專利名稱：用于豬同窩仔規(guī)模的dna標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選豬以確定與較大的同窩仔規(guī)模有關(guān)的骨橋蛋白(OPN)等位基因的有或無的方法，涉及用該方法預(yù)測豬的同窩仔規(guī)模以及用于實(shí)現(xiàn)該方法的試劑盒。
如果能夠提高動(dòng)物同窩仔的規(guī)模，就可以提高肉的產(chǎn)量和動(dòng)物飼養(yǎng)效率?？梢杂奢^少的親代動(dòng)物產(chǎn)出相同數(shù)量的家畜，由此可降低生產(chǎn)成本。另外，動(dòng)物飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)會(huì)因篩選出更多具有改善的遺傳學(xué)性狀的后代而受益。不過，同窩仔規(guī)模難于用常規(guī)方法選擇，因?yàn)槠渚窒抻谝环N性別，而且嚴(yán)重受非遺傳因素影響(遺傳力是表型變異的一種指標(biāo)，它是由遺傳差異引起的，對于豬的同窩仔規(guī)模來說，這種變異約為0.1)。
提高同窩仔規(guī)模的一種方法可能是將具有明顯較大同窩仔規(guī)模的品種的優(yōu)良基因?qū)肷a(chǎn)品系。不過，數(shù)量遺傳學(xué)表明，諸如同窩仔規(guī)模的復(fù)雜性狀受控于很多基因，每個(gè)基因?qū)υ撔誀畹淖饔幂^小。如果事實(shí)確實(shí)如此的話，選擇復(fù)雜的性狀的遺傳學(xué)過程將是極為緩慢的。另一種觀點(diǎn)是，盡管有很多基因與復(fù)雜的性狀相關(guān)，但僅有少數(shù)的相關(guān)基因(主基因)對該性狀有較大影響。如果這種觀點(diǎn)成立，則該性狀的遺傳學(xué)進(jìn)程可以很快，只要可以鑒定并篩選相關(guān)主基因的優(yōu)良等位基因。由于基因組作圖的出現(xiàn)，鑒定影響數(shù)量性狀的基因(數(shù)量性狀基因座，QTL)已成為現(xiàn)實(shí)，是通過檢查所述性狀與分子標(biāo)記之間的關(guān)系而實(shí)現(xiàn)的，所述分子標(biāo)記均勻分布在被作圖動(dòng)物的基因組中。對于選擇來說，重要的是該標(biāo)記表型的遺傳力為1.0。
已知豬的中國梅山(Meishan)品種每窩比大多數(shù)多產(chǎn)的歐洲品種多產(chǎn)4個(gè)左右豬仔。這種品種的多產(chǎn)(同窩仔規(guī)模)基因在提高商品化西方豬品種的同窩仔規(guī)模的計(jì)劃中極有價(jià)值。事實(shí)上，已證實(shí)與梅山品種的雌激素受體基因(ESR)相關(guān)的遺傳標(biāo)記對同窩仔規(guī)模有有益影響，有關(guān)資料披露于WO 92/18651中。
綿羊的Booroola Merino品種極為多產(chǎn)。3個(gè)或3個(gè)以上的同窩仔規(guī)模是常見的。已證實(shí)該品種突出的多產(chǎn)性是由于單一基因FECB的作用(參見GW Montgomery等，Endocrine Reviews，13309-328(1992))。用人DNA標(biāo)記進(jìn)行的遺傳作圖證實(shí)，F(xiàn)ECB的人類形式位于染色體4上(GW Montgomery等，Nature Genetics，4410-114(1993))并與編碼分泌性磷蛋白-1(SPP-1)的基因密切相關(guān)，SPP-1又被稱作骨橋蛋白(OPN)、2ar、骨涎蛋白-1、44kDa骨磷蛋白和腫瘤分泌性磷蛋白。比較作圖(H Ellegren等，Genomics，17599-603(1993))已證實(shí)人的染色體4和豬的染色體8極為相似(同線的)。豬SPP-1基因也位于染色體8上。
最近已證實(shí)，牛的FECB連鎖標(biāo)記并不能作為選擇較高排卵率的群體的較大同窩仔規(guī)模的標(biāo)記(Blattman等，Mid-West Animal ScienceMeeting，1843(1995))。
不過，我們已驚奇地發(fā)現(xiàn)，在豬上，OPN的某些DNA標(biāo)記與同窩仔的規(guī)模相關(guān)，因此可以用于篩選有較大機(jī)會(huì)產(chǎn)生較大同窩仔規(guī)模的豬，和選擇具有代表較小同窩仔規(guī)模的等位基因的豬。在本文中，“較大同窩仔規(guī)?！笔侵竿C仔的規(guī)模明顯大于特定群體的平均值。
