專利名稱：：特異于呼吸道合胞病毒融合蛋白的高親和性人單克隆抗體的制作方法
背景技術(shù)：
：呼吸道合胞病毒(RSV)是肺病毒屬的Parmixovirus，它常感染上下呼吸道，它的傳染性很強(qiáng)以致于大多數(shù)兩歲左右的孩子曾經(jīng)被它感染，甚至實(shí)質(zhì)上所有四歲左右的孩子已經(jīng)對RSV有免疫力。典型地，RSV感染是溫和的，它局限于上呼吸道并引起與感冒類似的綜合征，不需廣泛的治療。然而對某些受試者而言，如免疫受抑制的個(gè)體(如嬰兒、老人)或患有潛在的心肺病的病人，此病毒可滲入下呼吸道，從而需要住院治療以及支持器。在一些這種病例中，RSV感染可導(dǎo)致永久的肺部損害或甚至對生命造成威脅，僅在美國RSV就會(huì)導(dǎo)致每年約有90,000人次入院治療，并導(dǎo)致約4500人死亡。主要依據(jù)與吸附糖蛋白G有關(guān)的血清學(xué)差異將RSV劃分為兩個(gè)主要的毒株亞群A和B。在分離株之間主要的表面糖蛋白，即90KD的G蛋白在氨基酸水平上的差異超過50％，Johnsonetal.Proc.Natl.Acad.Sci.(1987)，84，5625-5629。與之相反，不同RSV毒株的潛在治療靶70KD融合(F)蛋白是高度保守的，即在氨基酸水平上約有89％相同，Johosonetal，J，Gen，Virol.(1988)，69，2623-2628。Johnsonetal.J.Virol，(1987)，10，3163-3166，P.L.Collins，PlenumPress，NY(1991)，103-162。而且已知抗特定型F-蛋白產(chǎn)生的抗體可以與其他型交叉反應(yīng)。F-蛋白是由線性前體產(chǎn)生的異二聚體，它分別由48和23KD的二硫鍵連接的片段組成，Walshetal，J.Gen，Virol，(1985)，66，401-415。通過多克隆抗體抑制合胞體的形成與23KD片段的顯著反應(yīng)有關(guān)。正如所指出的，盡管RSV感染通常是溫和的，但在一些個(gè)體中RSV感染可能會(huì)威脅生命。最近通過服用抗病毒劑Ribavarin來治療嚴(yán)重的RSV感染，然而，盡管Ribavarin對于控制RSV感染有一些效力，但它的使用因幾個(gè)原因而受到冷遇，例如它很昂貴并且只有在醫(yī)院才能施用。其他已知的RSV治療法僅僅治療RSV感染的綜合征，包括給患有氣管炎的病人使用煙霧化的支氣管擴(kuò)張藥，給患有支氣管炎和RSV肺炎的病人使用皮質(zhì)類固醇療法。迄今為止，欲加強(qiáng)抗病毒保護(hù)性抗體的RSV疫苗很不成功，例如，基于約25年前試驗(yàn)的福爾馬林滅活的RSV的疫苗所誘導(dǎo)的抗體在融合抑制活性方面有缺陷，Murphyetal，ClinicalMicrobiology(1988)，26，1595-1597，有時(shí)甚至?xí)又夭∏?。這可以解釋為被福爾馬林滅活的病毒不具備誘導(dǎo)保護(hù)性抗體的能力。當(dāng)在疫苗受體中檢測到高抗體滴度時(shí)，特殊的保護(hù)性滴度比對照群中的低，這可能是由于被福爾馬林滅活的RSV不能顯示產(chǎn)生保護(hù)性抗體所需的必需構(gòu)象表位所致。盡管目前還沒有已知有效的RSV疫苗，但存在一些臨床證據(jù)，即對于易感個(gè)體而言，抗體療法可能會(huì)賦予抗RSV感染的保護(hù)作用，甚至可能會(huì)清除現(xiàn)存的RSV感染，例如，已有極道稱新生兒嚴(yán)重氣管炎的發(fā)生率低，假定這歸功于保護(hù)性母體抗體的存在，Ogilvieetal，J.MedVirol(1981)，7，263-271。而且對再次感染有免疫力的孩子與被再次感染的那些孩子相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯示出較高的抗-F-蛋白滴度。另外，由高滴度RSV-免疫供體制備的靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)可減少鼻內(nèi)RSV的流出并可改善氧合作用。Hemmingetal，Anti.ViralAgentsandChemotherapy(1987)，31，1882-1886。最新的研究已暗示通過施用富含RSV的免疫球蛋白(RSVIG)可與病毒抵抗并防止肺的損害，Groothuisetal，TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1524-1530，K.McIntosh.TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1572-1573，J.R.Groothuis，AntiviralResearch，(1994)，23，1-10，Siberetal.J.InfectiousDiseases(1994)，169，1368-1373，Siberetal.J.InfectiousDiseases(1992)，165456-463。類似地，一些動(dòng)物研究暗示含病毒中和抗體的抗體療法可賦予抗RSV的保護(hù)作用，或甚至可清除現(xiàn)存的RSV感染，例如，已報(bào)道體外中和的小鼠單克隆抗體可保護(hù)小鼠以抗感染，也可清除已確立的RSV感染，Tayloretal.J.Immunology，(1984)，52，137-142，Stottetal.，“ImmuneResponses，VirusInfectionsandDisease，I.R.L.Press，London(1989)，85-104。而且在體外和體內(nèi)RSV模型中RSVF-蛋白的單克隆抗體顯示出高的親和性。Tempestetal.Bio/Technology，(1991)，9，266-271，Croweetal.，Proc.Natl.Acad.Sci(1994)，91，1386-1390，WalshetalInfectionandImmunity，(1984)，43，756-758，BarbasIII，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci(1992)，89，10164-10168，Walsh.etal.，JGen.Vitol.(1986)，67，505-513。已報(bào)道在動(dòng)物研究中低至520-2000μg/kg體重的抗體濃度可導(dǎo)致幾乎立即恢復(fù)，Croweetal.Proc，Natl.Acad，Sci.(1994)，91，1386-1390。而且已公開這些單克隆抗體既可中和A株也可中和B株，包括實(shí)驗(yàn)室毒株和野生型毒株?；蛘咄ㄟ^注射，Croothuisetal.TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1524-1530，Siberetal.，J.InfectiousDiseases(1994)，169，1368-1373或者通過煙霧化Croweetal，Proc.Natl.Acad.Sci(1994)，91，1386-1390可施用這些抗體。在以前的文獻(xiàn)中已描述了兩種不同類型的有潛在治療作用的RSVF-蛋白單克隆抗體，人源化的鼠抗體在Tempestetal.，Biol.Technology，(1991)9，266-271，或真正的人抗體(Fab片段)在BarbasIII，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)，89，10164-10168。通過將中和交叉毒株的鼠抗-F-蛋白抗體CDR移植到普通的人FC以及可變區(qū)部分的結(jié)構(gòu)區(qū)域即可產(chǎn)生人源化的鼠抗體，通過組合文庫技術(shù)可產(chǎn)生人Fab片段，所述技術(shù)使用了得自HIV陽性供體(免疫妥協(xié)的)的人骨髓細(xì)胞。人源化的和人的RSV抗體治療的活體內(nèi)滴度分別為5和2mg/kg體重。然而應(yīng)注意人源化抗體是在合胞體抑制試驗(yàn)中被檢測的，而檢測人抗-RSVFab片段是為了測定它們的病毒中和活性，因此有關(guān)人源化和人抗-RSV抗體的報(bào)道結(jié)果不能直接相比較。據(jù)報(bào)道由組合文庫技術(shù)產(chǎn)生的Fab片段在煙霧化的形式下是有效的，這可能是由于相對小的分子大小。這些結(jié)果很能鼓舞人，因?yàn)镽SV疫苗的主要靶群體是嬰兒，因此煙霧劑是十分合乎需要的施用模式。然而，不抵制先前已公開的特異于RSV的人源化和人的Fab片段的有關(guān)報(bào)道，仍然很需求是有改良的治療潛力的改良的抗-RSV抗體，尤其是對RSVF蛋白有高親和性和特異性的抗-RSV抗體，它能有效中和和預(yù)防RSV感染?？贵w療法可被次分為兩個(gè)主要的不同行為(i)使用未受損的不經(jīng)標(biāo)記的抗體或經(jīng)標(biāo)記的抗體的被動(dòng)免疫療法和(ii)使用抗-獨(dú)特型以重新建立自身免疫的網(wǎng)絡(luò)平衡的主動(dòng)免疫療法。在被動(dòng)免疫療法中，施用裸露的抗體以中和抗原或者將效應(yīng)子功能導(dǎo)向被擊靶的膜相關(guān)抗原。中和作用可以是中和淋巴因子，激素或敏毒素，即C5a。效應(yīng)子功能包括補(bǔ)體的結(jié)合，巨噬細(xì)胞的激活和征集以及依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。已經(jīng)使用裸露的抗體來治療白血病，Ritzetal.，S.F.Blood，(1981)，58，141-152，使用GD2的抗體來治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤Schulzetal，CancerRes.(1984)，445914和黑素瘤Irieetal，ProcNatl.Acad.Sci.(1986)，838694。最近在實(shí)驗(yàn)性試驗(yàn)中使用了具有高的抗-RSV滴度的靜脈內(nèi)免疫γ球蛋白(IVIG)抗體以治療由RSV感染引起的呼吸窘迫Hemmingetal，Anti.ViralAgentsandChemotherapy，(1987)，31，1882-1886，Groothuisetal.，TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1524-1530，K.McIntosh，TheNewEnglandJ.Med.(1993)，329，1572-1573，J.R.Groothuis、AntiviralResearch，(1994)，23，1-10，Siberetal，J.InfectiousDiseases(1994)，169，1368-1373。單克隆抗體的治療效力取決于下列因素。包括例如與抗原結(jié)合之抗體的量，反應(yīng)性，特異性和類別，抗體的體內(nèi)半壽期也是值得注意的治療因素?？娠@著影響抗體治療潛力的另一個(gè)因素是它們來源的種，最近，用于免疫療法的單克隆抗體幾乎全部來源于嚙齒動(dòng)物。Schulzetal.CancerRes，(1984)，445914，Milleretal，Blood(1981)。58，78-86，Lanzavecchiaetal，J.Edp.Med.(1988)，167，345-352，Sikoraetal，Br.Med.Bull.(1984)，40240，Tsujisakietal.，CancerResearch(1991)，512599。這大半是由于嚙齒動(dòng)物單克隆抗體的產(chǎn)生使用了被詳盡描述和高度有效的技術(shù)Khleretal，Nature，(1975)，256495，Galfreetal，Nature，(1977)，266550。然而盡管嚙齒動(dòng)物單克隆抗體具有治療效力，但它們相對于人抗體而言卻存在限制和不利之處，例如，它們經(jīng)常誘導(dǎo)宿主效應(yīng)子功能(如CDCC，ADCC等)的亞-最適刺激，鼠抗體也可誘導(dǎo)人抗-鼠抗體(HAMA)反應(yīng)，Schroffetal，Can，Res，(1985)，45879-885，Shawleretal，J.Lmmunol(1985)，1351530-1535。這可以導(dǎo)致抗體半壽期縮短，Dillmanetal，Mod.(1986)，5，73-84，Milleretal，Blood，(1983)，62988-995，在一些情況下會(huì)導(dǎo)致毒性副作用，如血清疾病和過敏癥。在一些受試者中，如免疫受重度抑制的受試者(如遭受大劑量化學(xué)物質(zhì)或放射介導(dǎo)的癌癥治療的病人，Irieetal，Proc，Natl.Acad，Sci，(1986)，838694，Dillmanetal，Mod，(1986)，5，73-84，Koprowskietal，Proc.NatlAcad.Sci，(1984)，81216-219)，鼠單克隆抗體的使用會(huì)導(dǎo)致受限制的消極副作用。與之相比，對于具有正常或超高活性免疫系統(tǒng)的病人，鼠抗體至少對某些疾病狀態(tài)的效力受到限制。在排除鼠單克隆抗體的局限性的努力中，已使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生嵌合的抗體，Morrisonetal，Proc.Natl，Acad.Sci.(1984)，81216-219，Boulianneetal，Nature，(1984)，312，644-646，通過“CDR移植”產(chǎn)生了人源化抗體，Riechmannetal，Nature(1984)，332，323-327，通過用其他氨基酸取代特異的表面殘基以減輕或消除抗原性產(chǎn)生了“虛飾”抗體。然而，盡管這種抗體在臨床上已被成功地使用，Gillisetal，J.Immunol，Meth(1989)，25191，但已證實(shí)這種抗體的制備很麻煩，這是由于有關(guān)最適抗原識別和親和性需求的認(rèn)識仍未被完全理解，人構(gòu)架和小鼠的CDR區(qū)域在空間上也常常相互作用，給抗體活性造成消極影響，而且這種抗體有時(shí)仍會(huì)在病人體內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)烈的HAMA反應(yīng)。人抗體與它們的鼠同類物相比存在很多優(yōu)點(diǎn)；它們誘導(dǎo)可任意選擇的效應(yīng)子功能，它們不誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)，宿主抗原-特異性的抗體可導(dǎo)致有治療價(jià)值之表位的鑒定，所述表位因太稀少而不能被異種生殖的免疫系統(tǒng)識別，Lennoxetal，“MonoclonalAntibodiesinClinicalMedicine，”LondonAcademicPress(1982)。盡管人抗體很合乎需要，但它們的生產(chǎn)因多種因素而變得復(fù)雜，包括倫理學(xué)上的考慮，以及常規(guī)下用于生產(chǎn)人抗體的方法經(jīng)常無效這一事實(shí)，例如出于倫理學(xué)和安全性的考慮，一般不能用多數(shù)抗原充分地免疫接種人受試者，結(jié)果，有關(guān)分離對特殊抗原是有有用的親和性，≥108摩爾的人單克隆抗體的報(bào)道非常少，McCabeetal，CancerResearch，(1988)，48，4348-4353。經(jīng)證實(shí)從供體致敏細(xì)胞中分離抗-病毒的人單克隆抗體也不方便，例如，Gorny報(bào)道了HIV陽性供體的外周血單核細(xì)胞(PMBC)經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的14329個(gè)培養(yǎng)物中只穩(wěn)定有7個(gè)可成為能產(chǎn)生的特異性抗-HIV抗體的細(xì)胞系，Gornyetal，Proc.Natl，Acad，Sci(1989)，861624-1628。迄今為止，從癌癥患者的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)Irieetal，Br.J.Cancer，(1981)，44262或腫瘤正在消退的淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞Schlometal，Proc.Natl，Acad.Sci.(1980)，776841-6845，Coteetal，Proc.Natl.Acad.Sci，(1983)，882026-2030中已生產(chǎn)出大多數(shù)人抗-腫瘤抗體。然而，這種抗體經(jīng)常與細(xì)胞內(nèi)的，因而在治療上沒什么用的抗原反應(yīng)，Hoetal，InHybridomaTechnology，Amsterdam(1988)。37-57，或者為IgM類，McCabeetal，CancerResearch(1988)，48，4348-4353，此類抗體與IgG相比，滲入實(shí)體腫瘤的能力較差，很少將這些人抗體搬到臨床試驗(yàn)中，Probyskietal，R.C.Transplantation(1991)，51，1190-1196，這暗示著被獲救的抗體可能具有亞-最適的特性，而且即然這些方法利用了試驗(yàn)供體致敏的B細(xì)胞，那么顯然這些細(xì)胞不是有用的單克隆抗體獲救的最佳來源。最近，通過用CD40刺激以導(dǎo)致人B細(xì)胞的擴(kuò)展Banchereauetal，F(xiàn).Science(1991)，25170，Zhangetal，J.Immunol.(1990)，144，2955-2960，Tohmaetal，J.Immunol(1991)，1462544-2552，或通過額外的體外加強(qiáng)步驟引發(fā)無限增殖化Chaudhurietal，CancerSupplement(1994)，73，1098-1104已經(jīng)改善了由致敏供體產(chǎn)生人抗體。