專利名稱：在種子中增加必需氨基酸積累的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域。尤其，本發(fā)明涉及在作為飼料的種子中增加營(yíng)養(yǎng)含量的方法。
背景飼料配方要為生長(zhǎng)提供動(dòng)物關(guān)鍵的必需營(yíng)養(yǎng)物。然而，一般地農(nóng)作物提供營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量低的食物資源因?yàn)檗r(nóng)作物含有低比例的一些單胃動(dòng)物不能自我合成的必需氨基酸。
多年來(lái)研究人員試圖通過(guò)育種方案來(lái)提高必需氨基酸在一些重要作物種子蛋白中的比例。隨著對(duì)種子貯藏蛋白以及編碼這些蛋白基因表達(dá)的更深了解，和更多種植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立，提高種子蛋白營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的分子手段能為較傳統(tǒng)手段提供其它途徑。因此，通過(guò)生物工程可增加某種作物特定的氨基酸水平。
其中一種方法是表達(dá)某種含有所需氨基酸成分的異源蛋白達(dá)到足以避免飼料的額外添加的水平。例如，一些富含硫氨基酸的種子蛋白已確定。這些蛋白正常表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵包括含有種子特異性啟動(dòng)子的有效表達(dá)盒。不但基因控制區(qū)域須指導(dǎo)合成高水平的mRNA，而且mRNA必須翻譯成穩(wěn)定的蛋白。
通常在這些動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要的必需氨基酸中農(nóng)作物缺乏的是甲硫氨酸，蘇氨酸和賴氨酸。試圖借助育種，突變選擇和/或改變農(nóng)作物積累貯藏蛋白組成來(lái)提高這些游離氨基酸水平只取得很小的成功。通常，表達(dá)轉(zhuǎn)基因貯藏蛋白不會(huì)導(dǎo)致總的種子氨基酸足夠的增加。由菜豆蛋白啟動(dòng)的巴西堅(jiān)果2S表達(dá)盒是一種有效的嵌合種子特異基因的一個(gè)實(shí)例。然而，既使通過(guò)巴西堅(jiān)果蛋白增加總甲硫氨酸和結(jié)合甲硫氨酸量，從而提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但出現(xiàn)了一個(gè)在種子中積累甲硫氨酸總量的閾值限制。這些種子保留不足的甲硫氨酸作為甲硫氨酸源因此在用上述豆類(lèi)作為食物時(shí)須有甲硫氨酸添加。
另一種通過(guò)改變目的氨基酸組成蛋白的水平來(lái)增加特定氨基酸水平的方法是氨基酸生物合成途徑的修飾。重組DNA和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)已用于改變氨基酸生物合成途徑中催化關(guān)鍵步驟酶的活性。Glassman，U.S.P.NO.5,258,300；Galili，et al.，European Pafent Application NO.485970；(1992)；在此全文引入。然而，修飾種子中氨基酸水平不總是聯(lián)系著那些參入有這些氨基酸蛋白含量的變化。Burrow，et al.，Mol.Gen.Genet.；Vol.241；PP.431～439；(1993)；在此全文引入作為參考。在葉片和種子中增加游離賴氨酸水平已通過(guò)選擇DHDPS突變體或在植物中表達(dá)大腸肝菌DHDPS而獲得。然而，由于種子中游離氨基酸水平常常僅是總氨基酸含量的小部分，這些增加不足以有效提高種子的總氨基酸含量。
lysC基因是細(xì)菌天冬氨酸激酶的一個(gè)突變體，它對(duì)由賴氨酸和蘇氨酸引起的反饋抑制不敏感。表達(dá)這一基因?qū)е略黾蛹琢虬彼岷吞K氨酸生物合成的水平。然而，用種子特異的表達(dá)盒來(lái)表達(dá)這一基因?qū)е略诜N子中僅有6～7％總蘇氨酸或甲硫氨酸水平的增加。參閱Karchi，et al.，The Plant J.，Vol.3；PP.721～7；(1993)；在全文引入作為參考。因此，僅對(duì)種子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有很小的影響，必需氨基酸的添加仍是需要的。
基于上述，仍存在對(duì)于一種增加植物種子必需氨基酸水平的方法的需求。從現(xiàn)有技術(shù)可知，前述方法不足以增加游離和結(jié)合氨基酸水平而有效地增加飼料營(yíng)養(yǎng)含量。仍存在一種需求來(lái)100％，增加必需氨基酸水平，即雙倍于現(xiàn)有水平。如果這個(gè)目標(biāo)達(dá)到，添加將不再需求。
因此本發(fā)明的目標(biāo)是提供方法從基因水平上修飾植物種子從而提高這種植物種子的必需氨基酸蘇氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的水平。
本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是作為食物和/或飼料提供比野生類(lèi)型種同樣種子含較高水平必需氨基酸，蘇氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的種子。
本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)是作為食物和/或飼料提供加倍的必需氨基酸水平，從而能避免飼料添加需求的種子。
概述本發(fā)明提供從基因水平上修飾植物種子從而提高必需氨基酸蘇氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的水平的方法。這些方法包括一種把提供增加了的目標(biāo)游離氨基酸類(lèi)群之來(lái)源和某種伴隨產(chǎn)生的，補(bǔ)充蛋白質(zhì)沉積，結(jié)合起來(lái)的方法，其結(jié)果是一個(gè)超出預(yù)料提高了的蛋白質(zhì)結(jié)合的目標(biāo)氨基酸的積累。
這些方法包括1)對(duì)種子內(nèi)氨基酸代謝途徑進(jìn)行操作，以提供增加必需氨基酸如蘇氨酸、甲硫氨酸和/或賴氨酸的水平和/或可能性；和2)過(guò)量表達(dá)已選定的基因，不管內(nèi)源的或異源的，編碼那些含有必需氨基酸如蘇氨酸、甲硫氨酸和/或賴氨酸的種子蛋白。合成足夠的游離目標(biāo)氨基酸作為來(lái)源結(jié)合到相伴合成選定的蛋白內(nèi)用作消除飼料中添加必需氨基酸需求的一種沉積。