已驚奇地發(fā)現(xiàn)，一方面綿羊、牛和人之間圍繞OPN在染色體同線性方面有一個(gè)明顯的斷裂點(diǎn)，另一方面小鼠和豬之間也有一個(gè)斷裂點(diǎn)(Montgomery等，J.Repruduction and Fertility supplement，49113-121(1995))。這表明，所述染色體的這一部分在具有較大同窩仔的動(dòng)物(小鼠和豬)和具有較小同窩仔的動(dòng)物(人、綿羊和牛)之間有所不同，因此所述主基因?qū)ι沉Φ挠绊懣杉右孕揎棥？赡艿慕忉尠ㄍㄟ^形成更多的轉(zhuǎn)錄活性或無活性區(qū)可以提高或降低所述主基因的表達(dá)；該主基因可直接置于一種修飾過的啟動(dòng)因子的操縱之下；所述主基因相對OPN的位置可以改變，以使OPN成為在確定豬的同窩仔規(guī)模方面比在確定綿羊或牛的同窩仔規(guī)模方面更有用的標(biāo)記。
因此，第一方面，本發(fā)明提供了一種用于篩選豬的方法，以確定更有可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，該方法包括以下步驟
(i)獲得豬的基因組DNA樣品，和(ii)分析步驟(i)所獲得的基因組DNA，此確定存在哪些OPN等位基因。
理想的是，步驟(ii)，即OPN等位基因的確定是通過檢查直接或間接與OPN連鎖的特定DNA標(biāo)記而實(shí)現(xiàn)的。
通過遺傳重組可以破壞遺傳標(biāo)記和決定一種特定性狀的基因之間的聯(lián)系。因此，標(biāo)記與有關(guān)基因之間的物理距離越小，通過重組將其分開的可能性越小。還可以確定其它DNA標(biāo)記的特定等位基因與已知與特定基因(例如，本文的OPN基因)相關(guān)的DNA標(biāo)記的等位基因之間的連鎖，該等位基因事先已被證實(shí)與特定性狀相關(guān)。因此，在本發(fā)明中，用OPN基因至少在短期內(nèi)可以篩選有可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬或有可能產(chǎn)生較小同窩仔的豬，通過選擇其它染色體8標(biāo)記的特定等位基因而間接選擇OPN相關(guān)標(biāo)記的某些等位基因。已知與豬染色體8上的OPN相連的上述標(biāo)記的例子包括Sw61、Sw1085、Sw194、Sw16、Sw790和SO178，所述的標(biāo)記均為微衛(wèi)星。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用了若干此類標(biāo)記。例如，可以用成對的標(biāo)記基因囊括所述主基因，以降低重組的可能影響。例如，這種標(biāo)記重組的例子包括SO 178和SW 61和SO 178和SW 790。
由于其作用可能與豬(和小鼠)和綿羊(和人及牛)的基因順序的差異相關(guān)，這表明最有用的第二標(biāo)記可能位于豬染色體8的非同源(非同線性)區(qū)。已知囊括該區(qū)域的標(biāo)記的合適組合的一個(gè)例子是OPN和SO 178。不過，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以用常規(guī)方法鑒定其它有用的標(biāo)記。
與OPN相關(guān)的一個(gè)特定遺傳標(biāo)記是微衛(wèi)星。它是4、3或更常見為2個(gè)核苷酸的簡單的序列重復(fù)，它以大體上隨機(jī)的方式出現(xiàn)在基因組中，大約每50,000個(gè)堿基有一個(gè)(每個(gè)單倍體基因組約有60,000個(gè)微衛(wèi)星)。復(fù)制期間DNA聚合酶打滑和重組期間的不均等交換被認(rèn)為可導(dǎo)致重復(fù)單位的減少或增加。這意味著微衛(wèi)星通常是多形性的，并可以有幾個(gè)重復(fù)長度的等位基因。
與一種特定基因相關(guān)的微衛(wèi)星的一個(gè)例子是(CA)n，可產(chǎn)生可能重復(fù)單位長度的等位基因，例如(CA)2、(CA)9、(CA)10、(CA)11和(CA)12。
采用可以與和特定基因相關(guān)的微衛(wèi)星的側(cè)翼區(qū)雜交的引物(例如，在嚴(yán)格條件下)，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)，可以產(chǎn)生不同長度的PCR產(chǎn)物，其長度取決于所述微衛(wèi)星的具體重復(fù)單位長度等位基因。
用與OPN基因相關(guān)的微衛(wèi)星分析該P(yáng)CR產(chǎn)物與同窩仔規(guī)模的關(guān)系，可以確定豬的與增加和減少同窩仔規(guī)模相關(guān)的標(biāo)記長度等位基因。
可以與所述微衛(wèi)星的側(cè)翼區(qū)雜交的合適引物對包括具有以下序列的引物GCTAGTTAATGACATTGTACATAA；或CCAATCCTATTCACGAAAAAGC；和GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC；或CAACCCACTTGCTCCCAC.