此原理已被用于使致敏供體的細(xì)胞對巨細(xì)胞病毒，Epstein-Barr病毒(EBV)和流感嗜血桿菌(Hemophilusinfluenza)產(chǎn)生人單克隆抗體(42-44)，而且產(chǎn)量明顯高于用其他方法得到的產(chǎn)量(32)。另外，為了論述供體致敏的限制，已報(bào)道了健康供體淋巴細(xì)胞的體內(nèi)免疫和培養(yǎng)，使用致敏供體的PBL細(xì)胞的來自于人(exhomine)的加強(qiáng)作用產(chǎn)生人單克隆抗體取得的一些成功已有報(bào)道，Maedaetal，Hybridoma(1986)，533-41，Kozboretal，J.Immunol，(1984)，1423，Duchosaletal，Nature.(1992)，355258-262。1967年Mishell和Dutton使用鼠淋巴細(xì)胞首次闡明了體外免疫的可行性Mishelletal，J.Exp.Med(1967)，126423-442，1973年，Hoffman成功地免疫了人淋巴細(xì)胞Hoffmanetal，Nature(1973)，243408-410。也已報(bào)道了外周血(Luzzatietal，J.Exp.Med，(1975)，144573-585，Misitietal，J.Exp.Med.(1981)，1541069-1084，Komatsuetal，Int，Archs.AllergyAppl.Immunol.(1986)，80431-434，Ohlinetal，C.A.K.Immunology(1989)，68325(1989))，扁桃腺(Strikeetal，J.Immunol，(1978)，1321789-1803)和脾[后者得自外傷(Hoetal.InHybridomaTechnology，Amsterdam(1988)，37-57，Boerneretal.J.Immunol.(1991)，14786-95，Hoetal.J.Immunol.(1985)，1353831-3838，Wassermanetal，J.Immunol.Meth.(1986)，93275-283，Wassermanetal.J.ImmunolMeth.(1986)，93275-283，Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas(1993)，4，47-56，Bramsetal，Hum.Antibod.Hydribomas(1993)，4，57-65)和原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)患者(Boerneretal，J.Immunol.(1991)，14786-95，Bramsetal，Hum，Antibod，Hybridomas(1993)4，47-56，Bramsetal，Hum，Antibod，Hybridomas(1993)，4，57-65，McRobertsetal，“InVitroImmunizationinHybridomaTechnology”，Elsevier，Amsterdam(1988)，267-275，Luetal.P.Hybridoma(1993)，12，381-389)]的淋巴細(xì)胞成功的初次免疫接種。體外免疫接種顯現(xiàn)出相當(dāng)多的優(yōu)點(diǎn)，如易于再現(xiàn)的免疫接種，利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)和操作技術(shù)將其自身很容易地提供給抗體類操作。Chaudhurietal，CancerSupplement(1994)，73，1098-1104，也有證據(jù)表明在IVI過程中對自身抗原的體內(nèi)耐受性較少見Boerneretal，J.Immunol，(1991)，14786-95，Bramsetal，J.Immunol，Methods(1987)，9811。因此，此技術(shù)有望可用于產(chǎn)生自身抗原的抗體，所述自身抗原如腫瘤標(biāo)記物和涉及自身免疫的受體。幾個(gè)研究小組已報(bào)道了對多種僅在體外攻擊的抗原，如腫瘤相關(guān)抗原(TAA)之反應(yīng)的產(chǎn)生Boerneretal，J，Immunol，(1991)，14786-95，Borrebaecketal，ProcNatl.Acad.Sci(1988)，853995。然而不幸的是所得抗體典型地為IgM而非IgG亞類，McCabeetal，CancerResearch(1988)，48，4348-4353，Kodaetal，Hum.Antibod，Hybridomas，(1990)，115，僅在有關(guān)使用經(jīng)免疫之供體的淋巴細(xì)胞的方案中報(bào)道了再次(IgG)應(yīng)答。因此，顯然這些方案僅僅成功地誘導(dǎo)了初次免疫應(yīng)答，但需要供體經(jīng)免疫的細(xì)胞產(chǎn)生回憶應(yīng)答。已經(jīng)開展的研究系統(tǒng)地分析了培養(yǎng)和免疫接種的變化，以開發(fā)出一種一般性的方案，能有效地在體外誘導(dǎo)人單克隆抗體Boerner.J.Immunol.(1991)14786-95，Bramsetal.HumAntibodHybridomas(1993)，4，47-56，Luetal，Hybridoma(1993)，12，381-389。這已經(jīng)導(dǎo)致經(jīng)原初人脾細(xì)胞的IVI誘導(dǎo)，特異于鐵蛋白之人單克隆抗體的分離Boerneretal，J.Immunol，(1991)，14786-95。此項(xiàng)研究還導(dǎo)致了一個(gè)方案，通過它可在體外從頭開始完整地誘導(dǎo)再次(IgG)應(yīng)答B(yǎng)ramsetal，Hum，Antibod，Hybridomas(1993)，4，57-65。然而，盡管IVI有很大的潛在優(yōu)勢，但由于免疫細(xì)胞在培養(yǎng)容器內(nèi)以單層生長這一事實(shí)使得這種方法的效力受到嚴(yán)重限制。與之相比，在免疫應(yīng)答的活性期，脾臟中發(fā)現(xiàn)了具有三維結(jié)構(gòu)的體內(nèi)生發(fā)中心，這些三維結(jié)構(gòu)含有被激活的T-和B-細(xì)胞，所述細(xì)胞被抗原-呈遞細(xì)胞包圍，大多數(shù)免疫學(xué)家相信所述抗原呈遞細(xì)胞可比得上B-細(xì)胞抗原-特異性激活的位點(diǎn)。天然脾臟環(huán)境的替代物是在免疫妥協(xié)的動(dòng)物宿主，如“重度聯(lián)合免疫缺損”(SCID)小鼠體內(nèi)“再造”或模擬脾臟的條件。人淋巴細(xì)胞易于被SCID小鼠過繼(hu-SCID)并產(chǎn)生高水平的免疫球蛋白Mosieretal，Nature(1988)，335256，McCuneetal，L，Science(1988)，241，1632-1639。而且，如果用于重建的供體已被暴露于特殊的抗原，在這種小鼠體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生對相同抗原強(qiáng)烈的再次應(yīng)答，例如，Duchosal等人，Douchosaletal，Nature(1992)，355258-262報(bào)道了得自17年前被破傷風(fēng)類毒素接種之供體的人外周血B-細(xì)胞在SCID環(huán)境中可再次被刺激以產(chǎn)生較高的血清水平，即104左右。他們進(jìn)一步公開了使用λ和M13噬菌體組合文庫法Huseetal，R.A.Science(1989)，2461275克隆和表達(dá)得自經(jīng)提取的人細(xì)胞的兩個(gè)人抗-TT抗體的基因。此抗體被報(bào)道的抗原親和性范圍為108-109/M，然而此方案需要供體致敏細(xì)胞且產(chǎn)量非常低，從370,000個(gè)克隆的文庫中僅能得到2個(gè)克隆。因此，以前hu-SPL-SCID小鼠僅被用于產(chǎn)生針對抗原的人單克隆抗體，其中供體或者已被有效地自然致敏或者已被免疫接種Sthlietal，MethodsinEnzymology(1983)，92，26-36，大多數(shù)情況下均涉及暴露于病毒或細(xì)菌抗原。使用hu-SCID動(dòng)物模型被報(bào)道的血清滴度水平顯著低于通過免疫接種正常小鼠典型獲得的血清滴度水平。另外，已描述了兩種方案，通過它們在hu-SCID小鼠中使用原初人淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)了初次抗體應(yīng)答之后還可誘導(dǎo)再次抗體應(yīng)答。然而，這兩種方案的使用實(shí)質(zhì)上受到了限制，在第一個(gè)方案中，在hu-SCID小鼠中誘導(dǎo)了初次應(yīng)答，其中已知被手術(shù)移植了人胎兒的肝臟，胸腺和淋巴結(jié)，然而此方法受到胎兒組織有限的可用性以及該方案繁雜的外科方法學(xué)的很大的限制McCuneetal，L.Science(1988)，241，1632-1639、在第二個(gè)方案中，用T-和B-細(xì)胞描述的人骨髓和SCID小鼠骨髓細(xì)胞重建了經(jīng)致死劑量放射的正常小鼠Lubinetal，Science，(1991)，252427。然而此方法是不利的，因?yàn)樗枰膫€(gè)月的保溫期，而且兩種方案的結(jié)果產(chǎn)生了很低的抗體滴度，即108以下。Carlson等人Carlssonetal，J.Immunol，(1992)，1481065-1071于1992年描述的方法使用了得自被抗原(破傷風(fēng)類毒素)致敏的供體的PBMC。在轉(zhuǎn)移至SCID小鼠之前的簡短體外培養(yǎng)和致敏期，細(xì)胞首先要被耗盡巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，然后用抗原加強(qiáng)免疫h(yuǎn)u-SPL-SCID小鼠，據(jù)報(bào)道此方法可導(dǎo)致在hu-SPL-SCID血清中平均的TT特異性人IgG滴度≈104，還有報(bào)道稱大于5×105。人單克隆抗體的產(chǎn)生進(jìn)一步典型地需要無限增殖化B-細(xì)胞的產(chǎn)生以得到的可分泌所需人單克隆抗體連續(xù)不斷的理想的永久來源的細(xì)胞。B-細(xì)胞的無限增殖化一般通過下列四種方法中的一種來實(shí)現(xiàn)(i)用EBV轉(zhuǎn)化，(ii)小鼠-人異源融合，(iii)EBV轉(zhuǎn)化，接著再異源融合，和(iv)組合免疫球蛋白基因文庫技術(shù)。在大量報(bào)道中成功使用了EBV轉(zhuǎn)化，主要是用于產(chǎn)生抗-HIV抗體，Gorny，etal，Proc.Natl，Acad.Sci.(1989)，861624-1628，Posner，etal，J.Immunol，(1991)，1464325-32。主要的優(yōu)點(diǎn)在于每200個(gè)B-細(xì)胞中約有個(gè)被轉(zhuǎn)化，然而，被EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞典型地是不穩(wěn)定的，產(chǎn)生了少量主要的IgM抗體，克隆少得可憐，培養(yǎng)幾個(gè)月之后停止制備抗體。異源融合Carrol，etal，J.Immunol，Meth，(1986)，8961-72典型地利于產(chǎn)生可分泌高水平IgG抗體的雜交瘤，通過有限稀釋易于克隆雜交瘤，然而不利之處是產(chǎn)量低，即每20,000個(gè)淋巴細(xì)胞≤1個(gè)雜交瘤Boerner.etal，J.Immunol，(1991)，14786-95，Ohlin，etal，C，A，K.Immunology(1989)，68325，Xiu-meietal，Hum.Antibod，Hybridomas(1990)，142，Borrebaeck.C.A.K.Abstractatthe“SecondInternationalConference”on“HumanAntibodiesandHybridomas，”April26-28，1992，Cambridge，England.聯(lián)合EBV轉(zhuǎn)化接著再異源融合有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)(i)經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化之后人B-細(xì)胞更易于融合伙伴融合，和(ii)產(chǎn)生更穩(wěn)定，更高產(chǎn)的雜交瘤。Ohlin，etal，Immunology，(1989)，68325，Xiu-mei，etal，Hum，Antibod，Hybridomas(1990)，142，BorrebaeckC.A.K.Absractatthe“SecondInternationalConference”on“HumanAntibodiesandHybridomas”April26-28，1992，Cambridge，England.最后一個(gè)技術(shù)，即組合免疫球蛋白基因文庫技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是利用M13Fab表達(dá)技術(shù)可篩選出很大的文庫Huse，etal，Science(1989)，2461275，WilliamHuse，AntibodyEngineeringAPracticalGuide，BorrebaeckC.A.K..ed5103-120，基因易于被轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)細(xì)胞系中這一事實(shí)，然而，產(chǎn)量典型地非常低，大約每370,000克隆中有1個(gè)Duchosal，etal，Nature(1992)，355258-262。因此，基于上述內(nèi)容，生產(chǎn)人單克隆抗體，尤其是特異于RSV之抗體的更有效的方法將會(huì)很有利，這一點(diǎn)是顯而易見的，而且，比那些最近使用的具有更高結(jié)合親和性，特異性和效應(yīng)子功能的特異于RSVF-蛋白的人抗體也是很合乎需要的，這一點(diǎn)也是顯而易見的。本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生特異于所需抗原的高滴度的人抗體的改良方法。本發(fā)明更具體的目的是提供產(chǎn)生高滴度人抗體的新的方法，所述方法包括(i)在體外用抗原致敏原初人脾細(xì)胞，(ii)將在體外被抗原致敏的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至免疫妥協(xié)的供體，如SCID小鼠，和(iii)用抗原加強(qiáng)免疫。本發(fā)明另一個(gè)具體的目的是提供產(chǎn)生特異于呼吸道合胞病毒(RSV)，尤其是RSV融合(F)蛋白的人單克隆抗體的改良方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生EBV無限增殖化B-細(xì)胞的改良方法，所述方法利于形成分泌IgG占優(yōu)勢的EBV無限增殖化的B-細(xì)胞。本發(fā)明更具體的目的是提供產(chǎn)生分泌IgG占優(yōu)勢的EBV無限增殖化的人B-細(xì)胞的改良方法，此方法包括(i)在體外用抗原致敏原初人脾細(xì)胞；(ii)將這種在體外用抗原致敏的原初脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至免疫妥協(xié)的動(dòng)物供體內(nèi)，如SCID小鼠；(iii)用抗原加強(qiáng)免疫免疫妥協(xié)的動(dòng)物供體如SCID小鼠；(iv)從被抗原加強(qiáng)免疫的免疫妥協(xié)供體如SCID小鼠中分離產(chǎn)生人抗體的B-細(xì)胞；(v)用EBV轉(zhuǎn)化所述經(jīng)分離的產(chǎn)生人抗體的B-細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有EBV轉(zhuǎn)化的得自SCID小鼠的人B細(xì)胞的新組合物，所述人B細(xì)胞分泌人IgG占優(yōu)勢。本發(fā)明更具體的目的是提供含有EBV轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞的新組合物，所述人B細(xì)胞分泌人IgG占優(yōu)勢，并且是由包括以下步驟的方法產(chǎn)生的(i)在體外用抗原致敏原初人脾細(xì)胞；(ii)將這種在體外用抗原致敏的原初脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至免疫妥協(xié)的動(dòng)物供體內(nèi)，如SCID小鼠；(iii)用抗原加強(qiáng)免疫免疫妥協(xié)的動(dòng)物供體如SCID小鼠；(iv)從被抗原加強(qiáng)免疫的免疫妥協(xié)供體如SCID小鼠中分離產(chǎn)生人抗體的B-細(xì)胞；(v)用EBV轉(zhuǎn)化所述經(jīng)分離的產(chǎn)生人抗體的B-細(xì)胞。本發(fā)明另一個(gè)具體的目的是產(chǎn)生可中和RSV的人單克隆抗體，所述抗體與RSVF-蛋白的親和性≤2×10-9M。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供EBV無限增殖化細(xì)胞系，所述細(xì)胞系可分泌能中和RSV的人IgG單克隆抗體，所述抗體與RSVF-抗原的親和性≤2×109M。