專利名稱:釉質(zhì)基質(zhì)相關(guān)多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及編碼屬于一組被稱為amelin的多肽的新核酸序列,其多肽序列包含與細(xì)胞表面識(shí)別有關(guān)的四肽功能域。amelin序列的可能用途涉及對(duì)硬組織形成失調(diào)的診斷,以及在生物物質(zhì)形成中可作為基質(zhì)成分或細(xì)胞識(shí)別標(biāo)記的amelin蛋白或其片段的產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及含本發(fā)明核酸片段的表達(dá)載體以生產(chǎn)蛋白質(zhì),涉及含所述表達(dá)載體的生物,生產(chǎn)該多肽的方法,含該多肽的組合物,以及治療各種硬組織疾病或失調(diào)癥的方法。
背景技術(shù):
在骨,牙質(zhì)和其他組織中,I型膠原或類似蛋白質(zhì)裝配成原纖維基質(zhì),后者在一些情況下作為結(jié)合礦物晶體的支架。鄰近的細(xì)胞與該基質(zhì)建立特異性接觸,該接觸由細(xì)胞外蛋白質(zhì)如膠原和細(xì)胞表面受體,如整聯(lián)蛋白中的功能域的相互作用的介導(dǎo)。已經(jīng)在數(shù)種細(xì)胞外蛋白質(zhì)中鑒定了涉及這些接觸的肽功能域(Yamada&Kleinman,1992)。在釉質(zhì)中尚未發(fā)現(xiàn)相當(dāng)于骨中膠原纖維的結(jié)構(gòu)網(wǎng)軟骨和牙質(zhì)。而且,還沒有在介導(dǎo)其錨著于細(xì)胞粘著分子的釉質(zhì)基質(zhì)蛋白質(zhì)中鑒定出序列片段。釉質(zhì)蛋白質(zhì)牙釉蛋白和enamelin不含有這類蛋白質(zhì)功能域。新沉積的釉質(zhì)的礦物成分是總質(zhì)量的15%左右并在以后隨蛋白質(zhì)的降解而增加到95%(Robinson等,1988)。
在釉質(zhì)中已鑒定了主要的兩組蛋白質(zhì)enamelin和牙釉蛋白(Termine等,1980)。在成熟釉質(zhì)中的蛋白質(zhì)片段類似于enamelin之一,tuftelin,它已被抗體定位于釉質(zhì)角柱體之間。已確定了對(duì)應(yīng)于tuftelin的cDNA序列,并推測(cè)該蛋白質(zhì)可能在釉質(zhì)礦化中具有功能(Deutsch等,1991)。其余(迄今所描述的)enamelin對(duì)釉質(zhì)形成的意義可能是有爭(zhēng)論的,因?yàn)橹饕鞍踪|(zhì)種類與來自血流的蛋白質(zhì)是同樣的(Strawich&Glinmcher,1990)。是否牙釉蛋白(最常見的蛋白質(zhì))為釉質(zhì)基質(zhì)提供一種支架仍在討論之中(Simmer等,1994)。
先前已經(jīng)匯集了一些從大鼠原位雜交文庫隨機(jī)篩選的部分序列(Matsuki等,1995),其中有些序列顯示與本發(fā)明的序列有同源性。沒有閱讀框被認(rèn)為來自于這些部分序列。沒有說明是否多肽被這些序列編碼亦沒有給出關(guān)于這類多肽之可能功能的假設(shè)。
已經(jīng)在豬的未成熟釉質(zhì)中鑒定了非牙釉蛋白蛋白質(zhì)(Uchida等,1995)。一種15kDa蛋白質(zhì)具有與先前已知enamelin質(zhì)非同源的N末端氨基酸序列(VPAFPRQPGTHGVASL-)。假設(shè)非牙釉蛋白包含enamelin質(zhì)的一個(gè)新家族但沒有提出它們的功能。該蛋白質(zhì)還沒有被完全測(cè)序并且它們的基因?qū)儆谖粗?br>
WO89/08441涉及包括用于誘導(dǎo)活礦化組織的各部分之間的結(jié)合的一種組合物,其中活性成分來源于牙釉質(zhì)的一種前體,即所謂的釉質(zhì)基質(zhì)。該組合物通過促進(jìn)礦化組織再生誘導(dǎo)結(jié)合。該活性成分是一個(gè)蛋白質(zhì)組分的一部分并以具有高達(dá)40.000kDa分子量為特征但沒有鑒定為單一蛋白質(zhì)。
發(fā)明概述雖然通常產(chǎn)生大量礦化的基質(zhì)蛋白質(zhì),它們較差的溶解度妨礙了直接分析。在牙基質(zhì)中基質(zhì)蛋白質(zhì)的生理降解發(fā)生在成熟期時(shí)的礦物質(zhì)獲得過程中并給分析基質(zhì)蛋白質(zhì)造成額外困難。本發(fā)明基于這種考慮即由于基質(zhì)形成細(xì)胞合成大量的相應(yīng)蛋白質(zhì),它們應(yīng)含有高拷貝數(shù)的mRNA。因此,對(duì)基質(zhì)形成細(xì)胞的主要種類的mRNA的序列分析可繞過部分問題并幫助研究基質(zhì)的某些蛋白質(zhì)成分。
這些考慮引入了所采用的導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新amelin mRNA序列的方法,即本發(fā)明的基礎(chǔ)。簡(jiǎn)言之,建立了含發(fā)育牙齒的mRNA序列種類的基因文庫。從單細(xì)菌克隆得到各個(gè)序列并用于整個(gè)發(fā)育中的牙齒組織切片的原位雜交實(shí)驗(yàn)。在形成硬組織基質(zhì)細(xì)胞(例如成釉質(zhì)細(xì)胞)中所檢測(cè)到的序列被確定并被用于查詢序列數(shù)據(jù)庫。大多數(shù)這樣篩選的序列在數(shù)據(jù)庫中都有描述,但在現(xiàn)稱為amelin序列的兩個(gè)序列沒有描述。在釉質(zhì)基質(zhì)形成期間新mRNA的這兩個(gè)變異體在大鼠成釉質(zhì)細(xì)胞中被高水平表達(dá)。所述序列分別含有407和304氨基酸殘基的開放閱讀框。被命名為amelin的被編碼蛋白質(zhì)富含脯氨酸,亮氨酸和甘氨酸殘基并含有與細(xì)胞表面相互作用的其他功能域相結(jié)合的肽功能域Asp-Gly-Glu-Ala(一種整聯(lián)蛋白識(shí)別序列)。編碼C末端305個(gè)氨基酸殘基的序列,即SEQ ID NO 2中的氨基酸102-407和SEQ ID NO4中的氨基酸19-324,3’非翻譯區(qū)部分和在非翻譯5’區(qū)的微衛(wèi)星重復(fù)序列在兩個(gè)mRNA變異體中是一致的。其余的5’區(qū)包括長(zhǎng)的變異體(在SEQID NO1中核苷酸12-349)所特有的338個(gè)核苷酸,共有的54個(gè)核苷酸和僅在短的變異體中存在的46個(gè)核苷酸(在SEQ ID NO3中核苷酸66-111)。十四個(gè)核苷酸有潛力編碼兩個(gè)蛋白質(zhì)在不同閱讀框中的5個(gè)氨基酸(在SEQ ID NO1中的390-403和SEQ ID NO3中的52-65)。較長(zhǎng)的變異體的閱讀框包括典型N末端信號(hào)肽的密碼子。amelin mRNA序列的性質(zhì)表明amelin是釉質(zhì)基質(zhì)的一種成分并且是迄今涉及成釉質(zhì)細(xì)胞表面與其細(xì)胞外基質(zhì)之間的結(jié)合相互作用的唯一蛋白質(zhì)。
預(yù)期amelin肽或其部分可通過化學(xué)或通過使用本文描述的序列信息借助表達(dá)載體來翻譯合成。進(jìn)一步預(yù)期這些肽可對(duì)設(shè)計(jì)修復(fù)牙齒或骨的醫(yī)療設(shè)備有用。這些肽還可與以提高人工植入材料的生物相容性的目的與這種材料結(jié)合使用。人的amelin mRNA或基因序列可有助于硬組織形成的遺傳病癥的診斷。
詳細(xì)描述為獲得可能是難于以直接途徑分析的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的序列資料,以含有基質(zhì)形成細(xì)胞的所有組成部分mRNA的λ噬菌體建立一個(gè)cDNA庫。以下列途徑篩選amelin RNA序列如實(shí)施例4進(jìn)行影印嗜斑拓取(replica plaque lift)實(shí)驗(yàn)并與分別與cDNA和牙釉蛋白以及膠原寡聚物雜交。嗜菌斑呈現(xiàn)與cDNA相對(duì)強(qiáng)的雜交信號(hào)但與寡聚物無信號(hào)被進(jìn)一步分析,設(shè)想它們含有常在cDNA中被描述但與牙釉蛋白和膠原不同的序列。這些陽性嗜菌斑克隆中的十五個(gè)被轉(zhuǎn)變成Bluescript質(zhì)粒。
為鑒定在基質(zhì)形成細(xì)胞(即可參與基質(zhì)產(chǎn)生和生長(zhǎng)磨牙的礦化的細(xì)胞)中表達(dá)的序列,合成RNA探針(riboprobe)供原位雜交用。挑選四天齡大鼠,因?yàn)樯婕坝再|(zhì)基質(zhì)生成的牙釉蛋白R(shí)NA的濃度約在此時(shí)最高。
圖1顯示用amelin探針?biāo)媒Y(jié)果(見實(shí)施例4和圖1a),作為與牙釉蛋白R(shí)NA(圖1b)和膠原(圖1c)反應(yīng)的比較。在分泌期檢測(cè)含成釉質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)釉質(zhì)上皮中的amelin和牙釉蛋白。膠原探針主要修飾位于間充質(zhì)髓周邊的成牙本質(zhì)細(xì)胞以及牙槽骨的成骨細(xì)胞。因此斷定amelin可對(duì)形成釉質(zhì)基質(zhì)起作用。對(duì)使在牙結(jié)構(gòu)中造成顯示探針原位雜交信號(hào)陽性的十四個(gè)cDNA插入片段進(jìn)行部分測(cè)序。所述片段用于查詢基因庫和EMBL數(shù)據(jù)庫以對(duì)它們作出鑒定。迄今兩個(gè)新序列沒有被描述。
為確定全amelin mRNA序列,用從上述初始amelin序列得到的一個(gè)寡核苷酸篩選牙cDNA文庫并分離到6個(gè)長(zhǎng)度范圍在0.5和2kb之間的另外的插入片段。序列分析表明所有7個(gè)克隆代表了對(duì)應(yīng)于3’mRNA部分的序列。然而,在兩個(gè)最長(zhǎng)的插入片段中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)不同的5’區(qū)特稱為amelin1和amelin2(圖2)。為得到全長(zhǎng)的序列描述,從大鼠磨牙建立隨機(jī)引物庫,并用從所述兩個(gè)突變異體的各自5’端(圖2下劃線)得到的兩個(gè)不同的寡核苷酸篩選。用從amelin1的5’部分得到的amelin2和amelin13克隆的5’部分雜交分離出5個(gè)克隆。序列分析證實(shí)了前面的結(jié)果并擴(kuò)延了現(xiàn)稱為amelin1和amelin2的兩個(gè)變異體的序列并分別在序列表中表示為SEQ ID NO1和SEQ ID NO3。兩個(gè)5’mRNA序列在最多達(dá)100x(AG)(數(shù)據(jù)未顯示)的多嘌呤重復(fù)處終止??紤]到在5’末端的AG重復(fù)和在3’末端的聚腺苷酸尾,合在一起的序列(圖2)不比由Northern印跡(見下)所確定的mRNA短。從polyT primed cDNA庫得到的克隆的序列分析顯示出聚腺苷酸添加信號(hào)AATAAA(雙下劃線)的一個(gè)意外的3’變異下游。在某些克隆中觀察到如預(yù)期的15個(gè)核苷酸下游的聚腺苷酸尾,但在其他克隆中觀察到其位于最多達(dá)79核苷酸的較長(zhǎng)距離。圖2中的序列顯示最長(zhǎng)距離的聚腺苷酸化部位變異體。所有的變異被定位在終止密碼子的下游。
兩個(gè)cDNA序列變異體顯示了單一的長(zhǎng)開放閱讀框(圖2)??騼?nèi)終止密碼子出現(xiàn)在聚(AG)和開放閱讀框之間,因而看來聚(AG)或近側(cè)序列似乎不可能編碼蛋白質(zhì)。amelin的閱讀框起始于聚(AG)重復(fù)序列的84個(gè)核苷酸下游。前86個(gè)氨基酸由一個(gè)未在amelin2中顯現(xiàn)的序列所編碼。amelin1的氨基酸87到99由amelin1和amelin2共有的序列所編碼。然而,該序列不編碼amelin2蛋白質(zhì)。雖然它包括了ATG密碼子,框內(nèi)終止密碼子只容許編碼七肽。與七肽終止密碼子重疊的下一個(gè)ATG起始編碼amelin2的最長(zhǎng)序列。有趣的是,它的前十四個(gè)核苷酸以不同的框架編碼amelin1和amelin2(圖2中加陰影部分)。接著的編碼amelin2的15個(gè)氨基酸的46個(gè)核苷酸未出現(xiàn)在amelin1RNA中。在amelin2RNA中的該“插入片段”引起兩個(gè)閱讀框的同步化,以至最后的305個(gè)氨基酸殘基對(duì)兩個(gè)蛋白質(zhì)是共有的。在amelin2的插入片段中有一個(gè)框內(nèi)ATG密碼子,它可能是作為另一個(gè)翻譯的起始。在此情況下,amelin2會(huì)少5個(gè)氨基酸并且沒有兩個(gè)框架編碼序列段。最長(zhǎng)的可能的開放閱讀框含amelin1的407個(gè)氨基酸殘基的密碼子和amelin2的324個(gè)殘基的密碼子。
