專利名稱：用微生物生產轉谷氨酰胺酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從諸如細菌，霉菌和酵母的微生物生產轉谷氨酰胺酶(下文稱為“TG”)的方法，以及用由此獲得的TG生產膠狀蛋白質的方法。
TG是催化肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧基酰胺的酰基轉移反應的酶。當TG作為?；荏w與蛋白質中賴氨酸殘基的ε-氨基反應時，在分子內和分子間形成ε-(γ-Glu)-Lys交聯鍵。當水作為酰基受體時，該酶幫助谷氨酰胺殘基的脫酰胺反應以形成谷氨酸殘基。
本發(fā)明生產的TG用于生產膠狀蛋白質，后者作為膠體食物，膠狀化妝品等有用，該TG類似于已知的來自放線菌屬的TG。
背景技術：
迄今已知在各種動物組織中含有TG。例如，在豚鼠肝臟中含有TG且對其進行了研究〔Connellan等，生物化學雜志，Vo1.246，10931098(1971)〕。然而，至于從微生物產生的TG，僅報道了由放線菌屬和枯草芽孢桿菌(M.V.Ramanujam等，FASEB J.Vol.4，A2321)和Myxomycetes(J.D.Klein等，細菌學雜志，Vol.174，2599至2605)產生的TG。
目前，由放線菌屬產生的TG在實踐上用于工業(yè)規(guī)模上〔日本專利未審公開申請(下文稱為“J.P.KOKAI”)No.Sho 64-27471〕。
來自動物的TG用于工業(yè)，特別是用于生產膠狀蛋白質時具有下列缺陷(1)難以以低花費獲得大量來自動物的TG。
(2)TG的應用受到限制，因為需要鈣離子。
來自放線菌屬的TG具有的缺陷是，由于放線菌屬的微生物生長速率通常低于細菌，需要較長的培養(yǎng)時間，所以導致生產成本增加。
發(fā)明公開至于來自動物的TG的實際應用，從未期望過這類應用，因為其需要鈣的特征限制了其用途且其低成本的大量生產是不可能的。來自放線菌的TG比來自細菌的TG具有較低的生長速率且從花費來看是不利的。
因此，本發(fā)明的目的是提供用從古代就常用于食品的微生物以高生長速率和以合理花費生產TG的新方法。
經過對解決上述問題的目的進行深入研究后，發(fā)明人發(fā)現特定的微生物在其培養(yǎng)過程中產生TG或它們在其細胞中積累TG。根據這一發(fā)現完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了生產轉谷氨酰胺酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微球菌屬，梭狀芽孢桿菌屬，球擬酵母屬，根霉屬和紅曲霉屬中任一種的微生物以便在培養(yǎng)基中或在微生物細胞中生產目的轉谷氨酰胺酶，然后分離該轉谷氨酰胺酶，還提供了用由此獲得的TG生產膠狀蛋白質的方法。
附圖簡述

圖1顯示了用于食品的細菌及相同屬的細菌在固體培養(yǎng)中的腐胺摻入活性。
圖2顯示了用于食品的細菌及相同屬的細菌在液體培養(yǎng)中的腐胺摻入活性。
圖3顯示了在用于食品的細菌及相同屬的細菌的液體培養(yǎng)物的上清液中摻入腐胺的活性。
圖4顯示了用于食品的酵母及同屬的酵母在固體培養(yǎng)物中的腐胺摻入活性。
圖5顯示了用于食品的酵母和同屬的酵母在液體培養(yǎng)物中的腐胺摻入活性。
圖6顯示了用于食品的酵母和同屬的酵母的液體培養(yǎng)物上清液中的腐胺摻入活性。
圖7顯示了用于食品的絲狀真菌和同屬的另一絲狀真菌在液體靜止培養(yǎng)物中的細胞腐胺摻入活性。
圖8顯示了用于食品的絲狀真菌和同屬的另一絲狀真菌的液體搖動培養(yǎng)物中的細胞腐胺摻入活性。
圖9顯示了用于食品的絲狀真菌和同屬的另一絲狀真菌在液體搖動培養(yǎng)物的上清液中的腐胺摻入活性。
圖10顯示了含擔子菌(Basidiomycoea)破碎細胞的懸液中的腐胺摻入活性。
圖11顯示了商業(yè)供應蛋白酶的腐胺摻入活性。
圖12顯示了蛋白酶抑制劑對腐胺摻入活性的影響。
圖13顯示了蛋白酶抑制劑對α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉的培養(yǎng)物上清液中蛋白酶活性的影響。
實施本發(fā)明的最佳方式本文的術語“TG”指催化肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧基酰胺基團的?；D移反應的酶。當TG作為?；荏w作用于蛋白質賴氨酸殘基的ε-氨基時，在分子中和分子間形成ε-(γ-Glu)-Lys交聯鍵。
在本發(fā)明中，轉谷氨酰胺酶優(yōu)選經過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上面限定的微生物以便在培養(yǎng)基或在細胞中生產目的轉谷氨酰胺酶，然后(1)從培養(yǎng)基中分離轉谷氨酰胺酶或(2)破碎細胞或經過裂解，然后如果需要溶解該產物來獲得。
經過對從古代就在培養(yǎng)液中或將細胞用于生產食品的各主要的細菌，酵母，真菌等的TG活性的深入研究，發(fā)明人發(fā)現了一些具有TG活性的菌株。
