專利名稱：在可食用生物中表達海洋魚類的抗凍肽以及其在食品生產中的應用的制作方法
1.前言由于存在抗凍肽而使極地魚類的血液不會凍結。根據(jù)其結構可以將這些抗凍肽分成4種類型(Davies and Hew，1990)。I型AFP含豐富的丙氨酸和有規(guī)則間隔的蘇氨酸和天冬酰胺并具有α螺旋構型。II型AFP含有高含量的半胱氨酸(8％)。III型AFP是小(約64個氨基酸長)的球形肽。最后一種，抗凍糖蛋白含有與特定二糖相連的重復三肽基元。所有這些肽都有非依數(shù)性的冰點降低并抑制冰晶生長的特性。這些特征可在改變冷凍產品的冰晶狀態(tài)方面有用。由于從魚類血液中純化這些肽沒有經濟上可行的方法，因此用現(xiàn)代生物技術尋找可大量生產AFP的方法。
早期在微生物中生產抗凍肽的工作集中于在酵母和大腸桿菌中表達I型AFP(Warren等，1993，McKown等，1991)。由于大腸桿菌能夠生產毒素，因此通常認為這種細菌不安全(GRAS)，這就使將這種細菌用于生產AFP出現(xiàn)了問題，因為所生產的AFP將最終應用于食品工業(yè)。
已知象啤酒糖酵母這樣的酵母菌株也是GRAS生物，但與大腸桿菌不同，它們能夠將異源蛋白質分泌到培養(yǎng)基中，這樣有利于產物的下游加工。因此酵母對于生產各種異源蛋白質來說是非常有吸引力的(Romanos等，1992)。
用酵母生產AFP的第一個報道涉及到合成的I型AFP與截短金黃色葡萄球菌蛋白質A之融合產物的細胞內積累(Warren等，1993)。認為這種肽可以保護酵母抵御冷凍的不利影響。未描述I型AFP的細胞外生產。也未提到其他類型的AFP。
在該實驗室，已經構建了攜帶表達載體的酵母轉化體，所述載體含有天然美洲擬鰈I型AFP的合成基因(HPLC)(Driedonks等，1995)，這些描述于申請人現(xiàn)在已放棄的PCT申請WO 94/03617中。未說明由這些酵母分泌活性單體AFP。得到明顯的冰再結晶抑制活性的唯一方法是表達預期的I型AFP多聚體以便隨后由內源酵母蛋白酶產生有活性的單體(Driedonks等，1995)。盡管最終目的是生產有活性的I型AFP，但這種方法會分泌出部分加工過的多聚體AFP的異源形式。認為隨后為得到作為單體的活性肽的處理方法對于工業(yè)生產來說是不可接受的。除額外的努力和花費外，是否會獲得許可應用于食品也是個問題。這首先是由于為得到活性單體而使用了化學物質，其次表達的不是天然序列。
因此似乎不可能用食用生物以一種簡單而有效的方式來表達并分泌活性單體AFP，所述方式可提供可用于食品生產的工業(yè)化方法。
在努力克服在酵母中表達I型AFP所遇到的問題時，我們試圖在酵母中表達來自美洲大綿鳚的III型AFP。III型AFP是小的球形蛋白質，由于這一原因，我們認為它們比α螺旋的I型AFP更適合在酵母中表達。
在極地魚類如美洲大綿鳚(Maerozoarces americanus)和狼魚的血液中發(fā)現(xiàn)了III型AFP(Davies and Hew，1990)。分離美洲大綿鳚的血液發(fā)現(xiàn)存在至少12種不同的III型AFP(

圖1，Hew等，1984，Davies andHew，1990)。這些肽是高度同源的，有至少60％的氨基酸一致性，而且體外誘變表明一種表面殘基群為所有美洲大綿鳚AFP變體所共有，這對于與冰結合是必需的(Chao等，1994)。23位和36位帶負電荷的谷氨酸(Glu)可能與熱穩(wěn)定性和熱滯后活性有關(Li等，1991)。14位、的天冬酰胺(Asn)、18位的蘇氨酸(Thr)和44位的谷氨酰胺(Gln)(另3個保守氨基酸)也可能是AFP-III之冰結合活性中的關鍵殘基(Chao等，1994)。
我們努力在酵母中表達美洲大綿鳚III型AFP的HPLC-1變體，但無法分泌足夠的III型AFP活性單體。這顯然不能解決上述問題。
此外，我們發(fā)現(xiàn)當與從美洲大綿鳚血液中分離的AFP制品相比時，由酵母生產的III型AFP HPLC-1有意想不到的低比活性。這樣的低活性可能是由于所述肽的不正確折疊或是由于HPLC-1變體本身就有較低的比活性。這當然沒有希望繼續(xù)這樣的研究來生產比美洲擬鰈中的有更高活性的AFP。
我們還將來自美洲大綿鳚血液的AFP分離成不同的HPLC級分并分析其再結晶活性以便確定除HPLC-1外的哪個級分可用于我們所希望的應用。HPLC12似乎是12個AFP III型級分中，以所試驗濃度在再結晶抑制中唯一有活性的級分。如果我們可設法克服其已出現(xiàn)在AFP I型和AFP III型之HPLC-1的重組生產中的問題，因此確定HPLC1-12是所需的。
在上述用I型AFP和III型AFP的試驗中，非常意想不到的是，我們隨后發(fā)現(xiàn)表達編碼III型AFP氨基酸序列的核酸會得到一種產物，所述產物以單體的形式被表達和分泌，而且沒有降低的活性。因此可以得到用重組DNA技術生產純活性AFP的非常適宜的生產方法。
此外所發(fā)現(xiàn)的事實是由酵母作為單體分泌的重組HPLC-12具有從美洲大綿鳚血液分離的AFP混合物的高抗凍肽活性。這種抗凍肽活性幾乎是美洲擬鰈I型AFP的兩倍。此外，該產物在再結晶試驗中更有活性，因此比其它AFP更適合于所需的應用。
已知各種天然III型AFP的氨基酸組成、序列和核酸序列。Davies和Hew(1990)給出了綜述并提供了Li等從1985和Hew等從1988的文章，所述文章是關于以噬菌體中魚基因組DNA的cDNA克隆為基礎，確定美洲大綿鳚的HPLC-1，4，5-7，9，11和12的序列。在1994年的蛋白質科學雜志中，Chao等描述了如何在大腸桿菌中合成并表達III型AFPHPLC-12的同種型以進行二維NMR研究，從而有助于理解抗凍肽的結構/功能關系并確定冰結合所需的基元。隨后突變核酸以產生突變III型AFP多肽，所述突變體是脯氨酸突變體。將未突變的重組HPLC-12的熱滯后值與從美洲大綿鳚中分離的AFP，即III型AFP進行比較。在標準誤差的范圍內，活性圖譜是不可區(qū)分的。沒有提高與其它AFP類型進行了比較。沒有給出不正常的高熱滯后值，事實上未給出一個值。未提到對再結晶特性有任何影響。因此我們指出熱滯后活性與再結晶特性無關。熱滯后值是結合強度的指標，但未給出類似再結晶試驗那樣的有關抗凍肽活性的測量方法。實施例是已知蛋白質有高滯后值的實施例，但對再結晶沒有影響，反過來說明沒有關系。
就重組HPLC-1所得到的結果和已經公開的有關AFP的文獻看，重組HPLC-12的高AFP活性是意想不到的。在Hew等(1984)文章的表1中給出了通過Sephadex柱分離得自美洲大綿鳚III型AFP而得到的III型AFP級分的熱滯后值，以及小鰈AFP(＝I型)和美洲絨杜父魚AFP(-II型)的值。這些值是從來自相關種的血液級分中得出的，而不是通過重組DNA技術。AFP的活性之間僅有細微的差別，而QAE-A的活性最高。QAE-A是可從QAE-Sephadex柱上分離的5種不同變體中的一種，并表明它來自HPLC-12。但是由于差異非常小，以致于落入因測量方法改變而引起的偏差內。在同一文章中，Hew等因不相關而忽略了這些熱滯后值的差異。他們認為“大部分美洲大綿鳚AFP都有可與其它已知AFGP和AFP相似的熱滯后值”。在后一篇文獻中，未提到比較了各種類型的或I型和III型之間的熱滯后值。就各種級分的再結晶影響而言，沒有任何教導或說明。因此，不能預料到任何單種III型AFP對晶體生長的抑制的比活性高于美洲擬鰈AFP的比活性。也未公開或說明HPLC-12比I型AFP肽或其它III型AFP肽有更高的活性。
為了檢測III型HPLC-12的AFP活性是否較高，我們用HPLC從血液中分級分離了美洲大綿鳚AFP制品。我們確定HPLC-12的比活性最高。其它組分在等于100mg魚III型AFP/ml的濃度檢測不到活性。
因此我們發(fā)現(xiàn)了制備純食用多肽的方法，所述多肽的AFP活性比I型AFP的幾乎高兩倍。與I型AFP相反，由于它可作為單體被分泌出來，所以很適合進行大規(guī)模生產，與經重組技術生產的I型AFP相比，所需的下游加工更少。此外，作為單體表達，指可以生產出幾乎等同于美洲大綿鳚血液中天然肽的產物。由于這種產物更接近于天然食用生物、美洲大綿鳚中的天然AFP，所以更容易獲得批準用于食品。