具體地講，已證實(shí)被稱為132和136的上述微衛(wèi)星標(biāo)記的重復(fù)單位長度等位基因與豬的較大同窩仔規(guī)模相關(guān)。另外，還發(fā)現(xiàn)被稱為112的重復(fù)單位長度等位基因與豬的較小同窩仔規(guī)模相關(guān)。
事實(shí)上，與較大同窩仔規(guī)模相關(guān)的等位基因主要源自歐洲親代原種。這與預(yù)期的結(jié)果相反，因?yàn)槿缟纤觯飞狡贩N比Landrace或Duroc每窩多4個(gè)豬仔，預(yù)計(jì)有益的標(biāo)記可能會(huì)與由梅山親代原種遺傳下來的基因相關(guān)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種篩選豬的方法，以確定更可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，該方法包括以下步驟(i)獲得豬的基因組DNA樣品；(ii)讓(i)中的基因組DNA與一種或幾種合適的引物雜交；(iii)用(ii)中的雜交核酸進(jìn)行一或幾輪PCR；和(iv)分析在(iii)中得到的PCR產(chǎn)物的長度。
理想的是，用以試劑盒形式提供的試劑和說明實(shí)施本發(fā)明方法。
因此，第三方面，本發(fā)明提供了一種用于篩選豬的試劑盒，以確定更可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，該試劑盒包括一種或幾種能夠鑒定豬基因組DNA樣品中的OPN等位基因的試劑或材料。
本發(fā)明的一種優(yōu)選試劑盒包括能夠鑒定與和OPN基因連鎖的DNA標(biāo)記(例如微衛(wèi)星標(biāo)記)相關(guān)的等位基因的試劑或材料。這種試劑盒最好包括一個(gè)或幾個(gè)選擇性地與標(biāo)準(zhǔn)PCR試劑一起的DNA引物。
最后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本文所述方法和試劑盒可以與其它已知方法和試劑盒結(jié)合，以篩選豬，確定更有可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬(或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬)。所述其它方法和試劑盒的例子披露于WO 92/18651中。當(dāng)然，有可能生產(chǎn)出可用于通過兩種方法篩選豬DNA的組合試劑盒。
在WO-A-9218651和USSN 08/312312中披露了基于與ESR基因的連鎖確定哪些豬更有可能產(chǎn)生較大同窩仔規(guī)模的方法。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的篩選方法可以與早先公開的ESR篩選方法結(jié)合，以提供用于這種確定的更有力的工具。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于篩選豬的方法，以確定更有可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，該方法包括以下步驟(i)獲得豬的基因組DNA樣品；(ii)分析在步驟(i)中獲得的基因組DNA，以確定存在哪些OPN等位基因；和(iii)分析步驟(i)中得到的基因組DNA，以確定存在哪些至少一個(gè)與豬的同窩仔規(guī)模相關(guān)的其它基因的等位基因。
在本發(fā)明這方面的一種實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)其它基因是ESR基因，如在WO-A-9218651和USSN 08/312 312中所披露的。
最后一方面，本發(fā)明提供了一種用于篩選豬的試劑盒，以確定更有可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，該試劑盒包括一種或幾種能夠鑒定豬基因組DNA樣品中OPN等位基因的試劑或材料，以及一種或幾種能夠鑒定豬基因組DNA樣品中至少一個(gè)與同窩仔規(guī)模有關(guān)的其它基因的等位基因的試劑或材料。
本發(fā)明的每一方面的優(yōu)選特征可以互換使用。