自提出第一次申請(qǐng)以來,已經(jīng)再次檢查了測(cè)序結(jié)果并做了某些修正。amelin1序列已被修正如下132號(hào)核苷酸已被從G變?yōu)镚沒有引起氨基酸變化。191號(hào)核苷酸已被從G變?yōu)锳引起33位的精氨酸變?yōu)?3位谷氨酰胺。200號(hào)核苷酸已被從G變成C引起36位甘氨酸變?yōu)?6丙氨酸。617號(hào)核苷酸已被從G變?yōu)镃引起175位甘氨酸變?yōu)?75位丙氨酸。809號(hào)核苷酸已被從G變?yōu)镃引起239位甘氨酸變?yōu)?39位丙氨酸。976號(hào)核苷酸已被從C變?yōu)镚引起295位脯氨酸變?yōu)?95位丙氨酸。1649號(hào)核苷酸已被從C變?yōu)锳未引起氨基酸變化。amelin2序列已被修正如下326號(hào)核苷酸已被從G變?yōu)镃引起92位甘氨酸變?yōu)?2位丙氨酸。518號(hào)核苷酸已被從G變?yōu)镃引起156位甘氨酸變?yōu)?56位丙氨酸。685號(hào)核苷酸已被從C變?yōu)镚引起212位脯氨酸變?yōu)?12位丙氨酸。1358號(hào)核苷酸從C變?yōu)锳沒有引起氨基酸變化。
為評(píng)估amelin轉(zhuǎn)錄物的大小,進(jìn)行了從4天齡大鼠的磨牙制備的總RNA的Northern印跡分析(圖3,a泳道)。DIG標(biāo)記的amelincRNA探針雜交到一2kb和一1.9kbRNA帶。如cDNA序列分析所確定的,若將0.2kb的聚(AG)重復(fù)序列和0.2kb的聚腺苷酸加入到展示序列中則amelin1和amelin2 mRNAs是2.3kb和2.0kb長(zhǎng)。這兩個(gè)測(cè)定十分符合說明所述序列包含amelin的全部或幾乎全部mRNA。為了比較,出示牙釉蛋白的兩個(gè)主要mRNAs(1.1kb和0.8kb長(zhǎng))(圖3,b泳道)。通過液相雜交實(shí)驗(yàn)確定了來自磨牙的總RNA中的與牙釉蛋白相關(guān)的amelin RNA的大部分(Mathews等,1989)。若與牙釉蛋白的含量相比,amelin RNA的量占大約5%。amelin1和amelin2的序列比較表明兩個(gè)RNAs是同一初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的剪接變異體,因?yàn)樵谙嗥ヅ涞男蛄胁糠种形窗l(fā)現(xiàn)有改變。
在amelin1和amelin2中最常見的氨基酸是脯氨酸,甘氨酸和亮氨酸;在任何一個(gè)序列中都沒有半胱氨酸(參見下表1)。推定的amelin1蛋白質(zhì)的氨基末端具有信號(hào)肽的特點(diǎn)殘基14到21是疏水的并具有亮氨酸序列段(圖2;Leader,1979)。在amelin2序列中沒觀察到可比較的基元。兩個(gè)amelin都含有肽功能域DGEA(Asp-Gly-Glu-Ala)(amelin1中的氨基酸370-373和amelin2中的氨基酸287-290)(圖2框起的部分),它在早些時(shí)候已被鑒定為構(gòu)成對(duì)細(xì)胞表面蛋白a2b1整聯(lián)蛋白的I型膠原蛋白的識(shí)別部位(Staatz等,1991)。此外,包括了具有VTKG(Val-Thr-Lys-Gly)序列的trombospondin樣細(xì)胞粘著功能域(在amelin1中的氨基酸277-280和amelin2中的氨基酸194-197)(Yamada&Kleinman等,1992)。這兩個(gè)功能域的存在表明amelin是細(xì)胞外基質(zhì)的成分。所預(yù)言的amelin在水溶液中的低溶解度與這個(gè)模型相一致。在amelin1中信號(hào)序列的存在證實(shí)其表現(xiàn)為一種分泌蛋白質(zhì)。在amelin2中沒有信號(hào)序列不意味著該蛋白質(zhì)不被分泌。無信號(hào)序列的分泌蛋白的先例是雞卵清蛋白,其中內(nèi)在的未被切割的序列提供同樣的功能(在Leader,1979中討論)。預(yù)言在細(xì)胞表面相互作用中有意義的兩個(gè)另外的功能域,EKGE(Glu-Lys-Gly-Glu)(amelin1中氨基酸282-285和amelin2中氨基酸199-202)和DKGE(Asp-Lys-Gly-Glu)(amelin1中氨基酸298-301和amelin氨基酸215-218),簇集在同一區(qū)域。如在本段落中所描述的四個(gè)肽功能域的結(jié)合是任何釉質(zhì)基質(zhì)蛋白迄今尚未描述的一個(gè)特點(diǎn)。
由于所預(yù)言的低溶解度,amelin在E.coli細(xì)胞中作為一種與硫氧還蛋白在氨基末端的末端的融合蛋白被表達(dá)。6個(gè)組氨酸標(biāo)記被加到羧基末端的末端并在Ni柱上純化蛋白質(zhì)。洗脫物含一種主要的融合蛋白還有幾種在Western印跡分析中與抗amelin兔血清反應(yīng)的肽。可通過抗硫氧還蛋白親和層析進(jìn)一步純化該蛋白質(zhì)。
已產(chǎn)生抗amelin蛋白的抗體。用amelin-硫氧還蛋白融合蛋白免疫兔并通過在偶聯(lián)到CNBr-活化的Sepharose上的amelin融合蛋白親和層析純化免疫血清。在硫氧還蛋白偶聯(lián)的Sepharose上可達(dá)到進(jìn)一步的純化。這些抗體已被用于例如在大鼠牙中amelin的免疫組化定位。
還確認(rèn)了牙提取物中amelin的存在。大鼠磨牙在碳酸鈉緩沖液pH10.8,1毫摩爾EDTA+蛋白酶抑制劑中被勻漿。用抗amelin-硫氧還蛋白免疫血清通過Western印跡分析了粗提物的上清液。檢測(cè)出與兩個(gè)amelin變異體相對(duì)應(yīng)的帶。在SephadexG100柱上進(jìn)一步層析粗提物。濃縮對(duì)應(yīng)于amelin分子量的組分并進(jìn)行制備電泳。電泳之后,現(xiàn)在通過N-末端序列分析鑒定電泳帶。如果電泳帶之一是amelin,測(cè)定體內(nèi)轉(zhuǎn)化起始。
通過研究2,5,10,15,20和25天齡的Sprague-Darley大鼠的上頜檢測(cè)了在牙齒不同發(fā)育階段中amelin序列的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)amelin伴隨牙釉蛋白出現(xiàn)在原位雜交實(shí)驗(yàn)中,即在分泌階段開始時(shí)成釉質(zhì)細(xì)胞伸長(zhǎng)期間。在較后的階段,牙釉蛋白與amelin的mRNA呈現(xiàn)根本不同的雜交型。在成熟階段牙釉蛋白mRNA大量消失僅在成熟了的成釉質(zhì)細(xì)胞的后期有少量存留,這個(gè)發(fā)現(xiàn)與Wurtz等(1995)的發(fā)現(xiàn)是一致的。然而用amelin探針得到的信號(hào)在成釉質(zhì)細(xì)胞的成熟階段沒有或只有很少程度的降低。
在功能上,兩個(gè)階段是不同的因?yàn)樵诔墒炱跊]有額外的釉質(zhì)基質(zhì)被沉積。然而,似乎在兩個(gè)時(shí)期都有礦物質(zhì)沉積,因?yàn)樾鲁练e的釉質(zhì)已經(jīng)含有礦物質(zhì)。將這些事件與各自的mRNA的出現(xiàn)相關(guān)連,amelin有可能參與礦化過程。如上所述amelin mRNA編碼一種含細(xì)胞結(jié)合功能域的蛋白質(zhì),說明它還或選擇性地參與成釉質(zhì)細(xì)胞結(jié)合到釉質(zhì)表面。amelin蛋白可起蛋白水解酶的功能。這已通過從丙烯酰胺凝膠切下并電洗脫主要融合蛋白帶進(jìn)行了檢測(cè)。在室溫溫孵過夜后,融合蛋白出現(xiàn)3條帶。4℃溫孵的對(duì)照只產(chǎn)生1條帶。這說明在較高溫度降解發(fā)生。要確定是否amelin事實(shí)上起蛋白水解酶的功能需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明提供編碼對(duì)細(xì)胞結(jié)合功能域有特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)是硬組織基質(zhì)的成分并介導(dǎo)與細(xì)胞表面的接觸。圖2描述該蛋白質(zhì)的編碼序列并且該序列從核苷酸的95位延伸到1361位。細(xì)胞結(jié)合功能域的新組合占據(jù)969位到1259位核苷酸。各個(gè)結(jié)合功能域可以現(xiàn)有形式被組合或以不同氨基酸周圍的前后關(guān)聯(lián)部分展現(xiàn)或被結(jié)合進(jìn)入非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物中。所述核苷酸序列和衍生的蛋白質(zhì)序列均可首先用作按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的amelin蛋白質(zhì)的人工表達(dá)工具(Ausubel等,1994),其次作為肽化學(xué)合成的資料。所述序列可被用于建立硬組織形成中失調(diào)的鑒別之用的診斷標(biāo)準(zhǔn),和作為在組織工程中生產(chǎn)生物材料的手段。此外,本發(fā)明提供含有位于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下游的所要求的序列的表達(dá)載體,以及生產(chǎn)和分離amelin的方法,這些方法基于所述表達(dá)載體的使用。
本發(fā)明涉及與含至少一個(gè)能介導(dǎo)多肽錨著于細(xì)胞粘著分子的序列元件的多肽相關(guān)的全部釉質(zhì)基質(zhì)。
如下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的,根據(jù)術(shù)語“釉質(zhì)基質(zhì)相關(guān)多肽”,就其最廣泛的意義來說,意味著一種是釉質(zhì)基質(zhì)蛋白質(zhì)或具有類似性質(zhì)即能介導(dǎo)釉質(zhì)和細(xì)胞表面之間接觸的合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的多肽。
在本說明書和權(quán)利要求中,術(shù)語“多肽”包括具有至少兩個(gè)氨基酸殘基和最多10個(gè)氨基酸殘基的短肽和寡肽(11-100個(gè)氨基酸殘基)以及蛋白質(zhì)(包括可通過被糖基化,被脂質(zhì)化,或通過包含輔基而被化學(xué)修飾的至少一個(gè)短肽,寡肽,或多肽的功能實(shí)體)。該多肽定義還包括動(dòng)物包括人中的肽/蛋白質(zhì)的天然形式以及以任何形式的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化任何種類的宿主而得的重組蛋白質(zhì)或肽,并且包括化學(xué)合成的肽。
本發(fā)明的已被稱做amelin蛋白質(zhì)的多肽不同于已知的enamelin質(zhì)牙釉蛋白和enamalin因?yàn)樗鼈兒兄辽僖粋€(gè)能介導(dǎo)該多肽錨著于細(xì)胞粘著分子的序列元件。特別是,它們含有一個(gè)選自包含四肽DGEA(Asp-Gly-Glu-Ala),VTKG(Val-Thr-Lys-Gly),EKGE(Glu-Lys-Gly-Glu)和DKGE(Asp-Lys-Gly-Glu)的序列元件。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是有氨基酸序列SEQ ID NO2或其類似物或其變異體的多肽以及有氨基酸序列SEQ ID NO4或其類似物或其變異體的多肽,和有氨基酸序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的亞序列的多肽。
進(jìn)一步說,本發(fā)明涉及編碼能介導(dǎo)釉質(zhì)和細(xì)胞表面之間的接觸的多肽的核酸片段。通過術(shù)語“核酸”意指作為DNA或RNA存在的高分子量多核苷酸并且可是單鏈或雙鏈。
雖然編碼包含SEQ ID NO2的氨基酸殘基1到407之多肽的核酸片段和編碼包含SEQ ID NO4的氨基酸殘基1到302之多肽的核酸片段是優(yōu)選實(shí)施方案,本發(fā)明還涉及編碼有SEQ ID NO2中所顯示的氨基酸序列或其類似物或其變異體之多肽的核酸片段并涉及編碼有SEQ ID NO4顯示的氨基酸序列或其類似物或其變異體之多肽的核酸序列。
術(shù)語“有SEQ ID NO2(或SEQ ID NO4)顯示的氨基酸序列或其類似物或其變異體之多肽”意指有氨基酸序列SEQ ID NO2(或SEQ ID NO4)之多肽以及有所述序列的類似物或變異體之多肽,它們當(dāng)本發(fā)明的核酸片段在適合的表達(dá)系統(tǒng)中被表達(dá)時(shí)被產(chǎn)生并且能介導(dǎo)釉質(zhì)和細(xì)胞表面之間的接觸,例如通過包含在組織培養(yǎng)中的細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)形成細(xì)胞的測(cè)試系統(tǒng)所證實(shí)的。通過加入多肽片段測(cè)試該多肽的濃度依賴型生物活性。通過顯微鏡觀察證實(shí)如果該片段能競(jìng)爭(zhēng)過細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)和細(xì)胞之間的接觸,則細(xì)胞就從基質(zhì)脫離。已知培養(yǎng)的細(xì)胞粘著到纖連蛋白,骨橋蛋白,膠原,層粘連蛋白和玻連蛋白。通過蛋白質(zhì)的RGD細(xì)胞附著功能域介導(dǎo)細(xì)胞結(jié)合活性。Amelin含有擇一的細(xì)胞結(jié)合功能域DGEA和VTKG。例如通過用amelin,BSA或纖連蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)皿可檢測(cè)細(xì)胞附著。通過檢測(cè)內(nèi)源性N-乙酰-β-D-氨基己糖苷酯酶可對(duì)結(jié)合UMR大鼠骨肉瘤細(xì)胞做定量測(cè)定。