現(xiàn)在本發(fā)明使我們第一次可以大規(guī)模低成本更容易地生產HPLC-12型的重組III型AFP，這種AFP本身比美洲擬鰈I型AFP有更高的比活性。本發(fā)明的III型抗凍肽由于其高特異性再結晶抑制活性而使其成為最有前途的候選者，用于最終將被冷凍的食品如冰淇淋和凍面以及其它冷凍面食。
另一優(yōu)點是作為活性多肽，優(yōu)選作為單體的表達產物的分泌可在食品生產過程中的原位進行，從而無需加入AFP?，F(xiàn)在在發(fā)酵過程中可以用能夠分泌實質上相應于III型AFP HPLC-12多肽的酵母生產發(fā)酵產品，由此可以在這些產品中生產實質上相應于III型AFP HPLC-12的多肽，而無需增加步驟如所述多肽的純化以及隨后再將其在食品生產過程中加入。現(xiàn)在可以開發(fā)具有良好抗凍特性的植物、水果或蔬菜和轉基因動物或其部分，原因是在其中表達了實質上相應于III型AFPHPLC-12的多肽。2發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于制備改進的產品的方法，所述改進在于例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中，影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，所述方法包括將多肽或蛋白質加到未改進的產品或制備未改進產品時常用的成分或混合物中，所述多肽或蛋白質具有基本上相應于AFP III型HPLC12的氨基酸序列，比來自美洲擬鰈AFP I型的AFP活性高，而且以足以影響冰晶生長的量加入重組多肽或蛋白質。所述產品可以是食品或生物材料。生物材料例如可以是動物器官或組織或植物材料。具體地說，可以加入重組多肽。優(yōu)選的多肽是食用狀態(tài)的，以便得到的最終產品也是可食用的。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述產品優(yōu)選是食品。適宜多肽的具體實施方案是實施例中所說明的酵母AFP。在生產有改進冷凍特性的改進產品中，所涉及的本發(fā)明的生產方法可包括加入在新多肽生產方法中所得到的AFP，所述的新多肽生產方法也在本發(fā)明范圍內并在說明書的其他地方加以說明。
術語“具有基本上相應于AFP III型HPLC12的氨基酸序列的多肽或蛋白質”含有與分離自美洲大綿鳚的HPLC-12的氨基酸序列相同的氨基酸序列，而且還含有符合下列條件的氨基酸序列，所述氨基酸序列與已知氨基酸序列有一個或兩個氨基酸差異，但仍編碼與天然蛋白質有相同AFP活性的多肽。所述突變或差異不能是已知對于所述多肽的活性所必需的氨基酸。因此優(yōu)選不能缺失或取代脯氨酸。優(yōu)選氨基酸序列中的任何差異均是沉默突變，這樣所述取代是不改變所述多肽親水性圖譜的保守取代，因此不會嚴重影響多肽的結構和活性，即具有疏水側鏈的氨基酸優(yōu)選只用另一具有疏水側鏈的氨基酸取代，而具有親水側鏈的氨基酸優(yōu)選只用另一具有親水側鏈的氨基酸取代。HPLC-12與HPLC-1之間的氨基酸同源性小于60％。預期有60％以上，優(yōu)選70％以上，最佳80％以上的同源性的氨基酸序列是與HPLC-12有相似特性的代表性多肽，因此認為基本上相應于HPLC-12。此外，由氨基酸序列編碼的多肽至少應具有美洲擬鰈之AFP I型的AFP活性，而且優(yōu)選至少應具有天然HPLC-12的AFP活性。通過將系列稀釋度的待測定多肽與從美洲大綿鳚血液的等量和等稀釋度的AFP I型和/或天然HPLC-12通過再結晶試驗進行比較來確定AFP活性。在實施例中說明了可被完成并評估的再結晶試驗的方法?？梢哉J為表現(xiàn)出上述任何或許多特征的多肽基本上相應于HPLC-12。
用于制備改進的產品的方法，所述改進在于例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中，影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，所述方法包括將能夠表達食用重組多肽或蛋白質的宿主生物加到未改進的產品或制備未改進產品中常用的成分或混合物中，所述多肽或蛋白質具有基本上相應于AFP III型HPLC12的氨基酸序列，隨后，將所述宿主生物置于可使編碼AFP III型HPLC12的核酸序列在產品或成分或混合物中表達的條件下，在通常用于制備未改進產品的步驟中加入說明書中所公開的本發(fā)明的多肽生產方法也在本發(fā)明的范圍內。所述產品可以是食品或生物材料。生物材料例如可以是動物器官或組織或植物材料。具體地說，可以加入重組多肽。優(yōu)選的多肽是食用狀態(tài)的，以便得到的最終產品也是可食用的。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述產品優(yōu)選是食品。適宜多肽的具體實施方案是實施例中所說明的酵母AFP?？梢栽谏a過程中或之后破壞掉所述宿主生物以便將AFP多肽釋放到混合物或產品組分中或釋放到產品本身中?？梢杂帽绢I域專業(yè)人員熟知的許多方法進行所述破壞，但必須小心，使所述過程不經歷過分劇烈的條件以防止丟失所述多肽或蛋白質的AFP活性。另外，在所述生產方法中，也可以使用能夠將AFP多肽或蛋白質分泌到食品組分或混合物中的宿主生物。例如面包酵母可以是生產食品入焙烤食品的方法中的宿主生物。按照常規(guī)完成所述生產過程，唯一不同之處在于在焙烤之前或過程中，在生面團中加入了不同的酵母，即能夠表達并分泌基本上相應于III型AFP HPLC-12之多肽或蛋白質的DNA構建體，由此可以生產具有改善的冷凍特性的面團或焙烤產品。其中使用細菌如乳酸菌的類似方法構成了本發(fā)明適宜的實施方案。制備奶酪和酸奶的方法或需要發(fā)酵的生產其他產品的方法也包括在本發(fā)明方法的范圍內。
有利的是，在已經表達或分泌了具有基本上相應于AFP III型HPLC12之氨基酸序列的重組多肽或蛋白質，從而得到了作為單體產品的AFP多肽或蛋白質后，不需再加入蛋白酶或化學物質就可完成用于生產本發(fā)明改進產品的生產方法。
在上述公開的任何實施方案中，將具有基本上相應于AFP III型HPLC12之氨基酸序列的重組多肽或蛋白質作為產品添加劑用于所述產品的改進的用途，所述改進在于例如通過防止或抑制冷凍后產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中，影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，以就AFP本身已知的方式得到比美洲擬鰈AFP高的特異性抗凍活性的用途也在本發(fā)明范圍內。優(yōu)選所述產品是食品。所述產品適宜地是生物材料。所述蛋白質或多肽可以是重組蛋白質或多肽。
用于改進產品的方法或用途的優(yōu)選實施方案是其中所述產品最終是冷凍產品的方法或用途。對于食品，冰激凌是適宜的實例。如上述說明的，面團或焙烤產品也是適宜的。
在上述公開的任何實施方案中，含有將具有基本上相應于AFP III型HPLC12之氨基酸序列的重組多肽或蛋白質作為產品添加劑用于所述產品的改進的食品，所述改進在于例如通過防止或抑制冷凍后產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中，影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，所述食品也在本發(fā)明范圍內。所述食品不含有天然的可食用生物，如美洲大綿鳚，僅僅以其在美洲擬鰈中的天然形式和數(shù)量含有編碼所述多肽或蛋白質的序列，所述多肽或蛋白質相應于美洲擬鰈HPLC-12之氨基酸序列。本發(fā)明的適宜產品種類不是動物產品。另一適宜的類是人造產品。植物產品也是本發(fā)明產品的適宜實例。本發(fā)明的食品可通過上述任何實施方案中的用于改進產品的方法或用途來得到。