下面將對細胞或其培養(yǎng)液中具有TG活性的細菌的例子進行描述。
優(yōu)選可用于食品的微球菌屬和梭狀芽孢桿菌屬的細菌。特別優(yōu)選藤黃微球菌和丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌。具體地說，優(yōu)選藤黃微球菌ATCC400和丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌ATCC 4259。
然后，對于在細胞或其培養(yǎng)液中具有TG活性的酵母的例子將在下面進行描述。
優(yōu)選可用于食品的球擬酵母屬酵母。特別優(yōu)選易變球擬酵母。具體地說，優(yōu)選易變球擬酵母NRRL·Y-6652。
對于在細胞或其培養(yǎng)液中具有TG活性的真菌的例子將在下面進行描述。
優(yōu)選可用于食品的根霉屬和紅曲霉屬的真菌。特別優(yōu)選米根霉，中國根霉，德列馬根霉，爪哇根霉和紫色紅曲霉。
更具體地說，可用米根霉FERM BP-5546和FERM BP-5549，中國根霉JCM 5596，德列馬根霉JCM 5564，爪哇根霉JCM 5574和紫紅色曲霉ATCC 16360?！癑CM”是日本微生物保藏中心的縮寫(下文將使用相同的縮寫)。
然后，將對微生物的培養(yǎng)方法和純化獲得TG的方法進行描述。在本發(fā)明的實施中，培養(yǎng)形式可以是液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)。當以工業(yè)規(guī)模進行培養(yǎng)時，在攪拌條件下通氣的培養(yǎng)具有優(yōu)勢。
使用的營養(yǎng)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分包括碳源，氮源，無機酸和其它常用于微生物培養(yǎng)的微量營養(yǎng)成分。另外，微生物可利用的營養(yǎng)成分是可獲得的。
(1)細菌和酵母的培養(yǎng)條件與(2)真菌略有不同。首先對(1)細菌和酵母的培養(yǎng)條件進行描述。在使其能生長產生TG的培養(yǎng)溫度范圍內，在需氧條件下培養(yǎng)細菌和酵母?？稍趨捬鯒l件下培養(yǎng)經厭氧培養(yǎng)可培養(yǎng)的細菌和酵母。
盡管條件不受嚴格限制，但培養(yǎng)溫度通常是10到50℃，優(yōu)選25到40℃。根據溫度和其它條件可改變培養(yǎng)時間以產生最大量的TG。培養(yǎng)時間通常是5小時至14天，優(yōu)選大約10小時到7天。
下面將對真菌進行描述。
在需氧條件下在使其能生長產生TG的培養(yǎng)溫度范圍內培養(yǎng)真菌。培養(yǎng)溫度通常是10到50℃，優(yōu)選20到35℃。根據培養(yǎng)條件可改變培養(yǎng)時間使產生最大量的TG。培養(yǎng)時間通常是1到20天，優(yōu)選2到14天。
培養(yǎng)完成后，經過濾從培養(yǎng)液中去掉固體，且從過濾液中獲得在培養(yǎng)液中積累的TG。經過用于純化酶的任一普通方法從培養(yǎng)濾液中獲得純TG。
例如，經過用諸如乙醇、丙酮或異丙醇的有機溶劑處理，用硫酸銨，食鹽或類似物的鹽析，透析，超濾，離子交換色譜，吸附色譜，凝膠過濾，用吸附劑吸附，等電點分離可獲得純TG。當經過適當結合這些方法可提高TG的純度時，這種結合也是可能的。
如果需要，可向上述獲得的酶溶液中加入鹽，糖類，脂，蛋白質，表面活性劑等作為穩(wěn)定劑，然后對溶液進行超濾濃縮，反向滲透濃縮，減壓干燥，冷凍干燥，噴霧干燥或等以獲得純化的液體或固體TG。
培養(yǎng)完成后從培養(yǎng)液中回收細胞收集在細胞中積累的TG。破碎或裂解(細菌裂解)細胞后，由此獲得的產物可就此或濃縮后用作膠化試劑。
經過諸如超聲處理，用珠或類似物研磨，加壓破碎和冷凍破碎的各種方法可進行破碎。
如果必須經過各種溶解方法溶解處理的細胞也可回收可溶部分中的TG活性。例如，(1)經過用諸如Triton X-100或烷基葡糖苷的表面活性劑處理細胞可溶解細胞。(2)經過用酸性或堿性緩沖液進一步處理已處理的細胞可溶解活性部分。(3)經過將它們懸浮于緩沖液中并將溫度升高到例如10℃或以上可溶解處理的細胞。以各類方法由此溶解的TG也可用作膠化試劑。
具有更高比活的純化TG可用任意常用于如上所述從培養(yǎng)液純化TG的酶純化方法從溶解的含TG的溶液獲得。由此獲得具有更高效力的膠化試劑TG。
如下所述經過測定將腐胺摻入二甲基酪蛋白的活性(下文稱為腐胺摻入活性)測定TG活性。經過使用以14C標記的腐胺和二甲基酪蛋白作底物進行反應。用10％TCA沉淀與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白且沉淀吸附于濾紙上。用液閃計數器或類似方法測量由此處理的濾紙的放射活性以進行測定。
然而，腐胺摻入二甲基酪蛋白中也是由蛋白酶脫水鍵合或轉變(transition)反應引起的反應。因此，存在檢測蛋白酶活性作為TG活性的可能性。