圖的簡(jiǎn)述

圖1描繪了一幅天冬氨酸類(lèi)生物合成途徑的簡(jiǎn)圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述在此使用的“沉積”指一種穩(wěn)定積累的蛋白質(zhì)并含有大量目標(biāo)氨基酸。
在此使用的“來(lái)源”指可用于蛋白質(zhì)生物合成的游離氨基酸。他們是經(jīng)生物合成途徑從頭合成的。
在此使用的“游離氨基酸”指那些未經(jīng)修飾的或直接合成的氨基酸。
在此使用的“結(jié)合氨基酸”指那些修飾后的，例如結(jié)合到肽和蛋白質(zhì)上的氨基酸。
在此使用的“目標(biāo)氨基酸”指一種將被大量產(chǎn)生的氨基酸。
在此使用的“選定的蛋白質(zhì)”指某種蛋白質(zhì)，或其基因等價(jià)物，它含有提高后水平的目標(biāo)氨基酸。
在此使用的“基因水平上修飾的”指一種植物細(xì)胞穩(wěn)定地參入一種由轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)致的核酸構(gòu)建物。術(shù)語(yǔ)“野生型”指一種未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
“內(nèi)源的”蛋白質(zhì)指植物中在天然部位正常具有的天然蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明含有本發(fā)明各種DNA構(gòu)建物的制備和使用方法。用描述的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物種子和微生物也是本發(fā)明的實(shí)施例。
優(yōu)選的其種子中蛋白質(zhì)含量通過(guò)本方法得到提高的植物包括，但不局限于大豆、canola，玉米，向日葵，小麥，大麥，燕麥，小米，水稻。高粱和黑麥。種子可直接用作飼料或食物，或進(jìn)一步加工。在本發(fā)明的實(shí)踐中最好的植物種子是大豆。
按照本發(fā)明，可提供簡(jiǎn)單，快速，和可靠的方法同于產(chǎn)生在結(jié)出的種子中增加了必需氨基酸積累的轉(zhuǎn)基因大豆植株。本方法是基因型獨(dú)立的，表明了比以前使用系統(tǒng)一個(gè)巨大的出乎意料的改進(jìn)。
氨基酸代謝途徑的操作近來(lái)在重組DNA和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)方面的進(jìn)展使得有可能分離、測(cè)序、操作和再導(dǎo)入基因到生物體中，參閱如植物生物工程學(xué)商業(yè)化前景和困難，(1993)，eds Prakash et al.，Oxford&IBH PwblishingCO.，新德里，印度；酵母分子生物學(xué)和基因工程，(1992)，Heslot，et al.，CRC Press，Inc.，USA；和分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，(1989)，Sambrook，et al.，Cola Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約；都在此全文引入作為參考。使用這些技術(shù)允許基因調(diào)控代謝途徑，最終導(dǎo)致某種代謝物濃度的改變。參閱Bailey，et al.，“面對(duì)一個(gè)代謝工程科學(xué)”Science；Vol.252；PP.1668～1675；(1991)；Muller-Rober，et al.，“在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中抑制ADP-葡萄糖焦磷酸化酶導(dǎo)致糖-貯存塊莖和影響塊基形成和塊基貯藏蛋白質(zhì)基因的表達(dá)”TheEMBO Journal；Vol.11(4)；PP.1229～1238；(1992)；Sonnenwald，et.al.，“轉(zhuǎn)基因煙草植株表達(dá)酵母來(lái)源的轉(zhuǎn)化酶于胞漿、液泡或非元質(zhì)體一種有效工具來(lái)研究蔗糖代謝和沉積/源關(guān)系”The PlantJournal；Vol.1(1)，PP.95～106；(1991)；和Tarczynski，et al.，“細(xì)菌mtlD基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)導(dǎo)致甘露糖醇的產(chǎn)生和積累”P(pán)roc.Natl.Acad.Sci.Vol.89，PP.2600～2604；(1992)；都在此全文引入作為參考。下面描述了標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法，借助它植物種子中代謝蘇氨酸、甲硫氨酸和賴氨酸的代謝途徑能被改變。這些非限制性方法的目的是增加這些不必需氨基酸的供給。
過(guò)量表達(dá)一種編碼目標(biāo)酶的基因這一方法增加某種期望目標(biāo)酶的濃度，這種酶是一種限速酶，常被調(diào)控位于代謝分支點(diǎn)上。參閱如Van Schaewen，A.，et al.，EMBOJ.，Vol.9；PP.3033～3044；(1990)；和Dickinson，C.D.，et al.，PlantPhysiol..Vol.95；PP.420～425；(1991).兩篇在此全文引入作為參考。目標(biāo)酶編碼基因的增加的表達(dá)能，例如，通過(guò)提高所用的驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄該基因啟動(dòng)子的強(qiáng)度和/或提高該基因和它的調(diào)控元件的拷貝數(shù)達(dá)到。強(qiáng)的基因表達(dá)和基因高拷貝導(dǎo)致增加mRNA和目標(biāo)酶的水平。目標(biāo)酶濃度的增加提高了通過(guò)限速步驟的代謝流。
例如，增加胱硫γ-合酶(“CS”)的量相對(duì)應(yīng)提高了甲硫氨酸的生物合成。參閱如Thompron，et al.，“浮萍中的甲硫氨酸生物合成”P(pán)lant Physiol.；Vol.69；PP.1077～1083；(1992)；在此引入作為參考。
