專利名稱：人b7.1和/或b7.2特異的猴源單克隆抗體靈長動物化形式,藥用組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制備和鑒定抗人B7，即人B7.1和人B7.2，的新型單克隆抗體和它們的靈長動物化形式。更具體地說，本發(fā)明涉及抗人B7，即人B7.1和人B7.2，的獼猴抗體的生產(chǎn)和鑒定，這些抗體是通過篩選噬菌體展示庫和用B7免疫的猴的B淋巴細胞所獲得的猴異種雜交瘤來進行制備的。
本發(fā)明進一步涉及與人B7，即人B7.1和B7.2結合的靈長動物化的特異抗體以及它們相應的氨基酸和核酸序列。
再者，本發(fā)明涉及含有抗人B7.1和/或人B7.2的特異猴源單克隆或靈長動物化抗體的藥用組合物以及它們通過調(diào)節(jié)B7CD28通路而作為免疫抑制劑的應用，例如，用于治療自身免疫病和預防器官移植排斥。
背景技術：
長期以來人們一直在關注免疫學、血液學和腫瘤學之間的臨床交叉。許多血液學家或腫瘤學家治療的疾病在病理生理上或含有自身免疫成份或含有免疫缺陷成分，這已導致血液學家廣泛采用免疫抑制劑，而腫瘤學家一直在尋找能增強內(nèi)源性抗腫瘤免疫的免疫佐劑。到目前為止，這些治療通常包括非特異方式的免疫抑制和免疫激活。除了這些治療的功效有限之外，伴隨它們的非特異性毒性作用也限制了它們的總體效果。因此，人們一直在尋找另外的策略。
人們闡明了正迅速增多的細胞表面分子的功能作用已極大地推動了免疫學與臨床血液學和腫瘤學的結合。在免疫和造血系統(tǒng)的細胞上已鑒定出近200種細胞表面抗原(Schlossman SF.Boumsell L.Gilks JM，Harlan T.Kishimoto，C.Morimoto C，Ritz J.Shaw S，Silverstein RL，Springer TA，Tedder TF，Todd RFCD抗原(1993)，《血液》(Blood)83879，1994)。這些抗原代表細胞系限制的和參與多種過程的更廣泛分布的分子，這些過程包括細胞識別、粘附、增殖的誘導和維持、細胞因子分泌、效應功能、甚至細胞死亡。認識了這些分子的功能屬性已促使人們進行操縱免疫應答的新嘗試。盡管涉及細胞粘附和抗原特異性識別的分子以前一直被認為是免疫治療的目標，但近來人們的注意力集中于細胞表面分子的一亞群，稱之為共刺激分子(Bretscher P“21年后淋巴細胞激活的雙信號模型”《今日免疫學》(Immunol.Today)1373(1992)；Jenkins MK，Johnson JG“參與T-細胞共刺激的分子”《免疫學現(xiàn)代觀念》(Curr Opin Immnol)5351 1993；Geppert T，Davis L.Gur H.Wacholtz M.Lipsky P“參與T細胞激活的輔助細胞信號”《免疫學綜述》(Immunol Rev)1175，(1990)；Weaver CT，Unanue ER“抗原遞呈細胞的共刺激功能”《今日免疫學》(Immunol Today)1149，(1990)；Stennam RM，Young JW“來自抗原遞呈細胞的信號”《現(xiàn)代免疫學觀念》(Curr Opin Imunol)3361，(1991))。共刺激分子不能啟動但是能夠產(chǎn)生和放大抗原特異的T細胞應答和效應功能(Bretscher P“21年后淋巴細胞激活的雙信號模型”《今日免疫學》(Immunol.Today)1373(1992)；Jenkins MK，Johnson JG“參與T細胞共刺激的分子”《現(xiàn)代免疫學觀念》(Curr Opin Immnol)5351(1993)；GeppertT，Davis L.Gur H.Wacholtz M.Lipsky P“參與T細胞激活的輔助細胞信號”《免疫學綜述》(Immunol Rev 1175，(1990)；Weaver CT，UnanueER“抗原遞呈細胞的共刺激功能”《今日免疫學》(Immunol Today)1149，(1990)；Stennam RM，YoungJW“來自抗原遞呈細胞的信號”《現(xiàn)代免疫學觀念》(Curr Opin Immunol)3361，(1991)；June CH，Bluestone JA，Linsley PS，Thompson CD“CD28受體在T細胞激活中的作用”《今日免疫學》(Immunol Today)15321，(1994)。
近來，一個稱為B7CD28的特異的共刺激通路由于它在B和T細胞的激活中發(fā)揮重要作用，幾個不同的研究小組已對其進行了研究(June CH，Bluestone JA，Linsley PS，Thompson CD“CD28受體在T細胞激活中的作用”《今日免疫學》(Immunol Today)15321，(1994)；June CH Ledbetter JA“CD28受體在T細胞對抗原的應答中的作用”《免疫學年度綜述》(Ammu Rev Immunol)11191(1993)；SchwartzRH“T淋巴細胞的共刺激CD28、CTLA-4、和B7/BB1在白細胞介素2產(chǎn)生和免疫治療中的作用”《細胞》(Cell)711065，(1992))。自從4年前發(fā)現(xiàn)了這個配體受體通路后，已積累了大量證據(jù)表明B7CD28相互作用在決定免疫反應性與無反應性方面代表一個關鍵接合點。(June CH，Bluestone JALinsley PS，Thompson CD“CD28受體在T細胞激活中的作用”《今日免疫學》(Immunol Today)15321，(1994)；June CH Ledbetter JA“CD28受體在T細胞對抗原的應答中的作用”《免疫學年度綜述》(Annu Rev Immunol)11191(1993)；Schwartz RH“T淋巴細胞的共刺激CD28、CTLA-4、和B7/BB1在白細胞介素2的產(chǎn)生和免疫治療方面的作用”《細胞》(Cell)711065，(1992)；Cohen J“發(fā)動對有害免疫應答的靶攻擊”(新聞；評論)《科學》(Science)257751，(1992)；Cohen J“作為T細胞‘共刺激因子’的一種新蛋白引人注目”(新聞；評論)《科學》(Science)262頁844卷，(1993))。
特別是，人B7抗原，即人B7.1和B7.2，的作用已被報道是在T細胞激活中發(fā)揮共刺激作用。
1.B7.1和B7.2在T細胞激活中的共刺激作用精確發(fā)生一次有效的免疫應答依賴于T細胞和抗原遞呈細胞之間的一系列特異相互作用。盡管該過程中所必需的第一步依賴于MHC II類分子存在的情況下抗原與T細胞受體結合(Lane，P.J.L，F(xiàn).M.McConnell，G.L.Schieven，E.A.Clark，和J.A.Ledbetter，(1990)，“II類分子在人B細胞激活中的作用”《免疫學雜志》(The Journal ofImmunology)，1443684-3692)，但是該相互作用本身不足以誘導一次對已知抗原的持久應答所必要的所有事件(Schwartz，R.H.(1990)，“T淋巴細胞克隆性無反應的一種細胞培養(yǎng)模型”《科學》(Science)，2481349；Jenkins，M.K.(1992)?！凹毎至言谡T導克隆性無反應中的作用”《今日免疫學》，1369；Azuma，M.，M.Catabyab，D.Buck,J.H.Phillips，和L.L.Lanier，(1992)?！癈D28參與一種人自然殺傷白血病細胞系所介導的非MHC限制性細胞毒?！薄睹庖邔W雜志》(The Journalof Immunology)，1491556-1561；Azuma，M.，M.Catabyab，D.Buck，J.H.Phillips，和L.L.Lanier，(1992)。“CD28與B7相互作用共刺激產(chǎn)生由靜止的小T淋巴細胞所介導的原發(fā)同源異體增殖應答和細胞毒?！薄秾嶒炨t(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，175353-360)。
與表達在抗原遞呈細胞上的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)一起作用，某些其它共刺激分子的參與是必要的(Norton，S.D.，L.Zuckerman，K.B.Urdahl，R.Shefner，J.Miller，和M.K.Jenkins.(1992)，“CD28的配體，B7，通過提供給T細胞一種共刺激信號而增加IL-2的產(chǎn)生”《免疫學雜志》(The Journal of Immunology)，1491556-1561)?！癈D28和CTLA-4的同源二聚體在T細胞上表達”(June，C.H.，J.A.Ledbetter，P.S.Linsley，和C.B.Thompson，(1990)，“CD28受體在T細胞激活中的作用”《今日免疫學》(Immunology Today)11211-216；Linsley，P.S.，W.Brady,M.Umes，L.S.Grosmaire，N.K.Damle，和J.A.Ledbetter，(1991)，“CTLA-4是B細胞激活抗原B7的又一個受體”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，174561)，它們是持久免疫應答所必須的主要共刺激分子對(Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits，和L.L.Lanier，(1993)，“B7/BB1在激活的T淋巴細胞上的功能性表達”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，177845-850；Freeman，G.J.，A.S.Freeman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman，和Lm.Nadler，(1989)，“B7，一個只表達于激活的和贅生性B細胞上的免疫球蛋白超家族的新成員”。《免疫學雜志》(The Journal ofImmunology)，1432714-2722；Hathcock,K.S.，G.Laslo，H.B.Dickler，J.Bradshaw，P.Linsley，和R.J.Hodes，(1993)，“共刺激T細胞激活的另一種CTLA-4配體的鑒定”《科學》(Science)，262905-911；Hart，D.N.J.，G.C.Starling，V.L.Calder，和N.S.Femando，(1993)?！癇7/BB1是在人樹突狀細胞上由活化所誘導的一種白細胞分化抗原”《免疫學》(Immunology)，79616-620)。在體外可以證實缺乏這些共刺激信號將導致T細胞激活通路不能得以進行，并且引起對特異抗原不發(fā)生應答或無反應性的形成。(參見，如，Harding，F(xiàn).A.，J.G.McArthur，J.A.Gross，D.M.Raulet，和J.P.Allison，(1992)?！癈D28介導的信號傳導共同刺激鼠T細胞并阻止在T細胞克隆中誘導無反應性。”《自然》(Nature)，356607-609；Gimmi，C.D.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，G.Gray，和L.M.Nadler，(1993)?！叭薚細胞克隆無反應性是在缺乏B7共刺激的情況下由抗原遞呈所誘導的?！薄秶铱茖W院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)， 906586-6590；Tan，P.，C.Anasefti，J.A.Hansen，J.Melrose，M.Brunvand，J.Bradshaw，J.A.Ledbetter，和P.S.Linsley，(1993)，“在人T淋巴細胞中通過阻斷CD28與它的自然配體B7/BBl之間的相互作用來誘導異體抗原特異的低應答。”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，177165-173)。體內(nèi)耐受的形成為免疫抑制和器官移植排斥的有效治療以及自身免疫病的治療提供了一種機制。使用CTLA4-Ig后這種耐受情況已在實驗模型中獲得(Lenschow，D.J.，Y.Zeng，R.J.Thistlethwaite，A.Montag，W.Brady，M.G.Gibson，P.S.Linsley，和J.A.Bluestone，(1992)，“CTLA-4 Ig所引起的異種胰島移植物的長期存活。”《科學》(Science)，257789-795)。