具體地說，含有具有改進的冷凍耐受性之食用重組宿主生物的食品，所述改進在于例如通過防止或抑制冷凍后產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中，影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，還要求了所述食用宿主生物，所述宿主生物含有上述任何公開的實施方案中基本上相應于AFP III型HPLC12之氨基酸序列的重組多肽或蛋白質和/或被所述多肽或蛋白質所包圍，和/或在冷凍前能夠表達和/或分泌所述多肽或蛋白質。
此外，所述重組食用宿主生物也在本發(fā)明范圍內。食用重組宿主生物能夠至少表達編碼AFP的核酸序列，所述核酸序列包含在DNA構建體中，所述DNA構建體是所述天然宿主生物中所不存在的，而且所述DNA構建體以下列順序含有(a)在所述宿主生物中有活性的強的、任選的可誘導啟動子，(b)ATG起始密碼子，可位于任選的DNA信號序列中，所述信號序列能夠在表達下列(c)中編碼AFP的核酸序列過程中，分泌由宿主生物生產的蛋白質，所述信號序列可以與AFP-編碼核酸序列同源或異源并與ATG起始密碼子一起在閱讀框內，(c)至少一種編碼基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12之氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列與ATG起始密碼子一起在閱讀框內，以及可選的(d)與AFP-編碼核酸序列3’末端結合的終止密碼子。
在下文有關多肽生產的方法中，描述了所述重組宿主生物的適宜實施方案并要求了這些生物。
本發(fā)明還涉及用于生產重組多肽或蛋白質的方法，所述重組多肽或蛋白質表現(xiàn)出改進的有關冰晶生長和形成的活性，所謂表現(xiàn)出比美洲擬鰈AFP的特異性抗凍活性高的重組抗凍肽(AFP)，通過1)在一定的條件下培養(yǎng)食用宿主生物，由此表達或誘導至少一種AFP-編碼核酸序列，所述核酸序列被包含在DNA構建體中，所述DNA構建體在天然宿主生物中不存在，并且所述DNA構建體以下列順序含有(a)在所述宿主生物中有活性的強的、任選的可誘導啟動子，(b)ATG密碼子，可位于可選DNA信號序列中，所述信號序列能夠在表達下列(c)中編碼AFP的核酸序列過程中，分泌由宿主生物生產的蛋白質，所述信號序列可以與AFP-編碼核酸序列同源或異源并與ATG起始密碼子一起在閱讀框內，(c)至少一種編碼基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12之氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列與ATG起始密碼子一起在閱讀框內，以及任選的(d)與AFP-編碼核酸序列3’末端結合的終止密碼子。
所述方法或者還可包含收集通過本身已知的方法進一步加工后得到的、從AFP-編碼核酸序列表達的產物。為了使核酸序列(所述核酸序列編碼基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12的氨基酸序列)的表達產物能夠分泌出來，所述DNA構建體還可含有用于宿主生物的信號序列，所述信號序列使在宿主培養(yǎng)過程中能夠進行分泌。宿主生物適宜的是微生物。適宜的食用微生物是真菌如酵母和細菌如乳酸菌。酵母細胞啤酒糖酵母、脆壁糖酵母、乳酸糖酵母是適宜酵母宿主細胞的實例。食品生產發(fā)酵領域的專業(yè)人員均已知酵母細胞是適宜的，而且轉化和表達系統(tǒng)是可以得到的(Romanos等，Campbell and Duffus)。乳酸細菌乳酸桿菌、鏈球菌和雙歧桿菌也是適宜的細菌宿主生物的實例，它們的許多菌株是已知的，其適宜的轉化和表達系統(tǒng)是現(xiàn)有的，這對于與日常生產有關的從事細菌重組DNA研究的本領域專業(yè)人員來說是已知的(Gasson，1993)。FDA有一份食用生物的名單，公眾可以得到該名單。本領域專業(yè)人員知道什么是食用GRAS(一般認為是安全的)狀態(tài)的生物。具體地說，與食品發(fā)酵和日常生產有關的生物是適宜的。
短語“編碼基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12之氨基酸序列的一種核酸序列”包含精確編碼美洲大綿鳚天然HPLC-12的氨基酸序列的任何核酸。所述核酸序列由于遺傳密碼的簡并性可能有所不同，簡并性指不同的核酸密碼子編碼相同的氨基酸。此外，本發(fā)明范圍內還包括編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列與已知氨基酸序列有一個或兩個氨基酸的不同，但仍編碼與天然蛋白質有相同AFP活性的多肽。突變或差異不能存在于對于所述多肽活性所必需的氨基酸中。因此，優(yōu)選不能缺失或取代脯氨酸殘基。優(yōu)選氨基酸序列中的任何差異均是沉默突變，這樣所述取代是不改變所述多肽親水性圖譜的保守取代，因此不會嚴重影響多肽的結構和活性，即具有疏水側鏈的氨基酸優(yōu)選只用另一具有疏水側鏈的氨基酸取代，而具有親水側鏈的氨基酸優(yōu)選只用另一具有親水側鏈的氨基酸取代。HPLC-12與HPLC-1之間的氨基酸同源性小于60％。預期有60％以上，優(yōu)選70％以上，最佳80％以上的同源性的氨基酸序列是與HPLC-12有相似特性的代表性多肽，因此認為基本上相應于HPLC-12。因此，詞組“基本上相應于”包括編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列與天然HPLC-12的氨基酸序列有60％以上的同源性。此外，由氨基酸序列編碼的多肽應至少具有美洲擬鰈AFPI型的活性并優(yōu)選至少具有天然HPLC-12的AFP活性。通過將系列稀釋度的待定多肽與從美洲大綿鳚血液中得到的AFP I型和/或天然HPLC-12(兩者與待定多肽的稀釋度相同)用再結晶試驗進行比較，即比較多肽或蛋白質的相同w/v來確定AFP活性。在實施例中說明了完成所述再結晶試驗的方法并進行評估。可將表現(xiàn)出任何或多種上述特征的多肽認為基本上相應于HPLC-12。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，DNA構建體和宿主生物的培養(yǎng)條件要使所述宿主分泌出單體多肽，所述單體多肽應具有基本上相應于AFPIII型蛋白質HPLC12的氨基酸序列。因此DNA構建體優(yōu)選不表達基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12之氨基酸序列的串聯(lián)二聚體或多聚體。二聚體或多聚體的生產還需要其他的下游加工步驟，或抑制活性多肽的分泌。因此，優(yōu)選DNA構建使含有單體形式的編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12的氨基酸序列。當然，DNA構建體可以以單體形式，串聯(lián)含有多拷貝的編碼氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12的氨基酸序列。
本發(fā)明其他優(yōu)選的實施方案包含DNA構建體，其中編碼基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12之氨基酸序列的核酸序列含有對于所述方法的宿主生物優(yōu)選的密碼子。從在特定的宿主生物中，避免特定的密碼子，從而提高翻譯效率的角度看，這樣做是優(yōu)選的。優(yōu)選密碼子的使用在原核、酵母和植物中與在美洲擬鰈中的有所不同。例如，GCA、GCG和GCT共占大腸桿菌、啤酒酵母和Z.mays已知基因丙氨酸密碼子的65％以上，而它們只占魚如美洲擬鰈丙氨酸密碼子的25％以下。同樣，這種情況也出現(xiàn)在蘇氨酸密碼子ACA、ACG和ACT上(PCT/US90/02626)。乳酸細菌和酵母優(yōu)選的密碼子使用可從這些微生物的具體文獻中得到。用這些特定的表達生物完成重組DNA技術的本領域專業(yè)人員可以知道哪個密碼子是優(yōu)選的。
當宿主生物是酵母時，DNA構建體的優(yōu)選實施方案將含有啤酒酵母的α交配因子的DNA前序列作為信號。在另一實施方案中，還在原序列和AFP-編碼核酸序列之間含有α交配因子的DNA原序列，這樣前序列、原序列和AFP-編碼核酸序列在相同的閱讀框中。另外，當宿主生物是酵母時，DNA構建體的優(yōu)選實施方案在編碼AFP的核酸序列前，含有啤酒酵母的轉化酶信號序列。