CS催化甲硫氨酸生物合成的第1步(見(jiàn)圖1)。明顯的生理底物是O-磷酸高絲氨酸，因此CS與蘇氨酸合酶競(jìng)爭(zhēng)這一底物，蘇氨酸合酶是蘇氨酸生物合成中的一個(gè)酶。CS水平與甲硫氨酸水平呈反相關(guān)，表明了甲硫氨酸或有關(guān)化合物的調(diào)節(jié)作用。過(guò)量表達(dá)CS須導(dǎo)致增加流過(guò)CS的流量，引起增加的甲硫氨酸生物合成。
為增加蘇氨酸合成，甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(“MAT”)能過(guò)量表達(dá)。MAT的直接產(chǎn)生物，S-腺苷甲硫氨酸(“SAM”)已在體外被證明強(qiáng)烈地激活蘇氨酸合酶(“TS”)。提高M(jìn)AT表達(dá)導(dǎo)致增加SAM的合成，從而引起將處于激活狀態(tài)的高濃度的TS。增加的TS活性導(dǎo)致蘇氨酸生物合成的提高。由于沉積蛋白質(zhì)的共同表達(dá)，如同本發(fā)明期望的，在目標(biāo)蛋白質(zhì)合成中游離蘇氨酸水平將不會(huì)足夠高而反面地影響天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶的活性或啟動(dòng)分解代謝的活性。
為增加賴氨酸的合成，過(guò)量表達(dá)二氫吡啶二羧酸合酶(“DHPS”)是有效的。DHPS的一種底物，天冬氨酸半醛，是一種分支點(diǎn)中間物，是高絲氨酸生物合成和DHP生物合成的一種前體。提高DHPS活性使之更多轉(zhuǎn)向DHP生物合成，從而，提高賴氨酸的生物合成。共同表達(dá)一種沉積蛋白質(zhì)必然引起在目標(biāo)蛋白生物合成過(guò)程中游離賴氨酸的水平足夠低以致于DHPS或AK-HSD活性不受反面地影響。
編碼目標(biāo)酶基因的低水平表達(dá)降低一種目標(biāo)酶的濃度是能達(dá)到的，例如使用一種反義構(gòu)建物。參閱如Temple，S.T.et al.，“調(diào)節(jié)谷氨酰胺合酶基因在煙草內(nèi)表達(dá)借助插入一個(gè)苜蓿谷氨酰胺合酶基因在有義和反義方向分子和生化分析”Molecwlar and General Genetics，Vol.238(2～3)；PP.315～325；(1993)；在此引入作為參考。表達(dá)一種反義基因構(gòu)建物導(dǎo)致用于酶合成的可轉(zhuǎn)錄mRNA降低，使得目標(biāo)酶濃度和在目標(biāo)酶位點(diǎn)的代謝流降低。
例如，蘇氨酸合酶(“TS”)催化蘇氨酸生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。TS的生理底物是O-磷酸高絲氨酸因此TS與CS競(jìng)爭(zhēng)此底物。TS的低水平表達(dá)減少通過(guò)TS的流，而為CS提供額外的底物(O-磷酸高絲氨酸)，從而增加了朝向甲硫氨酸生物合成的代謝流。而且，低水平的TS引起蘇氨酸生物合成和濃度的下降，因而降低了這種代謝物對(duì)AK-HSD反饋抑制的水平，再次導(dǎo)致甲硫氨酸生物合成的增加。因此，碳骨架和代謝能被從蘇氨酸生物合成轉(zhuǎn)向甲硫氨酸生物合成。
對(duì)于蘇氨酸，DHPS和CS的低水平表達(dá)，與如上所述同樣的原因是有效的。例如，降低水平的CS為T(mén)S提供增加了的O-磷酸高絲氨酸，從而提高了蘇氨酸的生物合成。
而且，降低的TS水平減少了蘇氨酸生物合成和由蘇氨酸對(duì)AK-HSD活性的抑制，這是由于游離蘇氨酸水平是相對(duì)低的。這些作用增加了賴氨酸(和甲硫氨酸)的生物合成。由于MAT具有一種對(duì)TS活性強(qiáng)烈的正影向，對(duì)它生物合成的抑制降低了活化TS的水平，這種效應(yīng)是相同于TS的低水平表達(dá)。
產(chǎn)生另一個(gè)代謝分支點(diǎn)，有時(shí)期望重新引導(dǎo)代謝流遠(yuǎn)離主要的分支點(diǎn)，在此點(diǎn)一種代謝物是多條競(jìng)爭(zhēng)途徑的底物，轉(zhuǎn)移到一條更直接的途徑或到產(chǎn)生一種新代謝物途徑上。這是能通過(guò)表達(dá)編碼目標(biāo)酶的單個(gè)基因或包括編碼多個(gè)酶的多個(gè)基因做到的。參閱如Tarczynski，M.C.，et al.，“在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)細(xì)菌mtlD基因?qū)е庐a(chǎn)生和積累甘露糖醇”P(pán)roc.Natl.Acad.Sci.USAVol.89；PP。2600～2604；(1992)；在此引入作為參考。
例如，在高等植物中O-磷酸高絲氨酸如不是唯一的也是主要的CS生理底物。第1個(gè)關(guān)鍵酶在甲硫氨酸生物合成(CS)和蘇氨酸生物合成(TS)都競(jìng)爭(zhēng)O-磷酸高絲氨酸。為提高甲硫氨酸生物合成，高絲氨酸可通過(guò)表達(dá)編碼高絲氨酸丙二酰轉(zhuǎn)移酶的基因部分地轉(zhuǎn)變?yōu)楸８呓z氨酸。丙二酰高絲氨酸，是除O-磷酸高絲氨酸外的CS但不是TS的一種底物，這樣能獲得CS的較高水平底物，使得甲硫氨酸生物合成提高。
某種目標(biāo)酶生化性質(zhì)的改變按照本方法來(lái)修飾某種目標(biāo)酶編碼基因，改變這種酶的生化性質(zhì)。參閱如U.S.P.NO.5,367,110，1994年11月22日公布，Galili，et al.，在此引入作為參考。有一些已知的方法可改變酶的生化性質(zhì)。這些方法包括定點(diǎn)突變。參閱如Deng，et al.，“通過(guò)消除一個(gè)單一位點(diǎn)實(shí)質(zhì)上可對(duì)任何質(zhì)粒定點(diǎn)突變”Anal.Biochem.，Vol.200，PP.81～88；(1992)在此引入作為參考?；诟淖兊慕Y(jié)果，代謝物質(zhì)流可以經(jīng)過(guò)目標(biāo)酶提高或降低。參閱如Shaul，et al.，“在表達(dá)一個(gè)大腸桿菌天冬氨酸激酶反義突變子的轉(zhuǎn)基因煙草植株中蘇氨酸過(guò)量產(chǎn)生”P(pán)lantPhys.；Vol.100；PP.1157～1163；(1992)；和Brzovic，et al.，“用天冬氨酸替代109位谷氨酸改變了鼠傷寒桿菌來(lái)源的色氨酸合酶雙酶復(fù)合體中β-亞基底物特異性和催化活性”Biochemistry；Vol.31；PP.1180～90；(1992)；都在此引入作為參考。