盡管B7.1以200Nm的解離常數(shù)(Kd)與CD28結合，而與CTLA-4以高20倍的親和力結合，但B7.1和B7.2分子均能與CD28或CTLA-4結合(Linsley，P.S.，E.A.Clark，和JA.Ledbetter，(1990)，“T細胞抗原CD28通過與活化抗原B7/BB-1相互作用而介導與B細胞的粘附?！薄秶铱茖W院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)，875031-5035；Linsley等，(1993)，“CD28受體在T細胞對抗原的應答中的作用，”《免疫學年度綜述》(Annu.Rev.Immunol.)11191-192；Linesley等，(1993)，“B7/BB1與CD28結合誘導CD28合成的短暫下調(diào)和延長的對CD28信號傳導的無應答，”《免疫學雜志》(The Journal of Immunology)，1503151-3169)。B7.2表達于活化的B細胞和干擾素誘導的單核細胞，但不表達于靜止的B細胞(Freeman，G.J.，G.S.Gray，C.D.Gimmi，D.B.Lomarrd，L-J.Zhou，M.White，J.D.Fingeroth，J.G.Gribben，和LM.Nadler，(1991)?！叭薆淋巴細胞活化抗原B7的鼠同源物的結構、表達和T細胞共刺激活性，”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，174625-631)。另一方面，B7.2以極低水平組成性表達于靜止的單核細胞、樹突狀細胞和B細胞，并且它在活化的T細胞、NK細胞和B淋巴細胞上的表達增加(Azuna，M.D.Ito，H.Yagita，K.Okumura，J.H.Phillips，L.L.Lanier，和C.Somoza，(1993)，“B70抗原是CTLA-4和CD28的又一配體，”《自然》(Nature)，36676-79)。盡管B7.1和B7.2可以在同一類型細胞上表達，但它們在B細胞上的表達以不同的動力學來進行(Lenschow，D.J.，G.H.Su，L.A.Zuckerman，N.Nabavi，C.L.Jellis，G.S.Gray，J.Miller，和J.A.Bluestone，(1993)，“CTLA-4另一種配體的表達和功能意義，”《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，9011054-11058；Boussiotis，V.A.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，J.Daley，G.Gray，和L.M.Nadler，(1993)，“活化的人B淋巴細胞表達三種共刺激T細胞激活的CTLA-4對應受體?！薄睹绹鴩铱茖W院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，9011059-11063)。在RNA水平的進一步分析已經(jīng)證實B7.2 mRNA是組成性表達的，而B7.1 mRNA在激活后4小時可以檢測到，并且在刺激后24小時才能檢測到最初低水平的B7.1蛋白(Boussiotis，V.A.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，J.Daley，G.Gray，和L.M.Nadler，(1993)，“活化的人B淋巴細胞表達三種共刺激T細胞激活的CTLA-4對應受體，”《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，9011059-11063)。因此，B細胞激活后，CTLA-4/CD28對應受體可在不同時期進行表達。
B7.1和B7.2不同時間的表達提示這兩種分子與CTLA-4和/或CD28之間的相互作用向T細胞傳遞不同的但是相關的信號(LaSalle，J.M.，P.J.Tolentino，G.J.Freeman，L.M.Nadler，和D.A.Hafler，(1992)，“在應答超抗原刺激的反應中CD28和T細胞抗原受體的信號傳導協(xié)同調(diào)節(jié)白細胞介素2基因的表達，”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，176177-186；Vandenberghe，P.，G.J.Freeman，L.M.Nadler，M.C.Fletcher，M.Kamoun，L.A.Turka，J.A.Ledbetter，C.B.Thompson，和C.H.June，(1992)，“抗體和B7/BB1介導的CD28受體結合能夠誘導人T細胞的酪氨酸磷酸化作用，”《實驗醫(yī)學雜志》(The Journal of ExperimentalMedicine)，175951-960)。T細胞表面CTLA-4和CD28的確切信號傳導功能目前是未知的(Janeway，C.A.，Jr.和K.Bottomly，(1994)，“淋巴細胞應答的信號和標志，”《細胞》(Cell)，76275285)。然而，可能是一套受體為T細胞激活提供起始刺激信號，而第二套提供持久的信號使通路進一步被激活和使克隆性擴增得以發(fā)生(Linsley，P.S.，J.L.Greene，P.Tan，J.Bradshaw，J.A.Ledbetter，C.Anasetti，和N.K.Bamle，(1992)，“活化T淋巴細胞上CTLA-4和CD28的共表達和功能協(xié)作，”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，1761595-1604)。目前的數(shù)據(jù)支持Jenkins和Schwartz所提出來的雙信號假說(Schwartz，R.H.，(1990)，“T淋巴細胞克隆性無反應的一種細胞培養(yǎng)模型，”《科學》(Science)，2481349；Jenkins，M.K.，(1992)，“細胞分裂在誘導克隆性無反應中的作用，”《今日免疫學》(Immunology Today)，1369)，即TCR和共刺激信號兩者對T細胞擴增、淋巴因子分泌和效應功能的完全發(fā)揮都是必要的(Greenen，V.和G.Kroemer，(1993)，“細胞免疫耐受的多種途徑，”《今日免疫學》(Immunology Today)14573)。缺乏第二種信號的傳遞會導致T細胞不能分泌IL-2并且使細胞對抗原不發(fā)生應答。
在結構上，B7.1和B7.2都含有細胞外的免疫球蛋白超家族V和C類似的結構域，一段疏水的跨膜區(qū)和一個胞漿內(nèi)尾部(Freeman，G.J.，J.G.Gribben，V.A.Boussiotis，J.W.Ng，V.Restivo，Jr.，L.A.Lombard，G.S.Gray，和L.M.Nadler，(1993)，“克隆B7-2共同刺激人T細胞增殖的一種CTLA-4對應受體，”《科學》(Science)，262909)。B7.1和B7.2都被高度糖基化。B7.1是44-54KD的包括一段223個氨基酸組成的胞外區(qū)、一段23個氨基酸組成的跨膜區(qū)和一段61個氨基酸組成的胞漿內(nèi)尾部的糖蛋白。B7.1含有3個潛在的蛋白激酶磷酸化位點。(Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits，和L.L.Lanier，(1993)，“B7/BB1在活化的T淋巴細胞上的功能性表達，”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，177845-850)。B7.2是一個306個氨基酸組成的膜結合糖蛋白。它包括一段220個氨基酸組成的胞外區(qū)，一段23個氨基酸組成的疏水的跨膜區(qū)和一段60個氨基酸組成的胞漿內(nèi)尾部(Freeman，G.J.，A.S.Freedman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman，和LM.Nadler，(1989)，“B7，只表達在活化的和贅生性B細胞上的免疫球蛋白超家族的一名新成員，”《免疫學雜志》(The Journal ofImmunology)，1432714-2722)。盡管B7.1和B7.2基因二者都定位在染色體上的同一區(qū)域(Freeman，G.J.，D.B.Lombard，C.D.Gimmi，S.A.Brod，L Lee，J.C.Laning，D.A.Hafler，M.E.Dorf，G.S.Gray，H.Reiser，C.H.June，C.B.Thompson，和L.M.Nadler，(1992)，“CTLA-4和CD28mRNA共同表達于激治后的大多數(shù)T細胞上，”《免疫學雜志》(TheJournal of Immunology)，1493795-3801；Schwartz，R.H，(1992)，“T淋巴細胞的共刺激CD28、CTLA-4和B7/BB1的作用，”Selvakumar，A.，B.K.Mohanraj，R.L.Eddy，T.B.Shows，P.C.White，C.Perrin，和B.Dupont，(1992)，“編碼B淋巴細胞活化抗原S7的人基因的基因組成和染色體定位”《免疫遺傳學》(Immunogenetics)，36175-181)，但這兩個抗原沒有很高水平的同源性。B7.1和B7.2之間總的同源性是26％，而鼠B7.1與人S7之間的同源性是27％(Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits，和L.L.Lanier，(1993)，“B7/BB1在活化T淋巴細胞上的功能性表達，”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，177845-850；Freeman，G.J.，A.S.Freedman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman，和LM.Nadler，(1989)；“B7，只表達于活化的和贅生性B細胞上的免疫球蛋白超家族的一名新成員，”《免疫學雜志》(The Journal ofImmunology)，1432714-2722)。盡管將人B7.1、人B7.2和鼠B.1的序列進行排列并沒有顯示長的同源性延伸區(qū)域，但是已知這三個分子都與人CTLA-4和CD28結合。這樣，很可能這三個分子共有一段在順序上或構象上相同的，或非常同源的區(qū)域。該區(qū)域可組成B7.1和B7.2分子與它們對應受體的結合點。針對這些表位所制備的抗體能夠潛在地抑制B7與它在T細胞上的對應受體之間的相互作用。更進一步，與B7.1和B7.2分子上的該區(qū)域交叉反應的抗體與分別抗B7.1或B7.2的抗體相比，將有潛在的實用優(yōu)點。
