v/v)，最后用60％乙酮(v/v)沖洗。將該樹脂重新懸浮于6ml 60％乙酮中并冷卻至0-4℃。在磁攪拌器攪拌的同時加入6ml CNBr溶液(10g/100ml乙酮)，然后在1-2分鐘的時間內(nèi)逐滴加入同樣體積的三乙胺(TEA)溶液(15.2g/100ml乙酮)。將該活化的樹脂過濾并用0.1M碳酸氫鈉洗滌。
(b)固定于瓊脂糖上。硝基抗生物素蛋白和硝基抗生蛋白鏈菌素與活化的瓊脂糖4B CL的結(jié)合是在4℃，在0.1M碳酸氫鹽溶液中反應(yīng)16小時完成的。
(iv)抗生物素蛋白-瓊脂糖和抗生蛋白鏈菌素-瓊脂糖樹脂的硝化。將按照上文(iii)(b)中所述，但使用的是沒有修飾的抗生物素蛋白，而制備的4ml抗生物素蛋白-瓊脂糖樹脂(1.4mg抗生物素蛋白/ml瓊脂糖)的一個樣品用50mM Tris-緩沖液pH8洗滌，并在23℃用6μl TNM處理50分鐘。將該硝化-修飾的樹脂先用1M NaCl，然后用雙蒸水，最后用PBS洗滌。
實施例2 生物素化的蛋白質(zhì)與硝基抗生物素蛋白的結(jié)合(i)生物素化蛋白質(zhì)與硝基抗生物素蛋白的結(jié)合是用幾種方式進行測試的。在一個實驗中，硝基抗生物素蛋白是通過實施例1(iii)中的溴化氰方法被固定在瓊脂糖上。使用了約0.5mg的抗生物素蛋白，并將緩沖液A、B或C(100μl)中的生物素化BSA的樣品加樣至100μl的硝基抗生物素蛋白瓊脂糖樹脂上。將流出的級分進行蛋白檢測。在不同pH值時結(jié)合的白分率是通過從加樣至樹脂上的蛋白質(zhì)量減去流出的級分中的蛋白質(zhì)的量來確定的。如圖3所示，最適結(jié)合發(fā)生于pH4。在較高pH(5和8之間)時觀察到結(jié)合水平的平臺。在pN8以上時，結(jié)合急劇下降，并且在pH10時只有微量結(jié)合。
(ii)使用生物素化堿性磷酸酶在一微量滴定板測試中獲得了相似的結(jié)合(圖4)。在這一實驗中，按照實施例1(i)制備的硝基抗生物素蛋白被吸附于微量滴定板上(1μg硝基抗生物素蛋白/100μl磷酸鹽緩沖液(PBS)/孔)，該板被1％BSA封閉，并用不同pH的緩沖液A、B和C中的生物素化堿性磷酸酶加樣(37μg/0.1ml緩沖液/孔)。將板洗滌，被結(jié)合的酶級分是按照上文方法v(b)所述，使用對-硝基苯磷酸鹽作為底物通過產(chǎn)色的酶檢測來確定的。
(iii)使用相似的微量滴定板酶檢測方法，將硝基抗生物素蛋白的結(jié)合活性與天然(沒有修飾)的抗生物素蛋白的結(jié)合活性進行了比較。在用抗生物素蛋白或硝基抗生物素蛋白涂敷的微量滴定板上(1μg/100μl PBS/孔)加上不同濃度(150μl緩沖液A中10ng和1μg之間)的生物素化辣根過氧化物酶，在實驗測定的最適pH(即pH4)結(jié)合。將板洗滌，辣根過氧化物酶活性是按照上文方法v(a)的描述，使用ABTS作為底物測定的。如圖5所示，在這些條件下，沒有修飾的抗生物素蛋白和硝基抗生物素蛋白的生物素結(jié)合性能非常接近。
實施例3 生物素化蛋白質(zhì)從硝基抗生物素蛋白的釋放。
(i)為確定生物素從硝基抗生物素蛋白柱上釋放的優(yōu)選條件，將生物素化BSA(1.5mg/150ul緩沖液A，pH4)加樣至按照實施例1(iv)的含有硝基抗生物素蛋白-瓊脂糖樹脂的柱上。用逐漸增高pH的緩沖液A、B和C洗滌被結(jié)合的材料，監(jiān)測流出級分中的蛋白質(zhì)濃度。從圖6可以看出，從該樹脂上釋放生物素化蛋白質(zhì)需用堿性溶液(緩沖液C，pH10)。
(ii)使用相同的方法，但僅用緩沖液C，pH10洗滌，使用按照實施例1(iii)的方法將硝基抗生蛋白鏈菌素連接到瓊脂糖上而制備的硝基抗生蛋白鏈菌素柱得到了相似的結(jié)果。