因此，經過檢查蛋白酶抑制劑對腐胺摻入活性的抑制可證實實際TG活性。即，當樣品的腐胺摻入活性不受蛋白酶抑制劑抑制時，其TG活性是實際活性。證實實際TG活性的詳情在下面所述的實施例中描述。
因此，本發(fā)明提供了篩選生產轉谷氨酰胺酶的微生物的方法，它包括在不存在蛋白酶抑制劑的條件下將微生物樣品與含14C標記的腐胺和二甲基酪蛋白的底物反應以選擇產生與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白的微生物，在選自大豆Bawman-Birk抑制劑，胰凝乳蛋白酶抑制劑和卵抑制劑的蛋白酶抑制劑存在的條件下用含14C標記的腐胺和二甲基酪蛋白的底物進行相同的反應，比較在蛋白酶抑制劑存在下進行的反應獲得的產物量和在缺乏蛋白酶抑制劑時進行的反應獲得的與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白的量，選擇在各蛋白酶抑制劑存在時產生的與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白量基本上不減少的微生物。優(yōu)選的微生物當在缺乏蛋白酶抑制劑的條件下培養(yǎng)產生的與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白為100份時，在存在一種上述蛋白酶抑制劑的條件下能產生至少65份，優(yōu)選75到100份與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白。即，選擇在三種培養(yǎng)條件之一的條件下(即在大豆Bawman-Birk抑制劑，胰凝乳蛋白酶抑制劑和卵抑制劑之一存在的條件下)能產生至少65份與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白的微生物。
在這一過程中，待試驗的微生物在最佳條件下培養(yǎng)。14C-標記的腐胺的量優(yōu)選為1到2000nmol，底物中的二甲基酪蛋白的量優(yōu)選為1到200mg/ml。培養(yǎng)時間優(yōu)選大約1分鐘到6小時。
下面將對本發(fā)明的另一實施方案，即，用TG生產膠狀蛋白質的方法進行描述。以異議日本專利公開(下文稱為“J.P.KOKOKU”)NoHei 6-65280和J.P.KOKAI No.Hei 6-225775(本文引用其說明書以供參考)揭示的方法可生產膠狀蛋白質。
用于膠狀蛋白質生產的TG包括純化的TG，具有TG活性的培養(yǎng)溶液和具有TG活性的級分，它經過破碎或裂解具有TG活性的細胞獲得。而且，上述可溶級分也是可用的。即，任何具有TG活性的級分都是可用的。
可用作底物的蛋白質的來源和特性不受限制，只要它具有賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基且只要它與上述催化劑反應。另外，用蛋白酶或類似物部分切割的肽，合成肽和化學修飾的各種蛋白質也可用作該酶的底物，只要它們含有賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基。
當將本發(fā)明獲得的TG加入含該蛋白質的液體或懸液中進行反應時，1)當該蛋白質濃度較高時獲得具有高粘度的產物或膠體形式的產物，或2)當蛋白質濃度較低時獲得溶液或沉淀形式的交聯高分子產物。至于反應條件，反應溶液的pH大約為4到10，反應溫度大約為5到80℃，反應時間一般為大約10秒到24小時。
經過選擇蛋白質的類型和其量可改變交聯的程度，因此根據目的和用途可改變凝膠的特性和水含量。
下面的實施例將進一步說明本發(fā)明，但并不意味著限制本發(fā)明的技術范圍。
實施例1在本實施例中，使用可用于食品的下列細菌菌株。
表1乳酸乳球菌(1) FERMP-14972乳酸乳球菌(2) AJ11145乳酸乳球菌(3) AJ5805耐久腸球菌 AJ3805糞腸球菌ATCC12984嗜熱鏈球菌 AJ3809玫瑰色葡糖桿菌 IAM1838氧化葡糖桿菌(1) IFO3172氧化葡糖桿菌(2) IFO3189乳酸片球菌 ATCC8042亨利伯建氏片球菌AJ3157戊糖片球菌 IFO3182易變微球菌 IAM1314藤黃微球菌(1) ATCC400藤黃微球菌(2) IFO3333凝聚微球菌 AJ1062巴斯德氏醋桿菌 FERMP-14973醋酸化醋桿菌(1) IFO3281醋酯化醋桿菌(2) IFO3288植物乳芽孢桿菌 ATCC8014清酒乳芽孢桿菌 ATCC9338干酪乳芽孢桿菌 ATCC7469德彼利氏乳芽孢桿菌 ATCC9649保加利亞乳芽孢桿菌 ATCC11842發(fā)酵乳芽孢桿菌 JCM1173腸系膜狀明串珠菌FERMP-14974大腸桿菌ATCC27325乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869亞麻短桿菌 ATCC9172丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌ATCC4259
在上表中，AJ和IAM分別是Ajinomoto公司中心研究實驗室和IAM培養(yǎng)物保藏中心的縮寫(下文將應用該縮寫)。