因此類似物或變異體是并不精確地具有SEQ ID NO2或SEQ IDNO4中所顯示的氨基酸序列,但仍能如上面定義的介導(dǎo)釉質(zhì)和細(xì)胞表面的接觸。例如,一般說,這樣的多肽當(dāng)與實(shí)施例中描述的amelin蛋白質(zhì)相比較時(shí)將是在氨基酸組成或翻譯后修飾例如糖基化或磷酸化方面有一定程度不同的多肽。
因此在本發(fā)明上下文中使用術(shù)語“類似物”或“變異體”指與從如實(shí)施例中描述的amelin蛋白質(zhì)得到的特有氨基酸序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO4相類似的氨基酸組成或序列的蛋白質(zhì)或多肽,允許其有少數(shù)改變氨基酸序列的變異例如氨基酸的缺失,替換或插入或它們的組合而產(chǎn)生amelin蛋白質(zhì)類似物。這些修飾可產(chǎn)生所述類似物的有趣和有用的新特性。可從動(dòng)物或人得到類似物多肽或蛋白質(zhì)或可它們可有部分或完全的合成來源。還可通過使用重組DNA技術(shù)得到該類似物。
因此本發(fā)明的一個(gè)重要的實(shí)施方案涉及其中至少一個(gè)氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基替換的多肽和/或其中至少一個(gè)氨基酸殘基已被缺失或被加入以至引起一個(gè)含不同于SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中顯示的氨基酸序列或如下面定義的氨基酸序列的亞序列但必須有如上面定義的amelin活性的多肽。
本發(fā)明的一個(gè)有趣的實(shí)施方案涉及一種多肽,它是本發(fā)明的含6到300氨基酸的多肽的亞序列,例如至少10個(gè)氨基酸,至少30個(gè)氨基酸,如至少60,90或120個(gè)氨基酸,至少150個(gè)氨基酸或至少200個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的特別重要的實(shí)施方案是含SEQ ID NO2(amelin1)中氨基酸1-407的多肽和含SEQ ID NO4(amelin2)中氨基酸殘基1-324的多肽。
已將氨基酸序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO4與已知氨基酸序列做了比較。與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(與其同源性最高),即牙釉蛋白和膠原IV的同源(同一性)程度是非常的低,分別是23%和26%。同一性散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中并且不限于特殊區(qū)域。在這方面應(yīng)該注意amelin不含重復(fù)的三連基元,相反膠原總被重復(fù)的三連基元,G-X-Y所編碼。對(duì)膠原IV和牙釉蛋白的同源性可能由于在兩個(gè)蛋白質(zhì)中的高含量的脯氨酸。因此看來amelin蛋白質(zhì)與先前已知細(xì)胞外蛋白質(zhì),特別是釉質(zhì)基質(zhì)蛋白質(zhì)僅有微弱的類似性。
本發(fā)明的一個(gè)重要實(shí)施方案涉及有一種氨基酸序列的多肽,其中的連續(xù)的一串20個(gè)氨基酸與選自SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所顯示的氨基酸序列的同樣長(zhǎng)度的一串氨基酸有至少80%程度的同源性。
與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中顯示的多肽有至少80%如至少85%(例如至少90%)同源性或同一性的本發(fā)明多肽序列構(gòu)成重要的實(shí)施方案。由于SEQ ID NO2和SEQ ID NO4顯示的序列看上去相當(dāng)獨(dú)特,本發(fā)明范圍還包括對(duì)選自SEQ ID NO2或SEQ IDNO4中顯示的氨基酸序列的類似連續(xù)一串20個(gè)氨基酸的同源程度至少是25%,如至少50%或至少75%的多肽。可從其他物種,例如哺乳動(dòng)物如小鼠,兔,豚鼠,豬,?;蛉说念愃频鞍踪|(zhì)得到這類序列。
通過使用本申請(qǐng)中公開的序列,本領(lǐng)域技術(shù)人員將能檢測(cè),克隆,測(cè)序,生產(chǎn),和研究amelin的人譯本。由于最方便的可用牙齒材料是被拔掉或切下的牙齒,主要是第三磨牙或贅生牙,一個(gè)實(shí)際問題是缺少原初材料。這些牙齒的發(fā)育通常相當(dāng)晚并因此參與基質(zhì)形成的細(xì)胞遠(yuǎn)在第二期之后或不再出現(xiàn)。
另一種選擇是,可從合用的組織培養(yǎng)得到原初材料,檢測(cè)其中提取的RNA以測(cè)定amelin信使的存在。在人骨肉瘤細(xì)胞(Sao2細(xì)胞)的情況得到Northern印跡陽性,盡管陽性RNA長(zhǎng)度與大鼠amelinmRNA相比要小得多。
因此,建立人骨肉瘤細(xì)胞(Saos2細(xì)胞)cDNA文庫以便發(fā)現(xiàn)代表一個(gè)或多個(gè)人類amelin或amelin樣結(jié)構(gòu)的cDNA。以類似方式,從最未發(fā)育的牙齒建立cDNA庫并用amelin探針或用從Saos2庫得到的探針進(jìn)行篩選。
術(shù)語“序列同源性”意指在多肽氨基酸的同一性和位置方面,相匹配的兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸區(qū)段中氨基酸序列的同一性。
因此本文使用術(shù)語“同源性”以解釋一個(gè)給定的多肽的氨基酸序列和在SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中顯示的氨基酸序列間同一性的程度??蓮囊粋€(gè)核苷酸序列如一個(gè)DNA或RNA序列,例如通過如下面定義的雜交得到的或可通過常規(guī)氨基酸測(cè)序方法得到的這樣的序列推斷與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4中顯示的氨基酸序列比較的氨基酸序列。優(yōu)選以成熟多肽的氨基酸序列(即不考慮任何先導(dǎo)序列)確定同源程度。一般說,當(dāng)比較核苷酸序列時(shí)為確定它們的內(nèi)部同源性只使用編碼區(qū)。
其中的一個(gè)方面是,本發(fā)明涉及編碼如上定義的本發(fā)明多肽的核酸片段。特別是,本發(fā)明涉及基本上包含SEQ ID NO1中顯示的序列或基本上包含SEQ ID NO3中顯示的序列的核酸片段。
本發(fā)明還涉及與含SEQ ID NO1中顯示的核酸序列或SEQ IDNO3中顯示的核酸序列的核酸片段或所述序列的部分核酸片段雜交的核酸片段,而它們?cè)趪?yán)謹(jǐn)條件例如5毫摩爾單價(jià)離子(0.1×SSC),中性pH和65℃下是穩(wěn)定的。
在另一方面,本發(fā)明涉及至少18個(gè)核苷酸的SEQ ID NO1中顯示的核苷酸序列或SEQ ID NO3中顯示的核苷酸序列的類似物或亞序列,它們1.與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中顯示的序列有至少90%同源性,和/或2.編碼一種多肽,其氨基酸序列與SEQ ID NO2或SEQ IDNO4中顯示的氨基酸序列至少有80%同源性。
本發(fā)明還涉及編碼含氨基酸序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的亞序列之多肽的核酸序列。在本說明書和權(quán)利要求中,術(shù)語“亞序列”指優(yōu)選有至少15個(gè)核苷酸,更優(yōu)選至少有18個(gè)核苷酸,并最優(yōu)選有至少21個(gè)核苷酸的序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,本發(fā)明核酸片段的亞序列或類似物將包括至少48個(gè)核苷酸,如至少75個(gè)核苷酸或至少99個(gè)核苷酸?!皝喰蛄小睉?yīng)符合至少上述標(biāo)準(zhǔn)1)和2)中之一或應(yīng)與含SEQ ID NO1中顯示的核苷酸序列或SEQ ID NO3顯示的核苷酸序列的核酸片段雜交。
眾所周知在PCR技術(shù)中如本文描述的小片段是有用的。這類片段和亞序列可在其他應(yīng)用中作為鑒別如實(shí)施例4中描述的本發(fā)明核苷酸序列的mRNA片段的探針。
關(guān)于本發(fā)明的核酸片段的術(shù)語“類似物”意指編碼功能上類似于由SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所編碼的多肽的一種多肽的核酸片段,因?yàn)槿缟鲜鰷y(cè)試所證實(shí)的該類似物能介導(dǎo)多肽錨著于細(xì)胞粘著分子。
眾所周知同一氨基酸可被不同密碼子編碼,密碼子的利用特別涉及所論及的生物表達(dá)核苷酸序列時(shí)的偏愛。因此,本發(fā)明核酸片段的一個(gè)或一個(gè)以上的核苷酸或密碼子可被其他當(dāng)表達(dá)時(shí)則產(chǎn)生相同于或基本上相同于所談到的核酸片段編碼的多肽的核苷酸或密碼子改變。
考慮到少數(shù)核苷酸變異對(duì)介導(dǎo)上述測(cè)試證明的釉質(zhì)與細(xì)胞表面之間的接觸沒有明顯的相反作用,在本上下文中還使用術(shù)語“類似物”以指明編碼構(gòu)成amelin樣多肽的氨基酸序列的核酸片段。
術(shù)語“明顯的相反作用”意指類似物的活性(當(dāng)按上面描述的而確定時(shí))應(yīng)至少10%,更優(yōu)選至少20%,甚至更優(yōu)選至少25%如至少50%的天然amelin附著或脫離活性??蓮囊粋€(gè)生物體如一個(gè)動(dòng)物或一個(gè)人得到同源核酸片段或核苷酸序列,或它們可以是部分或完全合成來源的。還可通過使用重組DNA技術(shù)得到該類似物。
而且,術(shù)語“類似物”和“亞序列”是要考慮到序列中的變異如一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸替換,插入(包括內(nèi)含子),添加和重排,這些變異對(duì)由核酸片段或其序列編碼的多肽沒有任何基本上的相反作用。
術(shù)語“替換”意指用一個(gè)或一個(gè)以上不同的核苷酸替換全長(zhǎng)核苷酸序列中的一個(gè)或一個(gè)以上的核苷酸,“添加”被理解為意指在全長(zhǎng)核苷酸序列任何一端加入一個(gè)或一個(gè)以上的核苷酸,“插入”意指在全長(zhǎng)核苷酸序列內(nèi)部引入一個(gè)或一個(gè)以上的核苷酸序列,“缺失”意指無論在該序列的任何一端或在序列內(nèi)的任何適當(dāng)位點(diǎn)從全長(zhǎng)核苷酸序列刪除一個(gè)或一個(gè)以上的核苷酸,和“重排”意指在該核酸內(nèi)或多肽序列內(nèi)分別互換兩個(gè)或兩個(gè)以上的核苷酸殘基。然而,該核酸片段還可通過在將其插入到生物體之前或之后的誘變而被修飾。
根據(jù)本發(fā)明在本說明書和權(quán)利要求中就片段,序列,亞序列和類似物所使用的術(shù)語“片段”,“序列”,“亞序列”和“類似物”當(dāng)然應(yīng)被理解為不包含在其天然環(huán)境中的現(xiàn)象,而包含例如被分離的,被純化的,體外或重組形式中的現(xiàn)象。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,可通過從細(xì)胞或組織提取RNA并將其轉(zhuǎn)變成cDNA供隨后的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中使用來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因突變的檢測(cè)和對(duì)amelinRNA的定量??苫诒景l(fā)明的核酸片段如SEQID NO1或SEQ ID NO3中顯示的核酸片段合成PCR引物。用于檢測(cè)和/或定量的這種方法可被用做診斷以高于或低于正常的量表達(dá)mRNA之疾病狀況的診斷方法。
屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有包含能檢測(cè)本發(fā)明核酸片段核苷酸探針的診斷試劑以及診斷amelin表達(dá)失調(diào)(deregulated)的疾病和/或amelin基因被突變的疾病的方法,包括從被懷疑患有存在高于正常量的amelin蛋白質(zhì)或amelin突變形式的疾病的病人取樣進(jìn)行PCR分析,其中樣品與按照上面的描述診斷試劑進(jìn)行接觸,使任何核酸片段得到擴(kuò)增并確定樣品中的任何一致的或同源的核酸片段的存在。另一方面,本發(fā)明還涉及含根據(jù)本發(fā)明amelin多肽的診斷試劑。