下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，這些實(shí)施例并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。例1DNA制備DNA可以用任何含有細(xì)胞核的組織材料制備，例如，白細(xì)胞，毛囊、耳切跡和肌肉。本文所述方法涉及血細(xì)胞制備；其它組織可以作類似處理，將材料直接懸浮于K緩沖液中，然后從所述血液方法的同一階段開始處理。本文所述方法能制備一種含有粗制DNA的細(xì)胞裂解液，所述DNA適于PCR擴(kuò)增。不過，任何用于制備純化或粗制DNA的方法都同樣有效。
應(yīng)將血液收集在50mM EDTA，pH8.0，以防止凝固。將50μl血分配到微量離心管(0.5ml Eppendorf管或等同物)中。將450μlTE緩沖液加至其中，以裂解紅血細(xì)胞(血基抑制PCR)，并將該混合物攪拌2秒鐘。然后在一臺(tái)微量離心機(jī)上以13,000g將完整的白細(xì)胞和殘余的紅細(xì)胞離心12秒。通過用一個(gè)低壓真空泵系統(tǒng)輕輕吸去上清液。然后再加入450μl的TE緩沖液，以裂解前面的離心收集的殘余紅細(xì)胞和白細(xì)胞。如果沉淀中有任何紅色物，就重復(fù)以上方法，直到沉淀變白。在從沉淀的白血細(xì)胞中除去最后一滴上清液后，加入100μl含有蛋白酶K的K緩沖液，并將該混合物在55℃下培養(yǎng)2小時(shí)。將該混合物加熱至95-100℃，持續(xù)8分鐘，然后將DNA裂解物在-20℃下保存待用。
試劑TE緩沖液10mM Tris-HCl，pH8.01mM EDTAK緩沖液 50mM KCl10mM TRIS-HCl，pH8.32.5mM MgCl20.5％Tween20在用于裂解物之前，每1.0ml K緩沖液中加入10μl的20mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim)。
PCR
在薄壁0.25ml試管中(Perkin Elmer)進(jìn)行以下反應(yīng)1.5μl 10×緩沖液；1.5μl 15mM MgCl2；1.5μl 2mM dNTPs(Pharmacia)；0.5μl 5mM的各種引物(Genosys)；9μl 無菌去離子水；0.1μl(0.5單位)AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)；1μl DNA裂解液。
然后將反應(yīng)試管放在Perkin Elmer 9600熱循環(huán)儀上，并按照以下方案進(jìn)行PCR94℃4分鐘；30輪次，94℃30秒，58℃1分鐘；以及72℃1分鐘；72℃4分鐘；4℃直至滿足需要。
試劑10×PCR緩沖液10mM Tris-HCl，pH8.3(25℃)，500mM KCl正向引物 GCTAGTTAATGACATTGTACATAA或 CCAATCCTATTCACGAAAAAGC反向引物 GTGTCATGAGGTTTGTGCCACTGC或 CAACCCACTTGCTCCCAC如果引物之一是由熒光標(biāo)記標(biāo)記的，所得產(chǎn)物可以在一臺(tái)自動(dòng)DNA測序儀上分析，如在Applied Biosystems 373 DNA Sequencer上用Genescan和Genotyper軟件分析。例2聚丙烯酰胺凝膠電泳將5μl的PCR產(chǎn)物與2μl的加樣緩沖液混合并在1×TBE緩沖液中在非還原聚丙烯酰胺凝膠板上以100V電壓電泳4小時(shí)進(jìn)行分離。然后將所述凝膠放在50ng/ml的溴化乙錠溶液中染色30分鐘，在紫外光透射儀上觀察PCR產(chǎn)物并照像。然后通過與同一凝膠上電泳的已知分子量的標(biāo)記比較的相對遷移率估計(jì)PCR產(chǎn)物的大小(以堿基對計(jì))。估算出的PCR產(chǎn)物大小反映了微衛(wèi)星等位基因的長度。
在PCR中如果使用了熒光標(biāo)記的引物，還可以在Apllied BiosystemsDNA Sequencer上分析PCR產(chǎn)物。
結(jié)果OPN等位基因頻率表1中示出了不同豬群體的OPN等位基因頻率結(jié)果。
表1 不同豬群體的OPN等位基因頻率