上面列出的菌株的固體培養(yǎng)基或液體搖動培養(yǎng)基用胰胨大豆培養(yǎng)基，乙酸細菌培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基等進行。在固體培養(yǎng)物中，培養(yǎng)2到4天后收集合適量的細胞。
經過向20ml試管中加入5ml培養(yǎng)基〔每升培養(yǎng)基中含5g葡萄糖，0.9g(NH4)2SO4，0.45g KH2PO4，0.075g K2HPO4，0.09gMgSO4·7H2O，0.9g NaCl，0.09g CaCl2·2H2O，10g胰胨(BBL)，5g酵母提取物(Difco)，2g肉提取物(Difco)，0.007g氯高鐵血紅素，4g Na2CO3，0.3g L-半胱氨酸HCl·H2O和0.001g刃天青，pH 7.2〕培養(yǎng)梭狀芽孢桿菌屬的細菌，然后控制氣相組成為N2/CO2/H2＝80/10/10，接種細菌并在厭氧條件下37℃進行培養(yǎng)。
在液體培養(yǎng)物中，取10ml培養(yǎng)液并在對數生長期(在附圖中稱作“l(fā)og”)(培養(yǎng)大約3到5小時后達到)和在靜止期(培養(yǎng)6到10小時后達到)，開始后0，5，10和20小時離心以獲得沉淀和上清液。作為沉淀獲得的細胞懸浮于1ml Tris緩沖液(20mM Tris，pH 7.5)中并用玻璃珠破碎。含破碎細胞和上清培養(yǎng)液的懸液用作待測樣品。
在固體培養(yǎng)基中，細菌在含瓊脂的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2到4天，然后收集合適量的細胞。用鉑環(huán)刮取細胞。由此獲得的適量細胞懸浮于1ml Tris緩沖液(20mM Tris，pH 7.5)中并用玻璃珠破碎。含破碎細胞的上清和上清培養(yǎng)液用作待測樣品。
經過測量腐胺摻入活性可測定TG活性。含10μl待測樣品的50μl反應液(pH 7.5的100mM Tris緩沖液，含6.3mg/ml二甲基酪蛋白和10nm14C-腐胺1.2μCi)37℃反應30分鐘，然后將40μl反應產物吸附于濾紙上并用10％TCA固定。用5％TCA溶液洗滌3次后，用液閃計數器測定產物的放射活性以測定腐胺摻入活性。菌株樣品的測定結果在圖1至3中顯示。
如圖1至3所示，腐胺摻入活性在Lactococcus，腸球菌屬，葡萄桿菌屬，片球菌屬，微球菌屬，醋桿菌屬，乳芽孢桿菌屬，明串珠菌屬，短桿菌屬，埃希氏桿菌屬或梭狀芽孢桿菌屬的細菌細胞中或在其培養(yǎng)液中識別。
其中，亞麻短桿菌，藤黃微球菌，乳酸乳球菌，干酪乳芽孢桿菌，糞腸球菌，氧化葡糖桿菌，戊糠片球菌，巴斯德氏醋桿菌，腸系膜狀明串珠菌，大腸桿菌和丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌具有相當高的腐胺摻入活性。
實施例2在本實施例中，使用可用于各種食品的酵母菌株或類似物，如下面表2所示。
表2易變球擬酵母NRRLY-6652漢遜氏德巴利氏酵母 IFO0644Pichia anomala(1) IFO0130Pichia anomala(2) IFO0144肋狀復膜孢糖酵母IFO0103卡爾斯伯糖酵母 CBS1513巴揚氏糖酵母(1) CBS395巴揚氏糖酵母(2) CBS380弗羅棱糖酵母AJ4100薛氏糖酵母 CBS400啤酒糖酵母 CBS1171Zygosaccharomyces rouxii(1) CBS726Zygosaccharomyces rouxii(2) IFO0495Zygosaccharomyces mrakiiCBS4218耐熱接合糖酵母 CBS6340戴爾凱氏有孢圓酵母(1) IFO1129戴爾凱氏有孢圓酵母(2) CBS817馬克斯克魯維氏酵母 IFO0288在上表中，CBS是真菌菌株保藏中心(Centraalbureau voorSchimmelcultures)的縮寫。
上面所述的各菌株的細菌用YM培養(yǎng)基或類似物在28℃經液體搖動培養(yǎng)來進行培養(yǎng)。在對數生長期(培養(yǎng)大約3到6小時后達到)，在靜止期開始時(培養(yǎng)大約6到12小時后達到)(即，第0天后)及在第二和第四天取10ml培養(yǎng)液并離心以獲得沉淀和上清液。作為沉淀獲得的細胞懸浮于1ml Tris緩沖液(20mM Tris，pH 7.5)中并用玻璃珠破碎。按與實施例1相同的方式對含破碎細胞的懸液和上清培養(yǎng)液進行腐胺摻入活性的試驗。
按與實施例1相同的方式進行固體培養(yǎng)，由此獲得的產物也用作按與實施例1相同的方式進行腐胺摻入活性的試驗的樣品。
液體培養(yǎng)物和固體培養(yǎng)物中的菌株樣品的測定結果在圖4至6中顯示。
如圖4至6所示，在球擬酵母屬，有孢圓酵母屬，糖酵母屬，接合糖酵母屬，復膜孢糖酵母屬，克魯維氏酵母屬和畢赤氏酵母屬的酵母細胞中或在其培養(yǎng)液中檢測到腐胺摻入活性。其中，易變球擬酵母，Pichiaanomala，啤酒糖酵母，耐熱接合糖酵母，肋狀復膜孢糖酵母，戴爾凱氏有孢圓酵母和馬克斯克魯維氏酵母具有高腐胺摻入活性。