2.阻斷B7/CD28的相互作用阻斷B7/CD28之間的相互作用提供了誘導特異性免疫抑制的可能性，這種免疫抑制有潛力用于產(chǎn)生長期持續(xù)的抗原特異的治療效果。已經(jīng)證實抗B7.1或B7.2的抗體能阻斷T細胞的激活過程，這可通過體外抑制IL-2的產(chǎn)生來測定(DeBoer，M.，P.Parren，J.Dove，F(xiàn).Ossendorp，G.van der Horst，和J.Reeder，(1992)，“一種新的抗B7單克隆抗體的功能特征，”《歐洲免疫學雜志》(Eur.Journal of Immunology)，223071-3075；Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits，和L.L.Lanier，(1993)，“B7/BB1在活化的T淋巴細胞上的功能性表達，”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，177845-850)。然而，已經(jīng)證明不同的抗體在它們的免疫抑制力方面是不同的，這可能反映了它們的親和力或表位特異性。CTLA-4/Ig融合蛋白和抗CD28 Fabs已被證明對下調(diào)IL-2的產(chǎn)生具有相似的效果。
體內(nèi)施用可溶性的CTLA-4/Ig融合蛋白已被證明能抑制小鼠體內(nèi)T細胞依賴的抗體應答(Linsley，P.S.，J.L.Greene，P.Tan，J.Bradshaw，J.A.Ledbetter，C.Anasetti，和N.K.Damle，(1992)，“活化的T淋巴細胞上CTLA-4和CD28的共表達和功能協(xié)作，”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，1761595-1604；Lin，H.，S.F.Builing，P.S.Linsley，R.O.Wei，C.D.Thompson，和L.A.Turka，(1993)，“由CTLA-4-Ig加供體特異的轉輸所誘導的長期接受主要組織相容性復合體不匹配的心臟異體移植物，”《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，1781801)，并且更進一步講，更大的劑量也能夠抑制再次免疫的應答，這證明了這種方法用于治療抗體介導的自身免疫病的可行性。另外，CTLA-4/Ig通過直接抑制T細胞和B7.1/B7.2抗原遞呈細胞之間的相互作用而能夠預防小鼠體內(nèi)胰島細胞的排斥(LenschoW，D.J.，G.H.Su，L.A.Zuckerman，N.Nabavi，C.LJellis，G.S.Gray，J.Miller，和J.A.Bluestone，(1993)，“CTLA-4另一個配體的表達和功能意義，”《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，9011054-11058)。在這種情況下，可獲得供體特異的長期耐受。
3.用于抗體篩選的重組噬菌體展示技術到目前為止，與B7.1和B7.2交叉反應的單克隆抗體尚未見報道。正如所提及的，這樣的抗體作為免疫抑制劑將有可能是非?？扇〉?。噬菌體展示技術正開始替代傳統(tǒng)的用于分離免疫應答中所產(chǎn)生的抗體的方法，因為這樣可以獲得比用傳統(tǒng)方法所可能獲得的更大比例的免疫庫。這種情況的部分原因是由于PEG融合的無效性、染色體的不穩(wěn)定、以及與異種雜交瘤制備有關的大量組織培養(yǎng)和篩選。相比之下，噬菌體展示技術依賴于有可能捕獲與某一已知抗原的應答有關的整個免疫球蛋白基因庫的分子技術。
該技術由Barber等人所述，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，887978-7982，(1991)?；旧?，免疫球蛋白重鏈基因經(jīng)PCR擴增并克隆進含有編碼絲狀噬菌體M13的次要衣殼蛋白基因的一個載體，克隆是以重鏈融合蛋白得以構建的方式進行。重鏈融合蛋白與輕鏈基因一起在噬菌體M13組裝的時候摻入M13的噬菌體顆粒中。每一個重組噬菌體在它的基因組中都包含一個在噬菌體表面展示的不同抗體Fab分子的基因。在這些基因庫中，可以克隆和展示106以上的不同抗體。噬菌體庫在抗原包被的微量培養(yǎng)孔中進行淘篩，非特異的噬菌體被沖洗掉，并且與抗原結合的噬菌體得到洗脫。分離出來自抗原特異性克隆的基因組并切除基因III，這樣抗體可以可溶性Fab形式進行表達用于進一步的鑒定。一旦篩選出一個作為潛在治療候選者的一價Fab，就能方便地轉換成一個完整的抗體。以前所述的用于將Fab序列轉換成為完整抗體的表達系統(tǒng)是IDEC’s哺乳動物表達載體NEOSPLA。該載體包含人γ1或γ4恒定區(qū)基因。用NEOSPLA載體轉染CHO細胞，經(jīng)擴增后，這個載體系統(tǒng)已被報道能提供非常高的表達水平(＞30pg/細胞/天)。
4.靈長動物化的抗體另一種制備重組抗體的高效方法由Newman所發(fā)表，(1992)，《生物技術》(Biotechnology)，101455-1460。更具體而言，該技術能夠制備包含猴可變區(qū)和人恒定區(qū)的靈長動物化的抗體。該參考文獻在此全文引入作為參考。再者，該技術也見于在1995.1.25提交的普通轉讓的美國申請?zhí)?8/379,072，它是在1992.7.10提交的美國系列號07/912,292的繼續(xù)申請，系列號07/912,292是在1992.3.23提交的美國系列號07/856,281的部分繼續(xù)申請，最終系列號07/856,281是在1991.7.25提交的美國系列號07/735,064的部分繼續(xù)申請。08/379,072和母申請在此全文引入作為參考。
該技術對抗體進行修飾，這樣當它們用于人時不會作為異種抗原而排斥。該技術依賴于用人抗原或受體對南美猴進行免疫。發(fā)展這種技術是用來制備抗人細胞表面抗原的高親和力的單克隆抗體。
以前已有報道采用這種方法制備的抗體能表現(xiàn)出對人的效應功能，免疫原性降低，并且血清半衰期長。該技術依賴于這個事實，即南美猴在種系發(fā)生上是與人相似的，盡管存在這個事實，但是它們?nèi)匀粚⒃S多人的蛋白質(zhì)識別為異物，因而引發(fā)免疫應答。而且，因為南美猴在種系發(fā)生上是與人接近的，所以在這些猴中所產(chǎn)生的抗體已發(fā)現(xiàn)與在人體內(nèi)產(chǎn)生的抗體具有高度的氨基酸同源性。事實上，當對獼猴免疫球蛋白輕鏈和重鏈的可變區(qū)基因進行測序后，人們發(fā)現(xiàn)每個基因家族的序列與人的對應基因具有85-89％的同源性(Newman等，(1992)，同上)。用這種方法產(chǎn)生的第一個抗體，抗-CD4抗體，與人免疫球蛋白框架區(qū)的共有序列具有91-92％的同源性。Newman等，《生物技術》(Biotechnology)，101458-1460，(1992)。
人B7抗原特異的單克隆抗體以前已在文獻中有報道。例如，Weyl等，《人類免疫學》(Hum.Immunol)，31(4)，271-276，(1991)描述了利用自然的和突變的抗原性變體來測定的抗HLA-B-27的人單克隆抗體的表位定位圖。再者，Toubert等，《臨床實驗免疫學》，(Clin.Exp.Immunol.)，82(1)，16-20，(1990)描述了也與35KD的細菌外膜蛋白發(fā)生反應的一種HLA-B27單克隆抗體的表位定位圖。再一篇，Valle等，《免疫學》(Immunol.)，69(4)，531-535，(1990)描述了一種屬于IgG1亞類、能識別表達于活化的B細胞和HTLV-1轉化的T細胞上的B7抗原的單克隆抗體。進一步，Toubert等，《免疫學雜志》(J.Immunol.)，141(7)，2503-9，(1988)描述了HLA-B27和HLA-B7抗原的表位定位圖，是通過在大腸桿菌中制備的這兩個等位基因的雜合基因所構建的區(qū)域內(nèi)重組體來進行的。
一些研究者一直認為B7抗原的高表達與自身免疫病相關。例如，Ionesco-Tirgoviste等，《相關醫(yī)學》(Med.Interre)，24(1)，11-17，(1986)報道在I型胰島素依賴型糖尿病患者中B7抗原的表達增加。再者，已有人報道B7抗原在銀屑病患者的皮膚樹突狀細胞上有表達。(Nestle等，《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)94(1)，202-209，(1994))。
進一步說，在文獻中已有人報道利用親和純化的可溶性HLA-B7來抑制抗HIA-B7異體反應性的CTL。(Zavazava等《移植》(Transplantation)，51(4)，838-42，(1991))。再者，已有人報道B7受體的可溶性配體，CTLA-4-Ig在動物模型中阻斷B7活性(參見，如Lenschow等，《科學)》(Science)，257，789，7955(1992))的應用以及能夠抑制B7的一種B7-1-Ig融合蛋白質(zhì)的應用。
發(fā)明概述和目的本發(fā)明的目的之一是制備并鑒定抗人B7抗原，更具體地說是抗人B7.1抗原和/或人B7.2抗原的新型獼猴抗體。
更具體地說，本發(fā)明的目的之一是制備并鑒定抗人B7抗原，即人B7.1和人B7.2抗原，的新型獼猴抗體，該目的是通過篩選噬菌體展示庫和/或利用人B7抗原，即，人B7.1或B7.2抗原免疫的猴B淋巴細胞所獲得的猴異種雜交瘤而達到的。
本發(fā)明的另一特定目的是提供抗-B7猴源單克隆抗體和其靈長動物化形式的抗體，這些抗體能特異地與人B7.1和/或B7.2抗原結合，抑制活化T細胞的B7/CD86通路和B7刺激，因而能抑制IL-2的產(chǎn)生和T細胞增殖，并作為有效的免疫抑制劑發(fā)揮作用。
本發(fā)明的另一目的是提供抗人B7.1和抗人B7.2猴源單克隆抗體和其靈長動物化形式的抗體，這些抗體能抑制供體脾細胞培養(yǎng)物中抗原驅動的應答，如抗原特異性IgG應答、IL-2產(chǎn)生和細胞增殖。
本發(fā)明的另一特定目的是鑒定人B7.1和人B7.2抗原特異的一些特定的猴源單克隆抗體和具有諸如親和力、免疫抑制活性等有利特性的它們的靈長動物化形式的抗體，它們作為治療劑是有效的。更具體地說，這些猴源抗體和它們靈長動物化的形式可被用作諸如免疫抑制劑之類，即用來阻斷抗原驅動的免疫應答，治療諸如銀屑病、類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)等自身免疫病，以及預防器官移植排斥。
本發(fā)明的另一目的是提供含有一種或多種人B7抗原，即，人B7.1和/或B7.2抗原，特異的猴源單克隆抗體，或它們靈長動物化形式的抗體的藥用組合物，該組合物中還包括一種制藥上可接受的載劑或賦形劑。這些組合物將被用作，例如，免疫抑制劑，以治療諸如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等自身免疫病，阻斷抗原驅動的免疫應答，以及預防移植物受者中的器官移植排斥。
本發(fā)明的另一目的是通過使用治療上有效量的與B7抗原即人B7.1和/或B7.2抗原特異結合的一種或多種猴或靈長動物化的單克隆抗體來提供新的治療方法。這樣的治療方法有助于治療通過抑制B7CD28通路可以治療的疾病，如，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、1型糖尿病、銀屑病、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化病、再生障礙性貧血等自身免疫病，該方法也有助于預防在移植病人中的排斥。