(iii)在一相似的實驗中，探討了用游離生物素競爭從根據(jù)實施例1(iv)制備的含有硝基-抗生物素蛋白瓊脂糖的柱上釋放生物素化BSA的方法。將生物素化BSA(1.5mg/150μl緩沖液A，pH4)加樣至一個2ml硝基抗生物素蛋白-瓊脂糖柱上。將含有0.6mM生物素的緩沖液A，pH4通過該柱，監(jiān)測蛋白質(zhì)濃度。如圖8所示，大部分的生物素-BSA可通過使用含0.6mM生物素的緩沖液A，pH4，而被釋放出來。對生物素-BSA的這種生物素-誘導(dǎo)的洗脫作為pH值的函數(shù)進行了研究，使用的是緩沖液A、B或C，pH值從4到10。
(iv)在相同條件下，用按照實施例1(iv)的方法制備的硝基抗生物素蛋白-瓊脂糖樹脂進行了相似的實驗，只是游離的生物素被溶解于從4到10范圍內(nèi)的不同pH值緩沖液中。如圖9所示，游離生物素在被測試的整個pH范圍內(nèi)都是一種有效的洗脫劑。將pH10時沒有生物素的洗脫作為對照。
實施例4 非修飾生物素-結(jié)合位點的封閉由于在所述條件下僅獲得結(jié)合-位點酪氨酸的部分修飾，非修飾位點會給硝基抗生物素蛋白隨后的使用帶來問題。這樣，將按照實施例1(i)制備的含有不同硝基-酪氨酸水平的(見圖2)的硝基抗生物素蛋白樣品涂敷于微量滴定板的孔中(1μg/100μl PBS/孔)。將相似濃度的天然卵白抗生物蛋白用作對照。將孔用1％BSA封閉，并用緩沖液A，pH4中0.6mM生物素的過量游離生物素將被吸附的蛋白質(zhì)樣品選擇性封閉。占據(jù)被修飾結(jié)合位點的生物素可用上文實施例3所述的堿性溶液(緩沖液C，pH10)釋放。封閉和堿處理后，該部分硝基化的抗生物素蛋白樣品的生物素結(jié)合能力用生物素化過氧化物酶系統(tǒng)(上文方法v(a))，通過在微量滴定板中的酶檢測來確定。如圖10所示，發(fā)現(xiàn)結(jié)合與修飾程度成比例，在約60％修飾時結(jié)合值最大。
實施例5 硝基抗生物素蛋白柱的重復(fù)使用對實施例1(iii)中的含有瓊脂糖-硝基-抗生物素蛋白樹脂的穩(wěn)定性通過生物素化蛋白質(zhì)的重復(fù)加樣和洗脫進行測試。將生物素化BSA的同一種樣品(300μg/1ml緩沖液A，pH4)加樣到一個0.75ml瓊脂糖-硝基-抗生物素蛋白柱上。用緩沖液A，pH4洗滌該柱，并用緩沖液C，pH10洗脫。將該步驟再重復(fù)三次，用Bradford試驗監(jiān)測級分的蛋白質(zhì)(圖11A)。如圖11B所示，洗脫出的級分的累積顯示出在硝基抗生物素蛋白柱上結(jié)合了和從它釋放出了基本相同水平的生物素化蛋白質(zhì)。
實施例6 用生物素-蛋白質(zhì)A/硝基-抗生物素蛋白柱純化IgG對硝基抗生物素蛋白柱作為通用的親和樹脂的性能進行檢測。在這一方法中，將生物素化蛋白質(zhì)A連接于瓊脂糖上并倒入柱中。將該柱用作直接從全兔血清中純化免疫球蛋白的免疫親和柱，并隨后將生物素化蛋白質(zhì)A從柱中釋放出來。向一個含有按照實施例1(iv)方法制備的0.5mg硝基抗生物素蛋白/ml瓊脂糖的柱中加入存在于4ml緩沖液A、pH4的1.8mg蛋白A。將全兔血清(0.5ml，用0.1M緩沖液B，pH8稀釋4倍)加樣到柱上。用同一種緩沖液洗滌柱，然后用10mM濃度的同一種緩沖液洗滌。被結(jié)合的免疫球蛋白是用緩沖液A，pH4，從柱中釋放的。隨后用50mM緩沖液C，pH10去除生物素化蛋白質(zhì)A。結(jié)果示于圖12。然后通過SDS-PAGE檢測各個峰，顯示出為期望蛋白質(zhì)的基本上純凈的級分(圖13)。該純化的免疫球蛋白顯示出與通過商業(yè)途徑獲得的相當級分的樣品純度相當。并且通過堿處理從柱中洗脫出的生物素基蛋白質(zhì)A具有相似的純度。