用重組DNA技術(shù)可生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的一個(gè)重要的實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的核酸片段的表達(dá)系統(tǒng)。特別是,本發(fā)明涉及可復(fù)制表達(dá)載體,它載有根據(jù)本發(fā)明的核酸片段并能調(diào)節(jié)該核酸片段的表達(dá)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)有一種攜帶根據(jù)本發(fā)明表達(dá)載體的生物。本發(fā)明這方面可使用的生物包括微生物如芽孢桿菌屬,埃希氏桿菌屬或沙門氏菌屬細(xì)菌,酵母如酵母屬,畢赤氏酵母屬,原生動(dòng)物或從多細(xì)胞生物得到的細(xì)胞如真菌,昆蟲細(xì)胞,植物細(xì)胞,哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系。若生物體是細(xì)菌,該細(xì)菌最好是埃希氏菌屬,例如E.coli。無論使用何種類型的生物,本發(fā)明的核酸片段或直接或用適當(dāng)?shù)妮d體被引入到該生物中。另外選擇是,通過直接或用一個(gè)表達(dá)載體引入本發(fā)明的核酸片段或類似物或其亞序列可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中生產(chǎn)多肽。
核酸片段或其類似物或其亞序列還可被克隆到適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定表達(dá)載體中,然后被放入適當(dāng)?shù)募?xì)胞系。然后根據(jù)在適合于所使用的載體和細(xì)胞系的條件下產(chǎn)量的水平來選擇產(chǎn)生需要多肽的細(xì)胞。選出的細(xì)胞被進(jìn)一步培養(yǎng)并形成所需要多肽的十分重要和連續(xù)不斷的來源。被用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的生物也可以是高等生物例如動(dòng)物。
本發(fā)明核酸序列的一個(gè)特殊類似物的實(shí)例是含SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中顯示的DNA序列或其部分的DNA序列并且該序特別適合在E.coli中表達(dá)。當(dāng)與適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列一起被插入到E.coli中時(shí),該DNA序列導(dǎo)致基本上具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4或其一部分的多肽的表達(dá)。因此,該DNA序列包含被E.coli所識(shí)別的特異密碼子。
在本上下文中,術(shù)語“基因”被用于指明參與產(chǎn)生多肽鏈的核酸序列并且它包括編碼區(qū)前后的區(qū)域(5’上游和3’下游序列)以及間隔序列,位于各編碼區(qū)段,外顯子之間或在5’上游或3’下游區(qū)域內(nèi)的內(nèi)含子。5’上游區(qū)域包括控制基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列,典型的是啟動(dòng)子。3’下游區(qū)包括參與基因轉(zhuǎn)錄終止的序列和非強(qiáng)制性地包括負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄物的聚腺苷酸化的序列和3’非翻譯區(qū)。本發(fā)明還涉及含如上述編碼本發(fā)明多肽核酸片段的表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)包含能介導(dǎo)所述核酸片段表達(dá)的5’側(cè)翼序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含編碼本發(fā)明多肽或如本文定義的融合多肽的核酸序列。在一個(gè)特別重要的實(shí)施方案中,本發(fā)明的核酸片段或類似物或其亞序列或如本文定義的本發(fā)明融合核酸片段可被可復(fù)制表達(dá)載體攜帶,后者能在宿主生物體或細(xì)胞系中復(fù)制。
該載體可特別是質(zhì)粒,噬菌體,粘粒,微型染色體或病毒。在本發(fā)明的一個(gè)有趣的實(shí)施方案中載體在被引入進(jìn)宿主細(xì)胞時(shí),被整合到該宿主細(xì)胞的基因組中。
在本發(fā)明的一個(gè)特別方面,以產(chǎn)生融合多肽為目的,本發(fā)明的核酸可包括編碼不同于或相同于本發(fā)明多肽的另一核苷酸片段,它在閱讀框內(nèi)被融合于編碼amelin多肽的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或其類似物所顯示之序列的核酸片段。在使用DNA技術(shù)時(shí),融合的核酸序列可被插入到適當(dāng)?shù)妮d體或基因組中。另外的選擇是,核酸片段之一被插入到已經(jīng)含有其他核酸片段的載體或基因組中。通過分別插入兩個(gè)核酸片段并允許表達(dá)發(fā)生也可產(chǎn)生融合多肽。宿主生物(可屬于原核生物來源或真核生物來源)在保證融合序列表達(dá)的條件下生長(zhǎng)。然后用適當(dāng)方法純化融合蛋白并從其融合配偶體分離本發(fā)明的多肽。因此,本發(fā)明的一個(gè)方面涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法,包括如下步驟
(a)將本發(fā)明的一個(gè)核酸片段插入到一個(gè)表達(dá)載體中,(b)用步驟(a)中產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗魃铮?c)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)步驟(b)中產(chǎn)生的宿主生物以表達(dá)多肽,(d)收獲多肽,和(e)非強(qiáng)制性地進(jìn)行多肽的轉(zhuǎn)錄后修飾。
如上描述的一種方法也屬于本發(fā)明范圍內(nèi),其中通過包含一個(gè)或一個(gè)以上的步驟的方法如用固定化的amelin多肽或與所述多肽起反應(yīng)的抗體進(jìn)行親和層析和/或其他層析以及電泳方法分離所產(chǎn)生的多肽。
作為熱處理,化學(xué)處理(甲醛,戊二醛等)或酶處理(肽酶,蛋白水解酶和蛋白修飾的酶)的結(jié)果,如上述產(chǎn)生的多肽可受到翻譯后修飾。與其天然產(chǎn)生環(huán)境相比,在生物體中產(chǎn)生時(shí),該多肽可以一種不同的方式被加工。例如,糖基化通常在高等生物如酵母或最好是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)多肽時(shí)完成。正常情況下發(fā)現(xiàn)糖基化與氨基酸殘基天冬酰胺,絲氨酸,蘇氨酸或羥脯氨酸有關(guān)。這對(duì)去除或改變由所談及的宿主生物引起的加工特點(diǎn)可能是或不是有利的。
按照本發(fā)明,繼多肽在一個(gè)生物體或一個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)之后,該多肽可被如此使用或可先從生物體或細(xì)胞系被純化。如果多肽被表達(dá)成一種被分泌的產(chǎn)物,它可被直接純化。如果多肽被表達(dá)成一種結(jié)合物,在純化前它可能需要宿主的部分或完全破碎。用于多肽純化的方法的實(shí)例是(i)用抗體進(jìn)行免疫沉淀或親和層析,(ii)用適當(dāng)?shù)呐浠M(jìn)行親和層析,(iii)其他層析方法如凝膠過濾,離子交換或高效液相層析或上述之中的任何衍生方法,(iv)電泳方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳和等電聚焦,(v)任何其他專門增溶溶解和/或純化方法。
本發(fā)明還涉及基本純的amelin多肽。在本上下文中,術(shù)語“基本純”被理解為意指所談及的多肽基本上沒有其他成分,例如其他多肽或碳水化合物,它們可形成于多肽生產(chǎn)和/或回收過程中或另外被發(fā)現(xiàn)與多肽在一起。蛋白質(zhì)純度可以例如通過SDS凝膠電泳來評(píng)估。
本發(fā)明的高純度多肽在該多肽被用于組合物時(shí)可能是有利的。還由于其高純度,可以比常規(guī)低純度多肽低的數(shù)量將基本純的多肽用于大多數(shù)目的。
在本發(fā)明的一個(gè)方面,可從表達(dá)本發(fā)明多肽的適當(dāng)細(xì)胞系獲得純的多肽。還可通過熟知的液相或固相肽合成方法利用多肽序列的各個(gè)氨基酸的連續(xù)偶聯(lián)制備本發(fā)明多肽。另外的選擇是,可通過各個(gè)氨基酸的偶聯(lián)形成多肽序列的片段然后再連接這些片段以至形成需要的多肽來合成多肽。因此這些方法構(gòu)成本發(fā)明的另一有趣方面。
另一方面,本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防牙周疾病的方法,該方法包括根據(jù)本發(fā)明對(duì)需要它的病人施用治療或預(yù)防有效量的多肽。期望本發(fā)明多肽將參與牙骨質(zhì)形成并因此促進(jìn)牙周韌帶的固定。
通過amelinRNA序列在骨形成細(xì)胞中的存在表明amelin蛋白在人工局部骨形成的過程(context)的用途通過Northern雜交在大鼠股骨以及顱蓋的骨組織中發(fā)現(xiàn)了滿足17頁1-5行給出的標(biāo)準(zhǔn)的amelinRNA的一個(gè)大小變異體。用amelin探針的原位雜交將該RNA定位于與生長(zhǎng)的骨相關(guān)連的成骨細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)中形成骨的大鼠顱蓋細(xì)胞在整個(gè)骨形成期間也一直表達(dá)amelinRNA的骨-變異體(C.Brandsten,C.Christersson和T.Wurtz,未發(fā)表)在天然和實(shí)驗(yàn)骨形成系統(tǒng)中amelinRNA的存在表明amelin蛋白在骨形成中的作用??梢韵胂笸獠考尤氲腶melin肽在試管內(nèi)和醫(yī)療應(yīng)用中都加速或介導(dǎo)骨形成。
而且,本發(fā)明涉及修復(fù)牙齒中損傷的方法,該方法包括向需要此種治療的病人施用與充填材料相結(jié)合的根據(jù)本發(fā)明的有效量的多肽。
本發(fā)明還涉及接合兩個(gè)骨單體的方法和涉及將植入體有效結(jié)合到骨中的方法。與此關(guān)聯(lián)的內(nèi)容中,如下面詳細(xì)描述的可將多肽與載體聯(lián)系起來施用。而且,本發(fā)明多肽可被用于促進(jìn)或引起選自骨,釉質(zhì),牙質(zhì)或牙骨質(zhì)的硬組織的礦化。
另外,本發(fā)明還涉及促進(jìn)植入器件或經(jīng)皮器件從例如與在US4,578,079中描述的方式的生物相容性的方法,該方法包括根據(jù)本發(fā)明用有效量的多肽覆蓋該植入器件,由此例如允許肌肉或韌帶與植入物接觸。
本發(fā)明還涉及通過施用本發(fā)明的多肽將上皮錨著于硬組織表面的方法,該硬組織表面選自與牙植入物相關(guān)連的釉質(zhì),牙質(zhì)或牙骨質(zhì)。而且,本發(fā)明涉及防止與牙的植入關(guān)聯(lián)之上皮的生長(zhǎng),該方法包括給需要此種治療的病人施用預(yù)防有效量的根據(jù)本發(fā)明的多肽,例如由此防止上皮生長(zhǎng)進(jìn)入牙周韌帶。
本發(fā)明的一個(gè)非常重要的方面涉及含amelin多肽和生理可接受賦形劑的一種組合物。該組合物可包含本發(fā)明的一種純化了的重組多肽。特別的但非絕對(duì)的是,本發(fā)明涉及適合于局部施用,例如用于口腔黏膜表面,的組合物。
適合于局部施用的本發(fā)明組合物可以是擦劑,凝膠,溶液,懸浮液,糊劑,噴霧劑,粉劑,牙膏,和漱口液。
本發(fā)明包括通過用牙膏制劑,例如常用類型的市售牙膏,與本發(fā)明多肽混合配制的牙膏,它可在常規(guī)的基礎(chǔ)上被使用以預(yù)防例如牙周炎。
藥膏將常含有磨光劑,表面活性劑,膠凝劑和其他賦形劑如調(diào)味劑和著色劑。磨光劑可被選自那些在牙制劑中正在被用于此目的的材料。適合的實(shí)例是水不溶性偏磷酸鈉或鉀,水合或無水磷酸二鈣,焦磷酸鈣,硅酸鋯或其混合物。特別有用的磨光劑是各種形式的硅石。磨光劑通常被細(xì)分,具有小于10微米的顆粒,例如2-6微米。磨光劑可以10-99%牙膏重量被使用。一般牙膏制劑將含20-75%的磨光劑。
適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┩ǔ1话谘栏嘀苿┲小1砻婊钚詣┮话闶撬苄缘姆窃砗铣捎袡C(jī)去污劑。適合的去污劑是下述構(gòu)層的水溶性鹽高級(jí)脂肪酸單酸甘油酯單硫酸鹽(例如氫化椰子脂肪酸單酸甘油酯單硫酸鈉);高級(jí)烷基硫酸鹽(例如月桂硫酸納)烷芳香基磺酸鹽(例如十二烷基苯磺酸鈉);和高級(jí)烷基磺酰乙酸(例如月桂基磺乙酸鈉)。此外,在?;锌墒褂煤?2-16碳原子的低級(jí)酯族氨基羧酸的飽和高級(jí)酯族酰胺并且其中的氨基酸部分得自有2-6碳原子低級(jí)酯族飽和單氨基羧酸,如甘氨酸,肌氨酸,丙氨酸,3-氨基丙酸和纈氨酸的脂肪酸胺,特別是N-月桂基,肉豆蔻基和棕櫚酰肌氨酸鹽化合物。若需要的話也可包括常規(guī)的非離子表面活性劑。