AK-HSD催化天冬氨酸類(lèi)氨基酸生物合成的第1步。這個(gè)酶通常由賴氨酸和蘇氨酸反饋調(diào)控。AK-HSD的突變體已在大腸桿菌和植物中選擇到，這些細(xì)菌和植物已表明過(guò)量產(chǎn)生游離的蘇氨酸和甲硫氨酸，賴氨酸和異亮氨酸。在結(jié)合蘇氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸或異亮氨酸含量方面僅微弱或無(wú)改變。參閱如Galili et al.，在此同上引用。
過(guò)量表達(dá)一個(gè)預(yù)先選擇的基因本發(fā)明進(jìn)一步包括遺傳地修飾一種植物種子優(yōu)選地表達(dá)一種預(yù)先選擇的蛋白質(zhì)。實(shí)例包括，但不局限于，一種富含甲硫氨酸的蛋白質(zhì)，一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，一種富含賴氨酸的蛋白質(zhì)，一種富含甘氨酸的蛋白質(zhì)，一種富含色氨酸的蛋白質(zhì)，和一種富含酪氨酸的蛋白質(zhì)。
在此使用的“富含…的”指比正常蛋白質(zhì)含較高百分率的氨基酸。
在此使用的“啟動(dòng)子”是指在某個(gè)基因中的一段DNA序列，通常位于基因編碼序列的上游(5′)，并且通過(guò)為RNA聚合酶和其它啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄必須的因子提供識(shí)別結(jié)合區(qū)控制該編碼序列的表達(dá)。首選的啟動(dòng)子是那些能在種子中特異表達(dá)預(yù)先選擇的蛋白質(zhì)以避免在非一種子組織中任何潛在的有害影響。這些啟動(dòng)子對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是很熟悉的。
種子特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括，但不局限于，那些以高度調(diào)控方式在種子中表達(dá)種子貯藏蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。Thompson，et al.，BioEssays；Vol.10；PP.108～113；(1989)；在此全文引入作為參考。那些將會(huì)特別有用的，在雙子葉植物種子中表達(dá)蛋白質(zhì)的種子特異性啟動(dòng)子包括豆類(lèi)β-菜豆蛋白，napin，β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)，和大豆 凝集素。對(duì)于單子葉植物，玉米15KD玉米醇溶蛋白，22KD玉米醇溶蛋白，γ-玉米醇溶蛋白，蠟質(zhì)的，皺縮的1，球蛋白1，和皺縮的2啟動(dòng)子將特別地用于多肽類(lèi)的表達(dá)。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員將承認(rèn)另一些啟動(dòng)子可提供結(jié)構(gòu)以在選作轉(zhuǎn)化的植物中提高預(yù)先選擇的蛋白質(zhì)的水平。
在一個(gè)首選的實(shí)施例中，預(yù)先選擇的蛋白質(zhì)是一個(gè)富含甲硫氨酸的2S種子貯藏蛋白質(zhì)如巴西堅(jiān)果蛋白質(zhì)(BNP)。Altenbach，et al.，Plant Mol.Biol.Vol.8；PP.239～250；(l987)；在此全文引入作為參考。一種編碼這一蛋白質(zhì)的天然的或構(gòu)建的DNA或RNA序列通過(guò)任何穩(wěn)定地整合基因到植物基因組的轉(zhuǎn)化方法被引入到植物細(xì)胞內(nèi)。這能包括許多載體，如病毒載體，游離型載體，穿梭載體，Ti質(zhì)粒載體及其類(lèi)似物，都按照熟知的步驟。Sun，et al.，Eur.Patent Appl.EP NO.295,959；(1991)；在此全文引入作為參考。
“載體”是一種復(fù)制子，如質(zhì)粒，粘粒，或噬菌體，其他DNA區(qū)段可連接其上以便產(chǎn)生連接區(qū)段的復(fù)制，或使得區(qū)段引入到一個(gè)細(xì)胞宿主中。
就某種蛋白質(zhì)而言在此使用的術(shù)語(yǔ)“異源的”指編碼這種蛋白質(zhì)的基因或基因片段是從一種或多種該基因最終在此表達(dá)的植物基因組之外的其它來(lái)源基因組中獲得。這來(lái)源可是天然的，如，基因可從另一種來(lái)源的生命體中獲得，例如細(xì)菌，酵母，真菌等，或一種不同種的植物。這來(lái)源也能是合成的，如，基因或基因片段能在體外通過(guò)化學(xué)合成制備。
就某種預(yù)先選擇的蛋白質(zhì)而言在此使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指編碼這一蛋白質(zhì)的基因被穩(wěn)定地整合進(jìn)細(xì)胞的基因組內(nèi)，以便由這一基因編碼的蛋白質(zhì)，如，某種富含甲硫氨酸的蛋白質(zhì)例如巴西堅(jiān)果蛋白質(zhì)(BNP)，在此細(xì)胞中產(chǎn)生。實(shí)例如，表達(dá)了BNP的新植物，含有可提取的種子BNP水平0.5％，最好的達(dá)至少2％。
編碼預(yù)先選擇的蛋白質(zhì)的核酸序列的特性可以是不相同的，優(yōu)選的實(shí)例描述了許多性質(zhì)這些可以是有利的但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將承認(rèn)這些不是絕對(duì)必需的。這些特性包括選擇某個(gè)具體的構(gòu)建物和載體以將該序列導(dǎo)入細(xì)胞和產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的表達(dá)。一名熟練的技術(shù)人員能夠建一個(gè)適合于在選定的細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)這預(yù)先選擇的蛋白質(zhì)的表達(dá)盒而無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。該發(fā)明的核心是這預(yù)先選擇蛋白質(zhì)的水平；因此，一般地這核酸序列額外的拷貝將產(chǎn)生對(duì)內(nèi)源蛋白質(zhì)合成增加抑制。