本發(fā)明還有另一目的是提供至少表達人B7.1和/或B7.2抗原特異的猴源單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的轉染子，例如，CHO細胞。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼人B7.1和/或B7.2抗原特異的猴源單克隆抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的核酸序列，以及用于表達靈長動物化抗體、含有這些核酸序列的表達載體。
定義對以下術語下定義，目的是更明確地理解本發(fā)明。排除抗體(Depleting antibody)—一種殺傷活化的B細胞或其它抗原遞呈細胞的抗體。非排除抗體(Non-depleting antibody)—一種阻斷B7與T細胞激活配體CD28和CTLA-4之間共刺激作用的抗體。這樣，它使抗原遞呈細胞無反應但并不消除它們。靈長動物化抗體—一種重組抗體，它是生物工程制備的，含有一種猴源抗體，尤其是南美猴抗體，的重鏈和輕鏈可變區(qū)，并且含有人恒定區(qū)序列，優(yōu)選人免疫球蛋白γ1或γ4的恒定區(qū)(或PE變體)。這種抗體的制備描述于Newman等，(1992)，“用于免疫治療人類疾病的重組抗體的靈長動物化一種抗人CDH的獼猴/人嵌合抗體”《生物技術》(Biotechnology)，101458-1460；也見于普通轉讓的08/379,072，二者在此全文引入作為參考。已有人報道這些抗體與人源抗體的同源性程度高，即85-90％，能表現(xiàn)出對人的效應功能，其免疫原性降低，以及可能與人抗原具有高親和力。B7抗原—本申請中的B7抗原包括例如人B7、B7.1和B7.2抗原。這些抗原能與CD28和/或CTLA-4結合。這些抗原在T細胞的激活過程中發(fā)揮共刺激作用。再者，所有這些B7抗原都包含細胞外的免疫球蛋白超家族V和C相似的區(qū)域、一段疏水的跨膜區(qū)和一個胞漿內(nèi)尾部。(參見，F(xiàn)reeman等，《科學》(Science)262909，(1993))，并且都是高度糖基化的。抗-B7抗體—是一些抗體，優(yōu)選猴源單克隆抗體或其靈長動物化形式的抗體，這些抗體以足夠的親和力與諸如人B7.1和/或B7.2抗原等人B7抗原特異地結合，以阻斷B7CD28之間的相互作用，并因此誘發(fā)免疫抑制。
附圖簡述

圖1示出含有根據(jù)獼猴免疫球蛋白序列所設計的引物的pMS載體，它用于篩選針對B7所制備的在絲狀噬菌體表面展示的重組免疫球蛋白庫。
圖2示出用于表達人B7.1抗原特異的本文的靈長動物化抗體的NEOSPLA表達載體。
圖3示出抗已轉染的CHO細胞表面B7.1的猴抗-B7.1血清滴度。
圖4示出存在未標記SB7和Mab L307.4鼠抗-B7.1抗體的情況下，SB7.1親和純化的猴源抗體與放射標記的sB7.1結合的抑制情況。
圖5示出通過與親和純化的SB7.1競爭性結合，放射標記的猴135和L3707.4抗-B7.1抗體與B7陽性的人SB細胞結合的抑制。
圖6示出通過與未標記的SB7.1鼠抗-B7.1抗體(L307.4)和猴1127親和純化的血清抗體競爭性結合，放射性標記的B7-Ig結合于活化的人外周血T細胞的抑制。
圖7示出在混合淋巴細胞培養(yǎng)中抗-B7.1親和純化的猴血清抗體對IL-2蛋白的抑制。
圖8a描述了7C10輕鏈的一種靈長動物化形式的氨基酸和核酸序列。
圖8b描述了7C10重鏈的一種靈長動物化形式的氨基酸和核酸序列。
圖9a描述了7B6輕鏈的一種靈長動物化形式的氨基酸和核酸序列。
圖9b描述了7B6重鏈的一種靈長動物化形式的氨基酸和核酸序列。
圖10a描述了(16C10)靈長動物化輕鏈的氨基酸和核酸序列。
圖10b描述了(16C10)靈長動物化重鏈的氨基酸和核酸序列。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明涉及制備與人B7.1和/或人B7.2抗原特異結合的新型猴源單克隆抗體，以及它們衍生的靈長動物化的抗體。這些抗體對人B7.1和/或B7.2具有高親和力，因而可以作為抑制B7CD86通路的免疫抑制劑。
優(yōu)選通過篩選噬菌體展示庫或利用B7(如，人B7.1和/或7.2)免疫的猴的B淋巴細胞所制備的猴異種雜交瘤來實現(xiàn)猴源單克隆抗體的制備。
正如所提及的，用于制備抗-B7抗體的第一種方法包括重組噬菌體展示技術。該技術總體上如上所述。
基本上，該技術包括構建在絲狀噬菌體表面展示的抗B7抗原的重組免疫球蛋白庫，以及篩選那些分泌與B7.1和/或B7.2抗原有高親和力的抗體的噬菌體。正如以上所提及的，優(yōu)選選擇與人B7.1和B7.2都結合的抗體。為達到這個方法的要求，本發(fā)明已為猴文庫構建了一個獨特的能降低重組的可能性和改善穩(wěn)定性的文庫。pMS這個載體將在下面的內(nèi)容中詳述，見圖1。
基本上，為采用噬菌體展示技術用于獼猴文庫，該載體含有特異的引物以利于PCR擴增猴免疫球蛋白的基因。這些引物的設計依據(jù)那些在發(fā)展靈長動物化技術時所獲得的獼猴序列和包括人序列的數(shù)據(jù)庫。
適合的引物公開于普通轉讓的08/379,072，在此將它引入作為參考。
第二種方法涉及人B7抗原，優(yōu)選人B7.1和B7.2抗原，對猴即獼猴進行免疫。獼猴用于制備單克隆抗體的內(nèi)在優(yōu)點如上所述。尤其是，這種猴，即南美猴，可以針對人抗原或受體進行免疫。再者，根據(jù)Newman等人所述的方法，所獲得的抗體可用于制備靈長動物化的抗體，Newman等，《生物技術》(Biotechnology)，10，1455-1460，(1992)，以及Newman等，普通轉讓的1995.1.25提交的美國系列號08/379,072，在此全文引入它們作為參考。
從南美猴中獲得這些抗體的重要有利條件是這些猴能識別許多人類蛋白質(zhì)作為異物，因而為抗體的形成提供了條件，這些抗體中有一些對所需要的人抗原，比如，人細胞表面蛋白質(zhì)和受體，有高的親和力。另外，因為它們在種系發(fā)生上與人接近，所以所產(chǎn)生的抗體與人體內(nèi)產(chǎn)生的抗體相比，表現(xiàn)出高度的氨基酸同源性。正如以上所提及的，當對獼猴免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因進行測序后，人們發(fā)現(xiàn)每個基因家族的序列與人的相應序列有85-88％的同源性(Newman等，(1992)，同上)。
基本上，對南美獼猴施用人B7抗原，如，人B7.1和/或人7.2抗原，從它們體內(nèi)分離出B細胞，比如，對動物進行淋巴結活檢來分離，然后在聚乙二醇PEG的介導下B淋巴細胞與KH6/B5(小鼠×人)異種雜交瘤細胞進行融合。然后鑒定出那些分泌與諸如人B7.1和/或人7.2抗原等人B7抗原結合的抗體的異種雜交瘤。
與B7.1和B7.2都能結合的抗體是所期望的，因為這種抗體有可能用于抑制B7.1和B7.2以及其它B7與它們對應受體，即人CTLA-4和CD28，之間的相互作用。抗這些表位的抗體可抑制人B7.1與人B7.2與它們的T細胞對應受體之間的相互作用。這有可能提供協(xié)同效果。
然而，只與一種人B7抗原、B7.1抗原或B7.2抗原結合的那些抗體也是非常期望的，因為這些分子共同參與T細胞激活、克隆性擴增、淋巴因子(IL-2)分泌，以及對抗原的應答。若人B7.1與B7.2均能與人CTLA-4和CD28結合，那么有可能潛在存在至少一個共同的或同源的能產(chǎn)生獼猴抗體的區(qū)域(可能是一個共同的構象表位或一些表位)。
發(fā)明人選用人B7.1抗原來免疫獼猴，所使用的是在CHO細胞中產(chǎn)生的并利用L307.4-瓊脂糖凝膠親和柱通過親和層析所純化的可溶性重組B7.1抗原。然而，人B7抗原，人B7.1抗原或人B7.2抗原的特定來源不是關鍵的，只要它具有足夠的純度，能夠引起對所施用的特定B7抗原以及可能對其它B7抗原的特異抗體應答就行了。
目前已克隆并測序了人B7抗原，人B7.1抗原(也稱之為CD80)和人B7.2抗原(也稱之為CD86)的基因，因此能方便地通過重組的方法進行制備。
優(yōu)選所施用的人B7抗原，人B7.1抗原和/或人B7.2抗原將以可溶性形式進行使用，比如，去掉了跨膜和胞漿區(qū)，因而只剩下細胞外區(qū)，即細胞外超家族V和C相似區(qū)域，的B7，B7.1或B7.2基因的表達產(chǎn)物。(參見，如，Grumet等，《人類免疫學》(Hum.Immunol.)，40(3)，228-234頁，1994，該文敘述人B7可溶性形式的表達，在此將它全文引入作為參考)。
在能夠引起特異性抗體產(chǎn)生的條件下，用B7，B7.1和/或B7.2抗原，優(yōu)選其可溶性形式，對獼猴進行免疫。優(yōu)選，可溶性的人B7，B7.1或B7.2抗原與一種佐劑聯(lián)合使用，比如，弗氏完全佐劑(CFA)、明礬、皂素、或其它的已知佐劑，以及這些佐劑的組合等。一般地，這種情況需要間隔數(shù)月重復免疫，比如，通過反復注射的方法。舉例說明，可溶性B7.1抗原與佐劑聯(lián)合使用，同時間隔3或4個月進行加強免疫是有效的，最終產(chǎn)生含有與人B7.1抗原結合的抗體的血清。
免疫后，通過對免疫的動物進行淋巴結活檢等方式收集B細胞，然后在聚乙二醇的介導下與KH6/B5(小鼠×人)異種雜交瘤細胞進行融合。制備這種異種雜交瘤的方法是已知的，并可見于1995.1.25 Newman等人提交的美國系列號08/379,072，在此引入作為參考。
然后鑒定那些能分泌與人B7，B7.1和/或B7.2結合的抗體的異種雜交瘤。這可通過已知的技術來完成。舉例說明，可利用酶或放射性核素標記的人B7，B7.1和/或B7.2抗原，通過ELISA或放射免疫試驗來進行測定。
然后將分泌對人B7，B7.1和/或B7.2抗原有所需特異性的抗體的細胞系進行亞克隆直到單克隆。
在本發(fā)明中，發(fā)明人篩選純化的抗體以測定它們與以下抗原結合的能力在ELISA試驗中的可溶性B7.1抗原包被的培養(yǎng)板，抗原陽性的B細胞，和在細胞表面表達人B7.1抗原的CHO轉染瘤細胞(transfectomas)。另外，篩選抗體以了解它們阻斷B細胞/T細胞相互作用的能力，這可通過混合淋巴細胞反應中IL-2的產(chǎn)生和氚標記的胸苷的攝取來測定，同時可利用125I放射標記的可溶性B7.1(SB7.1)測定B7的結合。
另外，測定那些來自獼猴的親和純化的抗體以了解它們對表達B7.1/Ig融合蛋白的CHO轉染子的反應性，以及對表達人B7.2抗原的CHO細胞的反應性。這些結果表明B7.1免疫血清與B7.2轉染瘤細胞結合?？贵w與B7.2抗原結合可利用可溶性B7.2-Ig試劑來證實。正如在實施例中所討論的，這可通過從CHO轉染瘤細胞中制備和純化足夠量的B7.2-Ig以制備B7.2-Ig-瓊脂糖凝膠親和柱來完成。與B7.2交叉反應的那些抗體將與B7.2-Ig-瓊脂糖凝膠柱相結合。
然后，能表達與人B7抗原，B7.1抗原和/或B7.2抗原特異結合的抗體的細胞系被用于克隆可變區(qū)序列以制備靈長動物化的抗體，基本上如下所述，Newman等，(1992)，同上，以及Newman等，1995.1.25提交的美國系列號379,072，二者均在此引入作為參考?；旧希撨^程包括從細胞中提取RNA，轉換成cDNA、然后用Ig特異的引物通過PCR進行擴增。合適的引物描述于Newman等，1992，同上，以及美國系列號379,072。(參見，尤其是美國系列號379,072的圖1)。