實施例7 碘化的抗生物素蛋白的制備以及生物素化蛋白質(zhì)與吸附在微量滴定板上的碘化抗生物素蛋白的結(jié)合(i)碘化抗生物素蛋白的制備。將0.5ml磷酸鈉緩沖液，pH7，中的一個2mg抗生物素蛋白的樣品用10μl KI溶液(32mg/ml)和200μl的氯胺-T(2mg/ml)處理。在23℃溫育30分鐘后，在1分鐘的期間內(nèi)加入300μl偏亞硫酸氫鈉溶液(2mg/ml)。加入1ml 1％KI溶液進行終止。將該樣品相對于雙蒸水透析過夜。
(ii)生物素化過氧化物酶與碘化抗生物素蛋白的結(jié)合。將碘化抗生物素蛋白吸附到微量滴定板上，將該板用1％BSA溶液封閉，將生物素化辣根過氧化物酶的樣品加樣至不同pH的緩沖液A、B和C中(37μg/0.1ml緩沖液/孔)。將板沖洗，過氧化物酶活性是按照上文方法v(a)所述，使用ABTS作為底物來測定的。如圖14所示，pH5時具有最適結(jié)合。
實施例8 偶氮酪氨酸-抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素的制備將對-阿散酸(對-氨苯基胂酸(100mg)溶解于0.3M HCl(10ml)中，并用NaNO2(5ml水中35mg)冰浴處理。6分鐘后，將該溶液用NaOH把pH調(diào)整到5，并立即使用。將0.5ml所產(chǎn)生的偶氮阿散酸(在0.1M硼酸鈉緩沖液中2mg，pH8.4)加到抗生物素蛋白溶液中(4.5ml 0.1M硼酸鈉緩沖液中5mg，pH8.4)，在室溫下反應(yīng)進行2小時。用分光光度計跟蹤反應(yīng)進程(λmax 342nm)，并將偶氮阿散酸化-衍生的抗生物素蛋白相對于PBS或50mM Tris-緩沖液，pH8透析。
用相似的方法制備偶氮-酪氨酸抗生蛋白鏈菌素。
用其它的對-氨苯基衍生物，如氨茴酸(鄰-氨基苯甲酸)、對-氨基苯甲酸、對-氨基苯磷酸和磺胺酸(對氨基苯磺酸)代替對-阿散酸，可得到相應(yīng)的偶氮衍生物實施例9 氨基酪氨酸-抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素的制備。
將硝基-抗生物素蛋白或偶氮酪氨酸-抗生物素蛋白(1ml 50mMTris緩沖液，pH8中2mg)用24倍摩爾過量的Na2S2O4(在4ml同種緩沖液中的1.4mg)處理。在室溫下反應(yīng)進行16小時，用分光光度計驗證還原的程度(對于硝基-抗生物素蛋白在λmax 428nm或?qū)τ谂嫉野彼?抗生物素蛋白在342nm的吸收降低)。將該蛋白質(zhì)相對于PBS進行透析。
氨基酪氨酸-抗生蛋白鏈菌素是通過相似的方法，使用1mg硝基抗生蛋白鏈菌素和相當摩爾過量的Na2S2O4制備的。
參考文獻1.Argarana，C.E.，Kuntz，I.D.，Birken，S.，Axel，R.and Cantor，C.R.(1986)Nucl.
Acids Res.14，1871.
2.Bayer，E.A.，Ben-Hur，H.and Wilchek，M.(1990)Methods Enzymol.184，80.
3.Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1990)Methods Enzymol.184，138.
4.Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1992a)Methods in Molec.Biology 10，137.
5.Bayer，E.A and Wilchek，M.(1992b)Methods in Molec.Biology 10，143.