本發(fā)明更具體的目的是提供兩個(gè)EBV無限增殖化細(xì)胞系，RF-2和RF-1，它們分別分泌的人單克隆抗體也被稱作RF-2和RF-1，所述抗體在體內(nèi)可中和RSV，每種抗體對RSVF-蛋白的親和性≤2×10-9M。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用編碼RF-1和RF-2重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA序列轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞以產(chǎn)生可分泌含RF-1或RF-2可變區(qū)的人抗體的轉(zhuǎn)染子。本發(fā)明的更具體的目的是提供經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，所述細(xì)胞可表達(dá)RF-1或RF-2重鏈和輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過施用治療或預(yù)防有效量的特異于RSVF-蛋白的可中和RSV的人單克隆抗體以治療或預(yù)防人類RSV感染，所述抗體對RSVF-蛋白的Kd≤2×10-9M。本發(fā)明更具體的目的是通過施用治療或預(yù)防有效量的在經(jīng)轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞中表達(dá)的RF-1或RF-2或人單克隆抗體以治療或預(yù)防人類RSV感染，所述真核細(xì)胞含有并表達(dá)RF-1或RF-2的可變重鏈和輕鏈區(qū)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療或預(yù)防RSV感染的疫苗，所述疫苗含有治療或預(yù)防有效量的特異于RSVF-蛋白，對RSVF-蛋白的Kd≤2×10-9M的人單克隆抗體，和藥用可接受的載體或賦形劑的聯(lián)合，所述抗體可在體外中和RSV。本發(fā)明更具體的目的是提供治療或預(yù)防RSV感染的疫苗，所述疫苗含有治療或預(yù)防有效量的得自經(jīng)轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞的RF-1和RF-2或人單克隆抗體和藥用可接受的載體和賦形劑的聯(lián)合，所述真核細(xì)胞含有和表達(dá)編碼RF-1或RF-2可變重鏈和輕鏈區(qū)的DNA序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過使用對RSV融合(F)蛋白的親和性≤2×10-9M的人單克隆抗體檢測分析物，如呼吸道中的液體中RSV的存在以診斷RSV感染的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于檢測RSV感染的新的免疫探針和檢測試劑盒，它包括特異于RSVF-蛋白的人單克隆抗體，所述抗體對RSVF蛋白的親和性≤2×10-9M，其抗體直接或間接地與適當(dāng)?shù)膱?bào)道分子，如酶或放射性核素結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些人單克隆抗體可含有真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞產(chǎn)生的RF-1或RF-2或重組人單克隆抗體，所述細(xì)胞被RF-1或RF-2的可變重鏈和輕鏈區(qū)轉(zhuǎn)染。發(fā)明簡述本發(fā)明最寬的實(shí)施方案涉及制備所需抗原之人抗體，尤其是涉及預(yù)防，治療或檢測人類疾病狀態(tài)之抗原的人抗體的新方法。這些方法包括在體外用抗原致敏原初人脾細(xì)胞，將所得的在體外經(jīng)抗原致敏的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至免疫妥協(xié)的供體，如SCID小鼠，并用抗原加強(qiáng)免疫所述免疫妥協(xié)的供體。本發(fā)明也涉及產(chǎn)生利于生產(chǎn)可分泌IgG之細(xì)胞的Epstein-Barr病毒(EBV)無限增殖化的B-細(xì)胞的方法，所述方法包括在體外用抗原致敏原初人脾細(xì)胞；將所得的在體外經(jīng)抗原致敏的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至免疫妥協(xié)的供體，如SCID小鼠；并用抗原加強(qiáng)免疫免疫妥協(xié)的供體；從被抗原加強(qiáng)免疫的免疫妥協(xié)供體，如SCID小鼠中分離可分泌人抗體，尤其是可分泌IgG的B-細(xì)胞；用EBV轉(zhuǎn)化所述的經(jīng)分離的可分泌人抗體的細(xì)胞。本發(fā)明更具體地涉及制備RSV，尤其是RSV融合(F)蛋白的人抗體的改良方法以及這些方法產(chǎn)生的人單克隆抗體，所述抗體對RSVF-蛋白有高親和性，也可中和RSV感染。優(yōu)選通過下列步驟實(shí)現(xiàn)此方法，即在體外用I1-2和任選地用RSVF-蛋白致敏原初人脾細(xì)胞；將所得的在體外被致敏的脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至免疫妥協(xié)的供體，如SCID小鼠中，并用RSVF-蛋白加強(qiáng)免疫以產(chǎn)生可分泌中和性抗-RSVF-蛋白人抗體的人B-細(xì)胞，所述抗體對RSVF-蛋白具有高親和性，即≤2×10-9M。優(yōu)選使所得B-細(xì)胞無限增殖化以便提供人抗-RBVF-蛋白單克隆抗體的連續(xù)不斷的穩(wěn)定來源。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從被抗原加強(qiáng)免疫的SCID小鼠中分離B-細(xì)胞，并用EBV病毒轉(zhuǎn)化此細(xì)胞以產(chǎn)生經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的分泌人IgG占優(yōu)勢的人B-細(xì)胞。然后克隆這些細(xì)胞以選擇被EBV轉(zhuǎn)化的可分泌對RSVF-蛋白具有高親和性，即≤10-7和優(yōu)選≤2×10-9M的人單克隆抗體的細(xì)胞系。本發(fā)明也涉及這種抗-RSVF-蛋白人單克隆抗體作為治療和/或預(yù)防以及診斷劑的用途。正如上文所提及的，本發(fā)明方法可導(dǎo)致人單克隆抗體的產(chǎn)生，所述抗體對RSVF-蛋白具有高親和性，即對RSVF-蛋白的Kd≤2×10-9M，所述抗體在體外也可中和RSV。因此，由于RSVF-蛋白是不同RSV分離株之間高度保守的表面蛋白這一事實(shí)的存在，這些抗體理想的適于用作預(yù)防和治療劑以預(yù)防或治療RSV感染。假定本發(fā)明的人單克隆抗體對RSVF-蛋白有高親和性和特異性，它們也可被用來診斷RSV感染。本發(fā)明更具體地提供了兩個(gè)特殊的針對RSVF-蛋白的人單克隆抗體，即RF-1和RF-2以及由它們衍生的重組人抗體，所述抗體優(yōu)選在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生，所述細(xì)胞已被編碼RF-1或RF-2可變重鏈或輕鏈區(qū)的DNA序列轉(zhuǎn)染。這些抗體作為治療或預(yù)防RSV感染的預(yù)防和/或治療劑特別有用。而且這些抗體作為診斷劑是有用的，因?yàn)樗鼈円愿哂H和性與RSVF-蛋白結(jié)合，即它們對RSVF-蛋白的親和性各≤2×10-9。它們用作治療劑特別有用，因?yàn)樗鼈儗SVF-蛋白有高親和力和特異性，它們在體外能有效中和RSV感染。附圖簡述圖1顯示了用抗-F蛋白hu-SPL-SCID血清免疫印跡F蛋白，在SDS-PAGE中電泳原始(A)和變性的(B)F蛋白并通過Western印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上。硝酸纖維素條與陽性對照小鼠抗-F蛋白MAb反應(yīng)(泳道1A和1B)，與陰性對照hu-SPL-SCID血清抗-TT反應(yīng)(泳道2A和2B)，和來自小鼠#6(泳道3A和3B)，#3(泳道4A和4B)和#4(泳道5A和5B)的hu-SPL-SCID抗-F蛋白血清反應(yīng)。圖2顯示了用hu-SPL-SCID血清抗-F蛋白使HEP-2細(xì)胞發(fā)免疫熒光，未被感染(左)和被RSV感染的HEP-2細(xì)胞與加強(qiáng)免疫后15天取出的以1∶50稀釋的hu-SPL-SCID小鼠#6的血清反應(yīng)，結(jié)合表現(xiàn)為GAHIgG-FITC。圖3表示純化的RF-1和RF-2與結(jié)合于塑料板上經(jīng)親和純化的RSVF-蛋白的反應(yīng)性，也記錄了作為參照的人抗-RSV血清LN的反應(yīng)性。ELISA板被50ng的RSVF-蛋白包被。圖4表示純化自腫瘤細(xì)胞上清液的RF-1(泳道2)和RF-2(泳道3)人MAb的IEF。IEF在pH梯度為3-10下進(jìn)行，泳道1表示pi標(biāo)準(zhǔn)。圖5表示HEP-2細(xì)胞和被RSV感染的HEP-2細(xì)胞(1×106，與不同量的RF-1一起保溫，隨后與FITC-標(biāo)記的GAHIgG一起保溫)的間接免疫熒光流式細(xì)胞計(jì)量試驗(yàn)，整個(gè)群相對平均強(qiáng)度被記錄下來。圖6表示用于表達(dá)人抗體的NEDSPLA載體，CMV＝巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，EBTA＝小鼠β珠蛋白主要的啟動(dòng)子，BGH＝牛生長激素聚腺苷酸化信號，SVO＝SV40復(fù)制起點(diǎn)，N1＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子1，N2＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子2，LIGHT＝人免疫球蛋白Kappa恒定區(qū)，HEAVY＝人免疫球蛋白γ1或γ4PE恒定區(qū)，L＝前導(dǎo)序列，SV＝SV40聚腺苷酸化區(qū)域。圖7a表示RF-1可變輕鏈區(qū)的氨基酸和核酸序列圖7b表示RF-1可變重鏈區(qū)的氨基酸和核酸序列。圖8a表示RF-2可變輕鏈區(qū)的氨基酸和核酸序列。圖8b表示RF-2可變重鏈區(qū)的氨基酸和核酸序列。圖9a表示RF-1輕鏈，前導(dǎo)序列和人Kappa恒定區(qū)序列的氨基酸和核酸序列。圖9b表示RF-1重鏈，前導(dǎo)序列和人γ/恒定區(qū)序列的氨基酸和核酸序列。圖9c表示人恒定區(qū)序列。圖10表示被稱為NSKE1的NEOSPLA載體，它含有圖9a-9c所列的RF-1核酸序列和人γ/恒定區(qū)。圖11a表示RF-2輕鏈，前導(dǎo)序列和人Kappa恒定區(qū)的氨基酸核酸序列。圖11b表示RF-2重鏈，前導(dǎo)序列和人γ/恒定區(qū)的氨基酸和核酸序列。圖11c表示人γ/恒定區(qū)的氨基酸和核酸序列。圖12圖解表示了被稱為NSKG1的NEOPLA表達(dá)載體，它含有圖11a-11c所示的RF-2核酸序列和人γ/恒定區(qū)序列。發(fā)明詳述如上文所討論的，本發(fā)明提供了產(chǎn)生抗所需抗原，優(yōu)選為人類疾病狀態(tài)所涉及的抗原的人單克隆抗體的新的高效方法。人類疾病狀態(tài)所涉及的抗原典型地為含有適當(dāng)?shù)目贵w治療靶的表面抗原，例如它包括病毒的表面蛋白以及人類癌細(xì)胞表面表達(dá)的抗原，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表面抗原包括RSV的融合蛋白(F-蛋白)。人類疾病狀態(tài)包括例如病毒感染，如RSV，乳頭狀瘤病毒，肝炎病毒，ALDS等，癌癥，細(xì)菌感染，酵母菌感染，寄生蟲感染，如瘧疾等。實(shí)質(zhì)上人類疾病狀態(tài)欲包含通過施用特異于特殊抗原的人單克隆抗體可潛在地預(yù)防或治療的任何人類疾病狀態(tài)。產(chǎn)生人單克隆抗體的本發(fā)明的方法實(shí)質(zhì)上涉及體外致敏原初人脾細(xì)胞，將這些脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至免疫妥協(xié)的供體，即SCID小鼠中，接著用抗原加強(qiáng)免疫已經(jīng)施用了所述脾細(xì)胞的SCID小鼠。令人驚奇地是發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生人抗體的這兩個(gè)已知方法的聯(lián)合會(huì)導(dǎo)致協(xié)同的結(jié)果，具體地說，導(dǎo)致對免疫抗原的抗原特異性反應(yīng)大大增強(qiáng)，IgG同種型人單克隆抗體的滴度很高，更具體地說，已發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)合導(dǎo)致前所未有的高的再次應(yīng)答hu-SPL-SCID血清中的人IgG反應(yīng)比那些將原初細(xì)胞轉(zhuǎn)移至SCID得到的要高10倍，特異性的抗體反應(yīng)增加1000倍。已發(fā)現(xiàn)所得抗體的高親和性和特異性可以與實(shí)驗(yàn)用高活性的免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體相比。也已發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用原初脾細(xì)胞時(shí)，為了得到這種出乎意料的結(jié)果，必須既在體外又在導(dǎo)入所得hu-SPL-SCID小鼠之后用抗原攻擊，優(yōu)選但不是必需在用抗原加強(qiáng)免疫前的瞬間將額外的新鮮的未致敏脾細(xì)胞導(dǎo)入hu-SPL-SCID供體中，已發(fā)現(xiàn)這可以導(dǎo)致抗體反應(yīng)的進(jìn)一步增強(qiáng)。在由原初人脾細(xì)胞產(chǎn)生再次應(yīng)答的最適體外初次和加強(qiáng)免疫方案已經(jīng)公開之后(Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas(1993)，4，57-65)，本發(fā)明得以有所進(jìn)展。已發(fā)現(xiàn)此方案(Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas(1993)，4，57-65)所提供的抗原特異性IgG反應(yīng)約比由經(jīng)受一次抗原攻擊的培養(yǎng)物得到的高2-10倍。使用很不相同的抗原可使這種體外免疫接種(IVI)方案得以開發(fā)和最優(yōu)化，所述抗原即為馬鐵蛋白(HoF)，鈣調(diào)蛋白，前列腺特異性抗原(PSA)，小鼠IgG，運(yùn)鐵蛋白，與依賴T-細(xì)胞的蛋白載體結(jié)合的匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)二硝基苯基(DNP)以及RSV融合(F)蛋白。實(shí)質(zhì)上此方案涉及在以抗原和自身脾細(xì)胞的比率為1∶1開始培養(yǎng)1天后再次刺激脾細(xì)胞培養(yǎng)物。已闡明使用此方案測得的IgG反應(yīng)是重復(fù)暴露于抗原的結(jié)果，與再次應(yīng)答相當(dāng)。這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明未受損傷的脾臟是淋巴細(xì)胞的最佳來源，包括愈傷的和ITP脾臟。與之形成對照的是經(jīng)證實(shí)外周血淋巴細(xì)胞(PBL)和扁桃體或淋巴結(jié)的細(xì)胞不適宜誘導(dǎo)抗原特異性反應(yīng)。而且，除去或中和任何細(xì)胞成分會(huì)導(dǎo)致低劣的反應(yīng)(Boerneretal，J.Lmmunol.(1991)，14786-95)。這些實(shí)驗(yàn)也表明對于特定脾細(xì)胞制品和抗原，存在唯一最適的抗原濃度。因此，已經(jīng)建立了最適的體外初次和加強(qiáng)免疫方案以由原初人脾細(xì)胞產(chǎn)生再次應(yīng)答；已設(shè)想出將此方案與以前的體內(nèi)方法聯(lián)合起來試驗(yàn)以產(chǎn)生人單克隆抗體，即SCID小鼠。在試驗(yàn)前，不知道什么影響(如果有的話為被抗原致敏的脾細(xì)胞的施用)會(huì)施加于由SCID小鼠最終產(chǎn)生的抗特定抗原的人單克隆抗體或者人淋巴細(xì)胞在SCID小鼠體內(nèi)維持的能力，然而我們希望能使在體外被抗原致敏的原初脾細(xì)胞的抗原加強(qiáng)免疫和表達(dá)增強(qiáng)。在這點(diǎn)上，以前有人報(bào)道人淋巴細(xì)胞可在SCID中建立自身并在其中存活幾個(gè)月(McCuneetal，Science(1988)，241，1632-1639，Lubinetal，Science(1991)252427)。而且如上文所提及，使用SCID或針對抗原的人單克隆抗體的前述方法已使用了先前或自然地或通過免疫接種暴露于抗原之供體的細(xì)胞，該方法典型地不會(huì)產(chǎn)生高的人抗體滴度。十分令人驚奇地是，已發(fā)現(xiàn)在hu-SCID模型中，用于使人原初脾細(xì)胞產(chǎn)生再次應(yīng)答的體外初次和加強(qiáng)免疫方案的聯(lián)合會(huì)導(dǎo)致協(xié)同的結(jié)果(Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas(1993)，4，57-65)，這一點(diǎn)已由對免疫抗原的高度顯著的抗原特異性IgG反應(yīng)所證實(shí)。