當宿主生物是酵母時，DNA構建體的優(yōu)選實施方案含有啤酒酵母的可誘導GAL7啟動子或組成性GAPDH啟動子。對于其他宿主生物，DNA構建體中所含的適宜啟動子是熟知的。
引述下列參考文獻，提供可能的轉化系統(tǒng)或其元件對于酵母Campbell和Duffus，對于植物PCT/US90/02626和van den Elzen等(1985)，對于動物Hannhan(1988)。
在本發(fā)明之前，尚未生產出基本上分離和純化的、基本上等同于III型AFP HPLC-12的，表現(xiàn)出高AFP活性的食用重組多肽或蛋白質。這是第一次生產出基本上分離和純化的、基本上等同于III型AFPHPLC-12的，表現(xiàn)出比美洲擬鰈的AFP活性高的食用重組多肽或蛋白質。本發(fā)明包括基本上純的分離的重組食用多肽或蛋白質，所述多肽或蛋白質有改變冰晶生長過程的改善的特性，例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中，所述冰晶生長過程影響冰的大小和形狀，從而使可能的冷凍損傷達到最小，所謂抗凍肽(AFP)比等量美洲擬鰈AFP I型的AFP活性高，所述多肽或蛋白質具有基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12的氨基酸序列。所述重組多肽，特別是具有上述改善活性如冰晶生長抑制活性的多肽或蛋白質，用本發(fā)明的任何前述實施方案的方法制備的所謂重組抗凍肽(AFP)也在本發(fā)明范圍內，所述抗凍肽具有比美洲擬鰈AFP高的特異性抗凍活性。2.材料和方法2.1菌株和生長條件將大腸桿菌菌株JM109(endA1、recA1，syrA96、thi、hsdR17、rk-、mk+、relA1、supE44，Yanisch-Perron等，1985)用于質粒擴增。將啤酒酵母菌株SU50(MATa、cir°、leu2、his4、can1；Verbakel，1991)用于多拷貝整合質粒的轉化。在含100μg氨芐青霉素/ml(Sambrook等，1989)的Luria瓊脂平板上篩選大腸桿菌轉化體。將酵母菌株保持在用必需氨基酸(組氨酸20μg/ml，尿嘧啶20μg/ml)補充的選擇性YNB平板(0.67％不含氨基酸的Difo酵母氮基，2％葡萄糖，2％瓊脂)上。將相同的液體培養(yǎng)基用于預培養(yǎng)，30℃生長48小時，用含5％用于誘導GAL7啟動子的半乳糖的YP培養(yǎng)基(1％Difco酵母提取物，2％Difco胨)以1∶10稀釋。質粒在表1中給出了含AFP-III質粒的詳細描述。轉化按照Chung等(1989)所述轉化JM109。主要根據(jù)Becker等(1991)所述，通過電穿孔轉化酵母菌株。在選擇性YNB平板上回收轉化體。本領域專業(yè)人員可以知道各種轉化方法均是可行的?？梢愿鶕?jù)待轉化的生物加以改變，而且在各種手冊如Sambrook等(1989)和Campbell andDuffus(1988)中有描述。分子生物學方法按照供應商的說使用限制酶和DNA修飾酶。
在Applied Biosystems 380A DNA合成儀上合成寡核苷酸并用標準方法純化。純化AFP-III從在紐芬蘭沿岸水域捕撈的魚血液中純化來自美洲大綿鳚，Macrozoarces americanus的AFP III。按Hew等(1984)所述，通過離心凝結的魚血清來制備AFP III樣品。陽離子交換色譜在SMART系統(tǒng)(Pharmacia Biotech)的Mono S柱(HR5/5，Pharmacia Biotech)上進行陽離子交換色譜。樣品緩沖液是10 mM磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉(Merck)pH 6.0，用0-0.5M NaCl(Merck)線性梯度進行洗脫，流速為100μl/分。用μ峰監(jiān)測儀(Pharmacia Biotech)在214和280nm檢測肽。監(jiān)測在214nm的信號，用集成SMART系統(tǒng)收集器收集級分，系統(tǒng)溫度為15℃。反相高效液相色譜在SMART系統(tǒng)(Pharmacia Biotech)的μRPC C4/C18 SC2.1/10柱(Pharmacia Biotech)上完成反相高效液相色譜。用在Milli Q水中的0.6％三氟乙酸(溶劑A)(TFA，Merck)將樣品上到柱上，用80％乙腈(Merck)、在MilliQ水中的0.54％TFA(溶劑B)洗脫。所用的標準梯度程序如下0分鐘，100％溶劑A；5分鐘，100％溶劑A；10分鐘，65％溶劑A；50分鐘，40％溶劑A；55分鐘，0％溶劑A；57.5分鐘，0％溶劑A，58分鐘，100％溶劑A，流速為100μl/分鐘。用μPeak Monitor(Pharmacia Biotech)在214、256和280nm檢測肽。監(jiān)測在214nm的信號，用集成SMART系統(tǒng)收集器收集級分，系統(tǒng)溫度為20℃。
通過下列修改的梯度分離AFP-III同種型1，2和30分鐘100％溶劑A；10分鐘，60％溶劑A；35分鐘，55％溶劑A；36分鐘，45％溶劑A；45分鐘，45％溶劑A；46分鐘，0％溶劑A；50分鐘，0％溶劑A；50.1分鐘，100％溶劑A和60分鐘100％溶劑A。緩沖液和所有關SMART系統(tǒng)的詳細描述均與標準梯度的相同。十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳按照供應商的方法，在Xcell電泳槽(Novex)上跑16％的聚丙烯酰胺Tricine凝膠(Novex)。樣品緩沖液來自Novex，由3.0ml TRIS-HCl 3.0M，2.4ml甘油，0.8g SDS，1.5ml 0.1％考馬斯蘭G，0.5ml 0.1％酚紅和5％-β巰基乙醇組成，用蒸餾水將終體積調到10ml(pH8.45)。展開緩沖液也來自Novex，并在總體積為1升的蒸餾水中含有12.1gTRIS，17.9g Tricine和1g SDS，pH約8.3。用溶解在40％乙醇(Merek)、10％乙酸(Merck)和50％蒸餾水溶液中的10％考馬斯蘭R250(Bio-Rad)染色，將該溶液在微波爐中加熱45秒，然后，將凝膠在旋轉振蕩器上染色15分鐘。用10％乙醇(Merck)、7.5％乙酸(Merck)和82.5％蒸餾水溶液將凝膠脫色。在確定分子量的情況下，用MARK 12預染的標記(Novex)。Western印跡按照供應商的方法，用轉印跡轉移介質(Bio-Rad)，將Novex Tricine凝膠印跡到Western轉移印跡模具(Novex)中。印跡后，用在150mMNaCl，50mM Tris/HCl pH7.4中的5％脫脂奶粉封閉膜，此后保溫于150mM NaCl，50mM Tris/HCl、吐溫20pH7.4中的1％脫脂奶和抗美洲大綿鳚抗凍肽的單克隆抗血清中。得到兩種不同的抗體(M.M.Gani，Unilever Research，Colworth House Laboratory的禮物)，一種用于確定S組，另一種用于確定Q組。在溫和的攪拌下，室溫保溫過夜。通過用保溫緩沖液洗滌(3×5分鐘)來除去未吸附的抗體。在室溫將膜與二級抗體(山羊抗小鼠IgG(H+L)，堿性磷酸酶結合物；BioRad，Richmond)保溫2小時。用BCIP/NBT(BioRad)將酶顯色。胰蛋白酶消化為了進行胰蛋白酶消化，將樣品溶解在0.1M NH4HCO3緩沖液pH8.3中。以酶∶底物1∶100的比率加入胰蛋白酶(TPCK處理的，Worthington，Millipore Corporation)。30分鐘后，檢測pH，再次加入相同量的胰蛋白酶。37℃保溫過夜。通過加入TFA使pH值達到2，從而停止消化。在SMART系統(tǒng)(Pharmacia)的RP-HPLC上分離肽。N末端氨基酸序列分析按照供應商的方法在LF 3000蛋白質測序儀(Beckman)上完成N末端氨基酸序列分析。在自動RP-HPLC系統(tǒng)、Gold系統(tǒng)(Beckman)上分析氨基酸的PTH衍生物。通過氨基酸分析確定蛋白質在真空110℃，在含1％酚的6M HCl中將AFP-III樣品水解24小時然后干燥。用供應商的方法，在α+系列2氨基酸分析儀(PharmaciaBiotech)上進行分析。再結晶試驗將待測AFP-III活性的樣品與蔗糖粉末混合得到30％(體積)的蔗糖溶液。將該溶液的一部分放在顯微鏡載玻片上，用蓋玻片覆蓋以防止蒸發(fā)，然后放在Linkam THMS冷載物臺上，用Linkam CS 196冷卻系統(tǒng)連接，并用Linkam TMS 91控制儀控制。將該溶液驟冷到-40℃(δ99℃/分)，隨后加熱到-6℃。在于-6℃培養(yǎng)的30分鐘過程中，顯微鏡檢查冰晶生長。
