專利名稱：轉(zhuǎn)運蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)運蛋白，具體涉及基于VP22的轉(zhuǎn)運蛋白、VP22的同源物或其片段，還涉及包括轉(zhuǎn)運蛋白的分子和組合物，并涉及高效遞送這類蛋白質(zhì)和任何結(jié)合的分子至靶細(xì)胞群的方法。
1型單純皰疹病毒(HSV-1)UL49基因的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)蛋白VP22(4)，是HSV殼的主要成分，處于病毒殼體外和包膜內(nèi)的毒粒的區(qū)室，由至少10個或更多個病毒多肽構(gòu)成(參見綜述(6))。VP22的分子量為32k，具有較強的堿性，并通過感染細(xì)胞內(nèi)的磷酸化和核苷酸化(1、4、8、9、11)而被修飾。
盡管和已被完全鑒定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白VP16一起是毒粒內(nèi)主要殼蛋白之一，但對于VP22在病毒復(fù)制循環(huán)中的作用知道得很少。尚不知它是否是必需的病毒蛋白，但在類似于VP16的方式中，VP22有可能在感染期間起兩個作用一首先在病毒基因表達中作為功能蛋白，其次在病毒裝配中作為毒粒的結(jié)構(gòu)成分。至于前者，一些跡象表明VP22能與HSV-1 DNA專一性地結(jié)合(2、8、10)。
我們最近闡述了VP16和VP22之間存在穩(wěn)定的和專一性的相互作用，它與裝配和轉(zhuǎn)錄激活中VP16的作用機制有聯(lián)系。在那些研究中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)VP22自身在細(xì)胞中時，它具有獨特的行為模式。在本文所述的工作中，我們擴展了這些研究以詳細(xì)探討細(xì)胞的定位作用，業(yè)已發(fā)現(xiàn)VP22表現(xiàn)出極為獨特的性能，因為它從最初表達它、而且它在其中表現(xiàn)胞質(zhì)定位作用的細(xì)胞有效地轉(zhuǎn)運至單細(xì)胞層內(nèi)的毗鄰細(xì)胞，它在毗鄰細(xì)胞中被攝取入細(xì)胞核。我們試驗過的一些蛋白質(zhì)中的其它任何蛋白質(zhì)例如VP16均未觀測到這種行為模式；而且據(jù)我們所知，這些性能和活性是前所未有的。
當(dāng)將VP22或VP16引入單細(xì)胞層大約30小時之后觀測到VP22的這種意外的性能，雖然平均而言可在約2-5％的細(xì)胞內(nèi)檢測到VP16(是這種試驗中常見的)，但VP22幾乎可在單細(xì)胞層的每個細(xì)胞中被檢測到。我們還發(fā)現(xiàn)VP22胞間轉(zhuǎn)運的專一性，并業(yè)已證實了在該蛋白質(zhì)的C端含有決定子。這是由于，缺失C端34個氨基酸的變體雖然在初始表達細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)定位中被表達，但未被轉(zhuǎn)運至毗鄰的細(xì)胞。
蛋白質(zhì)分泌或外排通常是通過專一途徑發(fā)生的，要求已被完全鑒定的信號序列，分選入輸出途徑中包括的區(qū)室和小泡，可參見綜述(12)。VP22沒有慣常的任意信號序列，而且它的轉(zhuǎn)運途徑和機制相當(dāng)獨特，從未被鑒定過。對于VP22中需要的決定子和細(xì)胞內(nèi)生理需要的進一步研究應(yīng)有助于闡明所涉及的途徑。因此，VP22或者更具體地指VP22轉(zhuǎn)運中涉及的決定子，可被轉(zhuǎn)移到其它蛋白質(zhì)，以能在靶細(xì)胞群內(nèi)轉(zhuǎn)運和有效表達或攝取?？扇菀椎卦O(shè)想該性質(zhì)的廣泛效用和應(yīng)用。
因此，本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)，即有可能將編碼轉(zhuǎn)運蛋白的核酸引入靶細(xì)胞群的第一部分，和任選地用編碼與轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)(例如融合配偶體)的核酸，來表達核酸，任選地從組織專一性啟動子產(chǎn)生蛋白質(zhì)；然后該轉(zhuǎn)運蛋白連同相關(guān)任意蛋白質(zhì)從細(xì)胞中輸出，而被不直接產(chǎn)生蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。通常發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)被靶細(xì)胞群的第二部分高效地攝取，并傾向于定位在靶細(xì)胞群的第二部分的核內(nèi)。于是，將初始引入作用和后續(xù)的轉(zhuǎn)運結(jié)合可使轉(zhuǎn)運蛋白和任何相關(guān)蛋白質(zhì)被高效遞送至靶細(xì)胞群。
因此，本發(fā)明的一方面在于提供這種蛋白質(zhì)它可從表達它的細(xì)胞內(nèi)輸出，并能被其它細(xì)胞例如不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞攝取。該轉(zhuǎn)運蛋白優(yōu)選與需要遞送至靶細(xì)胞群的一種或多種其它蛋白質(zhì)結(jié)合。
進一步的實驗證實，當(dāng)VP22作為提取物被加入胞外介質(zhì)時它就被輸入細(xì)胞。這說明，要發(fā)生觀測到的胞間轉(zhuǎn)運，無需在至少部分細(xì)胞群中表達VP22。
在另一方面，VP22轉(zhuǎn)運蛋白例如可通過共價鍵與相關(guān)分子偶聯(lián)，或與相關(guān)分子結(jié)合，并以該形式應(yīng)用；這與應(yīng)用表達載體產(chǎn)生蛋白質(zhì)和/或相關(guān)分子恰好相反。具體地說，這可使非肽基分子如核酸、藥物或標(biāo)志物(蛋白質(zhì)除外或作為蛋白質(zhì)的替代物)與轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合并被細(xì)胞群攝取，而無需在至少部分細(xì)胞群內(nèi)表達VP22及相關(guān)分子，其中需要將VP22和/或相關(guān)分子遞送至這些細(xì)胞群。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供如下轉(zhuǎn)運蛋白(ⅰ)VP22或其活性部分；(ⅱ)VP22的片段或同源物，包括提供轉(zhuǎn)運性能的一種或多種決定子；或者，(ⅲ)得自VP22的C端34個氨基酸的片段；該轉(zhuǎn)運蛋白任選與需要轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞群的一個或多個其它分子結(jié)合。
在本發(fā)明中，“活性部分”表示比全長VP22短的肽，但它保留被產(chǎn)生它的細(xì)胞分泌和被其它分子攝取的性能。