已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這些方法的聯(lián)合(使用馬鐵蛋白(HOF)作為模式抗原)(i)在轉(zhuǎn)移至SCID之前引入體外免疫接種步驟對于可靠地誘導(dǎo)顯著抗原特異性反應(yīng)是必需的；(ii)必須將人細(xì)胞轉(zhuǎn)移至腹膜內(nèi)以在SCID小鼠體內(nèi)非強(qiáng)制性地維持人脾細(xì)胞；(iii)最適的體外培養(yǎng)約為3天；(iv)在體外使用IL-2和任選使用IL-4或IL-6會(huì)在hu-SPL-SCID體內(nèi)導(dǎo)致抗原特異性反應(yīng)的最高抗體滴度；(v)優(yōu)選使用在佐劑，如弗氏完全佐劑(FCA)和/或明礬中乳化的抗原加強(qiáng)免疫h(yuǎn)u-SPL-SCID小鼠；(vi)令人奇怪地是無論是鼠源或人源的NK細(xì)胞的殺傷或中和對抗體的產(chǎn)生都沒什么益處，然而已發(fā)現(xiàn)將SCID-米色小鼠(NK地位較低的系)用作體外致敏細(xì)胞的宿主，當(dāng)使用佐劑的聯(lián)合，即FCA和明礬來實(shí)現(xiàn)加強(qiáng)免疫時(shí)可提供較強(qiáng)的應(yīng)答。(vii)約1/3hu-SPL-SCID小鼠的脾臟，而不是淋巴結(jié)比正常的SCID脹大了25倍，而且在這種脾臟中有多至2/3的細(xì)胞被檢測到正常的人淋巴細(xì)胞膜標(biāo)記物。更具體地說，本發(fā)明的方法包括用抗原在體外致敏原初人脾細(xì)胞約1-10天，優(yōu)選約3天，將經(jīng)致敏的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至SCID小鼠，隨后用抗原加強(qiáng)免疫此小鼠，隨后意味著約3-14天后，優(yōu)選約7天后。已闡明從約第24天之前，所得hu-SPL-SCID小鼠的血清中就出現(xiàn)了高的抗原特異性IgG反應(yīng)。典型地，使用首次用于實(shí)驗(yàn)的抗原馬鐵蛋白時(shí)，血清終點(diǎn)稀釋滴度約為106(在約為50mgIgG/ml時(shí)最大反應(yīng)的一半)，當(dāng)用病毒抗原即RSV的融合蛋白誘導(dǎo)回憶應(yīng)答時(shí)，血清終點(diǎn)稀釋滴度約為107(在約為50mgIgG/ml時(shí)最大反應(yīng)的一半)，根據(jù)這些結(jié)果我們希望使用其他抗原也能得到類似的反應(yīng)。如上文所提及，在hu-SPL-SCID小鼠中所需抗體反應(yīng)的最佳誘導(dǎo)需要既在體外也在體內(nèi)用抗原攻擊人細(xì)胞，還發(fā)現(xiàn)在體外致敏過程中IL-2是必需的，而IL-4和IL-6與IL-2相伴施用會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)hu-SPL-SCID小鼠的反應(yīng)，而且，SCID的重建被促進(jìn)了，但它不依靠相伴隨的腹膜內(nèi)施用經(jīng)照射的同種異型淋巴細(xì)胞。已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)一個(gè)脾臟與另一個(gè)脾臟之間抗體反應(yīng)有顯著差異，例如一些脾臟需要在第10天相伴施用抗原和新鮮的自身脾細(xì)胞以產(chǎn)生抗原特異性抗體反應(yīng)。也已發(fā)現(xiàn)在不同的hu-SPL-SCID小鼠中抗體反應(yīng)的水平也有某種程度上的差異，然而基于本申請的教導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)容易選擇適當(dāng)?shù)臈l件以對特定抗原產(chǎn)生最適抗原特異性抗體反應(yīng)。例如，通過檢測幾個(gè)不同的脾臟制品在培養(yǎng)物中產(chǎn)生特異性抗體的能力(例如體外免疫接種10天后)，即可鑒定出最強(qiáng)的反應(yīng)者。而且，既然從每個(gè)脾臟中已制備和冷凍了大量細(xì)胞，就可以從選定的脾臟中建立一套為期3天的新的體外免疫接種方案，隨后再轉(zhuǎn)移至SCID小鼠中。與之形成對照的是假定從單次轉(zhuǎn)移的一個(gè)供體中可回收的PBL的量完全受限制其他細(xì)胞材料，如外周血細(xì)胞不適宜這種最優(yōu)化。如上文所提及的，與以前的報(bào)道形成對比的是已發(fā)現(xiàn)對于本方法而言，當(dāng)使用外周血細(xì)胞時(shí)，中和人NK活性對于脾臟沒什么影響，而且，用結(jié)合補(bǔ)體的抗-唾液酸GMI抗體中和SCIDNK細(xì)胞會(huì)減小抗原特異性IgG反應(yīng)。與之相比，使用一株NK細(xì)胞水平降低的SCID/米色小鼠與使用正常SCID相比，不會(huì)提供顯著增加的抗原特異性IgG反應(yīng)。另外，還比較了兩種免疫接種途徑(靜脈內(nèi)(IV)和腹膜內(nèi)(IP)所提供的SCID小鼠重建的能力，即脾細(xì)胞在其中維持并產(chǎn)生人抗體的能力。已發(fā)現(xiàn)腹膜是細(xì)胞轉(zhuǎn)移和免疫接種的最佳場所，而且迄今為止，當(dāng)在小鼠血清中檢測到大于0.01μg/ml的人IgG時(shí)，從未發(fā)現(xiàn)靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生重新進(jìn)入的群體。也已發(fā)現(xiàn)所得IgG的濃度與被轉(zhuǎn)移的人細(xì)胞數(shù)目直接相關(guān)，例如，當(dāng)腹膜內(nèi)注射5×106個(gè)體外致敏脾細(xì)胞時(shí)，SCID重新進(jìn)入的群體為92％，當(dāng)腹膜內(nèi)注射5×107個(gè)體外致敏脾細(xì)胞時(shí)，SCID重新進(jìn)入的群體實(shí)質(zhì)上為100％。根據(jù)本申請的教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇最適當(dāng)數(shù)目的體外致敏脾細(xì)胞供注射用，通常約為104-108個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選約106-108個(gè)細(xì)胞，最優(yōu)選至少約為107-108個(gè)細(xì)胞。也已發(fā)現(xiàn)特殊佐劑的存在會(huì)影響抗體反應(yīng)，更具體地說據(jù)觀察當(dāng)使用被完全弗氏佐劑(CFA)或CFA和明礬的聯(lián)合乳化的抗原加強(qiáng)免疫h(yuǎn)u-SPL-SCID小鼠時(shí)可得到最大的人抗體反應(yīng)。對被鐵蛋白加強(qiáng)免疫的hu-SPL-SCID的試驗(yàn)表明CFA是比明礬更好的佐劑，它們各自產(chǎn)生了33mg和13mg/ml人IgG。CFA和明礬的聯(lián)合不能改善SCID中的反應(yīng)，然而，在SCID/米色-hu(此小鼠含有能導(dǎo)致NK細(xì)胞活性降低的突變)中使用這些佐劑與僅使用CFA相比，其IgG的產(chǎn)量增加了8-10倍。然而，希望其他佐劑或它們的聯(lián)合也可產(chǎn)生類似的或甚至更強(qiáng)的結(jié)果。同時(shí)使用完全弗氏佐劑和明礬的最高的人IgG總濃度約為10mg/ml，特異性的最高IgG濃度約為500μg/ml單克隆抗體等價(jià)物。使用包括鐵蛋白的此方法產(chǎn)生了在特異性，反應(yīng)性和Ig鏈同種型的使用方面與得自高免疫力山羊、兔和豬的可以相比的多克隆抗體反應(yīng)。hu-SPL-SCID血清抗體大多數(shù)為IgG，它僅與鐵蛋白含量高的組織的細(xì)胞結(jié)合，而不與鐵蛋白含量低或不含鐵蛋白的組織的細(xì)胞結(jié)合，在Western印跡中既能被天然的鐵蛋白識別，也能被變性的鐵蛋白識別，這些結(jié)果在抗體濃度和所得人抗體的抗原特異性方面都十分出乎意料，而且使用不同的抗原得到了類似的結(jié)果。注射后發(fā)現(xiàn)人細(xì)胞趨向于在兩處積累，即腹膜和小鼠脾臟。盡管在血液中發(fā)現(xiàn)的人細(xì)胞不超過約7％，但淋巴結(jié)和肝臟為人抗原，在一些動(dòng)物腫脹的脾臟和偶發(fā)的腫瘤中有25％-33％的細(xì)胞來源于人。在腫脹的脾臟中這些人細(xì)胞幾乎全是B和T-細(xì)胞，有少量CD14+細(xì)胞，主要為單核細(xì)胞。通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)研究脾臟，淋巴結(jié)，肝臟和腹膜來測定這些結(jié)果。在那些人脾細(xì)胞重新進(jìn)入脾臟的情況下，發(fā)現(xiàn)脾臟經(jīng)常腫脹，比原初SCID的脾臟大25倍。提取后立即測量，脾臟中人細(xì)胞構(gòu)成了總細(xì)胞數(shù)的約30％，剩下的不知其來源。然而培養(yǎng)3天后，由于細(xì)胞與抗體結(jié)合并未表現(xiàn)出與小鼠淋巴細(xì)胞的交叉反應(yīng)性，故所發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)存活細(xì)胞來源于人。進(jìn)一步觀察到經(jīng)重構(gòu)的小鼠可被分為兩組，即具有正常大小脾臟的那些和具有腫大脾臟的那些。具有腫脹脾臟，即25倍于正常大小的脾臟的Hu-SPL-SCID小鼠所具有的人IgG水平約比具有正常脾臟的那些小鼠高150倍，在經(jīng)類似處理的具有正常大小的脾臟上述小鼠中，抗原特異性人IgG約高10,000倍。也已發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)始末抗原特異性反應(yīng)的相對親和性有所增加，這表明較高百分比的總免疫球蛋白庫由具有較好結(jié)合特性的抗體組成，這些結(jié)果表明系統(tǒng)是由抗原驅(qū)動(dòng)的。這些結(jié)果非常有意義，且表明了一般應(yīng)該可以從hu-SPL-SCID中拯救人細(xì)胞，并將之用于產(chǎn)生組合人抗體基因文庫，從而得到能用于臨床和/或診斷的高親和性和特異性的人單克隆抗體。更具體地說，本發(fā)明提供了抗RSVF-蛋白的新的人單克隆抗體，所述抗體對RSVF-蛋白具有高親和性，即≤2×10-9M蛋白質(zhì)，所述人單克隆抗體能在體外中和RSV。本發(fā)明進(jìn)一步提供了制備這種抗RSVF-蛋白人單克隆抗體的方法。通常按下述生產(chǎn)這種人抗體，即在體外用RSVF-蛋白免疫接種原初人脾細(xì)胞，將這種在體外經(jīng)免疫接種的人脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至免疫妥協(xié)的動(dòng)物供體，即SCID小鼠中，用RSVF-蛋白加強(qiáng)免疫所述動(dòng)物，從中分離人B細(xì)胞，所述細(xì)胞分泌抗RSVF-蛋白的人單克隆抗體，免疫接種所述人B細(xì)胞，克隆所述經(jīng)免疫的B細(xì)胞并選擇能分泌對RSVF-蛋白具有高親和性(優(yōu)選至少10-7M，更優(yōu)選≤2×10-9M)的人單克隆抗體的細(xì)胞。如上文所討論的，已發(fā)現(xiàn)體外免疫接種，尤其是人脾細(xì)胞的聯(lián)合相對于在SCID小鼠中制備人抗體的常規(guī)方法可提供顯著的優(yōu)點(diǎn)，上述聯(lián)合即為先前已經(jīng)或未曾暴露于RSVF-抗原并轉(zhuǎn)移至免疫妥協(xié)的動(dòng)物供體，即SCID小鼠中，隨后用RSVF-蛋白抗原加強(qiáng)免疫所述供體。也就是上述聯(lián)合可提供很高的抗體滴度，即最高的抗-F蛋白滴度約為10-7，還可提供高IgG濃度，即對于最強(qiáng)的反應(yīng)者而言約為3mg/ml。而且此方法考慮到產(chǎn)生具有高度有利的特性組合的人抗體，即所述抗體既對RSVF-蛋白有高親和性，又顯示出顯著的體外中和活性。在實(shí)施例中將要更詳細(xì)地描述本發(fā)明人已分離了兩個(gè)人單克隆抗體，RF-1，當(dāng)通過胞質(zhì)基因組共振測定時(shí)，RF-1顯示出對F-蛋白的親和性常數(shù)Ka，Ka＝1010M，RF-2，當(dāng)通過微量滴定比色法測定時(shí)，RF-2顯示出親和性常數(shù)Ka＝5×108M，RF-2經(jīng)計(jì)算的Kd＝2×10-9M。而且這兩種抗體在濃度為8-120ng/ml時(shí)會(huì)顯示出體外中和病毒的特性，并表現(xiàn)出抑制先前已被RSV感染的細(xì)胞融合的能力。值得注意地是可使用這種體外中和活性抵抗多種不同的野生型和實(shí)驗(yàn)室RSV毒株，包括A和B病毒型。假定這些結(jié)果，即本發(fā)明抗體對RSVF-蛋白的高親和性(所述RSVF-蛋白包括被RSV感染的細(xì)胞表面表達(dá)的表面蛋白)以及有效中和病毒和抑制被病毒感染之細(xì)胞的融合的能力，本發(fā)明的人單克隆抗體應(yīng)該適于作為治療劑和預(yù)防劑，即在易感的或經(jīng)RSV感染的受試者中治療或預(yù)防RSV感染。如上文所提及，RSV感染在嬰兒以及免疫妥協(xié)的人群中特別流行，因此，本發(fā)明的單克隆抗體特別適于在這種受試者中預(yù)防或治療RSV感染。而且假定本發(fā)明的單克隆抗體來源于人，它們特別適于被動(dòng)免疫療法，這是因?yàn)樗鼈兛赡懿粫?huì)遭受鼠單克隆抗體潛在的約束。即HAMA反應(yīng)和正常人效應(yīng)子功能的缺乏。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體的鑒定(下文實(shí)施例中有述)，RF-1和RF-2顯然比以前公開的鼠或嵌合抗-F蛋白抗體和得自重組文庫的人Fab片段具有實(shí)質(zhì)上更高的體外中和活性和抑制先前已被RSV感染之細(xì)胞的融合的能力。假定它們是來源于人的，還希望這種中和活性通過體內(nèi)施用得以維持。本發(fā)明的人單克隆抗體的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們實(shí)質(zhì)上缺乏與正常組織的反應(yīng)性。如下文所示，本發(fā)明的人單克隆抗體僅與被RSV感染的細(xì)胞結(jié)合，而不與代表淋巴樣組織，肝臟，前列腺的或喉的表皮的細(xì)胞系結(jié)合。因此，通過體內(nèi)施用的這些抗體應(yīng)能有效地與被RSV感染的細(xì)胞結(jié)合，而不與正常的組織結(jié)合，從而應(yīng)能提供對RSV感染的中和作用。另外基于已公開的特性，希望使用本發(fā)明抗RSVF-蛋白的人單克隆抗體以保護(hù)易感受宿主免受RSV感染。更具體地說，例如通過從外傷或LTP來源得到人脾細(xì)胞，然后在體外致敏即可產(chǎn)生本發(fā)明抗RSVF-蛋白的人單克隆抗體。此方法實(shí)質(zhì)上包括在足夠量的IL-2和任選為RSVF-蛋白的存在下在體外培養(yǎng)所述原初人脾細(xì)胞以誘導(dǎo)免疫接種，這也稱作抗原致敏。通?？梢允褂玫腞SVF-蛋白的量的范圍約為1-200ng/mlRSV蛋白，更優(yōu)選10-100ng/ml，最優(yōu)選約為40ng/mlRSVF-蛋白。體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選含有淋巴因子，尤其是IL-2，任選含有IL-4和IL-6。其用量應(yīng)能供免疫接種和按所需產(chǎn)生生產(chǎn)抗體的細(xì)胞，例如對IL-2而言，適當(dāng)?shù)钠淞康姆秶s為5-200IU/ml，更優(yōu)選約為10-50IU/ml，最優(yōu)選25IU/ml。此培養(yǎng)基也可含有在培養(yǎng)物中維持人脾細(xì)胞的存活所必需的其他成分，如氨基酸和血清。在實(shí)施例中，使用的培養(yǎng)基含有IMDM，其中添加有2mM各氨酰胺，2mM丙酮酸鈉，非必需的氨基酸，25IU/mlIL-2和20％胎牛血清。然而根據(jù)本申請的教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用常規(guī)的最優(yōu)化方案改變培養(yǎng)基。體外免疫接種步驟可以在足以誘導(dǎo)免疫接種的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)，通常在RSVF-蛋白的存在下將細(xì)胞培養(yǎng)約1-10天，優(yōu)選培養(yǎng)約3天，然而根據(jù)例如特殊的脾臟樣品也可改變培養(yǎng)時(shí)間。類似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本申請的教導(dǎo)使用已知方法可確定體外免疫接種步驟適當(dāng)?shù)钠谙?。用于體外免疫接種的抗原優(yōu)選為經(jīng)純化的RSVF-蛋白以確保脾細(xì)胞被免疫接種是為了抗F-蛋白，而不是抗其他無用的(非表面的)抗原。得到純化的RSV蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，本發(fā)明人特別使用了Walshetal，J.Gen.Virol.，70，2953-2961，1989的方法。然而，如果已得到足夠純度的RSVF-蛋白，從而可得到對RSVF-蛋白有特異性的人單克隆抗體，那么對特殊的方法不必苛求。另外，通過1994年2月22日授予的美國專利No.5288630中所述的重組方法可生產(chǎn)RSVF-蛋白。體外免疫接種之后，將經(jīng)RSVF-蛋白免疫或致敏的原初人脾細(xì)胞導(dǎo)入免疫妥協(xié)的供體，即SCID小鼠體內(nèi)。