為了檢測HPLC純化的肽，將來自RP-HPLC柱的含純化AFP-III同種型的樣品在用Milli Q水進行了一次再水合步驟后，用Speed VacConcentrator(Savant)干燥兩次。第二個干燥步驟后，將樣品溶解在100μl Milli Q水中，然后檢測pH，以確保除去來自RP-HPLC緩沖液的所有TFA。將樣品稀釋到在λ＝214nm的吸收值為0.700，這相當于約0.1μg/ml的魚AFP-III溶液。為了確保樣品含等量的AFP-III，用氨基酸分析對其進行檢測。若使用純化的樣品AFP-III同種型時，用N末端氨基酸序列分析檢測其純度。補料分批發(fā)酵接種方法將適宜轉化體的培養(yǎng)物生長在25ml基本培養(yǎng)基中，在30℃和300rpm過夜培養(yǎng)。隨后將培養(yǎng)物轉移到含500mlYP(含2％葡萄糖)的1000ml振蕩燒瓶中，然后在30℃和300rpm過夜培養(yǎng)。用該培養(yǎng)物作為補料分批試驗的接種物。
使用下列分批培養(yǎng)基110g葡萄糖.1H2O，用去礦物質水制成500g。25g Trusoy，50g酵母提取物(Ohly)，10.5g磷酸氫二鉀，5ml1000XEgli維生素溶液，50ml 100XEgli痕量金屬(Egli，1980)，0.25g L-組氨酸.HCl(Sigma)，3g硫酸鎂，2g消泡劑，用去礦物質水制成4500g。將葡萄糖溶液加熱滅菌，再將維生素溶液分別過濾滅菌。在發(fā)酵罐中，將所有其他組分均加熱滅菌。將溫度調到30℃，pH調到5.0。接種發(fā)酵罐，以2 l/分的空氣流速，600rpm的攪拌速度培養(yǎng)細胞。18小時后，開始補料期。
使用下列補料培養(yǎng)基1100g葡萄糖.1H2O，用去礦物質水制成1750g。62.5g酵母提取物(Ohly)，30g磷酸氫二鉀，5ml 1000XEgli維生素溶液，50ml 100XEgli痕量金屬(Egli，1980)，6.25g L-組氨酸.HCl(Sigma)，6.25g7水硫酸鎂，2g消泡劑，用去礦物質水制成850g。
以Keulers(1993)描述的軟件工具為基礎，將補料泵調到1.05的恒定RQ值(生產的二氧化碳摩爾數(shù)和消耗的氧氣摩爾數(shù)之比)。37小時后收集培養(yǎng)物。實施例1 構建編碼III型AFP的合成基因按如下構建編碼HPLC I抗凍肽的核苷酸序列，該序列對于在啤酒酵母中表達是最佳的合成一組12個寡核苷酸(invafp1、invafp2、invafp3、invafp4、invafp5、invafp6、invafp7、invafp8、invafp9、invafp10、invafp11和invafp12)，主要含有成熟AFP的DNA序列，該序列優(yōu)先使用啤酒酵母密碼子。設計合成的基因，以使其含有與產生粘性末端的PstI和HindIII相容的5’單鏈區(qū)(圖2)。
為了組裝合成的AFP基因，將各50pmol的寡核苷酸溶解在12μl水中，95℃保溫2分鐘，然后直接放在冰上。該變性步驟后，37℃，在含2.5mM ATP，5mM DTT和約10U多核苷酸激酶的20μl終體積中將所述寡核苷酸磷酸化40分鐘，然后在95℃變性2分鐘，接著置于冰上。將各10μl的磷酸化寡核苷酸與其大部分互補的DNA寡核苷酸混合以形成雙螺旋。95℃保溫2分鐘變性后，將各雙螺旋緩慢冷卻到30℃。再合并所有6個10μl的雙螺旋混合物，然后20℃在含50mMTris/HCl，pH7.5，8mM MgCl2，8mM DTT和40μg/ml明膠和10UDNA連接酶的100μl終體積中保溫2小時。然后沉淀連接混合物，并再溶解在30μl的TE緩沖液中。將15μl混合物放在2％瓊脂糖凝膠上，從凝膠上切下預期大小(約224個堿基對)的DNA帶，最后按照供應商的說明，用Gene Clean II方法純化。
然后將得到的DNA片段連接到PstI/HindIII線性化載體pTZ19R(Pharmacia)中，然后用標準方法轉化到大腸桿菌JM109中。用稍加改進的堿溶解小量制備方法來分離數(shù)個轉化體的質粒DNA，然后用數(shù)種酶進行限制分析。用雙鏈質粒的Sanger雙脫氧測序法(Sanger等，1977)確定了在一種所述質粒中所含的插入序列。將含有合成AFP-III盒編碼區(qū)的該中間構建體命名為pUR7700(圖3)。實施例2構建含編碼AFP-III HPLC-1合成基因的酵母表達載體由pUR7700攜帶的合成AFP-III基因不含有在酵母中表達該肽所需的信息。為了進行該基因的表達和分泌，必需構建含AFP-III基因與適宜分泌信號序列的翻譯融合序列的構建體，并將這些融合序列置于酵母基因啟動子的控制下。
適宜的分泌信號序列可選自編碼酵母可有效分泌的蛋白質的基因，如有SUC2或α交配因子、MFα1和MFα2編碼的轉化酶。為了得到含有轉化酶信號序列的適宜融合序列，產生含有轉化酶信號序列、GAL7啟動子和適宜限制酶位點的PCR片段，以確保帶有合成AFP-III基因的轉化酶信號序列的融合序列在框中。
為了得到該片段，用下列序列設計PCR引物invafp14NheI BamHI3′CCA AAA CGT CGG TTT TAT AGA CGATCG CCTAGGGC 5′invafp14G F A A K I S A將該引物在PCR反應中作為3’引物，5’引物為與GAL7啟動子中的序列雜交的PG705 AF(Verbakel，1991)。用pUR2778質粒DNA作為模板(圖4，van gorcom等，1991)，反應產生一約243bp的片段。從瓊脂糖凝膠上洗脫該片段，然后按照制造商的說明，用Gene Clean方法純化。隨后用SacI和BamHI消化純化的片段，將所得約88bp片段連接到質粒pTZ19R中的適宜位點。通過轉化將連接混合物導入大腸桿菌JM109中，從轉化體中分離質粒DNA，并進行測序以確定克隆插入片段的一致性。將該質粒命名為pUR7701(圖5)。
為了得到轉化酶信號序列與合成AFP-III基因的框架融合序列，用NheI和HindIII消化pUR7700，分離約196bp的片段，并與通過用NheI和HindIII消化pUR7701而形成的約2911bp片段相連。將所得質粒命名為pUR7702(圖6)。用相似的方法，用引物MFαAFPIII作為3’引物，產生含α交配因子前原信號序列的PCR片段NheI3′CTA TTT TCT CTC CGA CTT CGATCGCC 5′MFαAFPIIID K R E A E A用MFαAFPIII和PG 05 AF為引物，從pUR2660(WO 94/03617)產生含部分GAL7啟動子和全部前原α交配因子編碼序列的PCR片段。pUR2660含有位于GAL7啟動子控制下的前原α交配因子編碼序列。按上述純化所得的約462bp片段，并SacI和NheI消化。將所得的約292bp片段連接到通過用SacI和NheI消化pUR7702而得到的約3025bp片段中。將來自用該連接產物轉化的數(shù)個大腸桿菌的質粒DNA進行測序以確定是否克隆了正確的片段。將這些質粒之一命名為pUR7703(圖7)。
為了構建能夠在酵母中表達AFP-III盒的質粒，將合成基因-信號序列融合序列按如下導入到各種酵母表達載體中用標準技術，將pUR7702的約278bp SacI/HindIII片段和pUR7703的約488bp SacI/HindIII片段(分別攜帶有轉化酶和α交配因子與AFP-III的融合序列)分別克隆到也用SacI和HindIII消化的酵母表達載體中。這些表達載體均攜帶了啤酒酵母GAL7啟動子，這樣在SacI位點插入的基因片段可以在GAL7的控制下進行插入基因的轉錄。