本發(fā)明的進一步方面是提供包括一種或多種上述轉(zhuǎn)運蛋白的組合物，該蛋白質(zhì)任選與需要遞送至細(xì)胞群的一個或多個分子結(jié)合。
本發(fā)明的又一方面在于提供將所需分子轉(zhuǎn)運入細(xì)胞群的方法，是通過將細(xì)胞暴露于所需分子和上述轉(zhuǎn)運蛋白而實施的。
因此在該方面，本發(fā)明提供的方法避免初始需要用編碼轉(zhuǎn)運蛋白和任選所需分子的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞群。這樣，也可以轉(zhuǎn)運非肽基、不能在細(xì)胞內(nèi)表達的分子，因為可將所需分子和轉(zhuǎn)運蛋白加入細(xì)胞周圍的介質(zhì)中。
在一些實施方案中，可使所需分子與轉(zhuǎn)運蛋白共價偶聯(lián)，并將這些實體暴露于靶細(xì)胞群。也可將所需分子與轉(zhuǎn)運蛋白非共價鍵結(jié)合，例如利用脂質(zhì)基載體摻合如核酸的所需分子和轉(zhuǎn)運蛋白。
因此在另一方面，本發(fā)明提供制備含有待轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞群的所需分子的組合物的方法，該方法包括共價鍵或非共價鍵地結(jié)合所需分子與轉(zhuǎn)運蛋白。
本發(fā)明的進一步方面在于，提供編碼轉(zhuǎn)運蛋白和(任選)相關(guān)分子的核酸。例如，在其中轉(zhuǎn)運蛋白作為融合構(gòu)建物表達的實施方案中，提供的核酸編碼轉(zhuǎn)運蛋白及其融合配偶體。
本發(fā)明的進一步方面在于提供這種表達載體它結(jié)合編碼轉(zhuǎn)運蛋白或其活性部分或其片段的核酸，和任選的編碼相關(guān)分子的核酸。
本發(fā)明的進一步方面在于提供用上述表達載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的進一步方面在于提供轉(zhuǎn)運所需蛋白質(zhì)或肽至靶細(xì)胞群的方法，該方法包括(ⅰ)用編碼轉(zhuǎn)運蛋白的核酸并任選地用編碼與轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)染、感染或其它方式引入靶細(xì)胞群的第一部分；(ⅱ)表達該核酸而產(chǎn)生蛋白質(zhì)，隨后從細(xì)胞輸出該轉(zhuǎn)運蛋白，連同與之結(jié)合的其它任何蛋白質(zhì)，由不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。
應(yīng)懂得，可通過用重組病毒感染而實現(xiàn)靶細(xì)胞群第一部分的轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明的進一步方面在于提供將所需分子轉(zhuǎn)運入細(xì)胞群的方法，該方法包括(ⅰ)將所需分子與轉(zhuǎn)運蛋白偶聯(lián)形成復(fù)合體；和(ⅱ)使細(xì)胞暴露于復(fù)合體中使細(xì)胞攝取該復(fù)合體。
在該方法中，將可以是非肽基的所需分子例如通過共價作用或摻合作用與轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合。
本發(fā)明的進一步方面在于提供上述轉(zhuǎn)運蛋白和載體以用于轉(zhuǎn)運分子的方法中。其中的方法指研究方法和治療方法。本發(fā)明特別適用于引導(dǎo)試劑至需要高效導(dǎo)向的細(xì)胞群的方法中，例如在基因治療方法中；癌的治療，例如可通過遞送腫瘤抑制劑至細(xì)胞。對圖的簡要描述

圖1示出表達VP22的COS-1細(xì)胞的免疫熒光。用VP22表達載體轉(zhuǎn)染生長于蓋玻片上的COS-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染40小時后，細(xì)胞于室溫下100％甲醇中被固定15分鐘，并與抗VP22單克隆抗體P43培養(yǎng)，接著與FITC-綴合次級抗體培養(yǎng)。然后用共焦顯微鏡檢術(shù)(confocal microscopy)分析這些細(xì)胞。(a)VP22表達細(xì)胞顯示的典型核定位。(b)存在于約5-10％表達細(xì)胞中VP22表達的胞質(zhì)模式。(c)當(dāng)表達量增加時觀測到的VP22定位模式。(d)VP22表達導(dǎo)致蛋白質(zhì)被定位于單細(xì)胞層內(nèi)每個細(xì)胞中。
圖2示出VP22在Vero細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運。按對圖1那樣進行轉(zhuǎn)染和檢測，只是該實驗是在Vero細(xì)胞中進行的。該畫面示出處于中心細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)VP22的焦點和在周圍細(xì)胞中(它被定位于細(xì)胞核內(nèi))呈密度梯度。
圖3示出VP22表達的轉(zhuǎn)染時間過程，表明VP22在細(xì)胞之間被轉(zhuǎn)運。COS-1細(xì)胞被轉(zhuǎn)染并在轉(zhuǎn)染后14、20、26和38小時被固定。示出的共焦圖像表示在20hr時間點時放大20倍(a欄)和38hr時放大100倍(b欄)。
圖4示出VP22的蛋白質(zhì)編碼序列，它是HSV-1 UL49基因的產(chǎn)物，該顯示△267突變體的截斷點；圖5(a)和(b)示出當(dāng)含全長VP22和△267 VP22的提取物被加入胞外介質(zhì)后進行的免疫熒光分析結(jié)果；和圖5(c)示出全長VP22和△267 VP22細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印跡；圖6示出應(yīng)用于介質(zhì)時VP22或其修飾物的輸入。
圖7a示出用β-gal的抗體染色后一個顯微注射細(xì)胞的視野的典型圖。
圖7b示出細(xì)胞的相同視野，其中VP22不但可見于顯微注射的細(xì)胞中，而且可見于周圍許多細(xì)胞中。
圖8a示出由T-抗原陽性COS細(xì)胞標(biāo)記的混合細(xì)胞的典型視野。T-抗原抗體未檢測到周圍的BHK細(xì)胞；圖8b示出VP22陽性細(xì)胞，即見到中央COS細(xì)胞加上周圍的非轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞；圖9a示出將表達全長VP22的COS-1細(xì)胞對于VP22和DNA進行染色，并分析有絲分裂不同階段的細(xì)胞。為染色DNA，將碘化丙錠(propidium iodide)加到甘油固定物上，最終濃度為3μg/ml。示出代表前期、前中期和后期的細(xì)胞。