通過(guò)但不局限于實(shí)例的途徑，那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地懂得另外的蛋白質(zhì)，如10KDa玉米醇溶蛋白來(lái)源于苜蓿的和2S白蛋白可替代BNP蛋白質(zhì)作為預(yù)先選擇的種子蛋白。分別參閱如Mol.Gen.Gtenet.(1988)Vol.211，PP.477～484；和J.Exp.Bot。Vol.41，233 PP.1541～7，1990，在此都被全文引入作為參考。熟練的技術(shù)人員將承認(rèn)這種預(yù)先選擇的蛋白質(zhì)的選定將取決于這種蛋白質(zhì)的氨基酸組成和它在種子積聚的能力。這包括所有類(lèi)型的種子貯藏蛋白質(zhì)；經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)修飾以便在這種蛋白質(zhì)中提高指定氨基酸的含量的2S，7S和11S蛋白質(zhì)。這氨基酸因它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而被選定從而對(duì)于植物產(chǎn)生一種附加值的特性以及作為一種陷井來(lái)限制指明內(nèi)源性蛋白質(zhì)可得性。可使用蛋白質(zhì)序列的適合來(lái)源的實(shí)例，按照本發(fā)明是植物，特別是高等植物。氨基酸適合于附加值特性以及作為一種限制合成內(nèi)源性蛋白質(zhì)的來(lái)源包括有，但不局限于甲硫氨酸，半胱氨酸，甘氨酸，賴氨酸，色氨酸，和酪氨酸。
在此使用的“植物”指一個(gè)整植物，一個(gè)植物的部分，一個(gè)植物的細(xì)胞，或一群植物細(xì)胞。能在本發(fā)明的方法中使用的植物類(lèi)群通常范圍寬達(dá)所有適合于轉(zhuǎn)化技術(shù)的具種子的高等植物，包括單子葉和雙子葉植物。按照本發(fā)明植物的轉(zhuǎn)化可以進(jìn)行基本上依照所有不同的對(duì)那些植物分子在生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。這些包括但不局限于粒子轟擊，微注射，電穿孔，和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。
如下的轉(zhuǎn)化，再生將正常地包括從轉(zhuǎn)化過(guò)程獲得一個(gè)整植株。從組織培養(yǎng)再生植株的技術(shù)，如被轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體或愈傷組織細(xì)胞系，在本領(lǐng)域是熟知的。參閱如，Phillips，et al.，Plant Cell Tissue OrganCulture；Vol.1；P.123；(1981)；Patterson，KE and N.P.Everett，Plant Sci，；Vol.42；PP.125～132；(1985)；Wright，et al.，Plant Cell；Reports.Vol.6；PP.83～89；(1987)；Barwale，et al.，Planta；Vol.167；P.473；(1986)；在此都全文引入作為參考。選擇一種合適方法是本領(lǐng)域技術(shù)的范疇。
在此詳細(xì)描述的本發(fā)明實(shí)施的范例特別涉及大豆植物和在雙子葉植物中操作的表達(dá)載體。在這些范例中大豆被選作一種模式系統(tǒng)主要是因?yàn)樵搹霓D(zhuǎn)化了的單個(gè)大豆細(xì)胞再生大豆植株的技術(shù)是以本領(lǐng)域熟知的某種方式進(jìn)行的。在此使用的表達(dá)載體是可論證地能夠在許多雙子葉植物中或在組織培養(yǎng)或整個(gè)植株中操作。因此在此公開(kāi)的本發(fā)明是能在雙子葉植物種中轉(zhuǎn)化單個(gè)植物細(xì)胞并能在雙子葉植物種中獲得整個(gè)完整的植株，這些植株可從轉(zhuǎn)化了的植物愈傷組織再生得到并表達(dá)了預(yù)先選擇的種子蛋白質(zhì)。那些目前不能再生的種，當(dāng)再生技術(shù)成熟時(shí)本發(fā)明是完全可用的。
此外，涉及種子蛋白質(zhì)的嵌合表達(dá)載體也是熟知的并在文獻(xiàn)中描述并已證明在單子葉植物細(xì)胞，至少在組織培養(yǎng)中是可操作的。有理由的希望，當(dāng)再生這些植物的技術(shù)完善時(shí)，這些載體也將在整個(gè)單子葉植物中適用，以便所有預(yù)先選擇的種子蛋白質(zhì)能在任何單子葉植物種子中表達(dá)。因此本發(fā)明適用于單子葉和雙子葉植物。
所以，本發(fā)明的實(shí)施能僅通過(guò)少量修飾用來(lái)改善農(nóng)作物象水稻，玉米，小麥，和大麥。這種實(shí)施方案的一個(gè)α-hordothionin高賴氨酸衍生物到一個(gè)大麥或小麥細(xì)胞以減少種子中purothionin的含量增加且種子中賴氨酸的含量。
Thionins是一些存在于大麥，小麥，和其它植物種類(lèi)胚乳中的小型抗菌蛋白質(zhì)。Florack，et al.，Plant Mol Bicl.；Vol.24；PP.83～96；(1994)；在此全文引入作為參考。天然的α-hordothionin富含精氨酸和賴氨酸殘基，每種含5個(gè)殘基(10％)。這蛋白質(zhì)的一些衍生物已制備出，在其中賴氨酸用來(lái)代替其它氨基酸產(chǎn)生對(duì)真菌毒性較低的復(fù)合物的并極大地更富含賴氨酸(29％賴氨酸)。
Purothionins也是存在于小麥和禾本科其它種胚乳中的小型富賴氨酸蛋白質(zhì)。Wada，K.Plant&Cell Physiol.23(8)，1357～1361；(1982)；在此全文引入作為參考。Purothionins對(duì)釀酒酵母是有毒的，其結(jié)果，含有高水平這種蛋白質(zhì)的大麥或小麥不能用來(lái)制作高質(zhì)量啤酒。
然而，按照本發(fā)明，一種高賴氨酸的α-hordothionin或另一種基因工程的為提高賴氨酸含量設(shè)計(jì)和減少對(duì)微生物毒性的thionin能被用來(lái)降低Purothionins的水平和提高大麥，小麥，或其它禾本科植物的賴氨酸含量。在釀造過(guò)程后這些富賴氨酸殘余物能出售用作飼料。
前述的是本發(fā)明范圍的說(shuō)明，一個(gè)本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多改善植物的其它實(shí)例能夠應(yīng)用于本發(fā)明。