表面活性物質(zhì)一般以牙膏制劑重量的約0.05-10%的量存在,典型的約0.5-5%。
典型牙膏流體將主要包括水,甘油,山梨糖醇,丙二醇或其混合物。一個(gè)有利的混合物是水和甘油,最好伴有山梨糖醇。可使用膠凝劑如天然或合成樹膠或樹膠樣物質(zhì),例如愛爾蘭蘚或羧甲基纖維素鈉。其他可用樹膠如西黃蓍膠,聚乙烯吡咯烷酮和淀粉。它們通常以牙膏重量的約10%,典型的約為牙膏重量的0.5-5%被使用。
藥膏的pH基本上是中性的,如約6-8的pH。若需要的話,可加入少量調(diào)pH試劑例如少量酸如檸檬酸或堿性物質(zhì)。
該牙膏還可含有其他物質(zhì)如可溶性糖精,調(diào)味油(例如綠薄荷油,胡椒薄荷油,冬青油),著色劑或增白劑(例如二氧化鈦),防腐劑(例如苯甲酸鈉),乳化劑,硅氧烷類,乙醇,薄荷醇和葉綠素化合物(例如葉綠酸鈉銅)。
本發(fā)明多肽在上述類型或下面討論的類型的牙膏中的含量通常在以總牙膏組成重量所計(jì)算的重量的1-20%范圍內(nèi),如在重量的5-20%的范圍內(nèi),特別是約為重量的10-20%如重量的12-18%。特別指出較后面的范圍用于治療齦炎和牙周炎的牙膏。然而,有興趣提供有低含量的本發(fā)明多肽的牙膏,這類牙膏將適合于防止或預(yù)防性目的。對(duì)于這類目的,感興趣的多肽含量范圍可以是從約為重量的0.1到約5%。
一種特別類型的牙膏是基本上透明的凝膠。這類牙膏可完全不含磨光劑或可含如此細(xì)分的磨光劑形式以至凝膠看起來仍基本上清澈。此凝膠牙膏類型可獨(dú)自被使用也可與含上面討論的磨光劑的牙膏結(jié)合使用。
可以許多不同方式將本發(fā)明的一種牙膏制劑的多肽與其他牙齒或口腔制劑混合。通常,將優(yōu)選形成本發(fā)明多肽的懸浮液并將該amelin懸浮液與其他制劑結(jié)合成膏的形式。另外的選擇是,可將amelin粉與其他制劑成分混合(先與干制劑成分混合然后與液體制劑成分或半液體制劑成分混合)或?qū)melin本身混合進(jìn)另外完成的制劑中。一般說,最好將amelin粉與磨光劑物質(zhì)或牙粉一起加入。
在進(jìn)行amelin或其他水不溶性或水微溶性多肽類似物的混合時(shí),最好考慮多肽的物理和化學(xué)性質(zhì),在牙膏或牙粉或本文討論的其他制劑方面的考慮將通常是十分簡(jiǎn)單并將通常在于加入amelin多肽到干燥的,溶解的或懸浮形式的制劑或其成分中。
局部施用可以是在或貼近于所談及的呈現(xiàn)病變的身體局部的一種施用,例如在身體外部如口腔黏膜表面。此應(yīng)用可以是簡(jiǎn)單涂抹該組合物,或可借助任何適于促進(jìn)實(shí)現(xiàn)組合物與病理損害之間接觸的器具。該組合物可被滲漬或散布于襯墊,膏藥,紙片,紗布,海綿材料,cottonwool piece等??扇我馐褂靡环N該組合物注入形式注入進(jìn)或接近損害處。
根據(jù)本發(fā)明,局部用組合物可包含1-80%重量的活性化合物(基于該制劑總重量),如0.001-25%w/w的活性化合物,例如0.1-10%,0.50-5%,或2-5%。多于一種的活性成分化合物可被參合到該組合物中;即含與其他藥物化合物合在一起的amelin蛋白的組合物也在本發(fā)明范圍內(nèi)。按常規(guī)該組合物一天使用1-10次,取決于損害的類型,嚴(yán)重性和部位。
為局部應(yīng)用,可根據(jù)常規(guī)用藥實(shí)踐配制該組合物,如在口腔局部用藥通常使用藥物可接受性賦形劑。任何具體組合物制劑中使用的載體性質(zhì)將取決于想要施用該組合物的方法??捎糜诮M合物的非水載體可包括固體或液體如潤(rùn)滑劑,溶劑,濕潤(rùn)劑,增稠劑和粉劑。預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的組合物可僅含有多肽,非強(qiáng)制性地與水混合,但該組合物也可含與載體,稀釋劑或黏合劑如纖維素聚合物,瓊脂,藻酸鹽或明膠混合的多肽,它們對(duì)所談及的目的是可接受的。就牙科應(yīng)用而言,載體或稀釋劑為牙科學(xué)可接受的是便利的。目前優(yōu)選使用含水溶性聚合物的載體。這類聚合物的非限制性實(shí)例是羧基纖維素鈉,微晶纖維素,羥乙基纖維素,羥基丙基纖維素,甲基纖維素,高分子聚丙烯酸,藻酸鈉,丙二醇藻酸酯,山噸樹膠,瓜耳樹膠,洋槐豆樹膠,改性淀粉,明膠,果膠或它們的結(jié)合物。與活性蛋白質(zhì)組分混合后,這些水溶性聚合物可任意被轉(zhuǎn)變成凝膠或膜,產(chǎn)生由于其便利的物理性質(zhì)而易于應(yīng)用的組合物。該組合物可非強(qiáng)制性地含為促進(jìn)儲(chǔ)存穩(wěn)定性目的的穩(wěn)定劑或防腐劑。
一種適當(dāng)?shù)馁x形劑是藻酸鹽,例如在EP336967中描述的。
為局部應(yīng)用,該組合物的pH可主要在十分寬的范圍內(nèi)如3-9。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,約4到8的pH是優(yōu)選的。如上述的常規(guī)緩沖試劑可被用于獲得需要的pH。
本發(fā)明制劑還含有其他添加劑如穩(wěn)定劑,防腐劑,增溶劑,螯合劑,凝膠形成劑,pH調(diào)節(jié)劑,抗氧化劑等。而且,可便利的提供改性緩釋制劑,其中活性成分被混合進(jìn)入聚合物基質(zhì),或毫微顆粒,或脂質(zhì)體或微胞,或吸附在離子交換樹脂上,或由聚合物所攜帶。
組合物可根據(jù)常規(guī)用藥實(shí)踐被設(shè)計(jì)并可以是半固體組合物凝膠,膏,混合物。
液體組合物溶液,懸浮液,滲麩液(drench),乳液。
如所指出的,本發(fā)明藥物組合物可包含本發(fā)明多肽本身或其功能衍生物,或此類化合物的結(jié)合物。適當(dāng)?shù)墓δ苎苌飳?shí)施例包括藥用鹽,特別是那些適合于在口腔環(huán)境中使用的藥用鹽。實(shí)施例包括氨基功能的藥用鹽,例如產(chǎn)生陰離子的酸式鹽,它們是藥用可接受性的,特別是在口腔環(huán)境中。實(shí)施例包括磷酸鹽,硫酸鹽,硝酸鹽,碘化物,溴化物,氯化物,硼酸鹽以及從羧酸衍生的陰離子包括醋酸鹽,苯甲酸鹽,硬脂酸鹽等。氨基功能的其他衍生物包括酰胺,酰亞胺,脲,氨基甲酸酯等。
其他適當(dāng)?shù)难苌锇ū景l(fā)明多肽的羧基基團(tuán)衍生物,包括鹽,酯和酰胺。實(shí)施例包括帶有藥物可接受性陽離子的鹽,例如鋰,鈉,鉀,鎂,鈣,鋅,鋁,正鐵,亞鐵,銨和低級(jí)(C1-6)-烷基銨鹽。酯包括低級(jí)烷基酯。
將用數(shù)個(gè)工作實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明,它們不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)本應(yīng)用范圍的限制。
除非另有說明,使用常規(guī)方法和試劑盒。按照各個(gè)提供者所給的說明書使用試劑盒。本文未描述或提及的方法中的步驟和試劑被解釋在分子生物學(xué)現(xiàn)代方法,作者F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.Smith andK.Struhl;John Wiley,NewYork(1994)。所有文字引用在此明確引入作為參考。
圖解圖1在生長(zhǎng)中的第一磨牙中RNA序列的定位。切下四天齡大鼠上頜,將其固定并包埋在石蠟中。用通過Bluescript質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄制備的與mRNA互補(bǔ)的DIG標(biāo)記RNA序列對(duì)整個(gè)磨牙遠(yuǎn)中(distal-mesial)的切片做原位雜交。圖1aamelin,圖1b牙釉蛋白,圖1cI型膠原。
圖2amelin1和2序列。數(shù)個(gè)來自兩個(gè)變異體的重疊序列被確定并排隊(duì)。同一序列被相互對(duì)應(yīng)印出,逗點(diǎn)表示缺少各變異體相對(duì)應(yīng)的序列。最長(zhǎng)的開放閱讀框用單字符密碼氨基酸名稱簡(jiǎn)示。具有兩個(gè)編碼框的部分被劃陰影(核苷酸390-403)。下劃線是被用于篩選含兩個(gè)變異體克降的寡聚物的互補(bǔ)序列(核苷酸248-272和414-430)。方框表示與細(xì)胞表面蛋白相互作用的功能域之共有序列。推測(cè)的多腺苷酸化信號(hào)被雙下劃線(核苷酸1892-1897)。
圖3來自大鼠磨牙的RNA Northern印跡分析。從四天齡大鼠切下第一磨牙。分離RNA,在瓊脂糖凝膠中每泳道4毫克電泳該RNA并將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜。將各泳道與amelin(a)和牙釉蛋白(b)DIG標(biāo)記的RNA探針雜交。kb長(zhǎng)度為已知的RNA(Gibco BRL)的位置被示明于左邊際。
實(shí)施例實(shí)施例1RNA的分離用一個(gè)市售試劑盒(Promega Biotech,RNAgents總RNA分離系統(tǒng))在500升4摩爾的異硫氰酸胍鹽,80毫摩爾EDTA(Chomczynski&Sacchi,1987)中將從4天齡或7天齡Aprague-Dawley大鼠切下的三只生長(zhǎng)中磨牙(B&K Universal,Sollentuna,Sweden)在玻璃-玻璃勻漿器中勻漿。然后用酚-氯仿提取并兩次異丙醇沉淀。溶解RNA于0.2×SET緩沖液(0.2%十二烷基硫酸鈉,4毫摩爾Tris-CIpH7.5,2毫摩爾EDTA)中并通過光密度測(cè)量確定其濃度。
實(shí)施例2cDNA文庫的制備借助于結(jié)合在硅酸鹽樹脂的寡-dT篩選含聚腺苷酸的RNA(mRNA)(Quiagen Oligotex mRNA Midi試劑盒)。從聚腺苷酸末端引發(fā)反轉(zhuǎn)錄,并將雙鏈的甲基化的cDNA連接到λZAP載體臂上并包裝進(jìn)入噬菌體顆粒中(Stratagen ZAP cDNA克隆試劑盒)。擴(kuò)增并鋪平板后,通過與總DIG標(biāo)記的cDNA(見下)選出含常見表達(dá)序列的噬菌體株。從陽性噬菌斑分離噬菌體并借助于ExAssist助噬菌體超感染λZAP感染的Escherichia coli SOLR細(xì)胞將分離的噬菌體轉(zhuǎn)變成質(zhì)粒。為獲得5’端較好的再現(xiàn),還建立了cDNA文庫并在隨機(jī)位點(diǎn)引發(fā)(Stratagen Random Unidirectional Linker-Primer)。用Taq聚合酶,熒光終止子和半自動(dòng)序列測(cè)試系統(tǒng)(Applied Biosystems,TaqDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit)的循環(huán)測(cè)序?qū)υ诨|(zhì)形成細(xì)胞上產(chǎn)生陽性原位雜交信號(hào)的插入片段測(cè)序。用Wisconsin程序組(Genetics Computer Group,Inc.)和DNAid(Fredeic Dardel,fred@botrytis.polytechnique.fr)分析了序列。
實(shí)施例3篩選文庫七天齡大鼠的第一和第二磨牙的cDNA文庫(2×106克隆)噬菌體被鋪平板,并將噬菌體吸附到硝酸纖維素膜(Schleicher andSchull)。影印濾膜與10毫微克/毫升cDNA或膠原-和牙釉蛋白寡核苷酸雜交。雜交在54℃進(jìn)行15小時(shí),并洗濾膜和顯影(BoehringerMannheim,The DIG System)。含牙釉蛋白,膠原或其余常見表達(dá)序列的噬菌體被再克隆兩次并通過用ExAssist助噬菌體(Stratagen)的重復(fù)感染實(shí)現(xiàn)由體內(nèi)剪切使其轉(zhuǎn)變成Bluescript質(zhì)粒。
實(shí)施例4雜交實(shí)驗(yàn)用探針的制備用0.25 mM核苷酸濃度伴以補(bǔ)充到0.1mM的毛地黃毒苷(DIG)-dUTP(Boehringer Mannheim)從有逆轉(zhuǎn)錄酶的富含聚腺苷酸的RNA(Promega Biotech,逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng))產(chǎn)生供篩選文庫用的cDNA探針。
在DIG修飾的UTP(Boehringer Mannheim)存在下,通過噬菌體T7或T3RNA聚合酶(Promega RNA探針Gemini II核心系統(tǒng),Melton等,1994)的體外轉(zhuǎn)錄合成與mRNA互補(bǔ)的RNA探針。含amelin(1700bp)的DNA模板是Bluescript質(zhì)粒,它是通過體內(nèi)剪切從λ噬菌體得到的。而且,通過限制酶切Bluescript SK質(zhì)粒得到牙釉蛋白(700bp)和I型膠原(850bp)序列。用[35S]代替DIG標(biāo)記定量RNA測(cè)定用的探針。