圖9b示出與末端標(biāo)記的40bp寡核苷酸(T24)一起培養(yǎng)的增加量的GST和GST-VP22融合蛋白；采用凝膠移位分析法分析所得復(fù)合體。將VP22專一性復(fù)合體標(biāo)記為1～3；和圖10示出用HSV-1[gH-ve]感染的Vero細(xì)胞。a表示對β-半乳糖苷酶染色而感染24小時后的視野。b示出對VP22染色后的相同視野。c示出對β-半乳糖苷酶染色而感染66小時后的視野。d示出對VP22染色后的相同視野。
原料和方法細(xì)胞和病毒。
HeLa(人上皮癌細(xì)胞)，COS-1細(xì)胞(由SV40 T-抗原轉(zhuǎn)化的猴腎成纖維細(xì)胞)，Vero細(xì)胞(猴腎成纖維細(xì)胞)和BHK(幼倉鼠細(xì)胞)均生長于含10％新生小牛血清的Dulbecco改進的極限必需介質(zhì)中。
質(zhì)粒。
受hCMV IE啟動子控制的真核表達載體pGE 109含VP22開放讀框，以前曾被描述過(4)。簡言之，該表達構(gòu)建物是這樣制備的利用聚合酶鏈反應(yīng)，以含BgⅢ或BamHⅠ限制酶切位點的接頭擴增VP22開放讀框，以便于后續(xù)在hCMV增強子/啟動子區(qū)控制下引入載體。
抗體。
這些實驗用到抗VP16單克隆抗體LP1和抗VP22單克隆抗體p43。p43抗體是通過單純皰疹病毒的毒粒蛋白制劑對小鼠免疫接種而產(chǎn)生的。對VP22有反應(yīng)活性的多克隆抗體(AGV30)是通過用由與VP22開放讀框連接的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成的融合蛋白對兔子免疫接種而產(chǎn)生的。該融合蛋白是這樣生成的通過得自pGE109的BglⅡ-BamHⅠ片段符合讀框插入可商購的(Pharmacia)細(xì)菌表達載體pGEX2T的BamHⅠ位點而產(chǎn)生載體pGST-VP22。往對數(shù)期培養(yǎng)物中加入IPTG(0.1mM)而引入含pGST-VP22的大腸桿菌(E.coli)株HB101，再過3小時后收集細(xì)胞。沉淀后，使細(xì)胞重懸浮于含0.5％NP-40的磷酸鹽緩沖鹽水，用Branson Ultra-sonic細(xì)胞勻漿器進行超聲處理，接著于4℃下在12000rpm時離心凈化20分鐘。然后通過在谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Pharmacia)上親和層析，在PBS 0.5％NP40中洗滌未結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用含5mM谷胱甘肽的10mM Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)洗脫來純化GST-VP22融合蛋白。對3只兔子中的每只每隔4周注射一次(每次約50μg)該融合蛋白的佐劑溶液，并于總計17周后采集血清。
SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。
通過用雙丙烯酰胺交聯(lián)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。干燥含放射性標(biāo)記的樣品的凝膠并暴露于X光片。用于蛋白質(zhì)印跡分析的凝膠被轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾器與合適的抗體反應(yīng)。應(yīng)用辣根過氧化物酶連接的次級偶聯(lián)物，以3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸二水合物(DAB)或以增強的化學(xué)熒光顯影可見到活性帶。
轉(zhuǎn)染和免疫熒光。
轉(zhuǎn)染前那天將細(xì)胞置于6孔盤(6×35mm)，每孔配有一個蓋玻片，密度為每孔2×105個細(xì)胞。用pUC19 DNA將500ng表達質(zhì)粒配成2μg而進行DNA轉(zhuǎn)染，利用磷酸鈣沉淀法，其中以BES[N,N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸]緩中鹽水代替以前描述的HEPES緩沖鹽水作出修改(3,5)。轉(zhuǎn)染40小時后于室溫下在100％甲醇中固定細(xì)胞達15分鐘，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌。轉(zhuǎn)染時，將蓋玻片上的細(xì)胞在室溫下與PBS/10％小牛血清培養(yǎng)15分鐘而封阻細(xì)胞。往此同一溶液(p43在1∶100的稀釋度下)中加入初級抗體并于室溫下培養(yǎng)20分鐘。用PBS充分洗滌后，將次級抗體(FITC偶聯(lián)的抗小鼠IgM和/或Texas Red(德克薩斯紅)偶聯(lián)的抗兔IgG)加入PBS/10％小牛血清并培養(yǎng)10分鐘。再用PBS充分洗滌，然后使蓋玻片在甘油中固定，應(yīng)用Biorad MRC600共焦顯微鏡在雙通道中檢驗。利用普通光學(xué)顯微鏡拍下相差照片。
結(jié)果VP22定位于兩個不同的模式中。
是這樣研究VP22的細(xì)胞定位的先應(yīng)用抗VP22單克隆P43進行VP22表達細(xì)胞的免疫熒光分析，接著通過共焦顯微鏡檢術(shù)分析。依上述方法轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，然后使細(xì)胞在甲醇中固定30～40小時并加工處理以檢測VP22。初始結(jié)果表明，在大部分含VP22的細(xì)胞中，蛋白質(zhì)存在于獨特的核模式中，往往表現(xiàn)出在核邊緣富集。圖1a表示VP22的核模式的典型實例。但在一些細(xì)胞中，VP22呈完全不同的胞質(zhì)的纖維狀模式(圖1b)。此時，檢測到的蛋白質(zhì)在胞質(zhì)內(nèi)呈網(wǎng)絡(luò)狀或籠形模式并被排除在細(xì)胞核外。這種分布不均一性雖然其自身并非異常，但對于本研究的其它HSV殼蛋白(VP16)未觀察到該不均一性，它呈現(xiàn)的模式因細(xì)胞不同而略有不同，主要包括擴散胞質(zhì)模式，少量存在于細(xì)胞核內(nèi)。
進一步研究表明，VP22的胞質(zhì)分布與核分布相互間不是無規(guī)的，即含胞質(zhì)VP22的中心細(xì)胞周圍被含核VP22的細(xì)胞暈圈環(huán)繞，后者細(xì)胞區(qū)中明顯地富含該蛋白質(zhì)，這些細(xì)胞毗鄰含胞質(zhì)VP22的中心細(xì)胞(圖1c)。最后，單細(xì)胞層區(qū)(其中每個細(xì)胞中可檢測到VP22)也呈現(xiàn)這種分布，在少量細(xì)胞中觀察到胞質(zhì)模式，在周圍細(xì)胞中觀察到核模式(圖1d)。