L93 Landrace×梅山雜交群體中出現(xiàn)的動(dòng)物L(fēng)94 Duroc×梅山雜交群體中出現(xiàn)的動(dòng)物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)得自L93和L94的雌性動(dòng)物的同窩仔規(guī)模(生育總數(shù)(TNB)和生育存活數(shù)(NBA))，如果可能對若干經(jīng)產(chǎn)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并將該數(shù)據(jù)與相同動(dòng)物組的OPN微衛(wèi)星基因型進(jìn)行比較。用最小二乘方法研究同窩仔規(guī)模與OPN基因型之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系，擬合通用的線性模型。確定每種OPN基因型的同窩仔規(guī)模的最小二乘方法平均值(LSMs)。LSMs是針對該模型中其它可能影響同窩仔規(guī)模的作用調(diào)整的平均值。
用一種等位基因置換模型進(jìn)一步分解單個(gè)OPN等位基因的作用，其中，根據(jù)其是帶有一種特定等位基因的0、1或2個(gè)拷貝對動(dòng)物進(jìn)行分組。測定每組同窩仔規(guī)模的LSMs。L93的結(jié)果示于表2中。
表2 L93的等位基因置換數(shù)據(jù)
顯著水平*，P＜0.05；+，P＜0.10；NS，P＞0.10.
模型包括季節(jié)，AI或天然服務(wù)型、經(jīng)產(chǎn)數(shù)、世代和OPN基因型TNB總生育數(shù)
NBA生育存活數(shù)LSM最小二乘方法平均值n統(tǒng)計(jì)數(shù)，即同窩仔數(shù)數(shù)據(jù)表明，等位基因112似乎與對同窩仔規(guī)模的負(fù)作用相關(guān)，而正面影響見于等位基因132(NBA)和136(TNB)。表1中的數(shù)據(jù)表明，盡管等位基因112和136可能源于Landrace，而等位基因132可能源于Landrace或梅山祖先。不過，由于132等位基因在Landrace中的出現(xiàn)頻率比在梅山品種中高2倍，很可能L93中較大比例的132等位基因源于Landrace。
為了研究這些等位基因作為同窩仔指標(biāo)的潛力，該分析中包括了L94的其它數(shù)據(jù)。該系中不存在等位基因112(可能該等位基因不存在于Duroc中)。表3中示出了等位基因132和136的綜合數(shù)據(jù)。
表3
顯著水平***，P＜0.001；**，P＜0.01；+，P＜0.05；NS，不顯著。
以上數(shù)據(jù)表明，僅有等位基因132對于同窩仔規(guī)模(TNB和NBA)均有顯著的正面作用。盡管等位基因136接近于TNB的顯著性，有可能這里的作用是由于少量的136/136動(dòng)物(3)具有極高的觀察結(jié)果。
已證實(shí)了兩個(gè)不同系的豬(L93和L94)的OPN等位基因與大同窩仔規(guī)模之間的關(guān)系。這表明影響同窩仔規(guī)模的QTL與豬OPN基因密切相關(guān)。不過，在豬的其它家族、系或種中，可能有一個(gè)不同的OPN等位基因與較大的同窩仔規(guī)模相關(guān)。
在下面的表4中給出。了用另一種模型對L93和L94和其它系L07(一種大型白色系)的數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析的結(jié)果。這包括將每個(gè)OPN等位基因作為一個(gè)可變因素，并對每種動(dòng)物的每個(gè)等位基因用0、1或2編號(即每個(gè)等位基因的0、1或2個(gè)拷貝)。
固定的效果是群體-季節(jié)-服務(wù)型和經(jīng)產(chǎn)數(shù)。種畜作為一種隨機(jī)作用包括在內(nèi)。ESR和OPN作為共可變因素配合。每一品系的所有數(shù)據(jù)均包括在內(nèi)，不僅是全同胞或半同胞家族。該分析中排除了第二基因型的不足10個(gè)同窩仔的OPN等位基因。
性狀分析為生育總數(shù)(TNB)和生育成活數(shù)(NBA)。每個(gè)系作三種模型，包括上述固定的、隨機(jī)的和ESR作用。
1.排除OPN的模型2.包括所有OPN等位基因的模型3.包括單個(gè)OPN等位基因的模型每種模型獲得2種對數(shù)相似性。計(jì)算所述模型的顯著性，從模型2或3或從模型1中扣除所述對數(shù)相似性，并將以上結(jié)果與卡方分布進(jìn)行比較。所采用的自由度(df)是兩種模型之間的差。
