專利名稱：測(cè)試親石蠟性微生物對(duì)抗微生物劑的敏感性的方法和裝置的制作方法
本申請(qǐng)是于1992.6.18遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/900,275的部分接續(xù)申請(qǐng)，后者是于1992.2.25遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/841,937的分案申請(qǐng)，后者反過來又是于1989.10.24遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/426,573的部分接續(xù)申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及測(cè)試親石蠟性微生物(paraffinophilic microorganisms)對(duì)于抗微生物劑的敏感性的方法和裝置。
鑒定和治療機(jī)會(huì)感染常常涉及對(duì)于涉及的微生物性質(zhì)作合理推測(cè)，而且一經(jīng)鑒定，就需要弄清楚有效處理該微生物的抗微生物劑的量。有些抗微生物劑相當(dāng)昂貴，所以只應(yīng)用治療該感染所需的量將大為有益。此外更重要的是，抗微生物劑可能具有不希望的副作用，所以應(yīng)謹(jǐn)慎地只用有效治療該感染所需的量。然而遺憾的是，目前還沒有一種方法能使醫(yī)師迅速確定哪種抗微生物劑將在保證有效抑制微生物的生長(zhǎng)方面表現(xiàn)最佳。這就會(huì)產(chǎn)生如下后果更大的費(fèi)用、更低的效果和可能招致更多的損害性副作用。存在這種情況的原因是，醫(yī)護(hù)人員不了解有關(guān)抗微生物劑敏感性方面的信息，也就不能更準(zhǔn)確地選擇抗微生物劑；因此一旦選擇了適當(dāng)?shù)目刮⑸飫?，有利于確定更準(zhǔn)確的應(yīng)用濃度。
已知有很多種非典型的分枝桿菌(Mycobacteria)生長(zhǎng)在缺乏除石蠟外的任何碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基上，可以石蠟涂覆的桿的形式將它們引入該培養(yǎng)基。Fuhs，G.W.，“Der Mikrobielle Abbau VonKohlenwasserstoffen”，Arch.Mikrobiol.，39374-422(1961)。Mishra，S.K.等，“Observations on Paraffin Baiting As A Laboratory DiagnosticProcedure In Nocardiosis”，Mycopathologica And MycologiaApplicata，51(2-3)147-157(1973)應(yīng)用石蠟涂覆的桿和基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基而從臨床樣品例如唾液、支氣管灌洗液和腦脊髓液中分離星狀諾卡氏菌(Nocardia asteroides)。
用石蠟涂覆的載玻片代替桿可進(jìn)一步改進(jìn)本技術(shù)，因而有可能對(duì)于在石蠟涂覆的載玻片上生長(zhǎng)的有機(jī)體原位應(yīng)用金楊氏(Kinyoun)耐冷酸染色法。Ollar，R.A.，“A Paraffin Baiting Technique That Enables ADirect Microscopic View of“in situ”Morphology of Nocardiaasteroides With The Acid-Fast or Fluorescence Staining Procedures”，Zb1.Bakt.Hyg.，Abt.Orig.A，23481-90(1976)。運(yùn)用該分析法，陽(yáng)性反應(yīng)立即告訴使用者存在除結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)之外的分枝桿菌有機(jī)體。