最初是在COS細(xì)胞內(nèi)進行這些實驗的，它依靠SV40T-抗原復(fù)制本文所用的VP22表達質(zhì)粒。盡管我們對于相同載體表達的其它蛋白質(zhì)(例如前述VP16)未檢測到這種分布，但我們希望排除這種可能性即VP22分布模式與COS細(xì)胞的應(yīng)用有關(guān)。于是用Vero細(xì)胞和HeLa細(xì)胞進行了同樣實驗，并得出完全相同的結(jié)果。圖2示出VP22在Vero細(xì)胞中的表達呈上述模式，其中含胞質(zhì)VP22的中心細(xì)胞周圍被含核VP22的細(xì)胞環(huán)繞。此時，可見VP22呈遞降的密度梯度，從中心細(xì)胞至毗鄰細(xì)胞具有稠密的核VP22，而相距更遠(yuǎn)的細(xì)胞核VP22密度更小。
這些意外結(jié)果指出，VP22從最初在其中合成并呈胞質(zhì)形式的細(xì)胞中被轉(zhuǎn)運至毗鄰細(xì)胞，也被轉(zhuǎn)運至再一次轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，其中它定位于細(xì)胞核。為了闡述VP22在細(xì)胞間的移動，研究了轉(zhuǎn)染的時間過程。轉(zhuǎn)染14小時后，可以在各個細(xì)胞中檢測到VP22表達。在20小時，可見到含VP22的細(xì)胞灶，其中含稠密的VP22的中心細(xì)胞周圍環(huán)繞數(shù)個含更低密度的VP22的細(xì)胞(圖3a，較低的放大倍數(shù)以利于看清點的分布)，而38小時后實際上每個細(xì)胞中都含該蛋白質(zhì)(圖3b)。
作為VP22在細(xì)胞間被轉(zhuǎn)運的另一個證據(jù)，用VP22表達載體，和pRG50(一種VP16表達載體)轉(zhuǎn)染獨立的兩皿COS-1細(xì)胞。24小時后，每皿細(xì)胞用胰蛋白酶消化，再將兩組細(xì)胞群混合后固定于蓋玻片上。24小時后，可能檢測VP16表達細(xì)胞，其細(xì)胞核內(nèi)也含有VP22，這表明從未暴露于VP22表達載體的細(xì)胞已攝取VP22蛋白。
胞間轉(zhuǎn)運需要VP22內(nèi)的C端決定子。
為開始鑒定VP22內(nèi)的需要，我們測試了含短鏈(3-4個氨基酸)的符合讀框的插入物的一組變體和缺殘基267至該蛋白末端(殘基301)的缺失突變體。插入突變體在位置60、159、192和267上含插入物。在插入突變體Ins60、Ins159或Ins267中，任何一個都不影響VP22定位的模式或者其進行胞間轉(zhuǎn)運的能力(數(shù)據(jù)未顯示，均與野生型相同)。然而在位置192上的插入具有顯著影響。該突變體表現(xiàn)的分布模式類似于從野生型見到的胞質(zhì)分布；于是，未觀測到毗鄰細(xì)胞中的核染色，總體觀測到更少的陽性細(xì)胞，而且在VP22陽性細(xì)胞中模式全是胞質(zhì)的(圖3c)。
對于缺乏C端34個殘基267-301的缺失突變體觀測到完全相同的表型(圖3d)。應(yīng)注意在位置267上的插入突變體是正常的。分布模式顯示全為胞質(zhì)VP22和267-301缺失突變體和插入突變體192沒有轉(zhuǎn)運至周圍細(xì)胞，這并非由于無效合成。當(dāng)用蛋白質(zhì)印跡比較總的合成時，觀測到相似量的w/t和突變型蛋白質(zhì)。
為開始提出這種可能性，即胞間轉(zhuǎn)運性能可用于轉(zhuǎn)運其它肽或蛋白質(zhì)，我們測試了VP22的一種變體(VP22ep)是否也能被轉(zhuǎn)運，該變體在其C端末端含12個殘基延伸(它含有單克隆抗體識別位點)。結(jié)果表明，該延伸蛋白被有效地轉(zhuǎn)運。事實上，闡述Vero細(xì)胞中轉(zhuǎn)運的圖3b用到該C端延伸變體。如上所述，含中心胞質(zhì)VP22ep的細(xì)胞灶周圍環(huán)繞含核VP22ep的細(xì)胞，而且，至于w/t蛋白質(zhì)，其實可在單細(xì)胞層的每個細(xì)胞中檢測到VP22的表達。此外，被檢測到的蛋白質(zhì)就是融合蛋白，而不是某些偶然的缺失產(chǎn)物，因為它可用抗VP22抗體p43或C端肽延伸的抗體檢測。這一重要結(jié)果表明，確實可以通過將肽或蛋白質(zhì)與合適的轉(zhuǎn)運蛋白如VP22連接而促使它們遞送至細(xì)胞。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以慣常地應(yīng)用這些或者其它定點誘變方法來定位或精修對于轉(zhuǎn)運性能至關(guān)重要和/或重要的VP22中決定子，因而能夠應(yīng)用VP22片段而不是全長蛋白質(zhì)。
從介質(zhì)攝取VP22。
雖然在細(xì)胞表面易于檢測VP22，但我們還不能檢測已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的介質(zhì)中的VP22。然而為檢驗VP22被從胞外介質(zhì)輸入的能力，將從VP22表達細(xì)胞制備的可溶性提取物加入未轉(zhuǎn)染細(xì)胞介質(zhì)。VP22被高效和迅速地輸入并定位于細(xì)胞核(見圖5(a))，加入介質(zhì)后5分鐘內(nèi)被攝取(可解釋我們未能在介質(zhì)中檢測它)。攝取機理不受4℃下培養(yǎng)作用的影響，說明不是通過正常的胞吞作用內(nèi)在化。在對照實驗中，對于所試驗的其它任何蛋白質(zhì)均未觀測到從介質(zhì)攝取。
將含全長(WT)或者截短(△267)VP22的可溶性提取物加入覆蓋蓋玻片上生長的COS-1細(xì)胞的介質(zhì)，1小時后固定細(xì)胞。還通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法分析等量的提取物。
為制備可溶性提取物，用全長或△267 VP22表達載體轉(zhuǎn)染一百萬個COS-1細(xì)胞，16小時后收集細(xì)胞，將提取物調(diào)和于10mMHEPES(pH7.9)、400mM NaCl、0.1mM EDTA、0.5mM DTT和5％甘油中。然后將一半提取物加入覆蓋生長于蓋玻片上5×105個COS-1細(xì)胞的介質(zhì)，1小時后固定細(xì)胞，利用多克隆抗VP22抗體進行免疫熒光分析(見圖5(a)和5(b))。分析1/10的所述提取物是在10％丙烯酰胺凝膠上進行電泳，接著用單克隆抗體P43進行蛋白質(zhì)印跡分析(見圖5(c))。
此外，雖然在可溶性提取物中存在與全長VP22等量的VP22缺失突變體△267(見圖5(c)，△267)，但在細(xì)胞間未檢測出，表明該過程需要C端34個殘基(圖5(b))。
為了進一步研究，我們制備了相應(yīng)于該C端34個殘基的肽并續(xù)上一個12個殘基的標(biāo)記以便于免疫檢測。將此肽應(yīng)用于細(xì)胞介質(zhì)后，它可進入細(xì)胞并被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核(圖6b)。這些實驗表明，這些C端34個殘基是a)所需的和b)足以引起轉(zhuǎn)運。
轉(zhuǎn)運融合蛋白雖然如上所述，我們已闡明可將肽融合至VP22而轉(zhuǎn)運，但尚不知道多大的蛋白質(zhì)可與VP22融合以便利轉(zhuǎn)運。