通過將來自pUR7702的轉化酶信號序列AFP-III盒插入到多拷貝的核糖體DNA整合載體pUR2778中來制備pUR7704(圖8)，而pUR7706(圖9)是含有衍生于pUR7703的α交配因子AFP-III盒的pUR2778，插入在SacI和HindIII位點之間。實施例3在啤酒糖酵母中表達AFP-III通過HpaI消化而將質粒pUR7704和pUR7706線性化，目的是將質粒整合到酵母rDNA區(qū)，然后通過電穿孔分別導入啤酒糖酵母菌株SU50中。通過其在不含亮氨酸時的生長能力來篩選轉化體。為了表達克隆的AFP-III，首先使攜帶pUR7704或pUR7706的轉化體在液體基本培養(yǎng)基中于30℃生長40小時，隨后以1∶10用新鮮制備的誘導培養(yǎng)基(酵母提取物1％，Difco胨2％，半乳糖5％)稀釋，并在30℃再保溫48小時。在該過程結束時，檢測培養(yǎng)上清液樣品抑制冰晶生長的能力。
在-6℃30分鐘后，顯微鏡下檢查冰晶的生長。清楚地表明與從未整合酵母或攜帶表達載體但沒有AFP-III合成基因之酵母的上清液樣品相比，來自攜帶合成AFP-III之酵母的上清液對冰晶生長有抑制作用。但是，酵母產生物質的再結晶抑制活性明顯低于等量魚AFP制品的抑制活性。
為了進一步分析所產生的抗凍肽，以4000rpm將來自pUR7704和pUR7706轉化體誘導培養(yǎng)物的10ml樣品離心5分鐘，收集細胞和上清液，然后于-20℃貯存。用變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，然用抗AFP特異性單克隆抗體通過Western印跡檢測AFP。
在來自攜帶pUR7704和pUR7706上清液樣品中，有一表現(xiàn)分子量為6.5kD的帶，這清楚地表明這些轉化體能夠生產AFP-III。用反相HPLC純化所述肽，并確定N末端序列。該序列表明酵母正確加工并分泌了HPLC-1肽。實施例4鑒定最有活性的美洲大綿鳚抗凍肽亞型用兩步法純化AFP-III同種型。首先將樣品上樣到陽離子Mono S柱上，用所述梯度洗脫。圖10中列出了洗脫圖譜。從柱上分離出一個非拖尾峰(Q峰)和4個洗脫峰(S1到S4)。S1表示在這些條件下，與MonoS陽離子交換柱有最低結合能力的蛋白質，S4含有與柱有最大結合能力的蛋白質。收集峰，并用上述梯度上樣到RP-HPLC柱上。圖11中列出了層析譜。峰是AFP-III同種型。并用具體的條件，根據(jù)其在該柱上的行為從1標到12。所有AFP-III同種型均是在25到45分鐘之間洗脫的。在圖12到16中列出了Q和S1到S4級分的RP-HPLC層析譜。各級分得到不同的AFP-III同種型。，在表2中總結了在各峰中所含的AFP-III同種型。用小鼠抗-AFP-III抗血清檢測從Mono S和RP-HPLC柱收集的級分，來自S1到S4的所有級分均與S型抗血清有陽性反應，來自Q組的同種型12與Q型抗血清有陽性反應。從同種型中的5個來確定N末端氨基酸序列(表3)。魚溶菌酶污染了AFP-III HPLC 7峰，但鑒定的其他氨基酸序列與AFP-III同種型的已知序列相關。檢測等量純化蛋白質的抗凍活性。
正如用再結晶試驗所表明的，只有AFP-III的HPLC-12同種型有顯著的抗凍活性。為了證實這一發(fā)現(xiàn)，在存在或不存在HPLC-12同種型的條件下，重建美洲大綿鳚AFP-III同種型。完整重建的肽制品保持了粗魚制品的活性，而不含HPLC-12同種型的制品通過再結晶試驗表明，其抗凍活性大為降低。
用同種型12的胰蛋白酶消化產物，確定該同種型的全部氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)該序列與文獻中描述的序列相同(Davies and Chow，1990)。實施例5構建編碼AFP-III的HPLC-12變異體的合成基因按照如下構建與轉化酶信號序列相連的編碼HPLC-12抗凍肽的核苷酸序列，試驗在啤酒酵母中表達優(yōu)選的密碼子合成15個核苷酸的組(HPLC 12.1、HPLC 12.2、HPLC 12.3、HPLC 12.4、HPLC 12.5、HPLC 12.6、HPLC 12.7、HPLC 12.8、HPLC 12.9、HPLC 12.10、HPLC 12.11、HPLC 12.12、HPLC 12.13、HPLC 12.14和HPLC12.15)，主要含有成熟AFP的DNA序列，該序列優(yōu)先使用啤酒酵母密碼子。設計合成的基因，以使其含有與產生粘性末端的PstI和HindIII相容的單鏈區(qū)(圖17)。
為了組裝合成的HPLC-12基因，將各50pmol的寡核苷酸溶解在12μl水中，95℃保溫2分鐘，然后直接放在冰上。該變性步驟后，37℃，在含2.5mM ATP，5mM DTT和約10U多核苷酸激酶的20μl終體積中將所述寡核苷酸磷酸化40分鐘，然后在95℃變性2分鐘，接著置于冰上。將各10μl的磷酸化寡核苷酸與其大部分互補的DNA寡核苷酸混合以形成雙螺旋。95℃保溫2分鐘變性后，將各雙螺旋緩慢冷卻到30℃。再合并所有10μl的雙螺旋混合物，然后20℃在含50mMTris/HCl，pH7.5，8mM MgCl2，8mM DTT和40μg/ml明膠和10UDNA連接酶的100μl終體積中保溫2小時。然后沉淀連接混合物，并再溶解在30μl的TE緩沖液中。將15μl混合物放在2％瓊脂糖凝膠上，從凝膠上切下預期大小(約291個堿基對)的DNA帶，最后按照供應商的說明，用Gene Clean II方法純化。
將該片段與衍生于通過SacI和HindIII消化而產生的多拷貝整合載體pUR2778的載體片段相連。確定所述插入片段的序列并將所得質粒命名為pUR7718(圖18)。
通過HpaI消化而將質粒pUR7718線性化，目的是將質粒整合到酵母rDNA區(qū)，然后通過電穿孔分別導入啤酒酵母菌株SU50中。通過其在不含亮氨酸時的生長能力來篩選轉化體。
為了表達克隆的HPLC-12，首先使攜帶pUR7718的轉化體在液體基本培養(yǎng)基中于30℃生長40小時，隨后以1∶10用新鮮制備的誘導培養(yǎng)基(酵母提取物1％，Difco胨2％，半乳糖5％)稀釋，并在30℃再培養(yǎng)48小時。在該過程結束時，檢測培養(yǎng)上清液樣品抑制冰晶生長的能力。
結果(再結晶試驗)清楚地表明培養(yǎng)上清液有高水平的抗凍活性。將這些結果與表達HPLC-1變異體之酵母而得到的結果進行比較，表明來自產生最低HPLC-12抗凍活性水平的轉化體的上清液優(yōu)于來自最佳HPLC-1轉化體的上清液。
用攜帶pUR7718的SU50轉化體完成補料分批發(fā)酵。在補料期結束時，用1升的吊桶(bucket)，用Jouan LR 5.22離心機，以4650rpm(7200g)離心30分鐘收集細胞。用冰再結晶抑制試驗，檢測上清液的抗凍活性。未稀釋的上清液明顯抑制晶體生長，這表明在培養(yǎng)上清液中存在高水平的活性抗凍肽。