實施例3在本實施例中，使用可用于各種食品的絲狀真菌菌株或類似物，如下面表3所示。
表3酪生青霉 IFO5849柑桔青霉 ATCC9849婁格法爾特氏青霉 IFO4622醬油曲霉 RIB1045米曲霉ATCC11494塔木里氏曲霉 JCM2259宇佐美氏曲霉 IAM2185灰綠曲霉 IAM2124Aspergillus saitoiIAM2190黑色曲霉 ATCC16404卷枝毛霉 ATCC15242Rhizomucor pusillus IFO4578紫色紅曲霉ATCC16360中國根霉 JCM5596德列馬根霉JCM5564爪哇根霉 JCM5574日本根霉 AJ6076米根霉(1) FERM BP-5549米根霉(2) FERM BP-5546(AJ6168)
在上面表中，RIB是國際釀酒研究所的縮寫(下文將使用相同的縮寫)。
上面列出的細菌菌株按如下方式培養(yǎng)使用YM培養(yǎng)基(包含5g/l蛋白胨，3g/l酵母提取物，3g/1麥芽提取物，10或200g/l葡萄糖)進行液體靜止培養(yǎng)，使用EPS培養(yǎng)基(包含3g/l大豆粉，3g/l Pharmamedia，10g/l可溶淀粉，3g/l酵母提取物，3g/l Nzamine A型，2g/l CaCO3和10或40g/l葡萄糖，pH 6.5)進行液體搖動培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25℃。在靜止培養(yǎng)物中，在第3，7和11天收集細胞。在搖動培養(yǎng)物中，在第3，5和7天取10ml培養(yǎng)液并離心將它分成上清液和細胞。
由此獲得的細胞懸浮于5到10ml Tris緩沖液(20mM Tris，pH7.5)中并用玻璃珠破碎。按與實施例1相同的方式分別測定(1)經靜止培養(yǎng)獲得的且含破碎細胞的溶液，(2)經搖動培養(yǎng)獲得的且含破碎細胞的溶液，(3)經搖動培養(yǎng)獲得的上清液中的腐胺摻入活性。
如圖7至9所示，在曲霉屬，青霉屬，根霉屬，紅曲霉屬，毛霉菌和Rhizomucor屬的絲狀真菌中檢測到腐胺摻入活性。
其中，Aspergillus saioti，米根霉，中國根霉，德列馬根霉，爪哇根霉，柑桔青霉，卷枝毛霉，Phizomucor pusillus和紫色紅曲霉中具有相當高的腐胺摻入活性。參考實施例1在用于小球藻屬的培養(yǎng)基〔包含0.15g/l Ca(NO3)2·4H2O，0.1g/lKNO3，50mg/l磷酸甘油鈉，40mg/l MgSO4·7H2O，0.1g/l維生素B12，0.1g/l生物素，0.01mg/l鹽酸硫胺素，0.5g/l tris(羥甲基)氨基甲烷，3ml/l PIV金屬，pH 7.5，其中PIV金屬是0.196g/lFeCl3·6H2O，36mg/l MnCl2·4H2O，22mg/l ZnSO4·7H2O，4mg/l CoCl2·6H2O，2.5mg/l MoO4·2H2O和1g/l Na2EDTA·2H2O〕中在25℃下和30001x(光照期間為12小時，黑暗期間為12小時)條件下經搖動培養(yǎng)來培養(yǎng)屬于單細胞綠藻的粉核小球藻NIES-226和普通小球藻。在第14天，離心5ml培養(yǎng)液以獲得細胞。細胞懸浮于1ml Tris緩沖液(20mM Tris，pH 7.5)中并用玻璃珠破碎。以與實施例1相同的方式對含破碎細胞的懸液進行腐胺摻入活性的試驗。
試驗結果表明，這些種類的小球藻屬具有腐胺摻入活性，如表4中所示。
表4菌株 腐胺摻入活性(dpm)粉核小球藻881普通小球藻156參考實施例2可食用的擔子菌微生物主要用于研究。使用了商用的和天然的擔子菌微生物。
大約2g子實體切成小片。向其中加入10ml Tris緩沖液(20mMTris，pH 7.5)先用勻漿器再用玻璃珠將其破碎。按與實施例1相同的方式對子實體的破碎細胞進行腐胺摻入活性的試驗。結果在圖10中表示。
如圖10所示，各種擔子菌微生物具有腐胺摻入活性。
Roseofomes subflexibilis，Russula delica和Grifola frondosa具有特別強的活性。參考實施例3腐胺摻入活性隨溫度的改變如上所述經過測定腐胺摻入二甲基酪蛋白的活性確定TG活性。已知由TG形成的交聯結構可經物理化學因素形成。特別是已知經加熱形成交聯結構。因此，根據條件，可檢測到非酶促的摻入活性。另外，腐胺經過脫水鍵或蛋白酶的轉移反應摻入二甲基酪蛋白，作為表觀TG活性可檢測到該效果。在環(huán)境條件下，進行了下列試驗1)腐胺摻入活性隨溫度的變化，2)腐胺摻入活性隨pH的變化，3)商品蛋白酶的腐胺摻入活性。
首先檢測了腐胺摻入活性隨溫度的改變。
在30，40，50，60，70，80和90℃下處理與實施例1相同的反應溶液(除了不含用作酶來源的樣品)30分鐘。按與實施例1相同的方式用液閃計數器測定摻入二甲基酪蛋白的腐胺的量。
表5溫度(℃) 304050607080腐胺摻入活性(dpm) 231 322 507 816 1526 3183從表5中很明顯地看出即使不存在TG時，隨溫度的升高腐胺摻入活性增加。參考實施例4腐胺摻入活性隨pH的改變在7，8，9，10或11的不同反應pH下處理與實施例1相同的反應溶液(除了不含用作酶來源的樣品)。按與實施例1相同的方式用液閃計數器測定摻入二甲基酪蛋白中的腐胺量。