用質(zhì)粒pGE109、△267或VP22-GFP轉(zhuǎn)染6mm皿中的COS-1細(xì)胞，VP22-GFP的構(gòu)建是將UL49開放讀框插入質(zhì)粒pGFP-N1(Clontech)的BamH1位點，得到VP22與綠熒光蛋白(GFP)的N端的融合體。轉(zhuǎn)染40小時后收集細(xì)胞，制備高含鹽量提取物。這些提取物的蛋白質(zhì)印跡表明，雖然提取物中存在等量的全長VP22和VP22的△267變體，但22-GFP蛋白質(zhì)的含量約小5倍。將等量的各提取物加入覆蓋蓋玻片上COS-1細(xì)胞的介質(zhì)，放置1小時，然后在100％甲醇中固定。用AGV30進行免疫熒光分析。結(jié)果示出(圖6a)，可在受體細(xì)胞中檢測到VP22-GFP融合蛋白，而且它已積累于細(xì)胞核內(nèi)。
總之，我們已證實能獲得表達融合蛋白的細(xì)胞提取物，其中連接的蛋白質(zhì)是32Kda，而且將該提取物應(yīng)用于細(xì)胞介質(zhì)后，可檢測細(xì)胞核內(nèi)的融合蛋白。
顯微注射VP22雖然通過轉(zhuǎn)染而轉(zhuǎn)運適用于組織培養(yǎng)應(yīng)用中，但在組織或病人中遞送可能不是真正有效的途徑。
顯微注射(還有脂質(zhì)體遞送)被用于活體內(nèi)且它還適用于闡述通過活體內(nèi)實用的遞送途徑的VP22轉(zhuǎn)運。
用100ng/μl pGE109和100ng/μl pBAG混合物作為注射細(xì)胞用的標(biāo)記物(PNAS 84:156-160)顯微注射鋪板于蓋玻片上的COS-1細(xì)胞，應(yīng)用Carl Zeiss半自動手工操作型顯微注射器。將細(xì)胞培養(yǎng)24小時，于100％甲醇中固定，應(yīng)用多克隆抗VP22抗體AGV30(1∶500)和單克隆抗β-半乳糖苷酶(1∶50)(Promega)進行雙免疫熒光分析。圖7a示出用β-gal的抗體染色的一個顯微注射細(xì)胞視野的代表圖。在這些細(xì)胞的相同視野內(nèi)，不但在顯微注射細(xì)胞內(nèi)而且在很多非注射細(xì)胞內(nèi)可見到VP22(圖7b)。因此，該遞送途徑可用于活體內(nèi)通過顯微注入例如腫瘤中心以遞送VP22或其變體。當(dāng)然，其它遞送途徑也同樣可行，這里只是闡述一種直接途徑。目前，應(yīng)用兩種主要途徑遞送基因，即脂質(zhì)體介導(dǎo)的感染和病毒感染。因此，可以把VP22或各種修飾物(包括融合蛋白)的基因摻入脂質(zhì)體載體供活體內(nèi)遞送。同樣，脂質(zhì)體遞送也可用于組織培養(yǎng)系統(tǒng)。也可將VP22或其變體的基因插入例如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組以傳遞感染。在兩種情況下，將在初始轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞群中表達，但VP22將被遞送至周圍細(xì)胞內(nèi)。這特別適用于通過設(shè)計成不復(fù)制的缺損病毒載體(disabled virus vectors)的遞送。該場合的遞送將會增強。直接顯微注射基因或者直接應(yīng)用裸DNA也是本領(lǐng)域中正在研究的方法。
轉(zhuǎn)運VP22至不同種細(xì)胞我們已進一步證實了VP22可從初始表達它的細(xì)胞被轉(zhuǎn)運至不同種細(xì)胞。
用被PUC19 DNA從1μg配成4μg的pGE109轉(zhuǎn)染60mm板中的COS-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時后用胰蛋白酶消化除去細(xì)胞，再與先被胰蛋白酶消化的BHK-21細(xì)胞(倉鼠)以1∶20的比率混合。將該細(xì)胞混合物鋪板于6孔板中的蓋玻片上，再進一步培養(yǎng)20小時，然后在100％甲醇中固定。應(yīng)用AGV30(1∶500)和單克隆抗T抗原pAB419(純凈的)進行雙免疫熒光分析以鑒定COS-1細(xì)胞(J.Vi-rol.39:861-869)。
圖8示出混合細(xì)胞的典型視野，其中可見T抗原陽性COS細(xì)胞(圖6a，左邊欄)，周圍的BHK細(xì)胞當(dāng)然未被T抗原抗體檢測到)，而在圖8b右邊欄中是VP22陽性細(xì)胞，即中心COS細(xì)胞和周圍的未轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞均可見。
VP22的DNA結(jié)合性能我們已證實，在VP22在核內(nèi)的細(xì)胞中，它在有絲分裂期間與濃縮染色體結(jié)合。這表明有絲分裂期間與染色體的強烈結(jié)合，且說明一旦VP22或其變體被攝入細(xì)胞，它們也在分裂后被傳給子細(xì)胞。這性能使VP22更適用于遞送。此外我們已證實，在體外，VP22具有非專一性DNA結(jié)合性能，這可能(至少部分地)解釋活體內(nèi)染色質(zhì)結(jié)合。綜合這兩種現(xiàn)象得知VP22有可能結(jié)合DNA和遞送DNA/基因至細(xì)胞核。
分析期間我們發(fā)現(xiàn)，一部分核內(nèi)含VP22的細(xì)胞中該蛋白質(zhì)的模式類似于有絲分裂染色質(zhì)的模式。對VP22和DNA的細(xì)胞雙染色表明，對于有絲分裂各階段的細(xì)胞均可檢測出VP22定位于濃縮染色體周圍(圖9a)。為測定VP22是否能與DNA直接作用，我們通過凝膠阻滯分析測試了GST-VP22融合蛋白結(jié)合40bp寡核苷酸探針的能力。對于GST-VP22觀測到3種復(fù)合體的出現(xiàn)隨劑量增大而增強(圖9b)，在GST對照組中未存在該現(xiàn)象。尺寸更大的復(fù)合體可能表示該蛋白質(zhì)的多聚化，因為所形成的最大一個對于更短的探針結(jié)合效果差(未顯示)。此外，VP22能結(jié)合一系列DNA探針，說明該蛋白質(zhì)與DNA以非專一性方式作用。
VP22在病毒感染的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運基因治療中遞送基因的主要途徑之一是應(yīng)用病毒來進行。這類病毒一般在某些方面無功效以至它們低效復(fù)制或完全不能復(fù)制。希望限制復(fù)制以防止病理方面的并發(fā)癥。病毒載體的安全性是基因治療中的主要問題，研究人員作出很大努力試圖開發(fā)嚴(yán)格缺損的病毒。但應(yīng)用缺損病毒的缺點在于目的基因只能被遞送至初始感染的細(xì)胞。