該發(fā)酵上清液的Western印跡表明分泌了AFPIII-HPLC12物質。酵母產生的HPLC12的表觀分子量等于魚產生的HPLC12的表觀分子量。酵母產生肽的純化和氨基酸測序證實不能將該物質與美洲大綿鳚產生的HPLC12肽區(qū)分開。參考文獻Campbell，I and Duffus，J.H.(1988)酵母，實踐方法，IRL出版社，牛津。Chao，H.，Davies，P.L.，Sykes，B.D.and Sonnichsen(1993)用脯氨酸突變來幫助解決III型抗凍蛋白質的NMR溶液結構。蛋白質科學2 1411-1428。Chao，H.，Sonnichsen，F(xiàn).D.，Deluca，C.I.，Sykes，B.D andDavies，P.L.(1994)在球形III型抗凍蛋白質中結構與功能的關系鑒定與冰結合所需的表面殘基簇。蛋白質科學3 1760-1769。Chung，C.T.，Niemela，S.L.Miller，R.H.，(1989)，一步法制備感受態(tài)大腸桿菌在相同溶液中轉化并貯存細菌細胞。美國國家科學院研究進展，86；2172-2175。Davis，P.L.and Chow，H.L.，(1990)，魚抗凍蛋白質的生物化學，F(xiàn)ASEB雜志，4 R2460-2468。Driedonks，R.A.Toschka，H.Y.van Almkerk，J.W，Schaffers andVerbakel，J.M.A.(1995)抗凍肽在啤酒糖酵母11中的表達與分泌。Egli，T.(1980)，Wachstum von methanol Assimelerende Hefen，博士論文Zurich 6538。van den Elzen等(1985)植物分子生物學，5149-154。Erhart，E.，Hollenberg，C.P.(1981)通過的轉化消除啤酒酵母2μm DNA，遺傳學現(xiàn)狀，3，83-89。Fletcher，G.L.Hew，C.L.Joshi，S.B.and Wu，Y.(1994)將表達抗凍多肽的微生物用于食品發(fā)酵和冷藏。美國專利申請。Gasson，M.J.(1993)，乳酸菌在生物技術中的發(fā)展和潛力，F(xiàn).E.M.S.微生物學綜述12，3-20。Hahahan(1988)遺傳學研究年鑒(Ann.Rev.Genetics)22479-519。Hew，C.L.Shaughter，D.，Shasbikant，B.J.，F(xiàn)letcher G.L.andAnanthanarayanan V.S.(1984)來自紐芬蘭美洲大綿鳚Macrozoarcesamericanus的抗凍肽多種和組成性有害組分的存在，J.Comp PhysiolB.155，81-88。Hew，C.L.，Wang，N-C.，Joshi，S.，F(xiàn)letcher，G.L.，Scott，G.K.，Hayes，P.H.，Buettner，B.and Davies，P.L.，(1988)多基因提供了抗凍蛋白多樣性的基礎和美洲大綿鳚中的含量，J.Biol.Chem.263，12049-12055。Keulers，M.(1993)Eindhoven技術大學的博士論文Li，X.，Trinh，K.Y.and Hew，C.L.(1992)在大腸桿菌中表達并表征來自美洲擬鰈、Macrozoarces americanus的活性和熱更穩(wěn)定性重組抗凍多肽通過修飾mRNA的二級結構來提高表達。蛋白質工程，4995-1002。McKown，R.L.and Warren G.J.(1991)表達抗凍基因類似物的酵母存活提高。低溫生物學28，474-482。Romanos，M.A.，Seorer，C.A.and Clare，J.J.(1992)外源基因在酵母中的表達綜述，酵母8 423-488。Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.(1989)分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約。Sanger，F(xiàn).，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1977)，用鏈終止抑制劑進行DNA測序，美國國家科學院院報745463-5467。Sonnichsen，F(xiàn).D.，Sykes，B.D.，Chao，H.and Davies，P.L.(1993)，III型抗凍蛋白的非螺旋結構，科學259，1154-1157。Toschka H.Y.，Verbakel，J.M.，Almkerk J.W.(1992)，優(yōu)先權為7月29日的荷蘭專利申請92202338.7的PCT專利申請WO94/03617，用于生產抗凍肽(AFP)的方法。Van Gorcom，R.F.M.，Hessing，J.G.M.，Maat，J.andVerbakel，J.M.A.(1991)木聚糖酶生產，國際專利中請WO91/19782。Verbakel，J.M.A.(1991)在啤酒酵母中表達異源基因。Utrecht大學的博士論文。Warren，G.J.，Hague，C.M.，Corroto，L.V.and Mueller，G.M.(1993)遺傳工程抗凍肽的特性。FEBS Letters 321，116-120。Yanisch-Perron，C.，Viera，J.，Messing，J.(1985)改進的M13噬菌體克隆載體和宿主菌質M13 mp18和pUC19載體的核苷酸序列?；?3，103-119附圖描述圖1.III型AFP的同種型。劃框區(qū)表示一致性區(qū)，陰影部分的氨基酸是對于所述肽的抗凍特性重要的氨基酸。
圖2.編碼AFP-III型HPLC1的合成基因。
圖3.圖示說明構建pUR7700，是攜帶合成AFP-III基因的質粒。
圖4.酵母表達載體pUR2778的限制性圖譜。
圖5.圖示說明構建pUR7701，是攜帶轉化酶信號序列的質粒。
圖6.圖示說明構建pUR7702，是攜帶與轉化酶信號序列在框架中相連的合成AFP-III基因的質粒。
圖7.圖示說明構建pUR7703，是攜帶與交配因子前原分泌信號序列在框內融合的合成AFP-III基因的質粒。
圖8.圖示說明構建pUR7704，是攜帶與轉化酶信號序列在框內相連的合成AFP-III基因的多拷貝rDNA整合載體。
圖9.圖示說明構建pUR7703，是攜帶與交配因子前原分泌信號序列在框架中相連的合成AFP-III基因多拷貝rDNA整合載體。
圖10.美洲大綿鳚抗凍肽從Mono S柱的洗脫圖譜。
圖11.用反相HPLC分離的抗凍肽的層析譜。
圖12.用反相HPLC分離的Mono S S1抗凍肽的層析譜。
圖13.用反相HPLC分離的Mono S S2抗凍肽的層析譜。
圖14.用反相HPLC分離的Mono S S3抗凍肽的層析譜。
圖15.用反相HPLC分離的Mono S S4抗凍肽的層析譜。
圖16.用反相HPLC分離的Mono S S1抗凍肽的層析譜。
圖17.編碼III型AFP HPLC12轉化酶信號序列融合蛋白的合成基因。
圖18.質粒pUR7718的圖。
表1
表2含AFP-III3同種型的Mono S級分
<p>表3AFP-III同種型的N末端氨基酸序列。
美洲大綿鳚的溶菌酶，正是稱為AFP 3同種型7的肽10 20Lys-Val-Phe-Asp-Arg-？-Glu-Trp-Ala-Arg-Val-Leu-Lys-Ala-Asn-Gty-Met-Asp-Gly-Tyr-21 30 40Arg-Gly-Ile-Ser-Leu-Ala-Asn-Trp-Val-？-Leu-Ser-Lys-Trp-Glu-Ser-？-Tyr-？-Thr-同種型編號910 20Ser-Gln-Ser-Val-Val-Ala-Thr-Tyr-Leu-Ile-Pro-Met-Asn-Thr-Ala-Leu-Thr-Pro-Ala-Met-同種型編號12110Asn-Gln-Ala-Ser-Val-Val-Ala-Asn-Gln-Leu-Ile-Pro-Ile-Asn-Thr-Ala-Leu-
表4AFP-III同種型編號12的胰蛋白酶肽的氨基酸序列肽編號1N-末端1-23110 20Asn-Gln-Ala-Ser-Val-Val-Ala-Asn-Gln-Leu-Ile-Pro-Ilc-Asn-Thr-Ala-Leu-Thr-Leu-Val-23Met-Met-Arg肽編號224到39110Ser-Glu-Val-Val-Thr-Pro-Val-Gly-Ile-Pro-Ala-Glu-Asp-Ile-Pro-Arg肽編號340到471Leu-Val-Ser-Met-Gln-Val-Asn-Arg肽編號448到61110Ala-Val-Pro-Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Met-Pro-Asp-Met-Val-Lys肽編號562到661Gly-Tyr-Pro-Pro-Ala
權利要求
1具有基本上相應于AFP-III HPLC12之氨基酸序列的多肽或蛋白質作為用于改進產品的產品添加劑的用途，所述改進在于例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而例如使可能的冷凍損傷達到最小，所述用途以對于抗凍肽本身已知的方式發(fā)生以得到比相同量美洲擬鰈AFP高的特異性的修飾活性，具體地說是抗凍活性。