6.Chandra，G.and Gray，G.(1990)Methods Enzymol.184.70.
7.Finn，F(xiàn).M.and Hofmann，K.H.(1985)Methods Enzymol.109，418.
8 Gitlin，G.，Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1987)Biochem.J.242，923.
9.Gitlin，G.，Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1988a)Biochem.J.250，291.
10.Gitlin，G.，Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1988b)Biochem.J.256，279.
11.Gitlin，G，Khaiy，I.，Bayer，E.A.，Wilchek，M.and Muszkat，K.A.(1989)Biochem.J.259，493.
12.Gitlin，G.，Bayer，E.A.and Wilchek，M(1990)Biochem.J.269，527.
13.Gorecki，M.，Wilchek，M.and Patehornik，A.(1971)Biochim.Biophys.Acta229，590-595.
14 Green，N.M.(1975)Adv.Protein Chem.29，85.
15.Green，N.M.(1990)Methods Enzymol.184，51.
16.Hiller，Y.，Bayer，E.A.and Wilchek，M.(1990)Methods Enzymol.184，68.
17.Katchalski-Katzir，E.(1993)TIBTECH 11，471.
18.Kohn，J.and Wilchek，M.(1984)Appl.Biochem.Biotechnol.9.285.
19.Riordan，J.F.，Sokolovsky，M.and Vallee，B.L.(1966)J.Am.Chem.Soc.88，410420.Scott，J.K.(1992)TIBS 17，241.
21.Sokolovsky，M.，Riordan，J.F.and Vallee，B.L.(1967)Biochim.Biophys.Res.
Conmmunic.27，20-25.
22.Suter，M.，Cazin，Jr.J，Butler，J.E.and Mock，D.M.(1988)J.Immunol.Meth113，8323.Weber.P.C.，Ohlendorf，D.H.，Wendolosky，J.J.and Salemme，F(xiàn).R.(1989)Science 243，85.
24.Wilchek，M.and Bayer，E.A.(1988)Analytical Biochemistry 171.，1.
25.Wilchek，M.and Bayer，E.A.，Eds.(1990)“Avidin-Biotin Technology”，Methodsin Enzymology，Vol.184，Academic Press，Inc.，San Diego.
權(quán)利要求
1.一種選自下組的生物素-結(jié)合的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型的分子(i)天然卵白抗生物素蛋白；(ii)重組抗生物素蛋白；(iii)去糖基形式的抗生物素蛋白；(iv)細菌抗生蛋白鏈菌素；(v)重組抗生蛋白鏈菌素；(vi)截短的抗生蛋白鏈菌素；和(vii)在必需的酪氨酸殘基之外的位點被修飾的(i)-(vi)中的衍生物，其特征在于，在所說的生物素-結(jié)合的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子中，生物素-結(jié)合位點的必需酪氨酸殘基被修飾，其修飾方式使其pKa與相應(yīng)的非修飾的抗生物素蛋白類型分子中的沒有被修飾的酪氨酸殘基的pKa相比被降低。
2.按照權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型的分子，其中生物素-結(jié)合位點酪氨酸殘基的pKa是通過在酪氨酸殘基上加入一個或多個親電和/或多個親核基團而降低的。
3.按照權(quán)利要求2所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，其中經(jīng)修飾的必需酪氨酸殘基具有以下通式
其中X1和X2各自是一個選自硝基、鹵素、NR1R2和-N＝NR3的基團，其中R1和R2每自選自鹵素、C1-C8烷基和C1-C6羧?；?、和R3是由酸基取代的芳基。
4.按照權(quán)利要求3所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型的分子，其中X1和/或X2是硝基。
5.硝基-酪氨酸天然卵白抗生物素蛋白。
6.硝基-酪氨酸細菌抗生蛋白鏈菌素。
7.一種制備權(quán)利要求4至6中任意一項所述的生物素-結(jié)合硝基-酪氨酸修飾的抗生物素蛋白類型分子的方法，包括將沒有修飾的抗生物素蛋白類型分子在非變性條件下與四硝基甲烷反應(yīng)。
8.按照權(quán)利要求3所述的經(jīng)修飾的抗生物素基白類型的分子，其中X1和/或X2為鹵素。
9.按照權(quán)利要求8所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，其中所說的鹵素是碘。
10.按照權(quán)利要求3所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，其中X1和/或X2是一個偶氮基團。
11.按照權(quán)利要求3所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，其中X1和/或X2是一個氨基基團。