表6pH 7891011腐胺摻入活性(dpm) 310 367 707 1460 7094從表6所示的結果很明顯地看到即使不存在TG時隨pH值的升高腐胺摻入活性增加。
在參考實施例3和4中獲得的結果表明當檢測樣品的TG活性和特性時，重要的是在相同反應條件下進行檢測。參考實施例5商品蛋白酶樣品的腐胺摻入活性的測定胰蛋白酶(T-8253，Sigma有限公司的產品)，α-胰凝乳蛋白酶(C-7762；Sigma有限公司)，枯草桿菌蛋白酶(P-5380，Sigma有限公司)和木瓜蛋白酶(P-4762；Sigma有限公司)用作酶來源。
至于反應條件，反應在0.1M Tris-HCl(pH 7.5)，6.3mg/ml二甲基酪蛋白，0.2mM腐胺二氫氯化物1，4-14C，1mM CaCl2和2mM DTT存在下37℃進行30分鐘。加入的酶量為0.1μg。
結果在圖11中顯示。從該結果了解到由此試驗的所有商品蛋白酶樣品具有腐胺摻入活性。由于蛋白酶本身具有微弱的腐胺摻入活性，由本試驗表明除了TG活性外還應檢測諸如蛋白酶活性的其它酶活性。
因此，經過使用來自微生物的普通TG，商品蛋白酶和本實驗中使用的篩選樣品詳細檢查了腐胺摻入活性和蛋白酶活性間的關系。實施例4蛋白酶抑制劑對腐胺摻入活性的影響來自輪鏈絲菌屬(下文稱為“BTG”)的TG酶制品，α-胰凝乳蛋白酶(C-7762，Sigma有限公司的產品)和從米曲霉培養(yǎng)物中獲得的上清液用作酶來源。用作樣品的米曲霉培養(yǎng)物上清液經過用超濾器濃縮從米曲霉ATCC11494培養(yǎng)物獲得的上清液(用于篩選的樣品，在表3中顯示)來獲得。
使用的蛋白酶抑制劑是大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma有限公司的T-9003，下文稱為“STI”)，大豆Bowman-Birk抑制劑(Sigma有限公司的T-9777；下文稱為“BBI”)，胰凝乳蛋白酶抑制劑(Sigma有限公司的C-7268；下文稱為“CYM”)，卵類粘蛋白(Sigma有限公司的T-2011；下文稱為“OVM”)和卵抑制劑(Sigma有限公司的T-1886；下文稱為“OVI”)。
經過將酶來源與各蛋白酶抑制劑混合并在測定腐胺摻入活性前使獲得的混合物在冰上靜置30分鐘來用蛋白酶抑制劑處理酶來源。在測定腐胺摻入活性時，將0.02μg的BTG，0.1μg的α-胰凝乳蛋白酶抑制劑或0.2μg培養(yǎng)米曲霉獲得上清蛋白用于各樣品。各蛋白酶抑制劑的量是每個樣品20μg。
測定結果在圖12中顯示。由此測定的活性以相對值給出(未使用任何抑制劑獲得的腐胺摻入活性為100)。當使用BTG時，以任何抑制劑未觀察到抑制。，然而，α-胰凝乳蛋白酶受BBI和CYM的嚴重抑制。當培養(yǎng)米曲霉獲得的上清液用作酶來源時，受CYM和OVI引起的嚴重抑制。
使用的抑制劑對蛋白酶具有高度特異性的事實表明α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉培養(yǎng)物上清液的腐胺摻入活性由蛋白酶引起。實施例5蛋白酶抑制劑對α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉培養(yǎng)物上清液的蛋白酶活性的影響經過使用α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉ATCC11494培養(yǎng)物上清液按與上面所述對腐胺摻入活性的抑制試驗相同的方式進行蛋白酶活性抑制試驗如下按如下方式測定蛋白酶活性向0.25ml樣品中加入0.2ml 5％(w/v)偶氮酪蛋白和0.05ml 1M Tris-HCl(pH 7.5)。37℃進行反應30分鐘后，向反應混合物中加入0.5ml 5％(w/v)三氯乙酸以終止反應。離心溶液以去掉沉淀。經過在366nm下測吸光率測定上清液中偶氮染料的量，以此估計樣品的蛋白酶活性。
向0.25ml樣品中加入酶來源和抑制劑。酶的量為1μgα-胰凝乳蛋白酶和1.6μg米曲霉培養(yǎng)物上清液中的蛋白質。在所有情況下抑制劑的量為50μg。將抑制劑與酶混合后，獲得的混合物在測定蛋白酶活性前在冰上靜置30分鐘。
蛋白酶活性的測定結果在圖13中顯示。以相對于無抑制劑時獲得的蛋白酶活性(100)的相對值給出活性。為了與腐胺摻入活性進行比較，也顯示了上述腐胺摻入活性的殘留相對活性。
結果，α胰凝乳蛋白酶或米曲霉培養(yǎng)物上清液中的蛋白酶受到與抑制腐胺摻入活性的蛋白酶抑制劑相同的抑制劑的抑制。即，α-胰凝乳蛋白酶的蛋白酶活性受BBI和CYM的特異性抑制，米曲霉培養(yǎng)物上清液的蛋白酶活性受CYM和OVI的特異性抑制。
這些結果表明α-胰凝乳蛋白酶和米曲霉培養(yǎng)物上清液各自的腐胺摻入活性由其中各自含有的蛋白酶引起。
從這些發(fā)現認為經過按上面所述的對于α-胰凝乳蛋白酶或米曲霉培養(yǎng)物上清液一樣測定各種蛋白酶抑制劑在腐胺摻入活性中的抑制情況可估計給定樣品的腐胺摻入活性是否來自蛋白酶。即，在BTG的情況下，TG本身的腐胺摻入活性不受蛋白酶抑制劑的抑制。