我們意在直接證實VP22可從病毒感染的細(xì)胞被轉(zhuǎn)運至未感染的細(xì)胞。為此，我們用缺損的單純皰疹病毒突變體HSV-1[gH-ve]感染細(xì)胞。該病毒缺乏病毒糖蛋白gH必需的基因，且必需在含gH的特化互補細(xì)胞系上繁殖。但當(dāng)該病毒感染非互補細(xì)胞(即不含病毒gH的任何細(xì)胞類型)時，該病毒能滲入初始細(xì)胞群、合成病毒蛋白(gH除外)和裝配病毒粒子，但這些都是非感染性的。未發(fā)生第二輪感染。我們想證實VP22可從初始用HSV-1[gH-ve]病毒突變體感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(Desai,P.J.等，J Gen Virol 69(pt 6):1147-56(1988)；Forrester,A.等，J Virol 66:341-8(1992)U.Gompels & A.Minson Virology 153:230-47(1986))。在大約0.2pfu/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)下用HSV-1[gH-ve]感染Vero細(xì)胞。因而大約5個細(xì)胞中有一個開始時將被感染。感染24或66小時后使細(xì)胞在甲醇中固定，再估測VP22或β-半乳糖苷酶的存在。應(yīng)注意，該病毒含β-半乳糖苷酶的基因，而且存在的β-半乳糖苷酶用作初級感染細(xì)胞的標(biāo)記物。結(jié)果示于圖10。
圖10a示出對β-半乳糖苷酶染色、感染24小時后的視野。
圖10b示出對VP22染色的相同視野。
圖10c示出對β-半乳糖苷酶染色、感染66小時后的視野。
圖10d示出對VP22染色的相同視野。
圖10a中用箭頭標(biāo)出了表達β-半乳糖苷酶的兩個細(xì)胞。注意周圍的細(xì)胞缺乏β-半乳糖苷酶。在對VP22染色的相同視野(圖10)中，這兩個細(xì)胞也是VP22陽性的(大箭頭)，但還檢測到幾個周圍細(xì)胞含VP22(小箭頭)，它們是β-半乳糖苷酶陰性的。
在圖10c(感染66小時后)中示出的3個細(xì)胞也是β-半乳糖苷酶陽性的(大箭頭)。在對VP22染色的相同視野(圖10d)中，這3個細(xì)胞是陽性的，但周圍其它細(xì)胞是β-半乳糖苷酶陰性的因而未感染，不過含有VP22，它已積聚于細(xì)胞核內(nèi)(小箭頭)。注意盡管在3個中心陽性細(xì)胞中濃染色，最后的這些細(xì)胞完全缺乏可檢測的β-半乳糖苷酶。
結(jié)果表明，VP22可從病毒感染細(xì)胞轉(zhuǎn)運。這不只是瘡疹病毒感染的性質(zhì)，因為VP22可從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或顯微注射的細(xì)胞轉(zhuǎn)運。因此，轉(zhuǎn)運不需其它任何瘡疹病毒編碼的蛋白質(zhì)，于是應(yīng)用任何病毒載體如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒都幾乎肯定會發(fā)生轉(zhuǎn)運。
這樣我們直接證實了VP22從病毒感染細(xì)胞轉(zhuǎn)運的原理依據(jù)。很容易預(yù)測，含目的基因的融合蛋白可通過與VP22的基因或其活性部分連接而被構(gòu)建，并在基本上有效的或組織專一性的啟動子控制下被插入病毒載體。隨后該融合蛋白可被遞送至比初始感染的細(xì)胞群要大得多的細(xì)胞群。
討論上還結(jié)果表明，VP22表現(xiàn)出相當(dāng)獨特的性能，因為它被有效地從初始表達它、而且它在其中表現(xiàn)為胞質(zhì)定位的細(xì)胞轉(zhuǎn)運至細(xì)胞單層中毗鄰細(xì)胞，在那里它被細(xì)胞核攝取。在我們試驗過的一系列蛋白質(zhì)中，對于其它任何蛋白質(zhì)均未觀測到這種行為模式，而且以前從未闡述過這種活性。于是，例如VP16也是在細(xì)胞胞質(zhì)中表達的，但它的表達模式在表達細(xì)胞群中是完全均勻的，而且它未被轉(zhuǎn)運至毗鄰細(xì)胞。這種差異和VP22的這種意外的性能從如下結(jié)果得以證實即，當(dāng)VP22或VP16被引入細(xì)胞單層大約30小時后，雖然VP16能在平均約2-5％的細(xì)胞中被檢測到，但VP22能在單層的每個細(xì)胞中被檢測到。
本工作還證明了VP22胞間轉(zhuǎn)運的專一性，并證明了該蛋白質(zhì)C端包含一個決定子，因為缺乏C端34個氨基酸的變體雖然在初始表達細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)定位中被表達，但未被轉(zhuǎn)運至毗鄰細(xì)胞。這些實驗表明，VP22的胞間轉(zhuǎn)運可在一些不同種細(xì)胞包括COS-1細(xì)胞、Vero細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中進行，即該現(xiàn)象對其中最初觀察到該現(xiàn)象的COS細(xì)胞不具有專一性。
蛋白質(zhì)分泌或外排通常經(jīng)過特定途徑發(fā)生，要求完全鑒定的信號序列以分選入外排途徑中包括的區(qū)室和載體。在蛋白質(zhì)分泌的主要機制之一中，信號序列通常殘留于蛋白質(zhì)的N端末端，被7S RNA和至少6個多肽的復(fù)合體識別，其中復(fù)合體的組分一起包括信號識別顆粒(SRP)。由SRP識別后接著在內(nèi)質(zhì)膜中?？亢蛯⑿盘栯膫鬟f給受體。然后該出現(xiàn)的多肽通過ER膜排出，接著通過在Golgi網(wǎng)絡(luò)中相互作用和小泡裝配的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進行處理。VP22不具備任何慣常的信號序列，而且它在胞質(zhì)內(nèi)的分布模式與ER分布或Golgi分布不相似。
已有少量有關(guān)哺乳動物蛋白質(zhì)通過非經(jīng)典途徑分泌的現(xiàn)有實例，例如包括細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1α和1β，以及堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(7)。輸出這類成分的一種可能性是通過ABC-轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)。這些蛋白質(zhì)包括依賴于ATP的蛋白質(zhì)和膜結(jié)合蛋白質(zhì)，它們含跨膜螺旋。它們包括于蛋白質(zhì)專一性結(jié)合中和轉(zhuǎn)運穿過膜并在細(xì)菌系統(tǒng)中已被最完全鑒定。然而，迄今尚無有關(guān)任意哺乳動物ABC-轉(zhuǎn)運蛋白在蛋白質(zhì)分泌中的作用的直接證據(jù)。
還有，雖然某些蛋白質(zhì)是通過非經(jīng)典途徑被分泌的，但VP22分泌的模式極為獨特。由于不想受任何具體理論的束縛，對于我們的結(jié)果的最簡單解釋是這樣的VP22被分泌后就被靶細(xì)胞的核攝取并在其中濃縮。又一次地，雖然該蛋白質(zhì)的預(yù)計分子量為32k，但VP22中沒有明顯的核定位信號，所以它無需專門的信號就能進入細(xì)胞核。對于VP22內(nèi)所需決定子和細(xì)胞內(nèi)生理需求的進一步研究將會有助于闡明所包括的途徑，而對于VP22如何被分泌的理解將有助于理解其它蛋白質(zhì)在非經(jīng)典輸出途徑中是如何被轉(zhuǎn)運的。