12.按照權(quán)利要求3所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，其中X1和/或X2是一個-N＝NR3基團，其中R3是由羧基或由一個衍生于一種無機酸的酰基取代的苯基。
13.按照權(quán)利要求1至6和8至12中任意一項所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，它被連接于固體支持物上。
14.按照權(quán)利要求3所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，其中該固相支持物是一種樹脂、一種微量滴定板、玻璃珠或磁珠。
15.按照權(quán)利要求14所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，其中該固體支持物是一種樹脂。
16.按照權(quán)利要求15所述的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子，其中該樹脂是瓊脂糖。
17.一種權(quán)利要求1中的用于固定生物素化配體的、含有一種連接于樹脂上的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子的柱。
18.按照權(quán)利要求17所述的柱，其中所說的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子是硝基-酪氨酸天然卵白抗生物素蛋白，所說樹脂是瓊脂糖。
19.按照權(quán)利要求17所述的柱，其中所說的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子是硝基-酪氨酸細菌抗生蛋白鏈菌素，所說樹脂是瓊脂糖。
20.在使用抗生物素蛋白一生物素技術(shù)的方法中，按照權(quán)利要求1至6，8至12和14至16中任意一項所述的生物素-結(jié)合的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子的應(yīng)用，或按照權(quán)利要求17至19中任意一項所述的柱的應(yīng)用。
21.按照權(quán)利要求20的所說經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子或所說的柱在親和層析中、在細胞分離中、在細胞的固定和釋放中、在DNA的捕獲和釋放中、在生物素化酶的固定和釋放中、在噬菌體文庫的制備中以及作為生物感應(yīng)器可逆性基質(zhì)中的應(yīng)用。
22.一種在使用抗生物素蛋白-生物素技術(shù)的方法中回收抗生物素蛋白柱或者生物素化配體的方法，它包含(i)將一種生物素化配體固定于一種含有根據(jù)權(quán)利要求1的連接于樹脂上的經(jīng)修飾抗生物素蛋白類型分子的柱上；(ii)對這樣被固定的生物素化配體進行所需的反應(yīng)或分離步驟；(iii)通過改變條件，從該固定化的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱上除去生物素化的配體。(iv)回收生物素化的配體和/或經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱，供以后使用。
23.按照權(quán)利要求22所述的方法，其中該生物素化的配體是通過提高pH值、加熱、加入過量濃度的生物素或低濃度的尿素、胍或硫氰酸脂、和/或其組合而從固定化的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱上除去的。
24.按照權(quán)利要求23所述的方法，其中該生物素化的配體是通過將pH提高至10而從固定化的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱上除去的。
25.按照權(quán)利要求23所述的方法，其中該生物素化配體是通過加入0.6mM生物素而從固定化的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白柱上除去的。
26.按照權(quán)利要求22至25中任意一項所述的方法，其中所說經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子具有以下通式表示的經(jīng)修飾的必需酪氨酸殘基
其中X1和X2各自為一個選自硝基、鹵素、NR1R2和-N＝NR3的基團，其中R1和R2各自選自氫、C1-C8烷基和C1-C6羧酸?；?、和R3是由一個酸基取代的芳基。
27.按照權(quán)利要求22至25中任意一項所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子是硝基-酪氨酸天然卵白抗生物素蛋白。
28.按照權(quán)利要求22至25中任意一項所述的方法，其中所說經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子是硝基-酪氨酸細菌抗生蛋白鏈菌素。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生物素——結(jié)合的經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子,其中生物素結(jié)合位點的必需酪氨酸殘基被修飾,其修飾方式使其pKa與相應(yīng)的非修飾抗生物素蛋白類型分子中的沒有被修飾的酪氨酸殘基的pKa相比被降低。修飾作用是用諸如硝基、鹵素、偶氮和氨基在相對于酪酸殘基的羥基的一個或兩個鄰位取代而進行的。該經(jīng)修飾的抗生物素蛋白類型分子可用于抗生物素蛋白生物素技術(shù)的所有應(yīng)用中。
文檔編號C12N11/02GK1191018SQ96195475
公開日1998年8月19日 申請日期1996年6月13日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月14日
發(fā)明者愛德華·A·拜爾, 梅厄·維爾徹克, 埃利·莫拉格 申請人:耶達研究與發(fā)展有限公司