膠原特異性寡核苷酸有5’-CATGTAGGCAATGCTGTTCTTGCAGTGGTAGGTGATGTTCTGGGAGGC-3’序列(Yamada等,1983),而牙釉蛋白特異性寡核苷酸是5’-ATCCACTTCTTCCCGCTTGGTCTTGTCTGTCGCTGGCCAAGCTTC-3’(Lau等,1992)。通過Boehringer方法中的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)用DIG修飾的ddUTP進(jìn)行3’標(biāo)記制備探針。
實(shí)施例5Northern印跡為Northern印跡分析,在50%甲酰氨存在下在使2厘米寬度的每孔中的15毫克總RNA熱變性并在有2.2摩爾甲醛,0.02摩爾N-嗎啉代丙烷磺酸,0.05摩爾醋酸鈉,1摩爾EDTA的瓊脂糖凝膠中電泳(Lehrach等1977)。在20×SSC(3摩爾氯化鈉,0.3摩爾檸檬酸鈉)中RNA被過夜轉(zhuǎn)移到尼龍膜中(Pall Biodyne B TransferMembrane)。用紫外光使該膜交聯(lián)并將其切割成條。加入100毫微克/毫升DIG標(biāo)記的cRNA探針后,各條在50%甲酰氨,5×SSC,2%封閉試劑(Boehringer Mannheim),0.1%N-月桂酰肌氨酸,0.02%十二烷基硫酸鈉(SDS)中68℃預(yù)雜交1小時(shí)并隨后在同樣條件下雜交過夜。然后用2×SSC,0.1%SDS在室溫洗膜5分鐘兩次并用0.1×SSC,0.1%SDS在68℃洗15分鐘兩次。通過磷酸酶偶聯(lián)的抗DIG抗體片段顯現(xiàn)DIG標(biāo)記的RNA的存在(Boehringer Mannheim,The DIGSystem)。
實(shí)施例6溶液雜交來自切下的磨牙的RNA與過量的35S-UTP標(biāo)記互補(bǔ)RNA探針雜交(Mathews等,1989)。40升0.6摩爾氯化鈉,4摩爾EDTA,10毫摩爾二硫蘇糖醇(DTT),0.1%SDS,30毫摩爾Tris-HCI,pH7.5和25%(v/v)甲酰氨的反應(yīng)物含20,000cpm探針和不同量的總RNA。用石蠟油覆蓋該混合物,在70℃溫孵過夜,用1毫升RNA酶溶液(40克RNA酶A,2克RNA酶T1,Boehringer-Mannheim,100克鮭魚色測(cè)試(salmon tests)DNA,Sigma Chemical Co.)稀釋并在37℃酶解1小時(shí)。用100升三氯醋酸(6摩爾)沉淀RNA酶抗性雙鏈RNA,并在玻璃纖維濾器上收集(Whatman GF/C)和在Wallac1409流體閃爍計(jì)數(shù)器中分析之。雜該探針與已知濃度的體外合成mRNA序列雜交的標(biāo)準(zhǔn)曲線被用于將放射性與測(cè)試-RNA中雜交序列的量聯(lián)系起米。
實(shí)施例7原位雜交4℃下用PBS(137毫摩爾氯化鈉,2.7毫摩爾氯化鉀,4.3毫摩爾磷酸氫二鈉,1.4毫摩爾磷酸二氫鉀)中的多聚甲醛固定四天齡Sprague Dawley大鼠的上頜24小時(shí),使其脫水并被包埋在石蠟中。7微米厚的切片被固定在vectabond-coated(Vector)載玻片上。用二甲苯除去石蠟后,在37℃用蛋白水解酶K(20微克/毫升)處理樣品30分鐘,用4%甲酰氨后固定5分鐘,用三乙醇胺和醋酸酐(2.66毫升三乙醇胺在200毫升水中;0.5毫升醋酸酐與該載玻片一起被加入其中)處理并滲沒于2×SSC中,42℃50%甲酰氨處理60分鐘。用含0.5毫微克/微升RNA探針的20微升0.3摩爾氯化鈉,10毫摩爾Tris-HCIpH8.0,1毫摩爾EDTA,Danhardt試劑(Watkins,1994),0.1克/升硫酸葡聚糖,50%甲酰氨覆蓋該樣品。樣品被蓋上蓋玻片,將載玻片保持在濕室中42℃過夜,室溫下用4×SSC洗一次,用2×SSC洗10分鐘三次并用0.1×SSC洗10分鐘三次。通過磷酸酶偶聯(lián)的抗DIG抗體片段(Boehringer Mannheim方法)顯示DIG標(biāo)記的RNA探針的存在。由于內(nèi)源磷酸酶沒觀察到該樣品的染色。
實(shí)施例8amelin基因的依次表達(dá)使用如實(shí)施例7中描述的雜交方法檢測(cè)20或25天齡大鼠中amelin基因的細(xì)胞表達(dá)。制備上頜切片并與amelinRNA探針雜交。在兩個(gè)發(fā)育階段,發(fā)現(xiàn)amelin基因在與根牙骨質(zhì)中新沉積的牙質(zhì)周邊表面鄰近的上皮細(xì)胞中以及在包埋于磨牙中細(xì)胞牙骨質(zhì)中的細(xì)胞中都有表達(dá)。amelin基因表達(dá)進(jìn)一步被定位于分泌著的成釉質(zhì)細(xì)胞以及定位于上皮牙根鞘。此外,從20天齡大鼠的剪切物顯示了在amelin基因表達(dá)被轉(zhuǎn)向分化成釉質(zhì)細(xì)胞前在外圍分泌牙質(zhì)的成牙質(zhì)細(xì)胞中amelin表達(dá)的證據(jù)。綜合起來,這些結(jié)果表明在成牙質(zhì)細(xì)胞和成釉質(zhì)細(xì)胞的分化期間amelin在上皮間充質(zhì)中的相互作用以及amelin可能是與牙骨質(zhì)生成偶聯(lián)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)之一。
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-WO 89/08441(Biora AB;1989年9月21日出版)序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)名稱口腔生物學(xué)中心(B)街P.O.Box 4064(C)城市Huddinge(E)國家瑞典(F)郵編(ZIP)S-141 04(ii)發(fā)明題日新DNA和肽序列及相關(guān)表達(dá)載體(iii)序列號(hào)4(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容PC(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專利發(fā)布號(hào)1.0,版本號(hào)1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特性(A)長(zhǎng)度1939堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵字CDS(B)位置94..1314(xi)序列描述SEQ ID NO1AGAGAGAGAG CCCCAGGAAC AGTCCAGAAA AAAATTAATC TTCTTTTCTT AGAACTGTTT 60TGATTGGCAT CATCAGGCCT GGGAGCACAG TGA ATG TCA GCA TCT AAG ATT CCA 114Met Ser Ala Ser Lys Ile Pro1 5CTT TTC AAA ATG AAG GGC CTG CTC CTG TTC CTG TCC CTA GTG AAA ATG 162Leu Phe Lys Met Lys Gly Leu Leu Leu Phe Leu Ser Leu Val Lys Met10 15 20AGC CTC GCC GTG CCG GCA TTT CCT CAA CAA CCT GGG GCT CAA GGC ATG 210Ser Leu Ala Val Pro Ala Phe Pro Gln Gln Pro Gly Ala Gln Gly Met25 30 35GCA CCT CCT GGC ATG GCT AGT TTG AGC CTT GAG ACA ATG AGA CAG TTG 258Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu Ser Leu Glu Thr Met Arg Gln Leu40 45 50 55GGA AGC TTG CAG GGG CTC AAC GCA CTT TCT CAG TAT TCT AGA CTT GGC 306Gly Ser Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Ser Gln Tyr Ser Arg Leu Gly60 65 70TTT GGA AAA GCA CTT AAT AGT TTA TGG TTG CAT GGA CTC CTC CCA CCG 354Phe Gly Lys Ala Leu Asn Ser Leu Trp Leu His Gly Leu Leu Pro Pro75 80 85CAT AAT TCT TTC CCA TGG ATA GGA CCA AGG GAA CAT GAA ACC CAA CAG 402His Asn Ser Phe Pro Trp Ile Gly Pro Arg Glu His Glu Thr Gln Gln90 95 100CCA TCC TTG CAG CCT CAC CAG CCA GGA CTG AAA CCC TTC CTC CAG CCC 450Pro Ser Leu Gln Pro His Gln Pro Gly Leu Lys Pro Phe Leu Gln Pro105 110115ACT GCT GCA ACC GGT GTC CAG GTC ACA CCC CAG AAG CCA GGG CCT CAT 498Thr Ala Ala Thr Gly Val Gln Val Thr Pro Gln Lys Pro Gly Pro His120 125 130 135CCT CCA ATG CAC CCT GGA CAG CTG CCC TTG CAG GAA GGA GAG CTG ATA 546Pro Pro Met His Pro Gly Gln Leu Pro Leu Gln Glu Gly Glu Leu Ile140 145 150GCA CCA GAT GAG CCA CAG GTG GCG CCA TCA GAG AAC CCA CCA ACA CCC 594Ala Pro Asp Glu Pro Gln Val Ala Pro Ser Glu Asn Pro Pro Thr Pro155 160 165GAG GTA CCA ATA ATG GAT TTT GCC GAT CCA CAA TTC CCA ACA GTG TTC 642Glu Val Pro Ile Met Asp Phe Ala Asp Pro Gln Phe Pro Thr Val Phe170 175 180CAG ATC GCC CAT TCG CTG TCT CGG GGA CCA ATG GCA CAC AAC AAA GTA 690Gln Ile Ala His Ser Leu Ser Arg Gly Pro Met Ala His Asn Lys Val185 190 195CCC ACT TTT TAC CCA GGA ATG TTT TAC ATG TCT TAT GGA GCA AAC CAA 738Pro Thr Phe Tyr Pro Gly Met Phe Tyr Met Ser Tyr Gly Ala Asn Gln200 205 210 215TTG AAT GCT CCT GGC AGA ATC GGC TTC ATG AGT TCA GAA GAA ATG CCT 786Leu Asn Ala Pro Gly Arg Ile Gly Phe Met Ser Ser Glu Glu Met Pro220 225 230GGA GAA AGA GGA AGT CCC ATG GCC TAC GGA ACT CTG TTC CCA GGA TAT 834Gly Glu Arg Gly Ser Pro Met Ala Tyr Gly Thr Leu Phe Pro Gly Tyr235 240 245GGA GGC TTC AGG CAA ACC CTT AGG GGA CTG AAT CAG AAT TCA CCC AAG 882Gly Gly Phe Arg Gln Thr Leu Arg Gly Leu Asn Gln Asn Ser Pro Lys250 255 260GGA GGA GAC TTT ACT GTG GAA GTA GAT TCT CCA GTG TCT GTA ACT AAA 930Gly Gly Asp Phe Thr Val Glu Val Asp Ser Pro Val Ser Val Thr Lys265 270 275GGC CCT GAG AAA GGA GAG GGT CCA GAA GGC TCT CCA CTG CAA GAG GCC 978Gly Pro Glu Lys Gly Glu Gly Pro Glu Gly Ser Pro Leu Gln Glu Ala280 285 290 295AGC CCA GAC AAG GGC GAA AAC CCG GCT CTC CTT TCA CAG ATT GCC CCC1026Ser Pro Asp Lys Gly Glu Asn Pro Ala Leu Leu Ser Gln Ile Ala Pro300305 310GGG GCC CAT GCA GGA CTT CTT GCT TTC CCC AAT GAC CAC ATC CCC AAC1074Gly Ala His Ala Gly Leu Leu Ala Phe Pro Asn Asp His Ile Pro Asn315 320 325ATG GCA AGG GGT CCT GCA GGG CAA AGA CTC CTC GGA GTC ACC CCT GCA1122Met Ala Arg Gly Pro Ala Gly Gln Arg Leu Leu Gly Val Thr Pro Ala330 335340GCT GCA GAC CCA CTG ATC