這優(yōu)選通過將經(jīng)RSVF-蛋白致敏的人脾細(xì)胞腹膜內(nèi)施用給SCID小鼠來實(shí)現(xiàn)，所施用的這種脾細(xì)胞的數(shù)目典型地在約104-108個(gè)脾細(xì)胞間變化，優(yōu)選為107-108個(gè)脾細(xì)胞，這種細(xì)胞的數(shù)目應(yīng)能導(dǎo)致所需的重建，即可產(chǎn)生特異性RSVF-蛋白的可回收濃度的人抗體的SCID小鼠，優(yōu)選在施用前將這種脾細(xì)胞懸浮于HBSS中，使其濃度約為8×108個(gè)細(xì)胞/ml。在腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移脾細(xì)胞之后，再用RSVF-蛋白加強(qiáng)免疫SCID小鼠，此步驟可在與脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移足夠接近的時(shí)刻實(shí)現(xiàn)，以使按所需產(chǎn)生人抗-RSVF-蛋白抗體得以實(shí)現(xiàn)。通常此步驟在轉(zhuǎn)移之后要實(shí)行3-14天，最適在轉(zhuǎn)移之后的實(shí)行7天。所述抗原的施用優(yōu)選在腹膜內(nèi)實(shí)現(xiàn)，所施用的RSVF-蛋白的量的范圍約為1-50μg，優(yōu)選均為1-10μg。在實(shí)施例中施用了5μg蛋白。然而，根據(jù)特殊的小鼠，脾臟樣品和RSVF-蛋白的純度，免疫接種的量和時(shí)間會(huì)有所變化。優(yōu)選在佐劑(如完全弗氏佐劑，明礬，皂苷等，其中優(yōu)選完全弗氏佐劑(CFA)和明礬)的存在下實(shí)現(xiàn)抗原的加強(qiáng)免疫，然而預(yù)計(jì)其他已知的佐劑可以取代以得到實(shí)質(zhì)上相當(dāng)?shù)幕蛏踔粮鼜?qiáng)的結(jié)果?？乖訌?qiáng)免疫之后，對SCID小鼠取血，如尾血，并檢測它們的血清中人IgG濃度和抗-F蛋白抗體滴度，然后使用那些顯示出最高抗體滴度和濃度的動(dòng)物以回收可分泌人IgG的細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)具有最高抗-F人抗體滴度的SCID小鼠長出了大的腹部腫瘤，此腫瘤可提供分泌人抗體之細(xì)胞的良好來源。優(yōu)選通過在無菌狀態(tài)下切除以回收這些腫瘤，制備單細(xì)胞懸浮液，然后洗滌細(xì)胞并培養(yǎng)之。在實(shí)施例中，用含有2％胎牛血清的IMDM洗滌細(xì)胞，在含有含10％FCS的IMDM的T-25燒瓶中的106個(gè)細(xì)胞/ml的懸浮液中培養(yǎng)細(xì)胞，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員可改變這種培養(yǎng)條件。然后優(yōu)選使用EBV使這些細(xì)胞無限增殖化，然后用已知方法(如ELISA)鑒定可分泌抗-F蛋白抗體的無限增殖化細(xì)胞。如上文所提及，此方法已被闡明可導(dǎo)致特異性結(jié)合RSVF-蛋白的兩個(gè)不同的人單克隆抗體，即RF-1和RF-2的鑒定。然而根據(jù)申請中的教導(dǎo)，尤其是根據(jù)實(shí)施例中的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員無需經(jīng)過過多的實(shí)驗(yàn)即可得到具有類似特性的抗RSVF-蛋白的其他人單克隆抗體。假定這些抗體中的大多數(shù)是使用不同的SCID在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生這一事實(shí)，這些抗體則是不同的。表達(dá)RF-1和RF-2的細(xì)胞系已經(jīng)能在培養(yǎng)物中維持更長的時(shí)間，即分別約為18和16個(gè)月；用約36-48小時(shí)的大致的雙倍時(shí)間來劃分。在以0.5×106個(gè)細(xì)胞/ml接種，培養(yǎng)了3天的培養(yǎng)物中特異性抗體濃度平均約為0.8-1μg/ml。如下文將更詳細(xì)討論的，RF-1和RF-2都是IgG(l，k)，在ELISA中對F-蛋白的一半-最大結(jié)合分別為0.6和1ng/ml，分別在約8.8和8.9處顯示出等電點(diǎn)。而且這些抗體對RSVF-蛋白表現(xiàn)出高親和性，具體地說，對RF-1而言，在IASYS儀上通過胞質(zhì)基因組共振測得的RF-1解離常數(shù)約為10-10M，RF-2的Ka常數(shù)同樣很高；當(dāng)根據(jù)Wisemanetal，(1989)和Robertetal.(1989)通過微量滴定比色法測定時(shí)，約為2×10-9M。另外，已闡明這些抗體可有效結(jié)合被RSV感染的細(xì)胞，而不會(huì)結(jié)合被檢測的正常的人細(xì)胞，如呼吸道內(nèi)表面(HEp-2，喉表皮癌，CCL23)，肝臟(HepG2，人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系，HB8068)，淋巴樣組織(SB，人B成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系，Cat.No.CCL120和HSB，T成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系，Cat.No.CCL120.1)和前列腺(LNCaP，F(xiàn)GC，人前列腺癌系，Cat.No.CRL1740)。值得注意的是RF-1和RF-2已顯示出實(shí)質(zhì)上在體外的對RSV病毒的中和作用，這一點(diǎn)已被兩個(gè)不同的試驗(yàn)闡明(下文將更詳細(xì)地描述)，即通過在將病毒加入至細(xì)胞之前，使之與純化的單克隆抗體預(yù)-反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的感染中和試驗(yàn)(此試驗(yàn)是為了測定抗體抑制病毒感染性的能力)和為測定單克隆抗體抑制病毒生長和抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞后的擴(kuò)充的能力的融合抑制試驗(yàn)。而且，如下文將要詳細(xì)討論的，RF-1和RF-2分別在濃度約為30ng/ml-1000ng/ml時(shí)可抑制病毒感染12個(gè)不同的分離株，因此RF-2顯然工作得比RF-1好，它在濃度比RF-1低約1.25-10倍的情況下產(chǎn)生50％病毒抑制作用(ED50)。與之相比，在以前已被感染的細(xì)胞中需要更高濃度的單克隆抗體來抑制融合和病毒抗原的表達(dá)，RF-1的效力比RF-2要高5-10倍，而且RF-1和RF-2都能有效地抵抗TypeBRSV，TypeB原型RS6556和TypeARSV，TypeA原型RSLong。因此體外結(jié)果表明本發(fā)明的人單克隆抗體可被用于治療或預(yù)防由TypeA和TypeB原型的不同RSV毒株引起的RSV感染。如上文所討論的，RSVF-蛋白在不同的RSV分離株中非常保守，因此本發(fā)明的抗RSVF-蛋白的單克隆抗體有可能與RSVF-蛋白保守的表位結(jié)合。如上文所討論的，含有可變重鏈和輕鏈序列的本發(fā)明人單克隆抗體或重組人抗體(其制備在下文中討論)將被用作治療和預(yù)防劑以通過被動(dòng)抗體療法治療或預(yù)防RSV感染。具體地說，可將編碼這些DNA可變區(qū)的DNA序列摻入圖2所示的歸IDEC所有的表達(dá)載體中。此形式實(shí)質(zhì)上被描述于1995年1月25日提交的共同轉(zhuǎn)讓的美國申請No.08/379,072中，本文將它列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。此載體含有人恒定區(qū)，如人γ1，人γ4或被稱為γ4PE的它們的突變形式(見美國申請No.08/379,072，本文將它列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn))。通常還包括給易感的受試者或顯示出RSV感染的個(gè)體施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的人單克隆抗體。有效劑量的量優(yōu)選范圍為約50-20,000μg/kg，更優(yōu)選約為100-5000μg/kg。然而根據(jù)如被治療宿主的身體狀況，體重等的因素可改變適當(dāng)?shù)膭┝?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定合適的有效劑量。可通過適于施用抗體的任何施用方式施用本發(fā)明的人單克隆抗體，典型地可通過注射，如靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，或更優(yōu)選通過煙霧化施用本發(fā)明的抗體。如上文所提及的如果被治療的受試者包括新生兒則特別優(yōu)選煙霧化施用?？赏ㄟ^使用已知藥用載體和賦形劑的已知方法實(shí)現(xiàn)藥用可接受形式的抗體的配制，適當(dāng)?shù)妮d體和賦形劑包括例如緩沖鹽水，牛血清白蛋白等。而且，假定本發(fā)明抗體對RSV感染細(xì)胞具有高特異性和親和性，那么可將它用作免疫探針以診斷RSV感染。它通常包括從懷疑有RSV感染的個(gè)體身上取樣，如呼吸道液體，并將此樣品與本發(fā)明的人單克隆抗體一起保溫以檢測被RSV感染的細(xì)胞的存在。此方法包括用報(bào)道分子直接或間接地標(biāo)記本發(fā)明的人抗體，所述報(bào)道分子可提供對人單克隆抗體-RSV免疫復(fù)合物的檢測，已知標(biāo)記物的例子包括例如酶(如β-內(nèi)酰胺酶，螢光素酶等)和放射性標(biāo)記物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知使用單克隆抗體實(shí)現(xiàn)抗原的免疫檢測的方法，本發(fā)明的抗-RSVF-蛋白抗體聯(lián)合診斷有效量的適當(dāng)報(bào)道分子也可被配制成檢測試劑盒以檢測RSV感染。材料和方法實(shí)施例1-6中使用了下述材料和方法。F蛋白的制備和純化實(shí)質(zhì)上可根據(jù)Walshetal.J.Gen.Virol，70，2953-2961，(1989)的方法制備F蛋白，簡單地說，即用RSV的Long毒株(A型實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株)感染70％鋪滿的HEp-2細(xì)胞，在T-150培養(yǎng)燒瓶中的添加有5％胎牛血清，ZmM谷氨酰胺和2mM丙酮酸鈉的IMDM中培養(yǎng)48小時(shí)之后，將細(xì)胞置于含1％Triton-x-100和1％脫氧膽酸鹽的PBS裂解緩沖液中裂解，在偶聯(lián)有鼠單克隆抗-F抗體B4(HiroykiTsutsumi友情贈(zèng)送)的Sephadex親和柱上從細(xì)胞粗裂解液中純化F蛋白(Tsutsumietal.1987)，用裂解緩沖液充分洗滌上述親和柱，在含0.1％脫氧膽酸鹽的0.1M甘氨酸pH2.5中洗脫經(jīng)純化的F蛋白，立即用1MTris，pH8.5中和洗脫液并對PBS透析，當(dāng)在Extracti-D凝膠柱(Pierce，Rockford，IL，Cat.No.20346)上除去去污劑后，通過EIA測定F蛋白的濃度，并通過γ照射使溶液滅菌。淋巴樣細(xì)胞的制備在臨床上對特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)患者行脾切除術(shù)后可得到脾臟，通過過金屬篩可制備單細(xì)胞懸液，并在添加有2％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中洗滌，通過在37℃下用氯化銨裂解緩沖液處理90秒可除去紅血細(xì)胞，然后用含血清的培養(yǎng)基將富含白血細(xì)胞的懸浮液洗滌兩次，以108個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮于冰冷的正在結(jié)冰的培養(yǎng)基中(95％FCS，5％DMSO)，并在液氮中冷凍直至使用。體外免疫接種(IVI)在添加有2mM谷氨酰胺，2mM丙酮酸鈉，非必需氨基酸，25μg/mlIL-2和10％胎牛血清的IMDM中建立培養(yǎng)，加入抗生素混合液，其中包括2.5μg/ml兩性霉素，100μg/ml氨芐青霉素，100μg/ml卡那霉素，5μg/ml氯四環(huán)素，50μg/ml新霉素和50μg/ml慶大霉素，在6-孔群中以3×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度將細(xì)胞與40ng/ml的F蛋白一起培養(yǎng)，3天后收集細(xì)胞，洗滌之并以8×108個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮于HBSS中以供SCID重建。SCID小鼠的重建通過腹膜內(nèi)注射200μl含4×107個(gè)經(jīng)IVI的人脾細(xì)胞的HBSS來重建5-8周齡的雌性CB17/SCID小鼠；腹膜內(nèi)注射1周后用于CFA中的5μgF蛋白加強(qiáng)免疫小鼠，再過15天后抽尾血，檢測其血清中人IgG的濃度和抗-F蛋白的抗體滴度。從hu/SCID小鼠中回收人細(xì)胞兩個(gè)具有高抗-F人抗體滴度的hu-SPL-SCID小鼠長出大的腹部腫瘤，在無菌狀態(tài)下從被處死的小鼠身上行切除術(shù)以回收腫瘤，制備單細(xì)胞懸浮液，用含2％胎牛血清的IMDM洗滌細(xì)胞，并在T-25燒瓶中的含10％FCS的IMDM中培養(yǎng)至106個(gè)細(xì)胞/ml。檢測人IgG和抗-F蛋白抗體在ELISA中進(jìn)行人IgG和抗-F抗體的檢測，為了此目的，分別用于0.1M碳酸氫鹽緩沖液，pH9.5中的GAH-Ig(0.05μg/孔)或F蛋白(0.05μg/孔)將培養(yǎng)板包被過夜，并用含1％胎牛血清的PBS轉(zhuǎn)閉，使小鼠血清，培養(yǎng)物上清或純化抗體的連續(xù)釋放液在培養(yǎng)板中反應(yīng)，通過隨即加入GAHIgG-HRP和OPD底物(Sigma，…，…，)顯示出結(jié)合的人IgG，在兩個(gè)試驗(yàn)中，將選定的高滴度人血清用作陽性對照，在估計(jì)人IgG和單克隆抗體的濃度時(shí)，分別使用純化的多克隆人IgG，或(γ.K.)骨髓瘤蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。人抗體的同種定型如上所述在經(jīng)F蛋白包被的培養(yǎng)板上用ELISA進(jìn)行同種定型，通過隨即加入與HRP偶聯(lián)的特異于人γ1，γ2，γ3，γ4，μ，k和λ鏈的小鼠單克隆抗體可顯示結(jié)合的人IgG，陽性對照與(γ1，k)，(γ2，k)，(γ3，λ)，(γ4，λ)或(λ，λ)同種型骨髓瘤蛋白和游離的K和λ鏈一起泳動(dòng)。A蛋白的純化在A蛋白-Sepharose4B柱上從培養(yǎng)物上清液中純化抗體，簡單地說，收集上清液，通過0.2mm的濾紙器過濾，并添加0.02％疊氮化鈉，用含0.02％疊氮化鈉的PBS平衡柱(凝膠體積約為0.5ml)，然后以低速上樣上清液，充分洗滌后，在0.1M檸檬酸鈉緩沖液，pH3.5中洗脫結(jié)合的人單克隆IgG，使用Centricon10濾器(Amicon，)對PBS-疊氮化物進(jìn)行透析，并通過γ照射滅菌直至使用，用檸檬酸(pH2.5)使柱再生，并用含0.02％疊氮化鈉的PBS再次平衡柱以供再次使用。等電聚焦在聚丙烯酰胺預(yù)制凝膠(Pharmacia，Uppsala，Sweden，Cat.No.80-1124-80)，pH3-pH10中進(jìn)行人抗體的等電聚焦(IEF)，簡單地說，上樣20μl樣品并在1500伏下電泳90分鐘，pi5.8-10.25的標(biāo)準(zhǔn)物被用作pi參照物(…)，在考馬斯亮藍(lán)染料中將凝膠染色，并在含25％甲醇，68％水和8％醋酸的脫色緩沖液中脫色。Western印跡原始的和通過煮沸變性的純化F蛋白在10％聚丙烯酰胺凝膠中遷移，將凝膠印跡到硝酸纖維素膜上，30伏下2小時(shí)，60伏下過液。轉(zhuǎn)移后在室溫下用含1％BSA和0.1％吐溫-20的PBS將硝酸纖維素膜封閉1小時(shí)，用PBS洗滌不同的條，并加入初次抗體，hu-SPL-SCID抗-F蛋白血清，或hu-SPL-SCID抗破傷風(fēng)類毒素陰性對照或小鼠抗-F蛋白陽性對照達(dá)1小時(shí)，所有血清以1∶500稀釋，用PBS充分洗滌之后，對于樣品和陰性對照加入再次抗體，GAHIgG-HRP達(dá)1小時(shí)，或?qū)τ陉栃詫φ占尤隚AMIgG達(dá)1小時(shí)，印跡用4-氯-1-萘酚顯示。免疫熒光使用冰冷的丙酮將被RSV感染的HEp-2細(xì)胞(4×104)固定在玻璃載玻片上，在37℃下與20μl以1∶10稀釋的血清，或純化的MAb，2μg/ml反應(yīng)1小時(shí)，洗滌載玻片，在37℃下用GAHIgG-FITC顯示結(jié)合抗體達(dá)30分鐘，并在熒光顯微鏡下觀察。FACScan分析用洗滌緩沖液(含0.1％疊氮化鈉的PBS)洗滌被RSV感染的HEp-2細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞/樣品)，將細(xì)胞碎片重新懸浮于50μl含2μg/mlRF-1或RF-2的保溫緩沖液中(添加有0.1％BSA并含0.1％疊氮化鈉的PBS)，在冰上保溫15分鐘后，洗滌細(xì)胞并重新在冰上將細(xì)胞重新懸浮于含GAHIgG-FITC保溫緩沖液中達(dá)15分鐘，洗滌3次后，在1ml含1％甲醛的PBS中固定細(xì)胞并在Becton-DickinsonFACScan裝置上進(jìn)行分析。