所克隆的猴可變區(qū)基因然后插入到含有人重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因的表達載體中。優(yōu)選采用IDEC，Inc.的稱為NEOSPLA的一個專利表達載體來進行。該載體見于圖2，并包括巨細胞病毒的啟動子/增強子、小鼠β珠蛋白的主要啟動子、SV40的復制起點，牛生長激素多聚腺苷酸序列、新霉素磷酸轉移酶的外顯子1和外顯子2、人免疫球蛋白κ或λ恒定區(qū)、二氫葉酸還原酶基因、人免疫球蛋白γ1或γ4PE恒定區(qū)和前導序列。人們發(fā)現(xiàn)該載體在融合有猴可變區(qū)基因，轉染CHO細胞后，在含G418的培養(yǎng)基中篩選并在含氨甲喋呤的培養(yǎng)基中擴增的情況下，能夠非常高水平地表達靈長動物化的抗體。
舉例說明，以前已公開發(fā)表，該表達系統(tǒng)能制備對CD4和其它的細胞表面受體具有高親和力(Kd≤10-10M)的靈長動物化抗體。另外，已發(fā)現(xiàn)這些抗體表現(xiàn)出與原來的猴源抗體相同的親和力、特異性和功能活性。這個載體系統(tǒng)基本上公開于普通轉讓的美國系列號379,072，在此將它引入作為參考，以及1993.11.3提交的美國系列號08/149,099，也在此全文引入作為參考。該載體系統(tǒng)是為高水平表達而準備的，即＞30pg/細胞/天。
正如以下所討論的，發(fā)明人已選出四種最重要的與B7.1抗原特異結合、也可能與B7.2抗原結合的候選猴源單克隆抗體。這些猴源單克隆抗體在此命名為7B6、16C10、7C10和20C9。
正如以下更詳細的討論，對這些抗體進行評定以了解它們阻斷B細胞/T細胞之間相互作用的能力，這可通過混合淋巴細胞反應中IL-2的產(chǎn)生和氚標記的胸苷的攝取來測定。為了進行測定T細胞結合的T細胞結合實驗，在存在PHA刺激物的情況下培養(yǎng)人外周血淋巴細胞3-6天。B7的結合利用125I放射標記的可溶性B7.1來進行放射測定。所觀察到的結果表明所有這些抗體以高親和力與B7.1抗原結合，并有效地阻斷B細胞/T細胞之間的相互作用，這可通過混合淋巴細胞培養(yǎng)的IL-2分泌減少以及增殖減弱來證明。
這些特定猴源單克隆抗體的特性概括如下1.為了證明猴抗體阻斷CTLA4-Ig之間物理的相互作用的能力，將不同濃度的猴抗B7.1抗體和未標記的CTLA4-Ig與放射標記的CTLA-IgI125一起共孵。抑制實驗的結果顯示了猴源抗體的IC50(引起50％抑制的抑制物的濃度)為a 7C10 0.39μg/Mlb 16C10 1.60μg/Mlc 20C9 3.90μg/Mld 7B6 39.0μg/Ml2.Scatchard分析表明猴抗體與B7-Ig包被的培養(yǎng)板結合的表觀親和常數(shù)(Kd)大約為a 7C106.2×10-9Mb 16C10 8.1×10-9Mc 7B6 10.7×10-9Md 20C9 16.8×10-9M3.在混合淋巴細胞反應實驗(MLR)中體外檢測這些抗體。MLR表明4種抗-B7.1抗體都能抑制IL-2的產(chǎn)生，但抑制程度不同，如以下Ibgo值所示a7B6 5.0μg/Mb16C10 ＜0.1μg/M
c20C92.0μg/Md7C105.0μg/M4.檢測猴抗-B7.1抗體與人外周血淋巴細胞(PBL)上B7分子結合的能力。FACS分析表明所有的這4種猴源抗體都檢測為陽性。
5.通過FACS分析檢測猴源抗體16C10、7B6、7C10和20C9的C1q結合。結果表明7C10猴Ig與B7.1 CHO-轉染的細胞孵育后表現(xiàn)出強的C1q結合。16C10是陽性的，然而20C9和7B6猴源抗體是陰性的。
6.為了選出一種動物模型用于病理毒理研究，用不同品種的動物血檢測猴源抗體。結果表明猴抗-B7.1抗體與人、黑猩猩、以及可能與狒狒有交叉反應。
根據(jù)這些特性，可以看出，16C10，7C10和20C9三種猴源單克隆抗體具有最有利的特性，同時16C10和7C10比20C9更好一點。
采用以上所述的以及在普通轉讓的美國系列號08/379,072中所述的技術，發(fā)明人已經(jīng)克隆了7C10、7B6和16C10的可變區(qū)，并提供了7C10輕鏈、7C10重鏈、7B6輕鏈、7B6重鏈、16C10輕鏈和16C10重鏈的靈長動物化形式的氨基酸和核酸序列。這些氨基酸和核酸序列可見于圖8a和8b、9a和9b、以及10a和10b。人γ1恒定區(qū)的DNA和氨基酸序列可見于08/379,072。
正如以上所討論的，優(yōu)選采用NEOSPLA表達載體表達這些靈長動物化抗體，該載體如圖2所示，基本上被描述于普通轉讓的08/379,072和08/149,099，這兩個申請在此引入作為參考。
正如以上所提及的，本文的靈長動物化抗體優(yōu)選包含人免疫球蛋白的γ1或γ4恒定區(qū)，同時優(yōu)選在兩位置突變以形成γ4 PE的γ4。γ4PE突變型包含兩個突變，在CH2區(qū)引入一個谷氨酸以消除殘留的FCR結合，和在鉸鏈區(qū)一個脯氨酸的替代，目的是增強重鏈二硫鍵的穩(wěn)定性。(參見，Alegre等，《免疫學雜志》(J.Immunol.)，148，3461-3468，(1992)；和Angel等，《分子免疫學》(Mol.Immunol.)，30，105-108，(1993)，二者在此引入作為參考)。
本文的靈長動物化抗體是含有γ1、γ4還是γ4 PE恒定區(qū)主要依賴于作為治療目標的特定疾病。優(yōu)選，制備和檢測針對特定疾病目標的排除和非排除性的靈長動物化IgG1和IgG4抗體。
已經(jīng)知道本文的猴源單克隆抗體的結合和功能特性，這些抗-B7.1單克隆抗體和它們靈長動物化的形式應該非常適合作為治療試劑，用于阻斷B7CD28之間的相互作用，因而提供免疫抑制效果。尤其是，已知它們與B7.1抗原的高親和力和通過混合淋巴細胞培養(yǎng)中IL-2與氚標記的胸苷的攝取所測定的阻斷B細胞/T細胞相互作用的能力，以及它們通過減少抗原特異的IgG應答、IL-2產(chǎn)生與細胞增殖所顯示的有效抑制供體脾細胞培養(yǎng)中抗原驅動的應答的能力，所以這些猴源單克隆抗體和它們的靈長動物化形式應該能作為調(diào)節(jié)B7CD28通路的有效免疫抑制劑來發(fā)揮作用。這對于治療許多治療時需要誘發(fā)免疫抑制以抑制不必要的抗原特異性IgG應答的疾病，如自身免疫病來說，是有意義的，對預防器官排斥和移植物抗宿主的疾病來說也是有意義的?；旧希趯χ委煏r需要B7CD28通路抑制的任一種疾病進行治療時，本文的抗體將是有用的。
本文的抗-B7.1抗體的主要治療適應癥包括，以舉例的方式說明，自身免疫病，如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、1型糖尿病、多發(fā)性硬化、再生障礙性貧血、銀屑病和類風濕性關節(jié)炎。
本文的抗-B7.1抗體的另一有效治療適應癥是用于預防器官移植和骨髓移植(BMT)中的移植物抗宿主疾病(GVHD)。本文的抗體也可用于誘導宿主對供體-特異性同種異型抗原的耐受，并因此有利于移植和降低移植物排斥的發(fā)生率。在同種異體心臟移植的鼠模型中，人們已證實靜脈內(nèi)給予CTLA4-Ig可以誘導免疫抑制或者甚至誘導對同種異型抗原的耐受。(Lin等，《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，1781801，1993；Torka等，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，8911102，1992)。預期本文的靈長動物化抗-B7.1抗體將表現(xiàn)出相似的或更高的活性。
用上述方法或通過相當?shù)募夹g所制備的抗體可以通過親和和大小排阻層析的聯(lián)合使用來純化，然后用于功能性生物學試驗的鑒定。這些試驗包括測定特異性和結合親和力，以及與所表達的獨特型有關的效應功能，如，ADCC或補體結合。這種抗體可以作為被動或主動的治療試劑來治療人類的許多疾病，包括B細胞淋巴瘤、包括AIDS在內(nèi)的感染性疾病、自身免疫病和炎性疾病以及和移植有關的疾病。這些抗體或以它們天然的形式或作為抗體/螯合物、抗體/藥物或抗體/毒素復合物的一部分來進行使用。另外，完整的抗體或抗體的片斷(Fab2，F(xiàn)ab，F(xiàn)v)可以被用作造影劑或在主動免疫治療中作為潛在的疫苗或免疫原以誘發(fā)抗-獨特型應答。
有效引起治療效果的抗體量可以通過本領域中普通技術人員所熟知的標準技術進行測定。通常溶于某種制藥上可接受的緩沖液的抗體可通過標準技術供給，并且可采用任一所需要的途徑進行使用。因為申請專利的本抗體的功效和人對它們的耐受，所以有可能反復使用這些抗體以在人體內(nèi)治療各種疾病或疾病狀態(tài)。
本發(fā)明的抗-B7.1抗體(或它們的片斷)能夠有效誘導免疫抑制，即誘導人或動物免疫系統(tǒng)的抑制。因此本發(fā)明涉及在有需要的人或其它的動物體內(nèi)預防性或治療性誘導免疫抑制的一種方法，它是通過對這種人或其它動物使用有效的、無毒劑量的本發(fā)明的這種抗體而實現(xiàn)的。
本發(fā)明中的復合物誘導免疫抑制的能力已在用于檢測這方面的標準試驗中得到證實，這些試驗比如，混合淋巴細胞反應試驗或通過胸苷攝取進行的測定T-細胞增殖抑制的試驗。
本發(fā)明的抗體能用來誘導免疫抑制這個事實表明，它們應當有助于治療或預防排斥或抗移植器官或組織(如，腎、心、肺、骨髓、皮膚、角膜等)；治療或預防自身免疫性、炎性、增生性或過度增生性疾病，以及免疫介導的疾病的皮膚表現(xiàn)(這種疾病如，類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、橋本氏甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、1型糖尿病、眼色素層炎、腎病綜合癥、銀屑病、變應性皮炎、接觸性皮炎和更嚴重的濕疹性皮炎、皮脂溢性皮炎、扁平苔癬、天皰瘡、大皰性天皰瘡、表皮松解的大皰形成、蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫、脈管炎、紅斑、皮膚嗜曙紅細胞增多癥、斑禿等)；治療可逆性氣道阻塞性疾病、腸炎和過敏(如，腹腔疾病、直腸炎、嗜曙紅細胞增多性胃腸炎、肥大細胞病、節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎)以及與食物有關的過敏(如，偏頭痛、鼻炎和濕疹)。
本領域中技術熟練的人通過常規(guī)實驗將能夠確定抗體有效的無毒性的劑量以實現(xiàn)誘導免疫抑制的目的。然而，有效量通常是每天每公斤體重大約0.05～100毫克。
本發(fā)明中的抗體(或它們的片斷)也應有助于治療哺乳動物的腫瘤。更具體地說，它們可能有助于減少腫瘤的大小、抑制腫瘤的生長和/或延長荷瘤小鼠的生存期。相應地，本發(fā)明也涉及治療人或其它動物腫瘤的一種方法，通過給這種人或動物使用有效的、無毒性劑量的抗體來實現(xiàn)該治療。本領域中技術熟練的人通過常規(guī)實驗將能夠確定抗-B7抗體有效的、無毒性的劑量以達到治療癌癥的目的。然而，預期通常的有效量為每天每公斤體重大約0.05～100毫克。