至于抗微生物敏感性試驗(yàn)，美國(guó)專利No.3,826,717提供了一種抗生物敏感性試驗(yàn)容器，它包括很多其中含有固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的孔。這些孔排成行，每一排都包括一種抗生劑，且同一排中不同的孔中濃度各不相同。還提供一個(gè)其中只有培養(yǎng)基而沒有抗生劑的對(duì)照孔。
盡管有上述啟示，但仍然需要有效而經(jīng)濟(jì)的方法和花費(fèi)不多的裝置以測(cè)試親石蠟性微生物對(duì)抗微生物劑的敏感性。
本發(fā)明滿足或超過了上述要求和其它要求。測(cè)定得自患者樣品的至少一種親石蠟性微生物對(duì)不同抗微生物劑及其預(yù)定量的敏感性的方法包括提供至少一個(gè)含有一種水溶液的容器，然后用樣品接種該溶液。于是本方法包括將(i)用于引誘至少一種親石蠟性微生物、石蠟涂覆的載玻片和(ii)預(yù)定量的待測(cè)抗微生物劑放入該容器。然后觀察該載玻片上親石蠟性微生物生長(zhǎng)與否，以確定預(yù)定量的抗微生物劑在抑制載玻片上親石蠟性微生物的生長(zhǎng)方面是否有效。
還提供了一種相關(guān)的裝置，它包括適于盛一種水溶液、一定量的待測(cè)抗微生物劑和患者樣品的一個(gè)容器以及適于放入所述容器的石蠟涂覆的載玻片。這樣，通過觀察載玻片上來自樣品的親石蠟性微生物生長(zhǎng)情況，就能確定抗親石蠟性微生物在載玻片上生長(zhǎng)所需的抗微生物劑濃度。


圖1示出了將石蠟涂覆的載玻片保持于無菌水溶液中的試管正視圖，該溶液用胞內(nèi)鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium-intracellulare)(“MAI”)接種。
圖2示出了耐酸-醇分析的示意圖。
圖3示出了亞碲酸鹽還原分析。
圖4示出了硝酸鹽還原分析。
圖5示出脲水解分析。
圖6示出了Tween80水解分析。
圖7示出了本發(fā)明的抗微生物劑敏感性測(cè)試分析。
本文提到的術(shù)語(yǔ)“非典型的分枝桿菌”表示除了結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)和副結(jié)核分枝桿菌(M.paratuberculosis)之外的所有分枝桿菌。
本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“患者”表示包括人類的動(dòng)物界中的一員，它的機(jī)體樣品用本發(fā)明的方法和裝置進(jìn)行處理。
參照?qǐng)D1，示出了MAI分離和物種形成盒10的部分。圖1示出的標(biāo)準(zhǔn)試管12包括無菌水溶液14(例如蔡氏培養(yǎng)基)和用于密封試管12的棉塞16。應(yīng)用時(shí)，將需測(cè)試是否存在MAI的樣品引入試管12，接著分析石蠟涂覆的載玻片18。樣品可以是患者的一定量血液、糞或唾液。后兩種樣品可直接接種入MAI分離和物種形成盒而不需某種血培養(yǎng)液體培養(yǎng)基。
最好是首先縱向切割標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡載玻片而制備載玻片18，使它們適于放入試管12因而可輕易拔出。塞好試管12并用高壓滅菌法滅菌。
在載玻片上涂覆石蠟時(shí)，優(yōu)選先在沸水浴中熔化幾試管無菌的組織級(jí)含有蠟的石蠟，同時(shí)另外在電熱板上加熱盛有一載玻片支持體的玻璃培養(yǎng)皿至足以熔化石蠟的溫度。然后將熔化的石蠟傾入熱培養(yǎng)皿中，傾入的量應(yīng)足以覆蓋支持體上的載玻片。
優(yōu)選應(yīng)用在乙醇-火焰上滅過菌的鑷子把原先未涂覆的載玻片轉(zhuǎn)移到含有已熔化蠟的熱培養(yǎng)皿中載玻片支持體上。將該載玻片浸入熔化的蠟中達(dá)數(shù)秒使它覆蓋上一薄層石蠟。以同樣方法制備許多載玻片，制備好6-10片載玻片之后加入一試管熔化的石蠟以保證總有足夠的蠟覆蓋支持的載玻片。
蔡氏液體培養(yǎng)基14可配有抗細(xì)菌的和抗真菌的/抗生的混合物例如由Becton Dickenson/Johnston Labs Division制備的、以商品名“PANTA”出售的那種。這種產(chǎn)品能耐可能的污染因子例如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)。該產(chǎn)品對(duì)MAI沒影響，因?yàn)镸AI能耐“PANTA”中常用的抗生素。