親和性測定使用兩種方法測定人MAb對可溶性F蛋白的親和性在使用IASYS儀的胞質(zhì)基因組共振中，抗體與裝置潮濕的那邊共價(jià)結(jié)合，根據(jù)裝置干燥的那邊所發(fā)出光的折射的變化可測定質(zhì)量的變化，加入不同濃度的F-蛋白，隨后用不斷流過的PBS洗脫下F-蛋白，測量作為從抗體上釋放下來的F-蛋白的結(jié)果的質(zhì)量上的變化，從動(dòng)力學(xué)上講測定了Koff，通過檢測從不同水平的最初飽和上脫下的速率可計(jì)算出Ka。另外，通過根據(jù)Wiseman等人和Robert等人的微量量熱法可測定親和性常數(shù)，方法如下，在42℃的熱容器中將已知濃度的RF-2和F蛋白一起保溫，測量由于溶液中免疫復(fù)合物的形成而造成的焓變化，在50℃下重復(fù)反應(yīng)，根據(jù)Robert等人的理論，在下列等式中將與結(jié)合相關(guān)的常數(shù)K計(jì)算成溫度和焓變的函數(shù)K＝Kobs.eΔllobslR.(1/T-1/Tobs)·eΔCTobs/R.(1/T-1/TTobs)·(T/Tobs)ΔC/R其中Kobs是在特定絕對溫度Tobs下的結(jié)合平衡常數(shù)，ΔHobs是在特定絕對溫度Tobs下實(shí)驗(yàn)觀察到的焓變；R是大氣常數(shù)(1.987)，ΔC是實(shí)驗(yàn)測得的結(jié)合熱容的變化。補(bǔ)體-增強(qiáng)的病毒中和試驗(yàn)使用兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室毒株(Long，A型和18537，B型)和從住院嬰兒體內(nèi)分離到的10株野生型RS病毒分離物來評價(jià)抗-F蛋白人MAb的中和能力。室溫下在微量滴定培養(yǎng)板的100μlIMDM/孔中，在補(bǔ)體的存在下將連續(xù)稀釋的人MAb與病毒(50-100pfu)一起預(yù)保溫30分鐘，在100μlMEM中加入HEp-2細(xì)胞(5×104孔)并在37℃，5％CO2下保溫3天，洗滌培養(yǎng)板用丙酮固定并風(fēng)干，通過使用小鼠MAb的ELISA檢測RSV抗原，將中和作用的終點(diǎn)任意測定為與無抗體的對照孔相比可將抗原的產(chǎn)生降低50％的稀釋度。病毒融合抑制試驗(yàn)通過在37℃，5％CO2下，將100TCID50RSVLong(A原型病毒)或RS6556(B型臨床分離物)與VERO細(xì)胞(5×103/孔)在微量滴度培養(yǎng)板中預(yù)保溫4小時(shí)可測定融合抑制作用的滴度，在每孔中加入不同濃度的人單克隆抗體或?qū)φ?，并?7℃，5％CO2下將一式四份的培養(yǎng)物保溫6天。對照培養(yǎng)物含有未被病毒感染的細(xì)胞(陰性)或在抗體缺乏的情況下被感染的細(xì)胞(陽性)，在使用兔多克隆抗-F蛋白抗血清和經(jīng)HRP-標(biāo)記的抗-兔IgG的ELISA中檢測病毒的生長，用TMBlue底物(KPI，Gaithersburg，MD)進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)MAb劑量反應(yīng)的回歸分析，滴度(ED50)被定義為抑制50％病毒生長的抗體濃度。實(shí)施例1HU-SPL-SCID滴度15只SCID小鼠接受了患有ITP三單個(gè)供體的人脾細(xì)胞，在IL-2和不同濃度之可溶性F蛋白的存在下將細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)3天，成功地重建了所有動(dòng)物，并在用F蛋白加強(qiáng)免疫之后，血清中人IgG總濃度在12μg/ml-10mg/ml之間變化，抗-F蛋白滴度在3×102-106之間變化(表1)，在體外暴露于F蛋白和體內(nèi)抗-F蛋白滴度之間沒有觀察到相關(guān)性。有關(guān)本發(fā)明的方法，以前已在馬鐵蛋白抗原系統(tǒng)中觀察到在脾細(xì)胞的體外培養(yǎng)期間必需暴露于抗原以確保隨后的體內(nèi)特異性抗體滴度。這兩個(gè)系統(tǒng)之間的差異可歸結(jié)為所涉及抗原的差異由于人不會(huì)自然暴露于馬鐵蛋白，IVI步驟涉及用抗原致敏脾細(xì)胞并在體外誘導(dǎo)初次應(yīng)答；另一方面，通過幼年時(shí)自然的感染實(shí)質(zhì)上所有人對RSV都有免疫力，這里所說的自然感染會(huì)導(dǎo)致對F蛋白永久的記憶，因此在體外僅用IL-2刺激，隨后在體內(nèi)加強(qiáng)免疫一次就足以誘導(dǎo)再次應(yīng)答。由等電聚焦模式判斷(數(shù)據(jù)未顯示)，抗血清為多克隆的，在Western印跡中檢測了它們對F蛋白的反應(yīng)性，我們的結(jié)果表明二聚體形式(140KD)和單聚體形式(70KD)的多克隆人Ab都不能識別可溶性的原始下蛋白；它們也能與變性F蛋白強(qiáng)烈反應(yīng)，特異性地與48KD和23KD的這2個(gè)亞單位結(jié)合(代表性的數(shù)據(jù)見圖1)，這暗示著至少對下蛋白的體液反應(yīng)的一部分直接抗分子的線性，非構(gòu)象表位。免疫熒光研究進(jìn)一步闡明了hu-SPL-SCID血清的特異性，這是由于免疫血清而不是原始SCID小鼠血清能與RSV-感染的HEp-2細(xì)胞強(qiáng)烈地反應(yīng)(圖2)。對用作陰性對照的未被感染的HEp-2細(xì)胞未觀察到反應(yīng)性，因此可得出結(jié)論可溶性的F蛋白是產(chǎn)生特異于自然感染的細(xì)胞上表達(dá)的膜病毒抗原之抗體的適當(dāng)?shù)目乖?。?shí)施例2鑒定腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中的抗體處死具有高抗-F蛋白滴度的所有小鼠，從腹腔灌洗和脾臟中收獲人細(xì)胞。兩只小鼠(hu-SPL-SCID#6和hu-SPL-SCID#15)同時(shí)長出腹部的實(shí)體腫瘤，回收所述腫瘤并刮成單細(xì)胞懸液，腫瘤細(xì)胞分泌的特異性抗-F蛋白抗體在ELISA中得以測定，這些腫瘤和抗體被稱作RF-1(RSVF-蛋白)和RF-2。RF-1和RF-2在間隔約2個(gè)月的兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生，并從各個(gè)hu-SPL-SCID小鼠中分離得到，因此它們是不同的抗體；它們分別在培養(yǎng)物中已建立自身達(dá)18個(gè)月和16個(gè)月以上，以36-48小時(shí)的雙倍時(shí)間分開。以0.5×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度接種并培養(yǎng)3天，培養(yǎng)物中特異性抗體濃度典型地為0.5-1μg/ml。為了進(jìn)一步鑒定，通過使用A蛋白Sepharose柱的親和層析從培養(yǎng)物上清液中純化兩種人MAb。RF-1和RF-2都是IgG(l，k)，在ELISA中與F-蛋白最大結(jié)合的一半分別為0.6和1ng/ml(圖3)。從IEF中的遷移模式看，RF-1和RF-2的等電點(diǎn)分別被測定為8.8和8.9(圖4)，在流式細(xì)胞術(shù)中RF-1和RF-2特異性地識別被RSV感染的HEp-2細(xì)胞(圖5)。在LASYS儀上通過胞質(zhì)基因組共振測定的RF-1解離常數(shù)Kd約為10-10M，根據(jù)Wiseman等人(1989)和Robert等人(1989)的微量滴定比色法測定的RF-2Kd常數(shù)為2×10-9M。實(shí)施例3抗-F蛋白的組織特異性利用通過流式細(xì)胞術(shù)測量的間接免疫熒光試驗(yàn)篩選純化抗體與一系列可得自ATCC的人細(xì)胞系的反應(yīng)性(表11)。此結(jié)果表明抗體不與以下列為代表的細(xì)胞系結(jié)合，即呼吸道內(nèi)表面(HEp-2，喉表皮癌，Cat.No.CCL23)，肝臟(HEpG2，人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系，Cat.No.HB8065)，淋巴樣組織(SB，人B成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系，Cat.No.CCL120和HSB，T成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系，Cat.No.CCL120.1)和前列腺(LNCaP.FGC.人前列腺癌系，Cat.No.CRL1740)。實(shí)施例4體外功能活性為了測定抗體在體外是否具有中和病毒的作用，將抗體經(jīng)受兩種類型的功能性測定在將病毒加入細(xì)胞之前，使之與純化的MAb預(yù)反應(yīng)可進(jìn)行感染中和試驗(yàn)，因此反映出MAb抑制病毒感染性的能力；融合抑制作用反映出Ab抑制病毒生長和病毒進(jìn)入細(xì)胞之后的擴(kuò)展的能力。如EIA中通過病毒抗原滴定所測定的，兩個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果被測定為特定保溫時(shí)間之后培養(yǎng)物中釋放的病毒量。對于所測試的所有12個(gè)分離株而言，濃度分別為30ng/ml-1000ng/ml和8ng/ml-165ng/ml的RF-1和RF-2Ab能抑制病毒感染，RF-2始終比RF-1工作得更好，在濃度比RF-1低1.25-10倍時(shí)產(chǎn)生50％病毒抑制作用(ED50)，代表性的數(shù)據(jù)列于表III。正如所期望的，在以前曾被感染的細(xì)胞中需要較高濃度的MAb抑制融合和病毒抗原表達(dá)，在此試驗(yàn)中，RF-1的效力比RF-2高5-10倍。在TypeB原型RS6556中的兩種MAb比TypeA原型RSLong中的更有效(表III)。表I</tables>表I在IL-2存在下，將單個(gè)供體的脾細(xì)胞與或不與F蛋白一起培養(yǎng)3天，用4×107個(gè)細(xì)胞重建SCID小鼠并用于CFA中的10μgF蛋白腹膜內(nèi)加強(qiáng)免疫所述小鼠，在小鼠#1，2，3，4和5中注射新鮮的自身細(xì)胞(20×106)以加強(qiáng)免疫，通過與多克隆IgG的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可測定人IgG的濃度，通過EIA中的終點(diǎn)稀釋測定抗-F蛋白滴度。表II</tables>表IIRF-2與多種細(xì)胞系的反應(yīng)性。用RF-2，200ng/106個(gè)細(xì)胞間接免疫熒光標(biāo)記不同的細(xì)胞系。Fab山羊抗-人IgG-FITC被用作第二步驟，(-)表示RF-2的存在不會(huì)導(dǎo)致平均熒光波道的變化；(+)表示平均標(biāo)記量以0.5log增加。表III</tables>表IIIED50被定義為根據(jù)單克隆抗體劑量反應(yīng)的回歸分析抑制50％病毒生長的抗體濃度。實(shí)施例5(比較實(shí)施例)在體外誘導(dǎo)對F-蛋白的IgG回憶應(yīng)答兩歲以上的群體中，95％以上已經(jīng)暴露于RSV并對RSV作出了成功的反應(yīng)(Hendersonetal，J.Med.(1979)，300，530-534)。因此在體外用RSVF-蛋白攻擊脾細(xì)胞應(yīng)該導(dǎo)致回憶應(yīng)答，而事實(shí)上在體外誘導(dǎo)了脾細(xì)胞主要的IgG反應(yīng)(見圖5)。最適抗原濃度40ng/ml至少比所觀察到的誘導(dǎo)初次應(yīng)答的抗原濃度即鐵蛋白，Ilig/ml要小一個(gè)數(shù)量級(Boerneretal.，J.Immunol.，1991，147，86-95；Bramsetal，Hum.Antibod.Hybridomas，1993，4，47-56)。因此應(yīng)考慮到在體外用F-蛋白致敏會(huì)誘導(dǎo)類似的再次應(yīng)答，對于PBMC和得自扁桃體的細(xì)胞而言，幾種在體外誘導(dǎo)對RSVF-蛋白的顯著反應(yīng)的嘗試均告失敗。由體外致敏的脾細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體的有限的努力產(chǎn)生幾個(gè)抗RSVF-蛋白的單克隆IgG抗體，然而在ELISA中，大多數(shù)所述抗體會(huì)與幾個(gè)對照抗原中的一個(gè)交叉反應(yīng)(結(jié)果未顯示)。實(shí)施例6克隆編碼RF-2的基因RF-1和RF-2克隆都不能產(chǎn)生顯著量的抗體。這兩個(gè)細(xì)胞系在含20％FCS的培養(yǎng)基中長得最好，這是不利的，因?yàn)樗鼤?huì)導(dǎo)致純化抗體被牛IgG污染。因此為了能產(chǎn)生和純化大量進(jìn)行有意義的動(dòng)物模型試驗(yàn)所需的抗體(所述試驗(yàn)典型地需要多至1克的一種選定抗體)，將編碼RF-1和RF-2的基因轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)載體和細(xì)胞系是有利的。本受讓人IDEC制藥公司已開發(fā)出很有效的真核生產(chǎn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在CHO細(xì)胞中可產(chǎn)生人單克隆抗體，此載體系統(tǒng)被描述于共同轉(zhuǎn)讓的美國申請No.08/379,072(1995年1月25日提交)和No.08/149,099(1993年11月3日提交)中，本文將它們都列為參考文獻(xiàn)。常規(guī)下使用此系統(tǒng)，在每升旋動(dòng)培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基中被抗體基因轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞產(chǎn)生了約200mg抗體，比用氨甲蝶呤擴(kuò)增后發(fā)酵罐中的抗體高500mg/l。使用mRNA分離試劑盒，F(xiàn)astTract(InVitroGen，SanDiego，California)提取經(jīng)克隆的RF-2細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物(見下文)，約5×106中的RNA，使用寡-dT引物和逆轉(zhuǎn)錄酶制備單鏈cDNA，將cDNA的等分試樣用作聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的起始物質(zhì)以擴(kuò)增可變區(qū)的基因，使用兩套引物進(jìn)行PCR(見表IV)。表IV*含Mlu1位點(diǎn)的重鏈引物VH15’(AG)10ACGCGTG(T/C)CCA(G/C)TCCCAGGT(G/C)CAGCTGGTG3’VH25(AG)10ACGCGTGTC(T/C)TGTCCCAGGT(A/G)CAG(C/T)TG(C/A)AG3’VH35(AG)10ACGCGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTG3’VH45(AG)10ACGCGTGTCCTGTCCCAGGTGCAG3’VH55(AG)10ACGCGTGTCTGGCCGAAGTGCAGCTGGTG3’含Nhe1位點(diǎn)的重鏈恒定區(qū)引物反義鏈IgGl-4(AG)10GCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGG3’含DraIII位點(diǎn)的Kappa鏈引物1.5’(AG)10CCAGGTGCACGATGTGACATCCAGATGACC3’2.5’(AG)10CCTGGATCACGATGTGATATTGTGATGAC3’3.5’(AG)10CCAGATACACGATGTGAAATTGTGTTGAC3’4.5’(AG)10TCTGGTGCACGATGTGACATCGTGATGAC3’含BsiWI位點(diǎn)的Kappa恒定區(qū)引物反義鏈Ck5(AG)10TGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCA(G/C)CTT3’*表IV的說明合成的寡核苷酸引物用以PCR擴(kuò)增人免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)，下劃粗線的是克隆的限制性位點(diǎn)。設(shè)計(jì)第一套引物是為了擴(kuò)增重鏈可變區(qū)，它由一個(gè)與J區(qū)結(jié)合的3′引物和五個(gè)與晚期前導(dǎo)序列和構(gòu)架1區(qū)域結(jié)合的家族特異性5′引物組成。設(shè)計(jì)第二套引物是為了擴(kuò)增Kappa可變區(qū)，它由一個(gè)3′引物和4個(gè)與晚期前導(dǎo)序列和構(gòu)架1區(qū)域結(jié)合的5′引物組成。在球脂糖凝膠上電泳PCR反應(yīng)產(chǎn)物，切下正確大小的350堿基對帶，電洗脫DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈畈⒖寺〉絀DEC的NEOSPLA表達(dá)載體(見圖6)中，用于表達(dá)人抗體的NEOSPLA載體含有CMV＝巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，BETA＝小鼠β株蛋白主要的啟動(dòng)子，BGH＝牛生長激素聚腺苷酸化信號，SVO＝SV40復(fù)制起點(diǎn)，N1＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子1，N2＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶外顯子2，LIGHT＝人免疫球蛋白Kappa恒定區(qū)，HEAVY＝人免疫球蛋白γ1或γ4PE恒定區(qū)，L＝前導(dǎo)序列，SV＝SV40聚腺苷酸化區(qū)域。