根據(jù)以上所提及的治療方法，本發(fā)明中的抗體可以以足以產(chǎn)生這種治療或預防效果的劑量施用于人或其它動物。本發(fā)明的這種抗體可以一種常規(guī)藥劑的形式施用于這種人或其它動物，這種藥劑形式是根據(jù)已知的技術通過組合本發(fā)明的抗體和一種常規(guī)的制藥上可接受的載劑或稀釋劑來進行制備的。本領域中的技術人員將認識到制藥上可接受的載劑或稀釋劑的形式和特性取決于將被組合的活性成分的量、給藥途徑和其它眾所周知的變量。
本發(fā)明抗體(或它們的片斷)的給藥途徑可為口服、非腸道用藥、吸入或局部用藥。此處所用的術語非腸道用藥包括靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、直腸或陰道用藥。通常優(yōu)選非腸道用藥中的皮下和肌肉內(nèi)形式。
使用本發(fā)明的組合物預防性或治療性誘導免疫抑制，或治療癌癥的非腸道用藥和口服的日常劑量通常為每天每公斤體重大約0.05～100毫克，但優(yōu)選0.5～10毫克。
本發(fā)明的抗體也可以通過吸入進行用藥。通過“吸入”是指鼻內(nèi)或口腔內(nèi)吸入用藥。對于這種用藥方式，可通過常規(guī)技術制備適當藥劑形式，比如氣霧制劑或定量的吸入劑。優(yōu)選本發(fā)明的組合物將被使用的劑量通常為大約10～100毫克。
本發(fā)明的抗體也可以局部使用。局部用藥是指非全身用藥，并包括本發(fā)明的抗體(或它的片斷)復合物外在應用于表皮、口腔和將這種抗體滴入耳、眼和鼻，以及它沒有明顯地進入血流的應用部位。全身用藥是指口腔、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)和肌肉內(nèi)用藥。當然，達到治療或預防效果所需要的抗體的量將隨著所選用的抗體、所治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度以及正在接受治療的動物而變化，并且最終是在醫(yī)生的判斷下而確定。通常本發(fā)明抗體局部用藥的適當劑量將是每天每公斤體重大約1～100毫克。制劑當一種抗體或它的片斷有可能單獨使用時，優(yōu)選將它制成一種藥用制劑的形式。對局部用藥來說，活性成分可能占0.001％～10％w/w，比如，1％～2％的制劑量，盡管它可以占制劑的10％w/w這么多的量，但優(yōu)選不超過制劑的5％w/w，而且更優(yōu)選占制劑重量的0.1％～1％w/w。
本發(fā)明局部應用的制劑包括與一種或多種可接受的載劑組合在一起的一種活性成分以及任選的任何一種其它的治療性成分。制劑中載劑必須是“可接受的”其含義是與制劑中的其它成分相容并且對受體無害。
適合局部用藥的制劑包括那些適合通過皮膚滲透到需要治療的部位的液體或半液體制劑，比如擦劑、洗劑、軟膏、油膏或糊膏，以及適合用于眼、耳或鼻的滴劑。
根據(jù)本發(fā)明制備的滴劑可以包括水狀或油狀的無菌溶液或懸液，并可通過在含有殺細菌性和/或殺真菌性試劑和/或任何其它合適防腐劑的適當水溶液中溶解活性成分來進行制備，并且優(yōu)選包括一種表面活性劑。所制備的溶液然后過濾使澄清，轉入一種合適的容器中，隨后密封容器并通過高壓或在90-100℃保持半小時來除菌。另一種選擇方法，溶液通過過濾除菌并通過一種無菌技術轉移到容器中。適合包含在滴劑中的殺細菌性或殺真菌性試劑的實例是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)、氯化苯甲烴銨(0.01％)和乙酸洗必太(0.01％)。適合用于制備一種油溶液的溶劑包括甘油、稀釋的乙醇和丙二醇。
根據(jù)本發(fā)明制備的洗劑包括那些適合用于皮膚或眼的制劑。一種眼用洗劑可包括含或不含殺菌劑的一種無菌水性溶液，并可通過類似于制備滴劑的方法來進行制備。用于皮膚的洗劑或擦劑也可包含一種促進干燥并使皮膚清涼的試劑，如乙醇或丙酮，以及/或包含一種保溫劑(moisturizer)，如甘油或諸如蓖麻油或花生油等一種油。
根據(jù)本發(fā)明所制備的軟膏、油膏或糊膏是含活性成分的半固體的外用制劑。它們的制備方法包括在適當機器的幫助下，將精細分離的或粉末形式的活性成分，單獨或以溶于一種水性或非水性流體的溶液或懸液的形式，與一種脂肪或非脂肪主劑進行混合。主劑可包括諸如硬、軟或液體石蠟，甘油，蜂蠟，金屬皂等碳氫化合物；一種粘膠；諸如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄欖油等一種天然油；羊毛脂或它的衍生物，或與諸如丙二醇或聚乙二醇等一種醇類混合的一種脂肪酸，如硬脂酸或油酸。該制劑可以包含任何一種適當?shù)谋砻婊钚詣?，如一種陰離子、陽離子表面活性劑，或非離子型表面活性劑如山梨聚糖酯或它的聚氧乙烯衍生物。制劑也可包含懸浮劑，如天然樹膠、纖維素衍生物或含硅硅土等無機材料，以及包含羊毛脂等其它成分。
本文的抗-B7.1抗體或它的片斷也可以與調(diào)節(jié)B7CD28通路的其它成分聯(lián)合使用。以舉例的方式說明，這些成分包括IL-7和IL-10等細胞因子，CTL4-Ig、可溶性CTLA-4以及抗CD28抗體及其片斷。
本領域中技術熟練的人將認識到本發(fā)明中的一種抗體或它的片斷對每個個體劑量的最適量和劑量范圍(spacing)將取決于所治疾病的性質(zhì)和程度、用藥的形式、途徑和部位、以及正接受治療的特定動物，并且這種最適量可通過常規(guī)技術進行確定。本領域中的技術人員也將明白治療的最佳程序，即，在特定的天數(shù)內(nèi)每天所給予的本發(fā)明中一種抗體或它的片斷的劑數(shù)，這可利用治療測定試驗的常規(guī)過程由本領域的技術人員進行確定。
雖然沒有進一步的詳細說明，但可以相信本領域的技術人員根據(jù)前面的描述可以最大程度地利用本發(fā)明。因此，以下的制劑被解釋為僅僅是舉例說明性的實施方案，而不是以任何方式對本發(fā)明范圍進行限制。膠囊組合物本發(fā)明的一種膠囊形式的藥用組合物由以下方法制備用50mg粉末形式的本發(fā)明中的一種抗體或它的片斷、100mg乳糖、32mg滑石粉和8mg硬脂酸鎂共同填充一種標準的兩部分組成的硬明膠膠囊?？勺⑸涞姆悄c道用組合物本發(fā)明的一種以適合注射用藥形式使用的藥用組合物由以下方法制備將本發(fā)明的抗體或它的片斷按1.5％的重量攪拌于10％體積的丙二醇水溶液中。過濾除菌。油膏組合物本發(fā)明的抗體或它的片斷1.0g。
白色的軟石蠟至100g。
本發(fā)明的抗體或它的片斷分散于小體積的載劑中以制備調(diào)勻的、均一的制品。然后用該分散劑填充可折疊的金屬管。局部軟膏組合物本發(fā)明的抗體或它的片斷1.0g。
Polawax GP200 20.0g。
無水羊毛脂2.0g。
白蜂蠟2.5g。
羥基苯甲酸甲酯0.1g。
蒸餾水至100.0g。
polawax、蜂蠟和羊毛脂于60℃在一起加熱。加入羥基苯甲酸甲酯溶液并高速攪拌使之均勻。然后使溫度降至50℃。然后加入本發(fā)明的抗體或它的片斷并徹底分散混勻，隨后低速攪拌使組合物冷卻。局部洗劑組合物本發(fā)明的抗體或它的片斷1.0g。
山梨聚糖單月桂酸酯(Sorbitan Monolaurate)0.6g。
Polysorbate 20 0.6g。
十六硬脂醇(Cetostearyl Alcohol)1.2g。
甘油6.0g。
羥基苯甲酸甲酯0.2g。
純化的水B.P.至100-00ml。(B.P.＝英國藥典)在75℃羥基苯甲酸甲酯和甘油溶于70ml水中。山梨聚糖單月桂酸酯、Polysorbate 20和十六硬脂醇于75℃一起溶化并加入到水溶液中。持續(xù)攪拌使所形成的乳濁液均勻并冷卻，然后本發(fā)明的抗體或它的片斷加入到剩余體積的水中成為一種懸液。攪拌整個的懸液直至它變得均勻。滴眼劑組合物本發(fā)明的抗體或它的片斷0.5g。
羥基苯甲酸甲酯0.01g。
羥基苯甲酸丙酯0.04g。
純化的水B.P.至100-00ml。
羥基苯甲酸甲酯和丙酯在75℃溶于70ml純水中，然后使所形成的溶液冷卻。隨后加入本發(fā)明的抗體或它的片斷，溶液通過濾膜(0.022μm孔徑)進行過濾除菌，并無菌包裝于適當?shù)南救萜髦小Ｍㄟ^吸入用藥的組合物在有15-20ml容積的氣霧劑容器中10mg本發(fā)明的抗體或它的片斷與0.2-0.5％的諸如Polysorbate 85或油酸等潤滑劑混合，并在氟里昂等推進劑，優(yōu)選在(1，2二氯四氟乙烷)和二氟氯甲烷的混合物中分散混勻，然后將它們置入一種適合于經(jīng)鼻或經(jīng)口吸入用藥的適當氣霧劑容器中。通過吸入用藥的組合物在有15-20ml容積的氣霧劑容器中10mg本發(fā)明的抗體或它的片斷溶解于乙醇中(6～8ml)，加入0.1-0.2％的諸如Polysorbate 85或油酸等潤滑劑；然后在氟里昂等推進劑中，優(yōu)選在(1，2二氯四氟乙烷)和二氟氯甲烷的混合物中分散混勻，并將它們置入一種適合于經(jīng)鼻或經(jīng)口吸入用藥的適當氣霧劑容器中。
本發(fā)明中的抗體和藥用組合物尤其有利于非腸道用藥，即皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)。適合非腸道用藥的組合物通常包括一種含有本發(fā)明的抗體或它的片斷的溶液，或一種溶于可接受的載劑，優(yōu)選一種水性載劑的混合劑。可以使用多種水性載劑，如水、緩沖水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。這些溶液是無菌的并且通常不含顆粒物質(zhì)。可采用常規(guī)的、眾所周知的消毒技術對這些溶液消毒。組合物可以包含制藥上可接受的為達到近似的生理狀態(tài)所需要的輔助物質(zhì)，如Ph調(diào)節(jié)或緩沖劑等。在這類藥用制劑中本發(fā)明中的抗體或它的片斷的濃度可在很大范圍內(nèi)變動，即從低于約0.5％，通常是或至少是1％左右，到高達15或20％的重量百分數(shù)，并且根據(jù)所選擇的特定用藥方式，主要依據(jù)流體體積、粘性等來進行選擇。
因此，可以制備適合肌肉注射的本發(fā)明的藥用組合物，使之包含1M1無菌緩沖水，和50mg本發(fā)明的抗體或它的片斷。類似地，可以制備適合靜脈內(nèi)輸注的本發(fā)明的藥用組合物，使之包含250ml無菌Ringer’s液，和150mg本發(fā)明的抗體或它的片斷。用于制備可以非腸道用藥的組合物的實際方法是眾所周知的或對本領域的技術人員是明白易懂的，并且更詳細的描述見于，如，《雷明頓制藥科學》(Remington’sPharmaceutical Science)，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，在此引入作為參考。
本發(fā)明的抗體(或其片斷)可以凍干保存，然后在使用前重懸于一種適當載劑中。已經(jīng)證實該技術對傳統(tǒng)的免疫球蛋白是有效的，并且可以利用本領域中已知的凍干和重建技術。
根據(jù)要達到的結果，本發(fā)明的藥用組合物可用于預防性和/或治療性處理。在治療性應用中，給正患某種疾病的病人使用足以治愈或至少部分治愈該疾病和它的并發(fā)癥劑量的組合物。在預防性應用中，給尚未患某種疾病的病人使用包含該抗體或它的一種混合劑的組合物以增強病人的抵抗力。
在施治醫(yī)生所選擇的劑量水平和用藥途徑下，可以一次或多次使用藥用組合物。在任何一種情況下，本發(fā)明的藥用組合物應提供足以有效治療病人量的本發(fā)明的已有改變的抗體(或它的片斷)。
也應該注意到本發(fā)明的抗體可用于設計和合成那些與抗體一樣在治療中是有益的肽或非肽化合物(模擬物)。參見，如，Saragovi等，《科學》(Science)，253，792-795，(1991)。
為了進一步舉例說明本發(fā)明，提供以下實施例。這些實施例無意，也不應把它們解釋為對本發(fā)明進行進一步限制。