這些結(jié)果揭示了有可能應(yīng)用VP22轉(zhuǎn)運中涉及的決定子來使其它蛋白質(zhì)或與VP22決定子相關(guān)的其他分子在靶細(xì)胞群中被轉(zhuǎn)運、有效表達或攝取。我們業(yè)已證實，短肽(12個殘基)可與VP22連接且該融合蛋白仍能被轉(zhuǎn)運至單層的每個細(xì)胞中。該結(jié)果表明，確實易于通過將肽與VP22連接而促使肽的傳遞。
此外，我們已證實大型蛋白質(zhì)(32Kd)與VP22連接后可從細(xì)胞介質(zhì)被輸入細(xì)胞，并看到它在細(xì)胞核內(nèi)積聚。
容易預(yù)測這種能力的廣泛應(yīng)用。例如有可能將DNA結(jié)合蛋白質(zhì)與VP22決定子連接，使得當(dāng)遞送至靶細(xì)胞群后，它們將在大得多的細(xì)胞群中被有效地表達。
其它應(yīng)用包括宿主加強免疫響應(yīng)需要共同刺激分子和細(xì)胞因子疫苗開發(fā)領(lǐng)域的近期資料著重于對共同刺激分子和細(xì)胞因子的需求，以使疫苗有效地作用以加強細(xì)胞水平的宿主免疫響應(yīng)。腫瘤細(xì)胞不在其細(xì)胞表面表達共同刺激分子，這就是為什么在宿主中沒有CTL(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)的克隆擴充的原因，導(dǎo)致病人沒有藥物介入就不能使腫瘤收縮。
直接刺激宿主中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞響應(yīng)遞送具有抗癌性能的外源蛋白至細(xì)胞核。外源蛋白可能是已知能引起對腫瘤的免疫(T細(xì)胞)響應(yīng)的腫瘤特異抗原。
該外源蛋白可與VP22分子一起直接遞送至細(xì)胞核(這也會模擬病毒感染-見注釋)。然后該外源蛋白在細(xì)胞的蛋白體中會斷裂成肽。如果接著進行經(jīng)典的T細(xì)胞引入途徑，則肽被導(dǎo)向通過細(xì)胞的ER和高爾基體并與MHC-Ⅰ型分子結(jié)合呈現(xiàn)于細(xì)胞表面。加強病人中CTL響應(yīng)對于非癌治療，尤其是由病毒感染引起的疾病有顯著作用。認(rèn)為在宿主中引起強烈的CTL響應(yīng)可導(dǎo)致體內(nèi)病毒的消除，近期已獲得科學(xué)證據(jù)。
用待導(dǎo)向的蛋白質(zhì)/抗原加強遞送MHC分子的免疫響應(yīng)有可能通過導(dǎo)向抗原加HLA分子來解決細(xì)胞群中MHC限制性并加強細(xì)胞的響應(yīng)的問題。該應(yīng)用也會具有非癌用途。
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)很多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是通過如下方法進行的轉(zhuǎn)移環(huán)境信號、激素、將配體與膜結(jié)合、脅迫(DNA損傷、熱滲透的等等)細(xì)胞核以引起基因表達變化?？梢酝ㄟ^將蛋白質(zhì)或肽與信號分子偶合而應(yīng)用VP22介導(dǎo)這種信號。遞送融合蛋白或相應(yīng)基因?qū)鰪娦盘枺驗槿诤象w也是輸出至相鄰細(xì)胞。例如，將VP22與質(zhì)膜相關(guān)性信號效應(yīng)子的顯性突變體(例如小GTP酶及其效應(yīng)子或編程性細(xì)胞死亡(apoptotic)調(diào)節(jié)分子)融合可能實現(xiàn)所需途徑，不但可在存在該基因的受體細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)，還能在沒有該基因的周圍細(xì)胞中實現(xiàn)。可設(shè)想調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多種變化形式。
VP22在體外與DNA結(jié)合的能力和VP22在有絲分裂期間與濃縮染色體結(jié)合的能力可應(yīng)用于基因/DNA治療。該應(yīng)用有如下幾種形式
a)病毒感染，其中VP22或其突變體的基因被插入腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組以傳遞感染。同樣，也可插入所需蛋白質(zhì)的基因從而可表達包括VP22和目的蛋白質(zhì)的融合蛋白。然后VP22就能遞送目的蛋白質(zhì)至周圍細(xì)胞群。這樣，可使這類病毒的量減少因而降低病毒感染的危害。
b)將編碼VP22(或其變體)的核酸和目的蛋白質(zhì)直接顯微注入細(xì)胞，于是一旦表達，VP22就能將目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運入周圍細(xì)胞群。
c)脂質(zhì)體介導(dǎo)的感染，其中VP22的基因或包括融合蛋白的各種修飾物被摻入脂質(zhì)體載體以供活體內(nèi)遞送。
對技術(shù)人員而言，將DNA引入細(xì)胞的其它方法是顯而易見的，例如，直接劃痕(direct scarification)，其中DNA直接被組織攝??；受體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)化；磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；和彈道式遞送(ballistic de-livery)。
有效遞送功能分子是基因/蛋白質(zhì)治療中所期望的。該機制的另外優(yōu)點在于，表達VP22的基因?qū)⒅淮嬖谟谛∪杭?xì)胞中，而蛋白質(zhì)存在于大得多的細(xì)胞群內(nèi)。當(dāng)需要考慮遞送基因的可能有害效果時，這將是有用的因素。低基因遞送量同時保持較大功能性蛋白遞送量是所期望的。實際上可預(yù)測，需要或者希望有效表達試驗蛋白質(zhì)的任何應(yīng)用都可運用VP22遞送機制。遞送腫瘤抑制蛋白、酶等等。我們還已證實有可能將核酸與VP22結(jié)合，因此，除了DNA之外也可以遞送反義RNA核酸等等。參考文獻1．Blaho,J.A.,C.Mitchell，和B.Roizman.1994.由單純瘡疹病毒1α調(diào)節(jié)蛋白0、4、22和27共享的氨基酸序列預(yù)示UL21、UL31、UL47和UL49基因產(chǎn)物的核苷酰化(nucleotidylylation)。J.Biol Chem269:17401-10。2．Blair,E.D.，和R.W.Honess.1983.由herpes virus saimiri專一化的DNA結(jié)合蛋白。J.Gen.Virol.64:2697-2715。3．Chen,C.，和H.Okayama.1987.