IDEC的NEOSPLA表達(dá)載體被設(shè)計(jì)用于大量生產(chǎn)免疫球蛋白基因(見全部列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)的Reffetal，Blood，(1994)，83，435-445)，使用這些載體已高水平地成功表達(dá)了小鼠/人嵌合，靈長類動(dòng)物/人嵌合和人抗體。NEOSPLA含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因以選擇已穩(wěn)定整合了質(zhì)粒載體DNA的CHO細(xì)胞。另外，NEOSPLA含有二氫葉酸還原酶基因以在氨甲蝶呤中擴(kuò)增人恒定輕鏈(k或λ)和人恒定重鏈區(qū)(γ1或γ4(PE))。γ4(PE)是具有2處突變的人γ4恒定區(qū)，在CH2區(qū)引入谷氨酸是為了消除殘基的FcR結(jié)合，在輕鏈區(qū)的脯氨酸取代欲增強(qiáng)重鏈二硫鍵相互作用的穩(wěn)定性，Algreetal，J.Immunol.，148，3461-3468，(1992)；Angaletal，Mol.Immunol.，30，105-108(1993)，這兩篇都已列入本文參考文獻(xiàn)。在載體中還摻入了獨(dú)特的限制性位點(diǎn)已便于所需的區(qū)域和輕鏈可變區(qū)的插入，Reffetal.，Blood，(1994)，83，435-445。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，RF-2的輕鏈已被克隆到NEOSPLA，并根據(jù)Sangeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1977)，74，5463-5467的方法測定其序列。Kappa鏈?zhǔn)荎appa2亞組中的成員，類似地，已分離出人RF-2重鏈可變區(qū)并將它克隆到人γ1恒定區(qū)的前面。RF-1和RF-2的輕鏈編碼基因易于克隆，而使用普通的Tac逆轉(zhuǎn)錄酶不能產(chǎn)生編碼重鏈之基因的cDNA，然而通過替換高溫(70℃)逆轉(zhuǎn)錄酶，此問題可迎刃而解，從而用主要來自VH2家族基因的引物可產(chǎn)生完整的PCR產(chǎn)物。RF-1輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核酸序列分別示于圖7a和7b，RF-2輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核酸序列分別示于圖8a和8b，圖9a-9c表示本發(fā)明NEOSPLA載體表達(dá)的RF-1的核酸和氨基酸序列，圖9a和9b表示前導(dǎo)序列，可變輕鏈和重鏈序列，和人恒定區(qū)序列，即人Kappa區(qū)和人γ/恒定區(qū)，圖9c表示人γ/恒定區(qū)的氨基酸和核酸序列，圖10圖解表示了在CHO細(xì)胞中可表達(dá)圖9a-9c所示序列從而得到重組RF-1的表達(dá)載體。圖11a-11c類似地表示了前導(dǎo)序列，RF-1可變輕鏈，人Kappa恒定區(qū)，RF-2可變重鏈和人γ/恒定區(qū)的氨基酸和核酸序列，圖12圖解表示了可在CHO細(xì)胞中表達(dá)重組RF-2的表達(dá)載體。實(shí)施例7克隆經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化之細(xì)胞的方案的建立經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化之細(xì)胞的抗體生產(chǎn)不斷地減少并最終停止，Kozboretal.，J.Immunol.(1981)，127，1275-1280。因此為了使抗體的生產(chǎn)無限增殖化，必需在此事件之前從細(xì)胞中提取編碼免疫球蛋白的基因，并將所述基因轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)。為了分離編碼由EBV-轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)合抗原之抗體的可變區(qū)的基因，必需確保細(xì)胞材料是單克隆的，然而無論通過有限稀釋或在半固體瓊脂培養(yǎng)基中都很難克隆經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，本發(fā)明的兩個(gè)抗-F蛋白抗體RF-1和RF-2的A蛋白純化制品的等電聚焦凝膠電泳表明在RF-2制品中至少有兩群抗體，在RF-1制品中可能有寡克隆性。通過將小鼠胸腺瘤細(xì)胞系EL-4B5(Zhangetal，J.Immunol.，(1990)，144，2955-2960)用作飼養(yǎng)層，細(xì)胞通過有限稀釋由單個(gè)細(xì)胞得以擴(kuò)充，人胸腺瘤細(xì)胞系EL-4B5可表達(dá)膜受體形式的gp39，gp39可誘導(dǎo)B細(xì)胞生長，將5×104個(gè)EL-4B5細(xì)胞/孔平鋪于微量滴定培養(yǎng)板上，將培養(yǎng)物中的細(xì)胞以不同濃度(從0.38個(gè)細(xì)胞/孔起逐漸升高)平鋪于EL-4B5層上，適當(dāng)長的時(shí)間后，計(jì)數(shù)對所鋪的每個(gè)濃度有生長現(xiàn)象的孔的數(shù)目。檢測上清液中人IgG和抗原-特異性IgG的存在，用此方案我們從原始的寡克隆制品中已分離和克隆了分別產(chǎn)生RF-1(見表V)和RF-2(見表VI)的細(xì)胞?？寺∵^程中發(fā)現(xiàn)的非特異性抗體僅被分析了其同種型方面的內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)它與特異性抗體IgG1K相同。根據(jù)在RF-1培養(yǎng)過程中的不同時(shí)間點(diǎn)冰凍制備的F-蛋白特異性克隆的產(chǎn)量，以及所產(chǎn)生的IgG的量，估計(jì)從培養(yǎng)一開始，特異性抗體就構(gòu)成了總抗體量的約1/20，培養(yǎng)約8個(gè)月后特異性抗體消失，RF-2構(gòu)成了總IgG的更大的一部分，在任何特定的時(shí)間都不少于10％。使用寡克隆制品的抗體來產(chǎn)生體外中和數(shù)據(jù)，結(jié)果超出了對ED50滴度的估計(jì)，然而我們使用胞質(zhì)基因組共振來研究親和性不必依賴純抗體的使用，對經(jīng)克隆的物質(zhì)進(jìn)行使用微量滴定比色法的親和性研究。表V**表V的說明通過有限稀釋克隆RF-1，以5×104個(gè)細(xì)胞/孔將EL4-B5細(xì)胞平鋪于平底96孔培養(yǎng)板上，約24小時(shí)之后，將所述濃度的指數(shù)生長的RF-1細(xì)胞平鋪于飼養(yǎng)層上，2-3周后，對孔進(jìn)行生長和抗-F活性存在的評分。表VI**表VI的說明通過有限稀釋克隆RF-2，接與表V相同的方式進(jìn)行。為了進(jìn)一步證實(shí)這兩個(gè)具有體外中和病毒之活性的人單克隆抗體的臨床可用性，在兩個(gè)不同的動(dòng)物模型中進(jìn)一步鑒定了這些抗體清除RSV感染的效力，通過CHO細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)來進(jìn)行這些預(yù)臨床表現(xiàn)的評價(jià)，所述CHO細(xì)胞被插入專用表達(dá)載體(見圖6)中的編碼抗體的克隆基因所轉(zhuǎn)染。將檢測兩個(gè)抗體模型，一個(gè)具有完整的補(bǔ)體和Fc受體結(jié)合區(qū)γ1，一個(gè)沒有這些區(qū)域，γ4(PE突變)(Alegreetal，J.Immunol.，(1992)，148，3461-3468；Angaletal.，MolecularImmunology，(1993)，30，105-108)。出于兩個(gè)考慮來確定檢測γ4形成的基本原理(i)盡管當(dāng)直接施用于肺時(shí)，抗-F蛋白Fab已顯示出顯著的體外Barbasetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)，89，10164-10168以及體內(nèi)Croweetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)，91，1386-1390中和病毒的作用，(ii)在通過病毒感染已經(jīng)應(yīng)激的敏感組織中由效應(yīng)子功能激活作用引起的潛在的可避免的肺損傷是有利可圖的。由機(jī)構(gòu)內(nèi)部的非特異性雜交瘤IgG1抗體產(chǎn)生一套非特異性的對照抗體，一個(gè)γ1和一個(gè)γ4(PE)。第一個(gè)動(dòng)物模型是小鼠模型，Tayloretal.，J.Immunology(1984)，52，137-142；Walsh，E.E.，J.InfectiousDiseases(1994)，170，345-350，此模型被用于測定有效劑量，所述有效劑量被定義為在保溫1周后，導(dǎo)致肺組織中荷載病毒2log降低的最小劑量，此模型也可被用來測定哪個(gè)抗體模型會(huì)繼續(xù)下去。第二個(gè)動(dòng)物模型是使用非洲綠候的靈長類動(dòng)物模型，Kakuketal，J.InfectiousDiseases(1993)，167，553-561，RSV在非洲綠猴中導(dǎo)致肺部損傷，此模型的主要目的是評價(jià)抗體預(yù)防損傷的特性。用此模型的試驗(yàn)數(shù)目被限定為以5個(gè)不同的劑量檢測1個(gè)抗體，可根據(jù)在小鼠模型中的發(fā)現(xiàn)確定抗體，劑量和相對于感染日期的輸注日期。在噬斑檢測試驗(yàn)中檢查肺切片負(fù)載病毒的情況，并通過光學(xué)顯微鏡檢測由RSV引起的損傷。可觀察到在刺激和擴(kuò)充產(chǎn)生兩個(gè)抗體之細(xì)胞的過程中，氨基酸序列中是否已發(fā)生了任何變化。通過用一套根據(jù)RF-1和RF-2重鏈·CDR3區(qū)域的PCR引物檢測，可確定編碼RF-1和RF-2的基因序列是否存在于原始冷凍的產(chǎn)生了兩個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞材料中。陽性對照是RF-1和RF-2被抑制的來源的細(xì)胞，根據(jù)下列原理進(jìn)行分析Levyetal.，1989，Levyetal.，J.Exp.Med.(1989)，1692007和Alegreetal.，J.Immunol.(1992)，148，3461-3468；Angaletal.，MolecularImmunology(1993)，30，105-108；Footeetal.，Natwre(1991)，352，530-532；Radaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1991)，85，5508-5512；Kocksetal.，Rev.Immunol.(1989)，7，537-559；Wysockietal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1986)，83，1847-1851；Kippsetal.，J.Exp.Med.(1990)，171，189-196；Uekietal.，Exp.Med.(1990)，171，19-34。實(shí)施例8生產(chǎn)能產(chǎn)生大量(＞100mg/l)RF-1和RF-2的CHO細(xì)胞系a.轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒，分離和擴(kuò)充G418抗性的可表達(dá)最高水平RF-1和RF-2的CHO克隆。一旦RF-1和RF-2可變區(qū)基因被克隆到NEOSPLA中，中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞(DG44)(Urlanbetal，J.Somat.CellMol.Genet.，(1986)，16，555)即可被質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化，在SSFMH-次黃嘌呤和胸苷(GIBCO)中培養(yǎng)CHO細(xì)胞，使用BTX600電穿孔裝置(BTX，SanDiego，CA)在0.4ml一次性樣品池中用25μg質(zhì)粒DNA電穿孔4×106個(gè)細(xì)胞，在電穿孔前，用PacI限制性酶切質(zhì)粒DNA，該酶可將在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的基因從用于在細(xì)菌中生長的質(zhì)粒部分上切割下來。電穿孔的條件是230伏，400微法拉第，13歐姆。每個(gè)電穿孔在96孔盤(約40,000個(gè)細(xì)胞/孔)中展開，電穿孔3天后用含400μg/mlG418(Geneticin，GIBCO)的培養(yǎng)基飼養(yǎng)盤中的細(xì)胞，然后周期性地用所述培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞直到集落產(chǎn)生，在ELISA中檢測集落上清液中人IgG和抗-F蛋白活性的存在。b.在氨甲蝶呤中擴(kuò)增抗體的表達(dá)。然后將G418抗性的可產(chǎn)生最大量免疫球蛋白的集落轉(zhuǎn)移到較大容器中并擴(kuò)充之，通過基因擴(kuò)增，通過在96孔盤中的JnM氨甲蝶呤(MIX)中選擇可增加能分泌最多G418的克隆的表達(dá)。然后擴(kuò)充能產(chǎn)生最大量抗體的5nM集落，再通過在96孔盤中的50nMMTX中選擇再次擴(kuò)增表達(dá)。根據(jù)此方案，我們以前已能分離出在旋動(dòng)培養(yǎng)7天后能分泌大于200mg/l之抗體的CHO細(xì)胞(比在發(fā)酵罐中6天后產(chǎn)生的抗體高0.5克/升)，然后使用A蛋白親和層析從上清液中純化人抗體。c.生產(chǎn)和純化抗體。每種抗體生產(chǎn)了100mg，以在小鼠模型研究中確定的量生產(chǎn)選定的抗體，使用旋動(dòng)燒瓶生產(chǎn)所需量的抗體，所述燒瓶中含有于CHO-SSFMII無血清培養(yǎng)基中的選定CHO轉(zhuǎn)染瘤(GIBCOCat.No.91-0456DK)，所述培養(yǎng)基中含有50nM氨甲蝶呤。收獲上清液并通過一套濾器過濾以除去特殊的物質(zhì)，以0.2nM濾器結(jié)束過濾。根據(jù)抗體總量，通過預(yù)定大小的A蛋白標(biāo)注動(dòng)上清液，洗滌后，用0.1M甘氨酸/HCl，pH2.8從柱上將抗體洗脫到中和緩沖液中(1MTris/HCl，pH7.4)，通過AmiconCentriprep或Centricon30(Cat.no.4306和4209)進(jìn)行超濾，用無菌PBS使洗脫/中和緩沖液充分交換(≥1000次)?？贵w的濃度被調(diào)節(jié)約2mg/ml，并穿過0.2nm濾器過濾以使抗體無菌。純化抗體，并置于2ml冷凍管中在冰上貯藏直至用于動(dòng)物。實(shí)施例9就在RSV動(dòng)物模型中的性能而言鑒定RF-1和RF-2。使用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型檢測RF-1和RF-2的性能，評價(jià)工作分兩步進(jìn)行，首先(a)使用Balb/c模型(Tayloretal.，J.Immunology(1984)，52，137-142；Croweetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)，91，1396-1390；Connorsetal.，J.Virology(1992)，66，7444-7451)以檢測抗體的效力，以及檢測哪種類型的支持物(效應(yīng)物)功能對于抗體清除病毒荷載是必需的。從小鼠模型中得到的數(shù)據(jù)看，可選擇一個(gè)候選者在靈長類動(dòng)物模型中進(jìn)一步研究。靈長類動(dòng)物模型是非洲綠猴模型(Kakuketal.，J.LnfectiousDiseases(1993)，167，553-561)。靈長類動(dòng)物模型特別適合于進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的單克隆抗體可用于預(yù)防與病毒相關(guān)的肺部損傷。a.在小鼠模型中檢測性能。我們已選擇的嚙齒類動(dòng)物模型是Balb/c小鼠，此模型已被詳細(xì)地描述(Croweetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)，91，1386-1390；Connorsetal.，J.Virology(1992)，66，7444-7451)，以用于有關(guān)被動(dòng)療法研究的研究。所有年齡的Balb/c小鼠都很能容忍RSV在上下呼吸道中生長，(Tayloretal.，J.Immunology(1984)，52，137-142)。分5組圈養(yǎng)動(dòng)物，飼喂標(biāo)準(zhǔn)的小鼠食物并隨意喂小，并根據(jù)RochesterGeneralHospital動(dòng)物園守則照顧這些小鼠，這些守則遵照紐約州衛(wèi)生部的聯(lián)邦動(dòng)物福利條例和DHHS法則。在開口的罩布下用penthrane麻醉小鼠后進(jìn)行所有程序，包括注射，病毒感染，眼窩取血和通過頸關(guān)節(jié)脫位處死小鼠。i.