本發(fā)明借助如下更加詳細(xì)描述本發(fā)明各種用途的實(shí)例能更好地理解但無(wú)意限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)驗(yàn)部分氨基酸途徑的改變?yōu)榱双@得AK基因的種子特異性表達(dá)和定位該酶到質(zhì)體上，使用步驟的描述如Karchi，et al.，“一種細(xì)菌脫敏的天冬氨酸激酶的種子特異性表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草種子蘇氨酸和甲硫氨酸的產(chǎn)生”The PlantJournal；Vol.3(5)；PP.721～727；(1993)；在此全文引入作為參考。使用菜豆蛋白構(gòu)建物。
一種富甲硫氨酸種子貯藏蛋白質(zhì)對(duì)大豆的轉(zhuǎn)化植物轉(zhuǎn)化大豆(Glycine max)種子，原始變種9341，暴露于由鐘形玻璃廣口瓶產(chǎn)生的氯氣下面消毒。氯氣是由在100毫升次氯酸鈉(5.25％w/w)中加入3.5毫升鹽酸(34～37％w/w)產(chǎn)生的。暴露達(dá)16～20小時(shí)在一個(gè)體積約一立方英寸的容器內(nèi)。表面消毒后的種子保存在培養(yǎng)皿內(nèi)在室溫下。種子的發(fā)芽是通過(guò)放置在1/10強(qiáng)度的瓊脂固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基依照Gamborg[B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基帶有少量有機(jī)物，Sigma Chemical Co.，Cat.no.G5893，0.32gm/上；蔗糖，0.2％v/v和2-(N嗎啉代)乙磺酸(MES)，3.0mM]無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)在28℃和16小時(shí)日照長(zhǎng)度大約20mEm 2S1照度的冷白熒光下培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)3天或4天后，種子可準(zhǔn)備進(jìn)行協(xié)同培養(yǎng)。去掉種子外皮并去掉子葉下3～4毫米處的伸長(zhǎng)根。數(shù)個(gè)培養(yǎng)皿的每個(gè)培養(yǎng)皿中存有10粒處理過(guò)的種子。
構(gòu)建質(zhì)粒為構(gòu)建含有單個(gè)拷貝嵌合富含甲硫氨酸的蛋白基因(BNP)的質(zhì)粒p12GUSBN17，利用了質(zhì)粒pARC12(Prosen D.E和R.B.Simpson，Biotechnology Vol.5，pp.966-971；(1987)；在此全文引入)。這是1個(gè)29.5kb的質(zhì)粒，它是膿桿菌二分載體(binary vecfor)系統(tǒng)的部分并含有作為植物細(xì)胞選擇性標(biāo)志的嵌合基因胭脂氨酸合酶/新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II。從質(zhì)粒PB1221獲得的嵌合基因CaMV35S/β葡糖醛酸酶(Jefferson，R.A.，Plant.Mol.Bio.Reporter；Vol.5(4)，pp.387-405；(1987)；在此全文引入作為參考)被插入PARC12，構(gòu)成質(zhì)粒p12GUS-15。質(zhì)粒pD3-8-12(Altenbach，et al.，Plant.Mol.Biol.；Vol.13；pp.513-522；(1989)；在此全文引入作為參考)含有載體pTZ19U中的BNP基因。質(zhì)粒pD3-8-12經(jīng)Hind III酶切后插入到質(zhì)粒p12GUS-15的Hind III位點(diǎn)。形成的質(zhì)粒p12GUSBN17大小約36kb，含有1個(gè)拷貝的BNP基因，并使細(xì)胞宿主能抗氨芐青霉素和四環(huán)素。
為構(gòu)建一個(gè)含有4個(gè)拷貝富含甲硫氨酸的蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒，質(zhì)粒pD3-8-12被用作起始質(zhì)粒。BNP基因是從pD3-8-12經(jīng)EcoR1，Hind III和Xmn1酶切而切出的。該片段的兩端用DNA聚合酶I的克列諾片段填成平端，一個(gè)3kb含有嵌合基因的片段經(jīng)凝膠純化。該片段連接到事先經(jīng)Smal酶切和用牛小腸磷酸酶處理后的質(zhì)粒pD3-8-12上。形成的質(zhì)粒稱為pD3-8-12-2X，它含有雙拷貝的嵌合串聯(lián)排列的富甲硫氨酸BNP基因。
為構(gòu)建含有4個(gè)拷貝嵌合的質(zhì)粒，質(zhì)粒pD3-8-12-2X經(jīng)EcoR1和Hind III酶切后兩端用DNA聚合酶的克列諾片段填成平端。1個(gè)含有雙拷貝嵌合基因的6kb片段被分離出。該片段被連接到事先經(jīng)Sma I酶切并經(jīng)牛小腸磷酸酶處理后的質(zhì)粒pD3-8-12-2X上。形成的質(zhì)粒是pD3-8-12-4X。
這嵌合BNP基因被插入到Ti質(zhì)粒載體pARC12中。一個(gè)從pD3-8-12-4X經(jīng)EcoRI和Hind III酶切切出的12kb片段被連接到事先經(jīng)EcoRI和Hind III酶切的pARC12上。形成的質(zhì)粒，p12-4X，含有位于tDNA邊界間4個(gè)拷貝的BNP基因，和1個(gè)作為植物細(xì)胞中選擇標(biāo)志的嵌合胭脂氨酸合酶新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因。隨后，該質(zhì)粒被從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到根癌膿桿菌菌系LBA4404中通過(guò)三親株融合法。形成細(xì)菌的鑒定由Southern印跡分析確定。
根癌農(nóng)桿菌LBA 4404/p12GUSBN17和p12-4X的制備包含二分質(zhì)粒p12GUSBN17(DP1816，單拷貝BNP序列)或p12-4X(DP1813，4個(gè)拷貝BNP序列)的根癌農(nóng)桿菌菌系LBA4404在含有1.0mg/ml四環(huán)素的基本A培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的過(guò)夜培養(yǎng)物被收集合并在550nm處測(cè)定其光密度。在15ml錐形離心管中裝入足夠體積的培養(yǎng)物使得沉降后每個(gè)離心管收集到1.0和2.0×1010個(gè)細(xì)胞，此時(shí)O.D.550 1.0＝1.4×109細(xì)胞/ml。沉降經(jīng)6000g離心10分鐘獲得。離心后傾注出上清液離心管室溫保存作為種子接種物但不能超過(guò)1小時(shí)。