認為經過結合蛋白酶抑制劑的抑制情況測定腐胺摻入活性的方法是一種新方法，以該方法可特異性地僅挑選出TG，它與僅測定腐胺摻入活性的常規(guī)方法不一樣。
上述結果表明，在實施例1至3和參考實施例1和2中獲得的腐胺摻入活性可能包括了諸如蛋白酶的其它因子的活性。根據這一觀點，將用于實施例1至3和參考實施例1和2的實驗中的所有樣品，即在表1至5中所示的微生物用上述新形成的測定方法再進行測試。用該方法可僅選擇出不包括蛋白酶或類似物的真正TG。實施例6用下述方法從上面表1至5中所示的所有樣品中特異性地選擇出僅產生TG的細菌。
用蛋白酶抑制劑測定腐胺摻入活性的方法如下所述。除非另有說明，采用實施例1的活性測定方法。
向10μl樣品中加入7μl水和1μl50mM的DTT。將由此獲得的混合物在冰上靜置2小時。然后向其中加入5μl蛋白酶抑制劑溶液，混合物在冰上靜置30分鐘。本文使用的蛋白酶抑制劑溶液是0.2mg/ml的BBI，0.2mg/ml的CYM，0.2mg/ml的OVI，0.2mg/ml的STI或0.2mg/ml的OVM。靜置后，加入試劑以獲得100mM Tris(pH 7.5)，6.3mg/ml的二甲基酪蛋白和1.2μCi的10nm14C-腐胺的終濃度，反應液的量控制為50μl。反應液在37℃反應30分鐘后，以與實施例1相同的方式測定TG活性。
一些測定的結果在表7和8中顯示。
表7腐胺摻入活性(相對值)抑制劑菌株 -CYMBBIOVISTIOVM藤黃微球菌 10075 98104 97 82ATCC400丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌 100 102 95 90111 93tylicum ATCC4259易變球擬酵母 10096144113 95 92NRRL-Y6652紫色紅曲霉 10064 91 77 88 95ATCC16360中國根霉 100 100131 86115 90JCM5596德列馬根霉 10088 91 66 75 98JCM5564爪哇根霉 100 139112 89 94 89JCM5574米根霉(1)10080101 84121 93FERM BP-5549米根霉(2)100 107 92 89105 104FERM BP-5546
表8腐胺摻入活性(相對值)抑制劑菌株 -CYMOVI亞麻短桿菌ATCC917210045 34馬克斯克魯維氏酵母IFF0288 100 195 28戴爾凱氏有孢圓酵母CBS817 10067 30巴楊氏糖酵母CBS395100 0 98醬油曲霉RIB1045 10031 nt柑桔青霉ATCC9849 10021 33酪生青霉IF05849 10014 ntGrifola frondosa 10060 39nt未檢測到表7顯示了腐胺摻入活性未受蛋白酶抑制劑強烈抑制的樣品的例子。腐胺摻入活性未受CYM，BBI和OVI中任一種的強烈抑制。從該事實判斷表7所示的微生物活性是內在的TG活性。
表8顯示了腐胺摻入活性受蛋白酶抑制劑強烈抑制的樣品的例子。例如，從亞麻短桿菌，巴楊氏糖酵母，醬油曲霉，柑桔青霉，酪生青霉或Hypsizigus marmoreus制備的樣品受CYM抑制的程度為至少50％。同樣，例如從亞麻短桿菌，馬克斯克魯維氏酵母，戴爾凱氏有孢圓酵母，柑桔青霉或Grifola frondosa制備的樣品受OVI抑制的程度為至少50％。從這些結果可判斷表8中所示樣品的腐胺摻入活性是由蛋白酶引起的。
在100℃下進行熱處理15分鐘后，以諸如耐熱接合糖酵母CBS6340，Aspergillus saitoi JAM2190，黑色曲霉ATCC16404或Russula delica的微生物制備的樣品具有與熱處理前相等的腐胺摻入活性。由此判斷這些樣品中每一種的腐胺摻入活性是由樣品中所含物質的作用引起的腐胺的非特異性吸附而產生。
經過在所有菌株中使用蛋白酶抑制劑的實驗后，選擇了微球菌屬，梭狀芽孢桿菌屬，球擬酵母屬，根霉屬和紅曲霉屬的微生物作為不受蛋白酶抑制劑抑制且不含非特異性腐胺吸附的微生物。
因此，判斷來自這些微生物的樣品的腐胺摻入活性是內在的TG活性。
特別是判斷下列微生物對于TG生產是有用的藤黃微球菌，丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌，易變球擬酵母，米根霉，中國根霉，德列馬根霉，爪哇根霉和紫色紅曲霉。實施例7在實施例6中判斷為產TG的微生物的易變球擬酵母NRRL Y6652的101液體培養(yǎng)物在與實施例2相同的條件下進行培養(yǎng)。收集細胞，洗滌，再收集并用玻璃珠破碎。離心破碎細胞的懸液，用Q Sepharose(Pharmacia Aktiebolag)對上清液進行離子交換色譜。用0M至1MNaCl進行洗脫后接著分離，經超濾濃縮具有TG活性的級分。含20％的該級分的溶液在酪蛋白溶液(10％酪蛋白，25mM Tris，pH 7.5，5mM DTT)中37℃反應24小時后，可證實反應溶液的膠體化。