下表中給出了模型2的每種系的顯著水平和模型3中任何顯著的等位基因。
表4
由以上數(shù)據(jù)可得出以下結(jié)論1.在同窩仔規(guī)模變化方面OPN占較大比例(在包括ESR之后)，L07(P＜0.10)；L93(TNBP＜0.10；NBAP＜0.05)和L94(TNBP＜0.01；NBAP＜0.05)。
2.OPN等位基因132對L93和L94的同窩仔規(guī)模有明顯的正面影響。
3.其它等位基因OPN122(L07)、OPN112和OPN154(L93)和OPN124(L94)有明顯的負(fù)面影響。
例3獲取并分析另一個(gè)系L03(另一種大型以白色為基礎(chǔ)的系)的基因組DNA樣品。結(jié)果示于表5中，分析了416只動(dòng)物的1010個(gè)同窩仔數(shù)。
采用幾種不同的模型。所有模型均包括產(chǎn)仔月份、經(jīng)產(chǎn)數(shù)和種畜的影響。在所有分析中將ESR作為共變量使用。
分析的性狀為總生育數(shù)(TNB)和生育存活數(shù)(NBA)。
所用模型
1.總生育數(shù)＝產(chǎn)仔月份+種畜+ESR+OPN等位基因2.TNB或NBA＝產(chǎn)仔月份+種畜+ESR+OPN112+OPN122等表5
該數(shù)據(jù)表明，就TNB而言，OPN124對等位基因每種拷貝有顯著的(P＜0.01)正面影響，其值為0.7。另外，OPN142對L03的同窩仔規(guī)模有負(fù)面影響的趨勢，類似于對L93的影響。
如上所述，已證實(shí)另一個(gè)基因ESR影響豬的同窩仔規(guī)模，將來還可能鑒定其它與同窩仔規(guī)模相關(guān)的基因。我們研究了兩個(gè)分立基因OPN和ESR的某些有益的等位基因組合是否對同窩仔規(guī)模有加合作用。
為了檢驗(yàn)這種可能性，我們研究了同窩仔規(guī)模與ESR和OPN等位基因的各種組合之間的關(guān)系。下面的表4和表5的結(jié)果表明，有益的OPN等位基因可以與有益的ESR等位基因進(jìn)行有效組合，因此，可以取得比單獨(dú)使用有益的OPN或ESR等位基因更大的同窩仔規(guī)模效果。
表4在品系93(L93)中OPN和ESR標(biāo)記對同窩仔規(guī)模(TNB)的等位基因置換的作用
同窩仔規(guī)模影響假定全加性(OPN132＝+0.49；ESRB＝+0.34)，不同的是在括號中假定OPN132或ESR B的影響＝+0.39。
權(quán)利要求
1.一種用于篩選豬的方法，以確定更有可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，該方法包括(i)獲得豬的基因組DNA樣品；和(ii)分析在(i)中獲得的基因組DNA，以確定存在哪些OPN等位基因。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(ii)中OPN等位基因的測定包括測定至少一個(gè)與至少一個(gè)DNA標(biāo)記相關(guān)的等位基因的存在，所述標(biāo)記直接或間接與OPN相連。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中，所述DNA標(biāo)記是微衛(wèi)星。
4.如權(quán)利要求3的方法，其中，所述DNA標(biāo)記是Sw1085，Sw194、Sw16、Sw790、So178或Sw61。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，將一種或幾種能夠與微衛(wèi)星相關(guān)部分雜交的引物加至基因組DNA的樣品中，接著進(jìn)行一或幾輪PCR，以產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中，通過參照引物延伸產(chǎn)物的長度確定基因組DNA樣品中存在的OPN等位基因。
7.如權(quán)利要求5或6的方法，其中，采用下列引物的一種或幾種GCTAGTTAATGACATTGTACATAA；CCAATCCTATTCACGAAAAAGC；GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC；或CAACCCACTTGCTCCCAC.