ACC CCT GAA TTA GCA GAA GTT TAT GAA ACC1170Ala Ala Asp Pro Leu Ile Thr Pro Glu Leu Ala Glu Val Tyr Glu Thr345 350 355TAT GGT GCT GAT GTT ACC ACA CCC TTG GGG GAT GGA GAA GCA ACC ATG1218Tyr Gly Ala Asp Val Thr Thr Pro Leu Gly Asp Gly Glu Ala Thr Met360 365 370 375GAT ATC ACC ATG TCC CCA GAC ACT CAG CAG CCA CCG ATG CCT GGA AAC1266Asp Ile Thr Met Ser Pro Asp Thr Gln Gln Pro Pro Met Pro Gly Asn380 385 390AAA GTG CAC CAG CCC CAG GTG CAC AAT GCA TGG CGT TTC CAA GAG CCC1314Lys Val His Gln Pro Gln Val His Asn Ala Trp Arg Phe Gln Glu Pro395 400 405TGACAACCTT GACATAGCAG CTACTTCATG TATGCACAAG CTTTTCAGCT TTGACCCCAT 1374AGCGTACCTT ATTGCTAAAA CACTTGCTAC CCTTCCACAG CGAAGGTATT AAGAGCACTA 1434AGCATGTATT AATAAATACA AGTGCCTAGA AATAGTGTAG GTCCCTTCTT GCTTCCATTC 1494TTATCGAAAT AAAACATATC AACTGTCTCC GTGACTTAGA AATACTATCG ATGATGTCAG 1554AGCAAGTCTG AGTGTCAGCA CTTGGTGATC TAGCATGTAG CTGTCTTAGG CATCATAAAA 1614TTCCTCTTAC TACATGACAT TATTATGCCC AGGAAATGTG ACACCGCTTC TTTCTCTACG 1674CAAAAGCACT TAGTTTCAGA ATTCCAAAGT ATTTCATTTA AACCGTATTA AATGGTGATT 1734GGTGGAGAAT CCTGACTGCT ATTACTGGGT ATCATATATT GGATTTAAAA TTCTTATTTA 1794TAGAATATTT TATTTAATCT AGGAAAAGAA AAGGCAATTG GCCTGTTTTA AATAAAGAAT 1854TTTTCTCACT GAAAATGTCA GGAATTGTAT GCTTATTATT TATATGTATT TAAATAGTAA 1914AGAAAAGCAT ACTCAAAAAA AAAAA1939(2)SEQ ID NO2資料(i)序列特性(A)長(zhǎng)度407氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Ala Ser Lys Ile Pro Leu Phe Lys Met Lys Gly Leu Leu Leu1 5 10 15Phe Leu Ser Leu Val Lys Met Ser Leu Ala Val Pro Ala Phe Pro Gln20 25 30Gln Pro Gly Ala Gln Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu Ser35 40 45Leu Glu Thr Met Arg Gln Leu Gly Ser Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu50 55 60Ser Gln Tyr Ser Arg Leu Gly Phe Gly Lys Ala Leu Asn Ser Leu Trp65 70 75 80Leu His Gly Leu Leu Pro Pro His Asn Ser Phe Pro Trp Ile Gly Pro85 90 95Arg Glu His Glu Thr Gln Gln Pro Ser Leu Gln Pro His Gln Pro Gly100 105 110Leu Lys Pro Phe Leu Gln Pro Thr Ala Ala Thr Gly Val Gln Val Thr115 120 125Pro Gln Lys Pro Gly Pro His Pro Pro Met His Pro Gly Gln Leu Pro130 135 140Leu Gln Glu Gly Glu Leu Ile Ala Pro Asp Glu Pro Gln Val Ala Pro145 150 155 160Ser Glu Asn Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ile Met Asp Phe Ala Asp165 170 175Pro Gln Phe Pro Thr Val Phe Gln Ile Ala His Ser Leu Ser Arg Gly180 185 190Pro Met Ala His Asn Lys Val Pro Thr Phe Tyr Pro Gly Met Phe Tyr195 200 205Met Ser Tyr Gly Ala Asn Gln Leu Asn Ala Pro Gly Arg Ile Gly Phe210 215 220Met Ser Ser Glu Glu Met Pro Gly Glu Arg Gly Ser Pro Met Ala Tyr225 230 235 240Gly Thr Leu Phe Pro Gly Tyr Gly Gly Phe Arg Gln Thr Leu Arg Gly245 250 255Leu Asn Gln Asn Ser Pro Lys Gly Gly Asp Phe Thr Val Glu Val Asp260 265 270Ser Pro Val Ser Val Thr Lys Gly Pro Glu Lys Gly Glu Gly Pro Glu275 280 285Gly Ser Pro Leu Gln Glu Ala Ser Pro Asp Lys Gly Glu Asn Pro Ala290 295 300Leu Leu Ser Gln Ile Ala Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Leu Ala Phe305 310 315 320Pro Asn Asp His Ile Pro Asn Met Ala Arg Gly Pro Ala Gly Gln Arg325 330 335Leu Leu Gly Val Thr Pro Ala Ala Ala Asp Pro Leu Ile Thr Pro Glu340 345 350Leu Ala Glu Val Tyr Glu Thr Tyr Gly Ala Asp Val Thr Thr Pro Leu355 360 365Gly Asp Gly Glu Ala Thr Met Asp Ile Thr Met Ser Pro Asp Thr Gln370 375 380Gln Pro Pro Met Pro Gly Asn Lys Val His Gln Pro Gln Val His Asn385 390 395 400Ala Trp Arg Phe Gln Glu Pro405(2)SEQ ID NO3資料(i)序列特性(A)長(zhǎng)度1648堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵字CDS(B)位置52..1023(xi)序列描述SEQ ID NO3GAGAGAGAGA GCCACCGCATAATTCTTTCC CATGGATAGG ACCAAGGGAA C ATG AAA 57Met Lys1CCC AAC AGT ATG GAA AAT TCT TTG CCT GTG CAT CCC CCA CCT CTC CCA 105Pro Ash Ser Met Glu Asn Ser Leu Pro Val His Pro Pro Pro Leu Pro5 10 15TCA CAG CCA TCC TTG CAG CCT CAC CAG CCA GGA CTG AAA CCC TTC CTC 153Ser Gln Pro Ser Leu Gln Pro His Gln Pro Gly Leu Lys Pro Phe Leu20 25 30CAG CCC ACT GCT GCA ACC GGT GTC CAG GTC ACA CCC CAG AAG CCA GGG 201Gln Pro Thr Ala Ala Thr Gly Val Gln Val Thr Pro Gln Lys Pro Gly35 40 45 50CCT CAT CCT CCA ATG CAC CCT GGA CAG CTG CCC TTG CAG GAA GGA GAG 249Pro His Pro Pro Met His Pro Gly Gln Leu Pro Leu Gln Glu Gly Glu55 60 65CTG ATA GCA CCA GAT GAG CCA CAG GTG GCG CCA TCA GAG AAC CCA CCA 297Leu Ile Ala Pro Asp Glu Pro Gln Val Ala Pro Ser Glu Asn Pro Pro70 75 80ACA CCC GAG GTA CCA ATA ATG GAT TTT GCC GAT CCA CAA TTC CCA ACA 345Thr Pro Glu Val Pro Ile Met Asp Phe Ala Asp Pro Gln Phe Pro Thr85 90 95GTG TTC CAG ATC GCC CAT TCG CTG TCT CGG GGA CCA ATG GCA CAC AAC 393Val Phe Gln Ile Ala His Ser Leu Ser Arg Gly Pro Met Ala His Asn100 105 110AAA GTA CCC ACT TTT TAC CCA GGA ATG TTT TAC ATG TCT TAT GGA GCA 441Lys Val Pro Thr Phe Tyr Pro Gly Met Phe Tyr Met Ser Tyr Gly Ala115 120 125 130AAC CAA TTG AAT GCT CCT GGC AGA ATC GGC TTC ATG AGT TCA GAA GAA 489Asn Gln Leu Asn Ala Pro Gly Arg Ile Gly Phe Met Ser Ser Glu Glu135 140 145ATG CCT GGA GAA AGA GGA AGT CCC ATG GCC TAC GGA ACT CTG TTC CCA 537Met Pro Gly Glu Arg Gly Ser Pro Met Ala Tyr Gly Thr Leu Phe Pro150 155 160GGA TAT GGA GGC TTC AGG CAA ACC CTT AGG GGA CTG AAT CAG AAT TCA 585Gly Tyr Gly Gly Phe Arg Gln Thr Leu Arg Gly Leu Asn Gln Asn Ser165 170 175CCC AAG GGA GGA GAC TTT ACT GTG GAA GTA GAT TCT CCA GTG TCT GTA 633Pro Lys Gly Gly Asp Phe Thr Val Glu Val Asp Ser Pro Val Ser Val180 185 190ACT AAA GGC CCT GAG AAA GGA GAG GGT CCA GAA GGC TCT CCA CTG CAA 681Thr Lys Gly Pro Glu Lys Gly Glu Gly Pro Glu Gly Ser Pro Leu Gln195 200 205 210GAG GCC AGC CCA GAC AAG GGC GAA AAC CCG GCT CTC CTT TCA CAG ATT 729Glu Ala Ser Pro Asp Lys Gly Glu Asn Pro Ala Leu Leu Ser Gln Ile215 220 225GCC CCC GGG GCC CAT GCA GGA CTT CTT GCT TTC CCC AAT GAC CAC ATC 777Ala Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Leu Ala Phe Pro Asn Asp His Ile230 235 240CCC AAC ATG GCA AGG GGT CCT GCA GGG CAA AGA CTC CTC GGA GTC ACC 825Pro Asn Met Ala Arg Gly Pro Ala Gly Gln Arg Leu Leu Gly Val Thr245 250 255CCT GCA GCT GCA GAC CCA CTG ATC ACC CCT GAA TTA GCA GAA GTT TAT 873Pro Ala Ala Ala Asp Pro Leu Ile Thr Pro Glu Leu Ala Glu Val Tyr260 265 270GAA ACC TAT GGT GCT GAT GTT ACC ACA CCC