根據本發(fā)明，可從具有下列三點優(yōu)勢的微生物中生產TG(1)低花費，(2)高生長率和(3)從古代起就被用于食品。由于由此獲得的TG能產生膠狀蛋白質，所以它能用于生產各種食品，如酸乳酪，乳酪和煮沸的魚糊。
在本說明書中描述的米根霉AJ6158于1995年7月3日以FERM NoP-15022的命名保存于通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)，然后于1996年5月27日根據需要以命名為FERM BP-5549進行了保藏而轉變成根據布達佩斯條約的保藏。米根霉AJ6168也于1996年5月23日以命名為FERM BP-5546保藏于通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學工業(yè)技術研究所(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號)。
權利要求
1.一種生產轉谷氨酰胺酶的方法，它包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微球菌屬，梭狀芽孢桿菌屬，球擬酵母屬，根霉屬和紅曲霉屬中任意一種的微生物以便在培養(yǎng)基中或在微生物細胞中產生所需的轉谷氨酰胺酶，然后分離轉谷氨酰胺酶。
2.權利要求1的方法，其中微球菌屬的微生物是藤黃微球菌，梭狀芽孢桿菌屬的微生物是丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌，球擬酵母屬的微生物是易變球擬酵母，根霉屬的微生物是米根霉，紅曲霉屬的微生物是紫色紅曲霉。
3.權利要求1的方法，其中使用的微生物是藤黃微球菌或易變球擬酵母。
4.生產轉谷氨酰胺酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)藤黃微球菌，丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌，易變球擬酵母，米根霉和紫色紅曲霉中的任意一種以便在培養(yǎng)基或在細胞中產生所需的轉谷氨酰胺酶，然后(1)從培養(yǎng)基中或(2)經破碎細胞或經裂解細胞后，如果需要進行溶解來分離轉谷氨酰胺酶。
5.生產轉谷氨酰胺酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)藤黃微球菌或易變球擬酵母以便在培養(yǎng)基或在細胞中產生所需的轉谷氨酰胺酶，然后(1)從培養(yǎng)基中或(2)經破碎細胞或經裂解細胞后，如果需要進行溶解來分離轉谷氨酰胺酶。
6.以權利要求1的方法可獲得的轉谷氨酰胺酶。
7.以權利要求4的方法可獲得的轉谷氨酰胺酶。
8.以權利要求5的方法可獲得的轉谷氨酰胺酶。
9.一種生產膠狀蛋白質的方法，它包括使用以權利要求1的方法可獲得的轉谷氨酰胺酶。
10一種生產膠狀蛋白質的方法，它包括使用以權利要求4的方法可獲得的轉谷氨酰胺酶。
11.一種生產膠狀蛋白質的方法，它包括使用以權利要求5的方法可獲得的轉谷氨酰胺酶。
12.一種篩選產轉谷氨酰胺酶的微生物的方法，它包括在不存在蛋白酶抑制劑的條件下將微生物樣品與含14C-標記的腐胺和二甲基酪蛋白的底物反應以選擇產生與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白的微生物，然后在選自大豆Bawman-Birk抑制劑，胰凝乳蛋白酶抑制劑和卵抑制劑的蛋白酶抑制劑存在的條件下用含14C-標記的腐胺及二甲基酪蛋白的底物進行相同的反應，比較在蛋白酶抑制劑存在下進行的反應獲得的產物量與在不存在蛋白酶抑制劑時進行的反應獲得的與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白的量，選擇在各蛋白酶抑制劑存在時能產生產量基本上不減少的與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白的微生物。
13.權利要求12的方法，其中選取的微生物是，當不存在蛋白酶抑制劑的條件下其反應產生的與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白為100份時，在存在上述各蛋白酶抑制劑的條件下產生至少65份與腐胺鍵合的二甲基酪蛋白。
全文摘要
一種生產轉谷氨酰胺酶的方法,它包含在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微球菌屬,梭狀芽孢桿菌屬,球擬酵母屬,根霉屬和紅曲霉屬中任一種的微生物以便在培養(yǎng)基中或在微生物細胞中產生所需的轉谷氨酰胺酶,然后分離轉谷氨酰胺酶,還提供了用由此獲得的轉谷氨酰胺酶生產膠狀物質的方法。根據本發(fā)明的方法,可以較低的花費迅速生產轉谷氨酰胺酶。
文檔編號C12P21/04GK1192235SQ96195878
公開日1998年9月2日 申請日期1996年6月10日 優(yōu)先權日1995年6月8日
發(fā)明者小林克德, 山中茂, 谷田有子, 津吉直子, 不藤亮介, 篠崎純子, 橫關健三, 鈴木俊一 申請人:味之素株式會社 被以下專利引用 (2),