2制備改進產品的方法，所述改進在于例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中，影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，所述方法包括將多肽或蛋白質加到未改進的產品或制備未改進產品時常用的成分或混合物中，所述多肽或蛋白質具有基本上相應于AFP III型HPLC12的氨基酸序列，而且所述重組多肽或蛋白質以足以較大程度影響冰晶生長的量加入，即比相同量的美洲擬鰈AFP有更高的特異性抗凍活性。
3制備改進產品的方法，所述改進在于例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中，影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，所述方法包括將能夠表達多肽或蛋白質的宿主生物加到未改進的產品或制備未改進產品時常用的成分或混合物中，所述多肽或蛋白質具有基本上相應于AFP III型HPLC12的氨基酸序列，隨后，將所述宿主生物置于可使編碼AFP III型HPLC12的核酸序列在產品或成分或混合物中表達的條件下，在通常用于制備未改進產品的步驟中添加權利要求10-20中任一多肽生產方法。
4根據(jù)權利要求3的方法，在表達或分泌了具有基本上相應于AFPIII型HPLC12的氨基酸序列的重組多肽或蛋白質得到作為單體的AFP多肽或蛋白質后，無需添加蛋白酶或化學物質。
5根據(jù)前述任一權利要求的方法或用途，其中所述產品是食品或生物材料。
6根據(jù)前述任一權利要求的方法或用途，其中所述產品是最終將被冷凍的產品如冰淇淋。
7根據(jù)前述任一權利要求的方法或用途，其中所述產品是冷凍的面團或冷凍的焙烤產品。
8根據(jù)前述任一權利要求的方法或用途，其中所述多肽或蛋白質是重組多肽或蛋白質。
9根據(jù)前述任一權利要求的方法或用途，其中所述多肽或蛋白質是食用多肽或蛋白質。
10用于生產重組多肽或蛋白質的方法，所述重組多肽或蛋白質表現(xiàn)出改進的特性，所述改進的特性例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，所述多肽或蛋白質具有基本上相應于AFP III型HPLC12的氨基酸序列，所謂重組抗凍肽(AFP)表現(xiàn)出比美洲擬鰈AFP更高的特異性抗凍活性，通過1)在一定的條件下培養(yǎng)食用宿主生物，由此表達或誘導至少一種AFP-編碼核酸序列，所述核酸序列被包含在DNA構建體中，所述DNA構建體在天然宿主生物中不存在，并且所述DNA構建體以下列順序含有(a)在所述宿主生物中有活性的強的、任選的可誘導啟動子，(b)ATG起始密碼子，可位于任選的DNA信號序列中，所述信號序列能夠在表達下列(c)中編碼AFP的核酸序列過程中，分泌由宿主生物生產的蛋白質，所述信號序列可以與AFP-編碼核酸序列同源或異源并與ATG起始密碼子一起在閱讀框架內，(c)至少一種編碼基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12之氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列與ATG起始密碼子一起在閱讀框架內，以及任選的(d)與AFP-編碼核酸序列3’末端結合的終止密碼子；和任選的2)收集用本身已知的方法進一步加工得到的AFP-編碼核酸序列表達的產物。
11根據(jù)權利要求10的方法，其中所述DNA構建體含有用于宿主生物的信號序列，所述信號序列在宿主培養(yǎng)過程中，可使宿主分泌核酸序列的表達產物，所述核酸序列編碼基本上相應于AFP III蛋白質HPLC12的氨基酸序列。
12根據(jù)權利要求10或11任一項的方法，其中所述宿主生物是微生物。
13根據(jù)權利要求10-12任一項的方法，其中所述宿主生物是酵母。
14根據(jù)權利要求10-13任一項的方法，其中在使宿主生物分泌單體多肽的條件下培養(yǎng)宿主生物，所述單體多肽具有基本上相應于AFPIII蛋白質HPLC12的氨基酸序列。
15根據(jù)權利要求10-14任一項的方法，其中編碼基本上相應于AFP-III HPLC12之氨基酸序列的所述核酸序列含有宿主生物優(yōu)選的密碼子。
16根據(jù)權利要求10-15任一項的方法，其中DNA信號序列是啤酒糖酵母α交配因子的DNA前序列。
17根據(jù)權利要求10-16任一項的方法，其中所述DNA構建體在所述前序列和AFP-編碼序列之間還含有啤酒酵母的α交配因子，由此，前序列、原序列和AFP-編碼核酸序列均在同一框架中。
18根據(jù)權利要求10-17任一項的方法，其中所述DNA構建體在編碼AFP的核酸序列前含有啤酒糖酵母的轉化酶信號序列。
19根據(jù)權利要求10-18任一項的方法，其中所述啟動子是啤酒糖酵母的可誘導的GAL 7啟動子或組成性GAPDH啟動子。
20具有改進特性的食用重組宿主生物，所述特性例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，所述食用重組宿主生物含有和/或被包圍于基本上相應于AFP-III型HPLC12的多肽或蛋白質和/或由權利要求10-19任一項的方法生產的AFP。
21能夠表達至少一種AFP-編碼核酸序列的食用重組宿主生物，所述核酸序列被包含在DNA構建體中，所述DNA構建體在天然宿主生物中不存在，而且所述DNA構建體以下列順序含有(a)在所述宿主生物中有活性的強的、任選的可誘導啟動子，(b)ATG起始密碼子，可位于任選的DNA信號序列中，所述信號序列能夠在表達下列(c)中編碼AFP的核酸序列過程中，分泌由宿主生物生產的蛋白質，所述信號序列可以與AFP-編碼核酸序列同源或異源并與ATG起始密碼子一起在閱讀框架內，(c)至少一種編碼基本上相應于AFP III型蛋白質HPLC12之氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列與ATG起始密碼子一起在閱讀框架內，以及任選的(d)與AFP-編碼核酸序列3’末端結合的終止密碼子。
22在權利要求10-19任一公開的實施方案中的權利要求21的重組食用宿主生物。
23含有基本上相應于AFP-III HPLC12的多肽或蛋白質和/或權利要求20-22任一重組食用宿主生物的產品，所述產品優(yōu)選是食品，所述產品不是天然以所述形式或量含有所述多肽或蛋白質的可食生物。
24根據(jù)權利要求23的產品，所述產品是最終將被冷凍的產品，例如冰淇淋這樣的產品，冷凍面團或冷凍焙烤產品。
25有改進特性的基本上純的分離的重組食用多肽或蛋白質，所述改進的特性例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，所謂重組抗凍肽(AFP)比相同量的美洲擬鰈I型AFP有高的抗凍活性，所述多肽或蛋白質具有基本上相應于AFP III型HPLC12的氨基酸序列。
26有改進特性的重組食用多肽或蛋白質，所述改進的特性例如通過防止或抑制冷凍時產品中冰的再結晶，而改變特別是在再生長中影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程，從而使可能的冷凍損傷達到最小，按照權利要求10-19任一項的方法制備的所謂重組抗凍肽(AFP)比相同量的美洲擬鰈I型AFP有高的抗凍活性。
全文摘要
將具有基本上相應于AFPⅢ型HPLC12之氨基酸序列的重組多肽或蛋白質作為產品添加劑用于所述產品的改進的用途,所述改進在于例如通過防止或抑制冷凍后產品中冰的再結晶,而改變特別是在再生長中,影響冰的大小和形狀的冰晶生長過程,從而使可能的冷凍損傷達到最小,所述用途以對于抗凍肽本身已知的方式發(fā)生以得到比相同量美洲擬鰈AFP高的特異性的修飾活性,具體地說是抗凍活性。
文檔編號C12N15/09GK1193999SQ96196501
公開日1998年9月23日 申請日期1996年7月1日 優(yōu)先權日1995年7月5日
發(fā)明者J·W·查普曼, W·慕斯特爾斯, P·D·范瓦森納爾 申請人:尤尼利弗公司