實施例1在絲狀噬菌體表面展示的重組免疫球蛋白庫最初是由以下兩篇文獻所述的McCafferty等，《自然》(Nature)，348552-554，1990和Barbas等，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)887978-7982，1991。利用該技術，已從免疫人重組庫中分離出高親和力抗體(Barbas等，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)58910164-10168，1992)。盡管所用的噬菌體展示概念基本上類似于Barbas，1991，同上文獻所述的概念，但該技術已發(fā)生了以下改變，用一種猴庫獨特的載體進行替換以降低重組的可能性和增加穩(wěn)定性。圖1的該載體，pMS含有單一的乳糖啟動子/操縱子，用于有效轉錄和翻譯多順反子的重鏈和輕鏈猴DNA。該載體含有兩個不同的前導序列，輕鏈的ompA(Movva等，《生物和化學雜志》(J.Bio.Chem.)，25527-29，(1980))，和重鏈Fd的pel B(Lei，《細菌學雜志》(J.Bact.)，4379-1094383(1987))。這兩個前導序列都被翻譯成疏水的信號肽，它們引導重鏈和輕鏈克隆的產(chǎn)物分泌到周質(zhì)中。在周質(zhì)的氧化環(huán)境中，這兩條鏈折疊并形成二硫鍵以組成穩(wěn)定的Fab片斷。我們從噬菌粒bluescript中得到載體的主要組成部分。(Stratagene，La Jolla，CA)。它含有β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因，該酶使攜帶pMS DNA的細菌能夠抗氨芐青霉素(羧芐青霉素)。我們從bluescript中也得到了多拷貝質(zhì)粒ColE1的復制起點以及絲狀噬菌體f1的復制起點。噬菌體f1的復制起點(所謂的基因內(nèi)區(qū))傳遞信號，通過病毒的酶分子起始單鏈pMS DNA的復制，起始衣殼的合成和終止RNA的合成。pMS DNA的復制和組裝進噬菌體顆粒中需要必須由輔助噬菌體所提供的病毒蛋白質(zhì)。我們采用了尤其適合該過程的輔助噬菌體VCSM13，因為它也含有一個編碼卡那霉素抗性的基因。通過將卡那霉素和羧芐青霉素加入到生長培養(yǎng)基中來篩選用VCSM13和pMS轉化的細菌。細菌將最終產(chǎn)生含pMS或VCSM13基因組的絲狀噬菌體顆粒，輔助噬菌體的包裝比pMS的包裝效率低，這會產(chǎn)生主要含有重組pMS噬菌體的混合噬菌體群。噬菌體的尾端選取每個尾端特異的次要蛋白。此處尤其感興趣的是在噬菌體的每個尾端有3～5拷貝的基因III的產(chǎn)物?；騃II的產(chǎn)物含有406個氨基酸殘基，并且它是噬菌體通過F菌毛感染大腸桿菌所必須的。重鏈的前兩個區(qū)域，可變區(qū)和CH1區(qū)，與基因III蛋白質(zhì)羧基端的一半相融合。該重組菌毛蛋白質(zhì)在pel B前導序列的引導下，被分泌到周質(zhì)中，它在此積聚并在組裝入噬菌體的衣殼中之前與輕鏈形成二硫鍵。再者，另一個載體含有構建在基因III下游的一段FLAG序列。FLAG是在Fd蛋白的羧基端進行表達的一段8個氨基酸的多肽。我們正利用商品化的單克隆抗-FLAG M2通過ELISA進行噬菌體Fab的純化和檢測(Brizzard，《生物技術》(Bio Techniques)，16(4)730-731，(1994))。
構建了載體pMS之后，我們用對照抗體基因檢測它表達噬菌體結合的Fab的能力。我們將一種抗-破傷風類毒素抗體，(從Dr.CarlosBarbas得來)，克隆進pMS并轉化XLI-blue菌。我們用VCSM13共轉染細胞并制備展示抗-破傷風類毒素抗體的噬菌體。我們進行效率測定實驗，在實驗中，抗-破傷風類毒素噬菌體與攜帶一種不相關抗體的噬菌體按1∶100,000的比例混合。我們用50μl這種混合的噬菌體對抗原(破傷風類毒素)包被的聚苯乙烯培養(yǎng)板進行了三次淘篩。非粘附的噬菌體被沖洗掉，而粘附的噬菌體用酸進行洗脫。將洗脫的噬菌體用于感染一份新鮮的XL1-blue細菌，并加入輔助噬菌體。過夜擴增后，制備噬菌體并于抗原包被的培養(yǎng)板上再次淘篩。經(jīng)過三次淘篩后，我們能夠證實我們已成功地富集了抗-破傷風類毒素的噬菌體。本技術的成功也依賴于制備可溶性Fabs的能力，它用于鑒定最終的淘篩產(chǎn)物。這可通過用限制性酶Nhe I從pMS DNA中切去基因III并隨后再連接來完成?；騃II被切去之后，F(xiàn)ab不再展示在噬菌體表面但在周質(zhì)間隙積聚。從表達可溶性Fab的細菌中準備溶解物并且利用ELISA檢測對抗原的特異性。檢測到了高水平表達的可溶性Fab。
為了改造噬菌體展示技術以適合獼猴文庫的應用，我們設計了特異的引物用于PCR擴增猴免疫球蛋白基因。這些引物依據(jù)于當我們在發(fā)展PRIMATIZEDTM抗體技術時所獲得的獼猴序列(參見，08/379,072，在此引入作為參考)以及包含人序列的數(shù)據(jù)庫。(Kabat等，(1991)，“免疫學感興趣蛋白質(zhì)的序列”，美國健康和人類服務部，國立衛(wèi)生研究院)。
我們設計了三套引物以覆蓋獼猴庫的擴增。我們的第一套引物是為了擴增重鏈VH和CH1(Fd)區(qū)而設計的。它包括一個3′CH1區(qū)引物和在框架1區(qū)結合的6個5′VH家族特異的引物。我們的第二套引物是用于擴增完整的λ鏈，它覆蓋了許多λ鏈亞群。它包括一個3′引物和在VL框架1區(qū)結合的3個5′簡并引物。我們的第三套引物是為了擴增κ鏈各亞群而設計的。它包括一個3′引物和五個VK框架1區(qū)引物。采用每一套引物時，使PCR參數(shù)最佳化以從每一引物對中獲得足夠強的信號，這樣可獲得文庫克隆的豐富材料。最近我們利用這些最佳化的PCR條件在我們的pMS載體中構建了獼猴混合文庫。從CD4免疫的猴中進行骨髓活檢作為免疫球蛋白RNA的來源。文庫包含大約106個成員并且正在抗原包被的培養(yǎng)孔上進行淘篩以獲得特異性結合者。
實施例2制備B7/CTLA-4試劑我們已制備了許多試劑用于以下目的免疫猴、體外進行結合和功能試驗、篩選異體雜交瘤和淘篩噬菌體庫。表1列出每一種試劑和它的預期目的。B7.1的情況中，從SB細胞中提取出RNA并用逆轉錄酶轉成cDNA。用B7.1特異的引物PCR擴增cDNA第一鏈并克隆進IDEC’sNEOSPLA哺乳動物表達載體。CHO細胞用B7.1 NEOSPLA DNA進行轉染，并鑒定出表達膜結合B7.1的細胞克隆。B7.1融合蛋白以類似的方法制備，但PCR擴增的B7.1基因被克隆進含有人CH2和CH3的免疫球蛋白基因的NEOSPLA盒載體。用B7.1/IgNEOSPLADNA轉化CHO細胞并擴增分泌B7.1/Ig融合蛋白的穩(wěn)定克隆?？傮w上，以相似的方法制備B7.2和CTLA4試劑，但對B7.2來說，RNA是從已用抗-Ig和IL-4刺激24小時的人脾細胞中分離，而對CTLA4構建物來說，基因的來源是PHA激活的人T細胞。
表1
特意制備這些試劑，以及抗B7.1(L3074)(Becton Dickinson，1994)和抗B7.2(Fun-1(Engel等《血液》(Blood)，84，1402-1407，(1994))單克隆抗體與純化的羊和兔抗血清，是為了檢測猴源Fab片斷，獲得以上試劑、抗體和血清的有利于鑒定那些具有所需特性的抗體。
實施例3研究南美猴中對可溶性和細胞結合人B7.1的免疫應答。
為了評估制備抗人B7.1抗原的猴源抗體的可行性，我們首先利用L307.4-瓊脂糖凝膠親和柱通過親和層析從CHO細胞培養(yǎng)基中純化了重組SB7.1。然后將SB7.1和佐劑注射入5只成年南美猴。加強免疫3到4個月后，檢測SB7.1或人SB細胞免疫的猴的血清以測定抗原的結合的情況。
從SB7.1免疫的5只猴和B7.1陽性的人SB細胞免疫的另外3只動物中取血清，檢測它們抗表達于轉染CHO細胞的膜結合B7.1的抗體滴度。結果總結于圖3，5只用親和純化的SB7.1免疫的猴中有4只產(chǎn)生超過1∶5000的抗體滴度。用含有細胞結合B7.1的SB細胞來免疫的3只動物表達較低的抗體滴度，為1∶1400～1∶2800。
實施例4我們用SB7.1-瓊脂糖凝膠從所有8只免疫的猴血清中純化抗體，并檢測它們結合以下抗原的能力1)ELISA中SB7.1包被的培養(yǎng)板；2)抗原陽性的B細胞和3)B7.1 CHO轉染瘤細胞。另外，評估它們阻斷B細胞相互作用的能力，這可通過混合淋巴細胞反應(MLR)中IL-2產(chǎn)生和氚標記的胸苷的攝取來測定。對于T-細胞結合實驗，人血沉棕黃層的外周血淋巴細胞在存在PHA刺激物的情況下，培養(yǎng)3-6天。B7結合是用125I-放射標記的可溶性B7.1(SB7.1)通過放射實驗進行測定的。
實施例5猴源抗體與放射標記的SB7.1的直接結合125I-放射標記的SB7.1在4、1和0.25μg/ml濃度的溶液中檢測與抗-B7.1抗體的結合。示于表2的結果表明大多數(shù)SB7.1免疫的猴所產(chǎn)生的抗體能以濃度依賴的方式與親和純化的125I-SB7.1結合。為了評估與標記的SB7.1結合的特異性，用來源于兩只動物的抗體進行未標記SB7.1的競爭實驗。從猴1133和1144中親和純化的抗體以400ng/孔的量包被于微孔培養(yǎng)板中。親和純化的未標記SB7.1(500和100ng/孔)被用作競爭劑。示于圖4的結果證實了SB7.1制品有效抑制125I-SB7.1與抗體的結合。
表2SB7-I125與SB7-Sepharose親和柱親和純化的猴源抗體結合
數(shù)據(jù)是兩次試驗的平均值并表示為SB7-I125結合的cpm。
實施例6放射標記的親和純化猴源抗體與B7+細胞的直接結合和SB7.1的抑制比較來源于猴PRI135的親和純化的放射標記猴抗-B7.1抗體和放射標記的L307.4 MAb與B7陽性的人SB細胞的直接結合。加入未標記的SB7.1(0.002-20μg/ml)來與這兩種標記的抗體進行競爭性結合，這作為一個特異性對照。我們證實了猴源抗體能與細胞結合的B7.1結合并受SB7.1的抑制，如圖5所示。用SB7.1可觀察到高至90％的抑制。
實施例7放射標記的B7-Ig融合蛋白與活化的T細胞直接結合并受到親和純化的猴源抗體的抑制。
人外周血T淋巴細胞被激活3-6天并檢測與125I-B7.1-Ig的直接結合。因為Fc受體在活化的人T細胞上的上調(diào)作用，所以有必要在B7-Ig加入到這些細胞中之前，將這些細胞與熱-凝聚的預先免疫的免疫球蛋白預先共同孵育以阻斷Fc結合位點。試驗中包括用SP2/0小鼠骨髓瘤細胞所做的背景對照以修正背景結合。圖6表明用親和純化的猴抗體在濃度為200～8μg/ml時可獲得125I-B7.1-Ig融合蛋白與活化T細胞結合的抑制。被用作對照的未標記SB7.1和L307.4 MAb也能夠有效抑制B7.1-Ig融合蛋白與細胞的結合。
實施例8在混合淋巴細胞反應中猴抗-B7抗體對IL-2產(chǎn)生的抑制阻斷CD28/B7之間的相互作用將會抑制T淋巴細胞產(chǎn)生IL-2。示于圖7的實驗中，從用SB7.1免疫的兩只猴(猴1137和1135)和用B7陽性SB細胞免疫的一只猴(猴1146)中親和純化猴抗體，評估它們在抑制混合淋巴細胞反應(MLR)中人T細胞激活的能力，這可通過抑制IL-2的產(chǎn)生來測定。該實驗的結果表明來自猴1146和1137的親和純化的抗-B7.1抗體當以50μg/ml的濃度加入時，會抑制IL-2產(chǎn)生。由于缺乏材料，所以未評估猴1135抗體兩個最高濃度的抑制情況，然而它在低濃度時表現(xiàn)出明顯的抑制。鼠Mab L307.4在10μg/ml的濃度時是具有抑制性的。在這些濃度下所檢測的其它猴血清是陰性的(未示出數(shù)據(jù))。這些結果證實至少三只用可溶性和膜結合的B7抗原形式所免疫的猴可產(chǎn)生具有免疫抑制力的B7-阻斷抗體。