8.一種篩選豬的方法，以確定更可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，該方法包括(i)獲得豬的基因組DNA樣品；(ii)讓(i)的基因組DNA與一種或幾種合適引物雜交；(iii)用(ii)的雜交核酸進(jìn)行一或幾輪PCR；和(iv)分析在(iii)中得到的PCR產(chǎn)物的長度。
9.如權(quán)利要求8的方法，由權(quán)利要求2-4中的任一個(gè)或幾個(gè)特征修飾。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中，采用下列引物中的一種或幾種GCTAGTTAATGACATTGTACATAA；CCAATCCTATTCACGAAAAAGC；GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC；或CAACCCACTTGCTCCCAC.
11.一種用于篩選豬的試劑盒，以確定更可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，其包括一種或幾種能夠鑒定豬基因組DNA樣品中OPN等位基因的試劑或材料。
12.如權(quán)利要求11的試劑盒，包括能夠鑒定與和OPN基因連接的DNA標(biāo)記相關(guān)的等位基因。
13.如權(quán)利要求12的試劑盒，其中，所述DNA標(biāo)記是微衛(wèi)星，而所述試劑盒包括一種或幾種能夠與和微衛(wèi)星相關(guān)的基因組DNA的一部分雜交的DNA引物。
14.如權(quán)利要求13的試劑盒，其中，包括一種或幾種下列引物GCTAGTTAATGACATTGTACATAA；CCAATCCTATTCACGAAAAAGC；GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC；或CAACCCACTTGCTCCCAC.
15.如權(quán)利要求13或14的試劑盒，其包括標(biāo)準(zhǔn)的PCR試劑。
16.一種確定哪些與豬OPN基因相關(guān)的DNA標(biāo)記的等位基因與較大同窩仔規(guī)模相關(guān)的方法，包括(i)獲得一種或幾種豬的基因組DNA；(ii)確定與OPN基因相關(guān)的特定DNA標(biāo)記存在哪些等位基因；(iii)將步驟(ii)的結(jié)果與用已知能產(chǎn)生較大同窩仔規(guī)模的一種或幾種豬進(jìn)行的類似測定進(jìn)行比較。
17.一種用于篩選豬的方法，以確定較可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，包括(i)獲得豬的基因組DNA樣品；(ii)分析步驟(i)中獲得的基因組DNA，以確定存在哪些OPN等位基因；和(iii)分析步驟(i)中得到的基因組DNA，以確定存在與豬的同窩仔規(guī)模相關(guān)的至少一種其它基因的哪些等位基因。
18.如權(quán)利要求17的方法，其中，所述至少一種其它基因是ESR基因。
19.如權(quán)利要求17或18的方法，用權(quán)利要求2-7中任一項(xiàng)的一或幾個(gè)特征修飾過。
20.一種用于篩選豬的試劑盒，以確定較可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔的豬，該試劑盒包括一種或幾種能夠鑒定豬基因組DNA樣品中OPN等位基因的試劑或材料，以及一種或幾種能夠鑒定豬基因組DNA樣品中與豬的同窩仔規(guī)模相關(guān)的至少一種其它基因的等位基因的試劑或材料。
21.如權(quán)利要求20的試劑盒，其中，所述至少一種其它基因是ESR基因。
22.如權(quán)利要求20或21的試劑盒，用權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)的一或幾個(gè)特征修飾過。
全文摘要
提供了篩選豬的方法,以確定其是較可能產(chǎn)生較大同窩仔和/或不大可能產(chǎn)生較大同窩仔,其依據(jù)是對存在于豬基因組DNA樣品中OPN等位基因的鑒定。還提供了用于該方法的試劑盒。
文檔編號C12P19/34GK1191576SQ96195760
公開日1998年8月26日 申請日期1996年6月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月12日
發(fā)明者A·J·邁爾哈姆, G·S·普拉斯托, O·I·索思伍德 申請人:達(dá)爾吉蒂公共有限公司