轉(zhuǎn)化接種分批進(jìn)行使得每個(gè)種子的平板都經(jīng)新鮮懸浮的膿桿菌沉淀處理。每次一個(gè)，沉淀懸浮在20ml接種培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基含有B5鹽(G5893)3.2gm/l；蔗糖2.0％w/v；6-苯基氨基嘌呤(BAP)44mM；吲哚基乙酸(IBA)0.5mM；乙酰丁香酮(AS)100mM并用10mM pH5.5MES緩沖液配制。經(jīng)渦旋振動(dòng)再次懸浮。然后種子接種物被注入含有處理的種子其子葉節(jié)用外科刀片浸漬的培養(yǎng)皿內(nèi)。這是這樣完成的通過(guò)沿著種子的長(zhǎng)軸經(jīng)莖尖把種子分成兩部分以保存2個(gè)整子葉。然后基尖的兩部分與它們各自的子葉折斷借助外科刀片將它們汾開(kāi)。然后子葉節(jié)用外科刀片沿著對(duì)稱軸反復(fù)劃痕而被浸漬。小心不能從外植體到遠(yuǎn)軸面整個(gè)切開(kāi)。二十個(gè)外植體經(jīng)處理在大約5分鐘內(nèi)然后在室溫下靜止培養(yǎng)30分鐘。額外的平板可在這段時(shí)間內(nèi)處理。30分鐘后外植體被轉(zhuǎn)移到同樣的含有0.2％w/v Gelrite(Merk在Co.Inc.)的固體培養(yǎng)基上。外植體以近軸面朝上水平種植在該培養(yǎng)基表面在22℃約20mEm2S1冷白熒光照射下培養(yǎng)3天。
培養(yǎng)和選擇3天以后外植體被轉(zhuǎn)移到液體反選擇培養(yǎng)基上。反選擇培養(yǎng)基含有B5鹽(G5893)3.2gm/L；蔗糖2.0％w/v；BAP5.0mM；IBA0.5mM；萬(wàn)古霉素200mg/ml；cefotaxime 500mg/ml并用3.0mM pH5.7MES緩沖液配制。每個(gè)培養(yǎng)皿中十個(gè)外植體進(jìn)行洗滌并在室溫下恒定，緩慢地旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)四天。反選擇培養(yǎng)基須替換四次。
外植體然后被放入瓊脂固化的選擇培養(yǎng)基上。選擇培養(yǎng)基含有B5鹽(G5893)3.2gm/L；蔗糖2.0％w/v；BAP5.0mM；IBA0.5mM；硫酸芐那霉素50mg/ml；萬(wàn)古霉素100mg/ml；cefotaxime 30mg/ml；timentin 30mg/ml并用3.0mM pH5.7MES緩沖液配制。選擇培養(yǎng)基因用0.3％w/v Seakem瓊脂固化。外值體被種植在培養(yǎng)基上，近軸面朝下培養(yǎng)在28℃16小時(shí)日照長(zhǎng)度和冷白熒光照度為60-80mEm2S1。
經(jīng)過(guò)二星期后外植體再次在旋轉(zhuǎn)搖床上用液體培養(yǎng)基洗滌、這一次洗滌進(jìn)行過(guò)夜在含有50mg/ml硫酸芐那霉素的反選擇培養(yǎng)基中。第二天外植體被放置在瓊脂固化的選擇培養(yǎng)基上。這些外植體再次被種植在培養(yǎng)基上，近軸面朝下，如同前面所述再培養(yǎng)另二個(gè)星期。
再生一個(gè)月后在選擇培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化后的組織肉眼可見(jiàn)，與發(fā)白健康狀況不佳的背景組織相反呈再生組織的綠色部分。去除沒(méi)有綠色區(qū)域的外植體，帶綠色區(qū)域的外植體轉(zhuǎn)移到延長(zhǎng)培養(yǎng)基上。延長(zhǎng)培養(yǎng)基含有B5鹽(G5893)3.2gm/L；蔗糖2.0％w/v；IBA3.3mM；赤霉酸1.7mM；萬(wàn)古霉素100mg/ml；cefotaxine 30mg/ml；timentin30mg/ml用3.0mMpH5.7MES緩沖液配制。延長(zhǎng)培養(yǎng)基用0.2％w/v gelrite固化。外植體被種植上近軸面朝上同前一樣培養(yǎng)。在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)繼續(xù)，每二個(gè)星期外植體被轉(zhuǎn)移到新鮮平板上。當(dāng)基長(zhǎng)至長(zhǎng)度為0.5cm時(shí)外植體從基部切斷被放置在13×100mm的試管長(zhǎng)根培養(yǎng)基上。長(zhǎng)根培養(yǎng)基含有B5鹽(G5893)3.2gm/l；蔗糖15gm/l；煙酸20mM；焦谷氨酸(PGA)900mg/l和IBA10mM。培養(yǎng)基用3.0mM pH5.7MES緩沖液配制用0.2w/v Gelrite固體。十天后這些基轉(zhuǎn)移到不含IBA和PGA同樣培養(yǎng)基上?；祥L(zhǎng)出根來(lái)并把這些試管按前述的保存在同樣的環(huán)境條件下。
當(dāng)根系統(tǒng)完全形成時(shí)小植株轉(zhuǎn)移到無(wú)菌土壤混合的植包內(nèi)(ICNBiomedicas，Inc.，cat.no.26-720在1-02)。溫度、光照期和光強(qiáng)與前述一樣。在這些條件下再生體變成茁壯的，大多數(shù)正常(雖小)的植株。當(dāng)它們的根系再次完全形成時(shí)切去植包的一角。在氣候室或溫室內(nèi)植株逐漸地耐寒。最終它們?cè)跍厥抑斜辉苑N在土壤中生長(zhǎng)成熟，結(jié)種子。
生長(zhǎng)，增殖，和收獲轉(zhuǎn)基因大豆在衣阿華州，同一品種(9341)未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化植株得到的種子在1992年春季種植于1992年秋季收獲。每個(gè)單獨(dú)品系保持隔離地生長(zhǎng)在1個(gè)或多個(gè)10.5英尺的行列中以保證最大的生長(zhǎng)。從轉(zhuǎn)化過(guò)程得到的品系其中插入單拷貝BNP基因的稱為BNP1X。那些插入四個(gè)拷貝基因的稱為BNP4X。
在1992年秋季大部分收獲的BNP4X種子在Puerto Rico中增殖。這種子按品系在1992年12月種植于1993年3月按品系收獲。
部分增殖，收獲的種子返回進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)試和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室測(cè)試。其余的按品系在1993年3月再次種植于Puerto Rico 1993年6月按品系收獲。整個(gè)第二次種植的增殖量約是2英畝，或每個(gè)品系略多于0.1英畝。