用質(zhì)粒DNA高效轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞。Mol.Cell Biol.7:2745-2752。4．Elliott,G.D.，和D.M.Meredith.1992。由基因UL49編碼單純瘡疹病毒-1型殼蛋白VP22。J.Gen．Virol.73:723-6。5．Greaves,R.F.，和P.OHare.1990。對于同細(xì)胞八聚體結(jié)合蛋白序列和靶TAATGARAT序列作用的單純瘡疹病毒-1型反式激活蛋白Vmw65的結(jié)構(gòu)要求。J.Virol.64:2716-2724。6．Haarr,L.，和S.Skulstad.1994。單純瘡疹病毒-1型粒子結(jié)構(gòu)和分子功能。論文綜述。Apmis 102:321-46。7．Klucher,K.1993.蛋白質(zhì)分泌的獨特途徑簡易分泌方式。Trendsin Cell Biol.3:421-426。8．Knopf,K.W.，和H.C.Kaerner.1980.與單純瘡疹病毒-1型(HSV-1)粒子結(jié)合的病毒特異性堿性磷蛋白和HSV-1感染的細(xì)胞的染色質(zhì)。J.Gen.Virol.46:405-414。9．Meredith,D.M.,J.A.Lindsay,I.W.Halliburton，和G.R.Whit-taker。1991.通過糖基化作用和磷酸化作用對單純瘡疹病毒-1型的殼蛋白(VP13和VP14)的翻譯后修飾。J.Gen.Virol.72:2771-5。10．Pinard,M.F.,R.Simard，和V.Bibor-Hardy.1987.單純瘡疹病毒-1型感染的BHK細(xì)胞核基質(zhì)的DNA結(jié)合蛋白。J.Gen.Virol.68:727-35。11．Preston,C.M.，和E.L.Notarianni.1983.單純瘡疹病毒立即早期多肽的聚(ADP-核糖基)化作用。Virol.131:492-501。12．Rothman,J.E.1994。胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的機制。Nature.372:55-63。
權(quán)利要求
1．VP22或者其活性部分、片段或同源物作為能被靶細(xì)胞群攝取的轉(zhuǎn)運蛋白的應(yīng)用。
2．權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中轉(zhuǎn)運蛋白至少包括VP22的C端34個氨基酸。
3．權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的應(yīng)用，其中轉(zhuǎn)運蛋白與一個或多個需要轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞群的其它分子結(jié)合。
4．權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中的一個或多個相關(guān)分子是非肽基分子。
5．前述權(quán)利要求任一項的應(yīng)用，其中的蛋白質(zhì)還能從表達它的靶細(xì)胞群的第一部分輸出，并被不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。
6．轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，它包括VP22或者其活性部分、片段或同源物，該蛋白質(zhì)結(jié)合需要轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞群的一個或多個其它分子。
7．權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)運蛋白，其中的一個或多個相關(guān)分子是非肽基分子。
8．權(quán)利要求6或權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)運蛋白，其中的蛋白質(zhì)還能從表達它的靶細(xì)胞群的第一部分輸出，并被不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。
9．核酸，它編碼權(quán)利要求6、7和8中任一項的轉(zhuǎn)運蛋白。
10．表達載體，它包括權(quán)利要求9的核酸。
11．哺乳動物或微生物宿主細(xì)胞，它包括權(quán)利要求10的載體或權(quán)利要求9的核酸。
12．轉(zhuǎn)運所需蛋白質(zhì)或肽至靶細(xì)胞群的方法，該方法包括ⅰ)將權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的核酸或載體引入靶細(xì)胞群的第一部分；ⅱ)表達該核酸而產(chǎn)生蛋白質(zhì)，隨后從細(xì)胞中輸出該轉(zhuǎn)運蛋白，連同與之結(jié)合的其它任何蛋白質(zhì)，而被不直接產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的靶細(xì)胞群的第二部分?jǐn)z取。
13．權(quán)利要求12的方法，其中通過重組病毒將核酸引入靶細(xì)胞群的第一部分。
14．權(quán)利要求12的方法，其中通過轉(zhuǎn)染將核酸引入靶細(xì)胞群的第一部分。
15．權(quán)利要求12的方法，其中通過顯微注射將核酸引入靶細(xì)胞群的第一部分。
16．將所需分子轉(zhuǎn)運至細(xì)胞群的方法，該方法包括ⅰ)將所需分子與包括VP22或其活性部分、片段或同源物的轉(zhuǎn)運蛋白偶聯(lián)而形成復(fù)合體；和，ⅱ)使細(xì)胞與該復(fù)合體接觸使細(xì)胞能攝取該復(fù)合體。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所需的分子是非肽基分子。
18．權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的方法，其中通過摻入脂質(zhì)基載體而將所需分子與轉(zhuǎn)運蛋白偶聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)運蛋白,具體涉及VP22及其同源物,并涉及遞送這些蛋白質(zhì)和任何結(jié)合的分子至靶細(xì)胞群的方法。該轉(zhuǎn)運蛋白可應(yīng)用于基因治療和引導(dǎo)試劑至需要高效導(dǎo)向的細(xì)胞的方法。
文檔編號C12N15/38GK1208438SQ9619584
公開日1999年2月17日 申請日期1996年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月28日
發(fā)明者P·F·J·奧黑爾, G·D·埃利奧特 申請人:瑪麗·柯里癌癥治療中心