測定抗體的有效劑量并比較RF-1和RF-2的γ1和γ4(PE形式)的性能。通過在第0天鼻內(nèi)滴注于100μl體積中的RSV106Long(A亞組)或10518537(B亞組)噬斑形成單位(PFU)以感染5組小鼠，在第4天病毒滴度到達(dá)峰值時(shí)，給動(dòng)物腹膜內(nèi)注射四種F-蛋白特異性單克隆抗體制品中的每一種或?qū)φ湛贵w。檢測到的劑量最初與參照劑量差不多，由體外研究計(jì)算出的參照劑量提供的血清中和滴度約為1∶300或更高。在小動(dòng)物中此滴度可與抵抗RSV攻擊的保護(hù)性水平相聯(lián)系，通過用25，5，1，1/5和1/25的參照劑量處理來評價(jià)劑量反應(yīng)，如果許可的話可進(jìn)行較高或較低劑量實(shí)驗(yàn)。如上所述，給對照注射相同劑量的同種型匹配的單克隆抗體。24小時(shí)后，第5天是病毒流出的高峰期，處死小鼠。通過心臟內(nèi)穿刺得到血清，除去鼻甲骨和肺，稱重，并分別在1和2mlNMM中勻漿，滴定勻漿液中HEp-2細(xì)胞上的病毒，病毒滴度以TCID50/gm組織表示，通過學(xué)生t-試驗(yàn)將組之間的平均滴度與對照組的相比，在感染和處死的時(shí)刻得到血清，以通過酶免疫測定法和中和試驗(yàn)測定人單克隆抗體的量。既然在上呼吸道中，IgG同種型不能有效地被分泌出來(與IgA相比)，那么可期望病毒滴度最大程度的降低會(huì)是肺部病毒的生長，在感染第4天可能的治療被證明在降低肺部病毒方面是無效的，在第2和/或3天的治療將被評價(jià)。如上文所述，使用ELISA測定貯存溶液和經(jīng)注射動(dòng)物的血清中每種單克隆抗體的滴度，在固相中使用了根據(jù)確立的方法(82)通過親和層析純化的RSV融合蛋白，也要設(shè)計(jì)測定RSVG蛋白的分離試驗(yàn)以評價(jià)小鼠IgG對實(shí)驗(yàn)性RSV感染的反應(yīng)。在ELISA中使用特異于人IgG和小鼠IgG的兔抗體(可購自VirionSystems，Inc.，Bethesda，MD)檢測人單克隆抗體或小鼠抗體。對于抗體而言，單克隆抗體的劑量反應(yīng)效果被測定為可將病毒滴度降低2log10以上或使病毒滴度降低＞99％的最低抗體滴度。保護(hù)的程度與處死小鼠時(shí)得到的血清抗體水平相關(guān)，另外，測定了人單克隆抗體不同聯(lián)合的潛在協(xié)同效果。上文所述的最初的體外研究的結(jié)果被用來指導(dǎo)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，例如，如果RF-1和RF-2具有RSVF蛋白上的不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，相同同種型(γ1或γ4)的聯(lián)合會(huì)提供協(xié)同保護(hù)作用。ii.肺組織的組織學(xué)評價(jià)。通過標(biāo)準(zhǔn)的組織病理學(xué)和免疫組化技術(shù)評價(jià)被動(dòng)療法對肺部炎癥的療效，初次或再次感染后的小鼠中的細(xì)支氣管周圍的浸潤和肺泡的浸潤都已被描述，Connersetal.，J.Virology，(1992)，66，7444-7451。如上所述用單克隆抗體處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，未被感染的未經(jīng)處理的對照小鼠被用作對比物以評價(jià)組織學(xué)效果。在感染后第5和8天，摘下肺，并在恒定的填充壓(30cmH2O)下用福爾馬林使肺充氣30分鐘，切片并用蘇木精-伊紅染色后，使用標(biāo)準(zhǔn)化的評分系統(tǒng)測定細(xì)支氣管周圍和肺泡區(qū)炎癥浸潤的程度(分別為PMN和淋巴細(xì)胞)。由于期望γ1和γ4單克隆抗體可以有區(qū)別地結(jié)合和激活補(bǔ)體，使用商購的兔抗-小鼠C3抗體(VironSystems，Inc.Bethesda，MD)和與過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗-兔IgG染色肺切片以顯示炎癥區(qū)域小鼠C3的沉積。除了評價(jià)在被固定的肺組織中看到的組織學(xué)變化以外，通過評價(jià)肺泡細(xì)胞學(xué)評價(jià)了肺部的炎癥。處死按上述處理的多組小鼠，通過將3mlPBS重復(fù)地灌進(jìn)下呼吸道以進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)，進(jìn)行BAL細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過染色細(xì)胞離心制品鑒定細(xì)胞類型。iii.抗體療法對抗感染的自然免疫應(yīng)答的影響。在棉田鼠和夜猴模型中，盡管動(dòng)物通過再次攻擊已被完全保護(hù)，用多克隆的IgG制品抗RSV感染的被動(dòng)療法消除了隨后對病毒的自然抗體反應(yīng)(Hemmingetal.，J.InfectiousDiseases(1985)，152，1083-1086；Princeetal.，VirusResearch(1985)，3，193-206)。與之形成對照的是，Graham發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理的小鼠的抗體反應(yīng)減弱，而且所述小鼠對病毒的再次攻擊敏感(Grahametal.，Ped.Research(1993)，34，167-172)。為了使用人單克隆抗體評價(jià)這種可能性，如上所述用RSVLong毒株感染小鼠，并在第4天用保護(hù)性劑量的抗體處理小鼠，對照包括被感染的未經(jīng)處理的動(dòng)物和未被感染的經(jīng)處理動(dòng)物。隔周(共8周)然后第4周(共8周)給小鼠抽血以檢測抗體，通過ELISA測定抗RSVF和G蛋白的人單克隆抗體和小鼠抗體，另外，測定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清中和滴度，從ELISA結(jié)果和未被感染的經(jīng)抗體處理之對照的中和活性結(jié)果中可推斷出殘留的人單克隆抗體和活躍產(chǎn)生的小鼠抗體對中和作用的貢獻(xiàn)。當(dāng)通過ELISA檢測不到人單克隆抗體時(shí)，用相同的RSV毒株再次攻擊動(dòng)物，4天后處死動(dòng)物，測定肺和鼻組織中病毒的滴度并與對照組相比。為了評價(jià)單克隆抗體療法對細(xì)胞毒T-細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)的影響，進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)，但感染6周后處死小鼠，并用活RSV刺激脾細(xì)胞培養(yǎng)物5天(Walsh，E.E.，J.InfectiousDiseases(1994)，170，345-350)。通過使用持續(xù)被感染的Balb/c成纖維細(xì)胞細(xì)胞系(BCH4細(xì)胞)的標(biāo)準(zhǔn)鉻51釋放試驗(yàn)評價(jià)CTL活性并與未被感染的Balb/c成纖維細(xì)胞細(xì)胞系比較。主要根據(jù)確定的RSV感染被動(dòng)療法的有效劑量研究，再測定哪種抗體，RF-1或RF-2能最有效地預(yù)防或治療RSV感染。在γ1或γ4(PE)形式之間的選擇考慮到肺組織學(xué)研究，尤其是補(bǔ)體的征集是否能被Clq結(jié)合抗體顯著增強(qiáng)，盡管隨后被增強(qiáng)的血管形成可能會(huì)增強(qiáng)病毒-抗體對抗補(bǔ)體的大規(guī)模激活作用潛在地具有不利的作用。c.在猴模型中檢測性能對于選定抗體的決定性試驗(yàn)在靈長類動(dòng)物模型中進(jìn)行，我們選擇了非洲綠猴(Cercopithecusaethiops)，因?yàn)樗芨叨热萑蘎SV，感染可導(dǎo)致增強(qiáng)的肺病理學(xué)和可測的損傷(Kakuketal.，J.InfectiousDiseases(1993)，167，553-561)非洲綠猴也易于使用并且沒有增加危險(xiǎn)性。這種猴重量為5-10kg。最高希望的抗體最大劑量是20mg/kg，每只10kg的含20mg/kg抗體的3只動(dòng)物等于600mg抗體，一些野生的非洲綠猴對RSV有自然的免疫力，之所以需要將猴納入我們的研究之中，是因?yàn)樗鼈儗SV為血清陰性。根據(jù)在小鼠模型中建立的基準(zhǔn)，有效劑量/kg和治療前的感染時(shí)間，進(jìn)行有限系列的試驗(yàn)以確立減少病毒的有效劑量，以及進(jìn)一步證實(shí)所述劑量是否與肺病理學(xué)的預(yù)防，尤其是薄壁組織炎癥的卷入有關(guān)，僅檢測了一個(gè)病毒株，Long(A亞型)，起初檢測了25，5，1和1/25倍的參照劑量，分析了兩個(gè)對照組，一個(gè)接受了病毒但未接受抗體，另一個(gè)接受了病毒和最大劑量的同種型匹配的對照抗體，實(shí)質(zhì)上如上所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，也通過鼻內(nèi)滴注106PFU病毒感染3組猴，用病毒感染猴6-7天后，處死猴，如上所述取出肺和咽樣品以檢測病毒和進(jìn)行組織學(xué)研究。實(shí)質(zhì)上如上所述進(jìn)行組織學(xué)研究，簡而言之，在恒定的填充壓下用10％中性緩沖的福爾馬林灌注肺，將肺置于福爾馬林中至少一周，切片并用蘇木精-伊紅染色后，根據(jù)Kakuketal.，J.InfectiousDiseases(1993)，167，553-561評價(jià)載玻片的組織病理學(xué)，在ELISA和感染中和試驗(yàn)中取血清樣品以測定抗RSV人抗體的滴度。實(shí)施例101.通過人組織切片的體外試驗(yàn)證實(shí)組織特異性通過在兩個(gè)不同個(gè)體的不同冷凍正常組織切片上的免疫組織學(xué)研究進(jìn)一步檢測抗體對正常組織的潛在的交叉反應(yīng)性，簡單地說，使冷凍組織的低溫控制切片機(jī)切片經(jīng)受3個(gè)試驗(yàn)結(jié)合分析，硝化分析和特異性/分布分析，加入于含1％BSA的PBS中的純化的經(jīng)生物素標(biāo)記的抗-RSVF-蛋白抗體，于200℃下在潮濕的小容中將載玻片保溫30分鐘，然后用含1％BSA的PBS洗滌載玻片，再將載玻片與含1％BSA的PBS中的親和素-HRP保溫30分鐘，HRP可與3，3二氨基聯(lián)苯胺-四氫氯化物反應(yīng)，通過HRP氧化作用的介導(dǎo)形成不溶性的沉淀染料，這就可以鑒定本發(fā)明的人單克隆抗體的任何潛在的交叉反應(yīng)。ImpathLaboratories，N.Y.，N.Y.可進(jìn)行此試驗(yàn)，此試驗(yàn)已獲FDA批準(zhǔn)I.N.D.提交人療法指定的產(chǎn)物，此組織學(xué)方法使用了預(yù)先已存在的組織，并比可代替的用放射性標(biāo)記的抗體對被RSV感染的猴的擊靶研究更便宜。權(quán)利要求1.人單克隆抗體，所述抗體與RSV融合蛋白特異性地結(jié)合，并且對RSVF-蛋白的親和性≤2×10-9M。2.權(quán)利要求1的人單克隆抗體，所述抗體可在體外中和RSV。3.人單克隆抗體，所述抗體與RSV融合蛋白特異性地結(jié)合，并選自由RF-1，RF-2和含有RF-1或RF-2可變重鏈和輕鏈區(qū)的重組人單克隆抗體組成的組中。4.權(quán)利要求3的人單克隆抗體，其中所述抗體是RF-1。5.權(quán)利要求3的人單克隆抗體，其中所述抗體是RF-2。6.權(quán)利要求3的人抗體，其中所說抗體是含有人γ1、人γ4或人γ4PE恒定區(qū)的重組抗體。7.被編碼RF-1或RF-2重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA序列轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞。8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是CHO細(xì)胞。9.權(quán)利要求7的真核細(xì)胞，其中所述DNA序列選自圖7a、7b、8a、8b、9a、9b、10a或10b中的任一個(gè)所列的DNA序列。10.Epstein-Barr無限增殖化B細(xì)胞系，所述細(xì)胞系可分泌人單克隆抗體，所述抗體對RSV融合蛋白的親和性≤2×10-9M。11.權(quán)利要求10的細(xì)胞系，其中所述抗體在體外中和RSV。12.權(quán)利要求10的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系選自RF-1和RF-2。13.生產(chǎn)特異于RSV融合(F)蛋白的人抗體的方法，所述方法包括(i)在IL-2存在下體外致敏人脾細(xì)胞；(ii)將所述經(jīng)致敏的人脾細(xì)胞轉(zhuǎn)移至SCID小鼠；(iii)用RSVF-蛋白加強(qiáng)免疫所述SCID小鼠；(iv)從所述SCID小鼠中分離可分泌特異于RSVF-蛋白的人單克隆抗體的人B細(xì)胞。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述經(jīng)分離的人B細(xì)胞被無限增殖化。15.權(quán)利要求14的方法，其中使用Epstein-Barr病毒(EBV)實(shí)現(xiàn)無限增殖化。16.權(quán)利要求15的方法，其中使用小鼠胸腺瘤細(xì)胞系EL-4B5作為飼養(yǎng)層克隆所述的EBV無限增殖化細(xì)胞。17.權(quán)利要求13的方法，其中在IL-4或IL-6的存在下實(shí)現(xiàn)致敏步驟。18.編碼RF-1或RF-2可變重鏈和/或可變輕鏈區(qū)的DAN序列。19.可表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求18之DNA序列的表達(dá)載體。20.權(quán)利要求18的DNA序列，所述DNA序列選自圖7a、7b、8a、8b、9a、9b、10a或10b所列DNA序列。21.在易感的或已感染RSV的人群中預(yù)防或治療RSV感染的方法，所述方法包括施用預(yù)防或治療有效量的一種或多種人單克隆抗體，所述抗體對RSVF-蛋白的親和性≤2×10-9M，并可在體外中和RSV。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述抗體選自RF-1、RF-2和含有RF-1或RF-2的可變重鏈和輕鏈區(qū)的重組人單克隆抗體。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述抗體通過注射或煙霧化的形式被施用。24.權(quán)利要求21的方法，其中所述抗體與佐劑聯(lián)合施用。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述佐劑是完全弗氏佐劑(CFA)、明礬或它們的聯(lián)合。26.適于預(yù)防或治療易感或已感染RSV的人群中的RSV感染的藥物組合物，所述藥物組合物包括預(yù)防或治療有效量的人單克隆抗體和藥用可接受的載體，所述抗體可在體外中和RSV，對RSVF-蛋白的親和性≤2×10-9M。27.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述人單克隆抗體選自RF-1、RF-2和含RF-1或RF-2可變重鏈和輕鏈區(qū)的重組人單克隆抗體。28.檢測分析物中RSV的存在的方法，所述方法包括在可形成RSVF-蛋白抗體免疫復(fù)合物的條件下，將所述分析物與人單克隆抗體一起保溫，所述單克隆抗體對RSVF-蛋白的親和性≤2×10-9M；檢測所述RSVF-蛋白抗體免疫復(fù)合物的存在以確定分析物中是否有RSV存在。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗體是RF-1或RF-2。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述抗體直接或間接與報(bào)道分子結(jié)合。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述報(bào)道分子是可檢測的酶或放射性核素。32.權(quán)利要求28的方法，其中分析物含有得自呼吸組織的液體。33.檢測分析物中RSV的存在的檢測試劑盒，其中包括(i)對RSVF-蛋白的親和性≤2×10-9M的人單克隆抗體；(ii)直接或間接與所述人單克隆抗體結(jié)合的報(bào)道分子。34.權(quán)利要求33的檢測試劑盒，其中所述人單克隆抗體是RF-1或RF-2。全文摘要本發(fā)明提供了生產(chǎn)人抗體,尤其是特異于RSV融合蛋白之人抗體的高效方法,所述方法包括在SCID小鼠中體外致敏人脾細(xì)胞,并且用抗原加強(qiáng)免疫。此方法可產(chǎn)生以IgG同種型占優(yōu)勢的很高的人抗體滴度,所述抗體對所需抗原有高特異性和親和性。此方法很適于產(chǎn)生能用于治療和診斷以及用于拯救人細(xì)胞以產(chǎn)生組合人抗體基因文庫的人單克隆抗體。本發(fā)明提高了兩個(gè)人單克隆抗體,RF－1和RF－2以及它們相應(yīng)的氨基酸和DNA序列,RF－1和RF－2對RSVF－蛋白的親和性各≤2×10文檔編號C12N5/10GK1192695SQ96196163公開日1998年9月9日申請日期1996年6月6日優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日發(fā)明者P·布拉姆斯,S·S·沙馬特,L·Z·潘,E·E·沃爾什,C·J·赫德,R·A·紐曼申請人:艾德藥品公司