在本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)是本發(fā)明所屬領(lǐng)域的那些本領(lǐng)域技術(shù)人員水平的體現(xiàn)。在此引入作為參考的所有出版物和專利申請(qǐng)是處于同等的程度，好象每一單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被特別地和獨(dú)立地指明引入作為參考。
上述實(shí)施例的變動(dòng)是在本領(lǐng)域技術(shù)人員普通技術(shù)能力的限度內(nèi)，這種變動(dòng)不偏離如同下述權(quán)利要求描述的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高某種植物種子內(nèi)一種目標(biāo)氨基酸水平的方法包括a)對(duì)這種氨基酸的代謝途徑進(jìn)行操作以提供這種目標(biāo)游離氨基酸的一種額外來(lái)源；和b)通過(guò)過(guò)量表達(dá)某種編碼含有目標(biāo)氨基酸的蛋白的預(yù)先選擇的基因而相伴地產(chǎn)生一種補(bǔ)充的沉積，使得有蛋白結(jié)合的目標(biāo)氨基酸的積累。
2.權(quán)利要求1所述的方法其中目標(biāo)氨基酸是從由賴氨酸，甲硫氨酸和蘇氨酸組成的組中選擇的。
3.權(quán)利要求2所述的方法其中代謝途徑是通過(guò)過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶，少量表達(dá)關(guān)鍵酶，重建代謝分支點(diǎn)或改變酶的生化特性來(lái)調(diào)節(jié)的。
4.權(quán)利要求3所述的方法其中種子是從由大豆，canola，玉米，向日葵，小麥，大麥，燕麥，小米，水稻，高粱和黑麥組成的組中選擇的。
5.權(quán)利要求4所述的方法其中代謝途徑是通過(guò)過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶，少量表達(dá)關(guān)鍵酶或改變酶的生化特性來(lái)調(diào)節(jié)的。
6.權(quán)利要求5所述的方法其中種子是從由大豆，玉米，高粱，canola和向日葵組成的組中選擇的。
7.權(quán)利要求6所述的方法其中種子是從由大豆，玉米和canola組成的組中選擇的。
8.權(quán)利要求7所述的方法其中種子是從由大豆種子組成的組中選擇的。
9.權(quán)利要求7所述的方法其中代謝途徑是通過(guò)改變酶的生化特性來(lái)調(diào)節(jié)的。
10.權(quán)利要求6所述的方法其中種子中甲硫氨酸水平的提高是通過(guò)a)過(guò)量表達(dá)編碼巴西堅(jiān)果蛋白質(zhì)基因；和b)過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶，少量表達(dá)關(guān)鍵酶或改變酶的生化特性而完成。
11.權(quán)利要求10所述的方法其中種子中甲硫氨酸水平的提高是通過(guò)改變酶的生化特性完成。
12.某種植物種子被遺傳地修飾能表達(dá)相對(duì)于同種野生型植物種子提高了水平的某種目標(biāo)氨基酸，這種修飾包括a)調(diào)節(jié)這種氨基酸代謝途徑以提供這種目標(biāo)游離氨基酸的一個(gè)增加來(lái)源；和b)通過(guò)過(guò)量表達(dá)某種編碼含有該氨基酸的蛋白質(zhì)的預(yù)先選擇的基因而相伴地產(chǎn)生一種補(bǔ)充的沉積蛋白質(zhì)，使得有蛋白結(jié)合的目標(biāo)氨基酸的積累。
13.權(quán)利要求12所述的種子其中目標(biāo)氨基酸是從由甲硫氨酸，賴氨酸和蘇氨酸組成的組中選擇的。
14.權(quán)利要求13所述的種子其中代謝途徑是通過(guò)過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶，少量表達(dá)關(guān)鍵酶，重建代謝分支點(diǎn)或改變酶的生化特性來(lái)調(diào)節(jié)的。
15.權(quán)利要求14所述的種子其中該種子是從由大豆，canola，玉米，向日葵，小麥，大麥，燕麥，小米，水稻，高粱和黑麥組成的組中選擇的。
16.權(quán)利要求15所述的種子其中該種子是從由大豆，玉米，高粱，canola和向日葵組成的組中選擇的。
17.權(quán)利要求16所述的種子其中該種子是從由大豆，玉米和canola組成的組中選擇的。
18.權(quán)利要求17所述的種子，該種子是大豆。
19.權(quán)利要求18所述的種子其中甲硫氨酸水平的提高是通過(guò)a)過(guò)量表達(dá)編碼巴西堅(jiān)果蛋白質(zhì)的基因；和b)過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶，少量表達(dá)關(guān)鍵酶或改變酶的生化特性而完成的。
20.權(quán)利要求19所述的種子其中代謝途徑是通過(guò)改變酶的生化特性來(lái)調(diào)節(jié)的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種提高植物種子中必需氨基酸水平的方法,從而增進(jìn)種子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。該方法包括調(diào)節(jié)氨基酸的代謝途徑以提供目標(biāo)游離氨基酸的一個(gè)增加源,和伴隨地過(guò)量表達(dá)某種編碼含有目標(biāo)氨基酸蛋白質(zhì)的預(yù)先選擇的基因,使得有蛋白結(jié)合的目標(biāo)氨基酸的積累。產(chǎn)生一個(gè)補(bǔ)充的蛋白質(zhì)沉積。本發(fā)明在提高種子中甲硫氨酸,賴氨酸和蘇氨酸水平中是特別有效的。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1195377SQ96196076
公開(kāi)日1998年10月7日 申請(qǐng)日期1996年5月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月31日
發(fā)明者L·R·比奇, M·C·塔爾茨斯基 申請(qǐng)人:先鋒高級(jí)育種國(guó)際公司