TTG GGG GAT GGA GAA GCA 921Glu Thr Tyr Gly Ala Asp Val Thr Thr Pro Leu Gly Asp Gly Glu Ala275 280 285 290ACC ATG GAT ATC ACC ATG TCC CCA GAC ACT CAG CAG CCA CCG ATG CCT 969Thr Met Asp Ile Thr Met Ser Pro Asp Thr Gln Gln Pro Pro Met Pro295 300 305GGA AAC AAA GTG CAC CAG CCC CAG GTG CAC AAT GCA TGG CGT TTC CAA1017Gly Asn Lys Val His Gln Pro Gln Val His Asn Ala Trp Arg Phe Gln310 315 320GAG CCC TGACAACCTT GACATAGCAG CTACTTCATG TATGCACAAG CTTTTCAGCT 1073Glu ProTTGACCCCAT AGCGTACCTT ATTGCTAAAA CACTTGCTAC CCTTCCACAG CGAAGGTATT 1133AAGAGCACTA AGCATGTATT AATAAATACA AGTGCCTAGA AATAGTGTAG GTCCCTTCTT 1193GCTTCCATTC TTATCGAAAT AAAACATATC AACTGTCTCC GTGACTTAGA AATACTATCG 1253ATGATGTCAG AGCAAGTCTG AGTGTCAGCA CTTGGTGATC TAGCATGTAG CTGTCTTAGG 1313CATCATAAAA TTCCTCTTAC TACATGACAT TATTATGCCC AGGAAATGTG ACACCGCTTC 1373TTTCTCTACG CAAAAGCACT TAGTTTCAGA ATTCCAA GT ATTTCATTTA AACCGTATTA 1433AATGGTGATT GGTGGAGAAT CCTGACTGCT ATTACTGGGT ATCATATATT GGATTTAAAA 1493TTCTTATTTA TAGAATATTT TATTTAATCT AGGAAAAGAA AAGGCAATTG GCCTGTTTTA 1553AATAAAGAAT TTTTCTCACT GAAAATGTCA GGAATTGTAT GCTTATTATT TATATGTATT 1613TAAATAGTAA AGAAAAGCAT ACTCAAAAAA AAAAA 1648(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特性(A)長(zhǎng)度324氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Pro Asn Ser Met Glu Asn Ser Leu Pro Val His Pro Pro Pro1 5 10 15Leu Pro Ser Gln Pro Ser Leu Gln Pro His Gln Pro Gly Leu Lys Pro20 25 30Phe Leu Gln Pro Thr Ala Ala Thr Gly Val Gln Val Thr Pro Gln Lys35 40 45Pro Gly Pro His Pro Pro Met His Pro Gly Gln Leu Pro Leu Gln Glu50 55 60Gly Glu Leu Ile Ala Pro Asp Glu Pro Gln Val Ala Pro Ser Glu Asn65 70 75 80Pro Pro Thr Pro Glu Val Pro Ile Met Asp Phe Ala Asp Pro Gln Phe85 90 95Pro Thr Val Phe Gln Ile Ala His Ser Leu Ser Arg Gly Pro Met Ala100 105 110His Asn Lys Val Pro Thr Phe Tyr Pro Gly Met Phe Tyr Met Ser Tyr115 120 125Gly Ala Asn Gln Leu Asn Ala Pro Gly Arg Ile Gly Phe Met Ser Ser130 135 140Glu Glu Met Pro Gly Glu Arg Gly Ser Pro Met Ala Tyr Gly Thr Leu145 150 155 160Phe Pro Gly Tyr Gly Gly Phe Arg Gln Thr Leu Arg Gly Leu Asn Gln165 170 175Asn Ser Pro Lys Gly Gly Asp Phe Thr Val Glu Val Asp Ser Pro Val180 185 190Ser Val Thr Lys Gly Pro Glu Lys Gly Glu Gly Pro Glu Gly Ser Pro195 200 205Leu Gln Glu Ala Ser Pro Asp Lys Gly Glu Asn Pro Ala Leu Leu Ser210 215 220Gln Ile Ala Pro Gly Ala His Ala Gly Leu Leu Ala Phe Pro Asn Asp225 230 235 240His Ile Pro Asn Met Ala Arg Gly Pro Ala Gly Gln Arg Leu Leu Gly245 250 255Val Thr Pro Ala Ala Ala Asp Pro Leu Ile Thr Pro Glu Leu Ala Glu260 265 270Val Tyr Glu Thr Tyr Gly Ala Asp Val Thr Thr Pro Leu Gly Asp Gly275 280 285Glu Ala Thr Met Asp Ile Thr Met Ser Pro Asp Thr Gln Gln Pro Pro290 295 300Met Pro Gly Asn Lys Val His Gln Pro Gln Val His Asn Ala Trp Arg305 310 315 320Phe Gln Glu Pro
權(quán)利要求
1.一種至少部分被純化的核酸片段,它編碼能介導(dǎo)釉質(zhì)與細(xì)胞表面的接觸的多肽。
2.一種權(quán)利要求1的核酸片段,它包括核苷酸序列SEQ ID NO1,其至少18個(gè)核苷酸的亞序列,或所述核酸序列或亞序列的變異體,該變異體與SEQ ID NO1或其至少18個(gè)核苷酸的亞序列至少有80%同源性。
3.一種權(quán)利要求1的核酸片段,它編碼一種多肽,該多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少有80%同源性。
4.一種權(quán)利要求1的核苷酸序列,它包括核苷酸序列SEQ IDNO3,其至少18個(gè)核苷酸的亞序列,或所述序列或亞序列的變異體,該變異體與SEQ ID NO3或其至少18個(gè)核苷酸的亞序列有至少80%同源性。
5.一種權(quán)利要求1的核酸片段,它編碼一種多肽,該多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列至少有80%的同源性。
6.一種至少部分被純化的核酸片段,它基本包含SEQ ID NO1中所示序列。
7.一種至少部分被純化的核酸片段,它基本包含SEQ ID NO3中所示序列。
8.一種權(quán)利要求1的核酸片段,它與含核苷酸序列SEQ ID NO1或其特異部分的核酸片段在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。
9.一種權(quán)利要求1的核酸片段,它與含核苷酸序列SEQ ID NO3或其特異部分的核酸片段在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交。
10.一種至少部分被純化的權(quán)利要求1的核酸片段,它編碼含SEQID NO2的氨基酸序列1到407的多肽。
11.一種至少部分被純化的權(quán)利要求1的核酸片段,它編碼含SEQID NO4的氨基酸序列1到302的多肽。
12.一種權(quán)利要求1的核酸片段,它編碼含氨基酸序列SEQ IDNO2或SEQ ID NO4之一或兩者的亞序列的多肽。
13.一種含權(quán)利要求1-12之任何的核酸片段的表達(dá)系統(tǒng)。
14.一種可復(fù)制表達(dá)載體,它載有如權(quán)利要求1-12之任一中定義的核酸片段并能夠介導(dǎo)該核酸片段的表達(dá)。
15.一種攜帶權(quán)利要求14的表達(dá)系統(tǒng)的生物,如微生物,如細(xì)菌,例如Escherichia coli,酵母,原生動(dòng)物,或從多細(xì)胞生物如真菌,昆蟲細(xì)胞,植物細(xì)胞,哺乳動(dòng)物得到的細(xì)胞或一種細(xì)胞系。
16.一種釉質(zhì)基質(zhì)相關(guān)多肽,它含至少一個(gè)能介導(dǎo)該多肽錨著于細(xì)胞粘著分子的序列元件,該序列元件選自四肽DGEA(天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸),VTKG(纈氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-甘氨酸),EKGE(谷氨酸-賴氨酸-甘氨酸-谷氨酸)和DKGE(天冬氨酸-賴氨酸-甘氨酸-谷氨酸)。
17.一種權(quán)利要求16的多肽,它含氨基酸序列SEQ ID NO2或其類似物或其變異體。
18.一種權(quán)利要求16的多肽,它含氨基酸序列SEQ ID NO4或其類似物或其變異體。
19.一種權(quán)利要求16的具有如此的氨基酸序列的多肽,所述序列中的20個(gè)氨基酸的連續(xù)鏈段與選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列之同樣長(zhǎng)度的氨基酸鏈段至少有80%程度的同源性。
20.一種含基本上在SEQ ID NO2中的氨基酸序列1-407的多肽。
21.一種含基本上在SEQ ID NO4中的氨基酸序列1-324的多肽。
22.一種權(quán)利要求16的多肽,該多肽含氨基酸序列SEQ ID NO2和/或序列SEQ ID NO4的亞序列。
23.一種權(quán)利要求16-22的任何基本純的多肽。
24.含權(quán)利要求23的多肽和非強(qiáng)制性的一種生理可接受性賦形劑的一種組合物。
25.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求16中定義的多肽的方法,包括如下步驟(a)插入權(quán)利要求1-12之任何中定義的核酸片段到一個(gè)表達(dá)載體中,(b)用步驟(a)中產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主生物,(c)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)步驟(b)產(chǎn)生的宿主生物以表達(dá)該多肽,(d)收獲該多肽,和(e)非強(qiáng)制性對(duì)該多肽進(jìn)行翻譯后修飾。
26.一種治療和/或防止牙周疾病的方法,該方法包括給需要此種治療的病人施用治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求16的多肽。
27.一種修復(fù)牙中損害的方法,該方法包括非強(qiáng)制性結(jié)合適當(dāng)?shù)某涮钗锊牧辖o需要此種治療的病人施用有效量的權(quán)利要求16的多肽。
28.一種接合兩只骨單體的方法,該方法包括給需要此種治療的病人施用有效量的權(quán)利要求16的多肽。
29.一種促進(jìn)或引起硬組織礦化的方法,該硬組織選自骨,釉質(zhì),牙質(zhì)和牙骨質(zhì),該方法包括給需要此種治療的病人施用有效量的權(quán)利要求16的多肽。
30.一種有效結(jié)合植入物到骨中的方法,該方法包括給需要此種治療的病人施用有效量的權(quán)利要求16的多肽。
31.一種促進(jìn)植入器具或經(jīng)皮器具生物相容性的方法,該方法包括用有效量的權(quán)利要求16的多肽覆蓋該植入器具。
32.一種診斷試劑,它包括權(quán)利要求1的核酸片段或權(quán)利要求16的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼能調(diào)節(jié)釉質(zhì)和細(xì)胞表面接觸之多肽的新核酸片段。本發(fā)明還涉及含本發(fā)明核酸片段的表達(dá)載體以生產(chǎn)蛋白質(zhì),涉及含所述表達(dá)載體的生物,生產(chǎn)該多肽的方法,含該多肽的組合物,識(shí)別該多肽的抗體或抗體片段,以及治療各種硬組織疾病或失調(diào)癥的方法。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1196086SQ96196921
公開日1998年10月14日 申請(qǐng)日期1996年6月26日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月13日
發(fā)明者R·克爾賴, I·斯拉拜, L·哈馬爾斯特羅姆, T·烏爾茨, C·D·芳 申請(qǐng)人:比奧拉公司