實施例9研究B7.1免疫的猴血清與B7.2抗原的交叉反應性制備的抗B7.1抗體將被檢測與B7.2的交叉反應性。從B7.1免疫的血清中用B7.1親和純化抗體，用該抗體所獲得的初步結果提供了與B7.2轉染的CHO細胞結合的提示性證據(jù)(未表示出)。這些數(shù)據(jù)應該用可溶性B7.2Ig試劑進行證實。我們將通過在B7.1Ig-瓊脂糖凝膠上進行親和層析首先從B7.1免疫的動物中純化出另外的猴源抗體。然后我們將從CHO細胞中制備和純化足夠量的B7.2Ig以制備B7.2Ig-瓊脂糖凝膠親和柱。我們將通過與B7.2Ig-瓊脂糖凝膠柱的結合而從B7.1特異的抗體群中篩選出那些與B7.2交叉反應的抗體。任何所鑒定出的交叉反應性抗體將通過以下方法被進一步鑒定直接與B7.1和B7.2都轉染的CHO細胞結合以及B7.1Ig對與B7.2轉染的細胞結合的抑制。
實施例10制備噬菌體展示庫從B7.1和B7.2免疫的猴中制備重組噬菌體展示庫。免疫后7-12天進行淋巴結和骨髓活檢以收集RNA豐富的B細胞和漿細胞。采用Chomczynski《分析生物化學》(Anal.Biochem.)，162(1)，156-159，(1987)所描述的方法，從淋巴細胞中分離出RNA。利用寡聚dT引物和逆轉錄酶將RNA轉成cDNA，cDNA第一鏈被分成幾份，并且用上述的幾套κ、λ和重鏈Fd引物和pfu聚合酶(Stratagene，San Diego)或Taq聚合酶(Promega，Madison)進行PCR擴增。收集重鏈PCR擴增的產(chǎn)物，用Xho VSpe I限制性酶切割并克隆進pMS載體中。隨后，收集輕鏈PCR產(chǎn)物，用Sac I/Xba I限制性酶切割，并進行克隆以制備重組文庫。用文庫DNA轉化XLI-Blue大腸桿菌并用VCSM13超感染以制備噬菌體展示抗體。文庫在B7.1或B7.2抗原包被的聚苯乙烯培養(yǎng)孔上淘篩四次。分析每一次淘篩中的單個噬菌體克隆。分離出pMS載體DNA并切去基因III。制備可溶性Fab片斷并在ELISA中檢測與B7.1和B7.2的結合。
實施例11噬菌體Fab片斷的鑒定鑒定猴源噬菌體Fab片斷的特異性和它們阻斷B7.1-Ig和B7.2-Ig與CTLA-4-Ig或CTLA-4轉染的細胞之間結合的能力。4次淘篩的第一次淘篩之后，也鑒定噬菌體片斷與用來免疫的不同種類B7的交叉反應性以篩選出高親和力的片斷。從在B7.1或B7.2抗原包被的表面進行的4次淘篩中鑒定出Fab片斷，通過感染和生長于大腸桿菌24小時發(fā)酵培養(yǎng)物中進行擴增。通過Kodak FLAG與抗-FLAG親和柱結合來純化這些片斷。用山羊抗猴Fab抗體或與辣根過氧化物酶結合的抗FLAGMAb，通過一種基于ELISA的直接結合的改良Scatchard分析來檢測純化的噬菌體Fabs的親和力(Katoh等，《化學和生物工程雜志》(J.Chem.BioEng.)，76451-454，(1993))?？购颋ab試劑將用人重鏈恒定區(qū)Ig吸附以除去任何與B7-Ig的交叉反應性。測定了與B7.1-Ig或B7.2-Ig包被的培養(yǎng)板的直接結合之后，計算出每一片斷的Kd值。
實施例12阻斷CTLA-4/B7結合的噬菌體Fab片段選擇在最低濃度最有效阻斷B7-Ig結合的Fab片斷作為主要的候選者。篩選是通過競爭性抑制125I-B7-Ig與CTLA-4-Ig或CTLA-4轉染的細胞之間的結合來進行的。另外的篩選標準包括，阻斷混合淋巴細胞反應(MLR)，它是通過抑制應答細胞中3H-胸苷的攝取(Azuma等，《實驗醫(yī)學雜志》(J.Exp.Med.)，177845-850，；Azuma等，《自然》(Nature)，30176-79，(1993))以及用IL-2試驗試劑盒直接分析IL-2的產(chǎn)生來測定的。選出三或四個在抑制MLR和CTLA-4結合試驗中最有效的候選片斷，以克隆進用于轉染CHO細胞和表達猴/人嵌合抗體的上述哺乳動物表達載體中。
實施例13制備猴異種雜交瘤從現(xiàn)有的針對B7.1和/或B7.2的血清檢測為陽性的免疫動物中，制備分泌單克隆抗體的猴異種雜交瘤。對一種或兩種抗原表現(xiàn)出陽性的動物進行淋巴結活檢。雜交瘤制備的方法類似于已建立的用于制備猴抗-CD4抗體的方法(Newman，1992(同上篇文獻))。具有高血清滴度的猴將在麻醉下切除許多腹股溝淋巴結。從組織中沖洗出淋巴細胞并在聚乙二醇(PEG)的介導下與KH6/B5異種雜交瘤細胞融合(Carrol等，《免疫學方法雜志)》(J.Immunol.Meth.)，8961-72，(1986))。在H.A.T培養(yǎng)基中篩選雜交瘤并在96孔培養(yǎng)板中反復亞克隆使之穩(wěn)定。
篩選與B7.2交叉反應的B7.1抗原特異的猴源單克隆抗體。利用125I-B7-Ig結合試驗將鑒定猴源抗-B7抗體阻斷B7/CTLA-4結合的特性。通過3H-胸苷的攝取和直接測定IL-2的生產(chǎn)所測定的MLR的抑制被用來篩選出三個候選者。當重復了所有的功能性研究后，兩個候選者將進行II期研究并表達于CHO細胞。為了達到建立一種用于體內(nèi)藥理學研究的動物模型的目的，抗-B7抗體將在幾種動物品系的細胞上進行測定。動物模型的建立將會使已選定的臨床指征的臨床前研究得以進行。
實施例14正如以上所討論的，采用上述異種雜交瘤的方法，已鑒定出四個主要的猴抗-B7.1抗體16C10、7B6、7C10和20C9。這些抗體的特征鑒定如下為了證明猴源抗體阻斷CTLA4-Ig之間物理的相互作用的能力，將不同濃度的猴抗B7.1抗體和未標記的CTLA4-Ig與放射標記的CTLA4-IgI125一起共孵。抑制實驗的結果表明了猴源抗體的IC50(引起50％抑制的抑制物濃度)為a7C10 0.39μg/Mlb16C10 1.60μg/Mlc20C9 3.90μg/Mld7B6 39.0μg/MlScatchard分析表明猴源抗體與B7-Ig包被的培養(yǎng)板結合的表觀親和常數(shù)(Kd)大約為a7C106.2×10-9Mb16C10 8.1×10-9Mc7B6 10.7×10-9Md20C9 16.8×10-9在混合淋巴細胞反應實驗(MLR)中體外檢測這些抗體。MLR表明這4個抗-B7.1抗體在不同的程度上抑制IL-2的產(chǎn)生a7B6 5.0μg/Mlb16C10 0.1μg/Mlc20C9 2.0μg/Mld7C10 5.0μg/Ml檢測這些猴源抗-B7.1抗體與人外周血淋巴細胞(PBL)上的B7結合的能力。FACS分析表明這4個猴源抗體都檢測為陽性。通過FACS分析檢測猴源抗體16C10、7B6、7C10和20C9的CIq結合。結果表明7C10猴Ig與B7.1 CHO-轉染細胞共孵后表現(xiàn)出高強度的與人CIq結合。16C10為陰性，與20C9和7B6猴源抗體相同。
實施例15利用引入作為參考的普通轉讓的美國系列號08/379,072的靈長動物化抗體的方法，以及利用示于圖2的NEOSPLA載體系統(tǒng)，克隆了7C10、7B6和16C10的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，并且利用NEOSPLA載體系統(tǒng)已在CHO細胞中合成了它們的靈長動物化形式。靈長動物化7C10的輕鏈和重鏈、7B6的輕鏈和重鏈和16C10的輕鏈和重鏈的氨基酸和核酸序列分別示于圖8a、8b、9a、9b、10a和10b。
已知這些抗體可能具有低的抗原性以及人體效應的功能，預期這些靈長動物化的抗體將非常適合作為治療試劑。事實上，最近已經(jīng)證實靈長動物化的16C10表現(xiàn)出人C19結合功能，但16C10卻沒有。
本領域中的技術人員將會認識到或能夠僅利用常規(guī)實驗確定許多等價于此處所述的本發(fā)明的特定實施方案的對應方案。下列權利要求意在包括這些等價方案。
權利要求
1.一種特異地與人B7.1抗原和/或人B7.2抗原結合的猴源單克隆抗體或其靈長動物化的形式。
2.權利要求1的抗體，它選自16C10、7C10、20C9和7B6。
3.權利要求1的抗體，它是一種排除抗體。
4.權利要求1的抗體，它是一種非排除抗體。
5.一種特異地與人B7.1抗原結合的靈長動物化抗體，它含有一種選自16C10、7C10、20C9和7B6的抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)。
6.權利要求5的靈長動物化抗體，其中所說的抗體衍生于7C10并且具有示于圖8a和8b的氨基酸序列。
7.權利要求6的靈長動物化抗體，它由示于圖8a和8b的核酸序列所編碼。
8.權利要求5的靈長動物化抗體，其中所說的抗體衍生于7B6并且具有示于圖9a和9b的氨基酸序列。
9.權利要求8的靈長動物化抗體，其中所說的抗體由示于圖9a和9b的核酸序列所編碼。
10.權利要求5的靈長動物化抗體，其中所述的抗體衍生于16C10并且具有示于圖4a和4b的氨基酸序列。
11.權利要求5的靈長動物化抗體，其中所述的抗體由示于圖10a和10b的核酸序列所編碼。
12.一種表達特異地與人B7.1和/或人B7.2抗原結合的靈長動物化抗體的轉染瘤細胞。
13.權利要求12的轉染瘤細胞，它是CHO細胞。
14.權利要求13的轉染瘤細胞，其中所述的細胞表達一種靈長動物化的抗體，該抗體具有圖8a、8b、9a、9b、10a和10b中任何一圖所示的氨基酸序列。
15.一種適合治療通過抑制B7-CD28結合而可治療的疾病的藥用組合物，它包括根據(jù)權利要求1至11任何一項的一種抗體。
16.一種通過抑制B7CD28通路來治療疾病的方法，它包括使用治療有效量的至少一種根據(jù)權利要求1至11任何一項的抗體。
17.權利要求16的方法，其中所述的抗體是16C10、7C10、20C9、7B6或其靈長動物化形式。
18.權利要求16的方法，其中所述的疾病是一種自身免疫病。
19. 權利要求16的方法，其中所述的疾病選自特發(fā)性血小板減少性紫癜，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、1型糖尿病、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病和多發(fā)性硬化。
20.權利要求16的方法，其中所述的疾病是移植物-抗-宿主疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及獼猴抗人B7.1和B7.2抗體的鑒定,該抗體是通過篩選噬菌體展示庫或用B7.1和/或B7.2免疫的猴的B淋巴細胞所獲得的猴異種雜交瘤而得到的。更具體地說,本發(fā)明提供了四種能抑制B7∶CD28通路并因此能作為有效的免疫抑制劑而發(fā)揮作用的猴源單克隆抗體7B6、16C10、7C10、20C9。本發(fā)明進一步提供了三種靈長動物化抗體的輕鏈和重鏈的完整DNA和氨基酸序列,這三種抗體為靈長動物化的7C10、靈長動物化的7B6和靈長動物化的16C10,它們均來源于與B7.1結合和可能與B7.2結合的那些猴源單克隆抗體。這些靈長動物化的和猴源抗體可以用作特異的免疫抑制劑,如用于治療自身免疫病和預防器官移植排斥。
文檔編號C12N15/09GK1192779SQ96196145
公開日1998年9月9日 申請日期1996年6月6日 優(yōu)先權日1995年6月7日
發(fā)明者D·R·安德爾森, P·布雷姆斯, N·漢娜, W·S·佘斯托斯基 申請人:艾德藥品公司