試劑盒10還可起這種作用它一方面可區(qū)別非典型的分枝桿菌和諾卡氏菌類有機(jī)體(nocardioform organisms)，而另一方面可區(qū)別非典型的分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌，因?yàn)楹笳卟荒芾檬炞鳛槲ㄒ惶荚础Ｒ阎谑灪湍芾檬炞鳛樗奶荚吹挠袡C(jī)體如非典型的分枝桿菌與諾卡氏菌類有機(jī)體之間可產(chǎn)生向性。該向性的外在表現(xiàn)或者引誘是石蠟表面出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。
一旦確定載玻片上出現(xiàn)除結(jié)核分枝桿菌之外的分枝桿菌或諾卡氏菌類有機(jī)體，就可應(yīng)用耐醇-酸試驗(yàn)40(圖2)以進(jìn)一步區(qū)別非典型的分枝桿菌和諾卡氏菌類有機(jī)體。已知非典型的分枝桿菌能耐醇-酸；諾卡氏菌類有機(jī)體能耐酸；而銅綠假單胞菌或熱帶假絲酵母既不耐酸又不耐醇-酸。因此，通過耐醇-酸測(cè)試盒40可排除后兩組(諾卡氏菌類和銅綠假單胞菌或熱帶假絲酵母)的可能性。
參照?qǐng)D2，示出了耐酸-醇測(cè)試裝置40。該測(cè)試裝置40包括多個(gè)其中含有不同溶液的試管。這些溶液給載玻片上的MAI染色以供后續(xù)的顯微鏡下分析。
將生長(zhǎng)有可見的MAI、石蠟涂覆的載玻片培養(yǎng)物42從圖1的試管12中取出，先浸入盛有蒸餾水的兩支相鄰試管50、51；然后浸入金楊氏卡寶品紅的試管52中達(dá)15分鐘。再將載玻片42浸入盛有蒸餾水的試管53中，然后置于含有由97ml絕對(duì)乙醇和3.0ml濃HCl構(gòu)成的酸-醇的試管54中達(dá)5分鐘。此后，將該載玻片置于第4支盛蒸餾水的試管55中洗滌，再置于1.0％(v/v)亞甲藍(lán)水溶液的試管56中達(dá)1分鐘。最后，將該載玻片于第5支蒸餾水的試管57中洗滌。
隨后從第5支蒸餾水的試管57中取出該載玻片培養(yǎng)物，并輕輕地用干凈的吸水紙吸干。然后在顯微鏡下在250×、450×和1000×油浸物鏡中觀察該載玻片培養(yǎng)物。
圖3示出了亞碲酸鹽還原分析，它包括其中優(yōu)選盛有蔡氏培養(yǎng)基加上一定量亞碲酸鉀試劑62的試管60。將培養(yǎng)的載玻片43浸入試管60并進(jìn)行培養(yǎng)。如果載玻片上存在MAI，則在載玻片43的彎月面膜65處形成深黑色沉淀64。該試驗(yàn)提醒使用者可能存在MAI。在下文中討論的分析法中分析結(jié)果出來后就能確證MAI的存在。
圖4示出硝酸鹽還原分析70。對(duì)于生長(zhǎng)稠密的載玻片培養(yǎng)物44分析把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的能力。是這樣分析的往含有無菌培養(yǎng)基的試管71中加入硝酸鹽。在37℃下培養(yǎng)12-24小時(shí)后，從無菌硝酸鹽培養(yǎng)基72中取出載玻片44并先后往試管71中加入5滴磺胺酸試劑溶液和5滴α萘胺試劑溶液。硝酸鹽還原為亞硝酸鹽時(shí)表現(xiàn)為變成紅色的培養(yǎng)基73。正如已知的那樣，如果硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，則表明載玻片上沒有MAI。
圖5示出脲水解反應(yīng)分析80。將載玻片培養(yǎng)物45放入含有4.5ml無菌脲培養(yǎng)基82的帶塞試管81中。在37℃下培養(yǎng)該培養(yǎng)物，并在3天后檢查。陽(yáng)性反應(yīng)表現(xiàn)為3天之后培養(yǎng)基82的顏色變?yōu)榉奂t或紅色。已知如果溶液變色，就表明載玻片45上沒有MAI。
圖6示出乳化劑水解分析90。所用的乳化劑為“Tween 80”，它是Atlas Chemical Industries，Inc.的商標(biāo)，通常稱它為山梨糖醇酐部分脂肪酸酯的聚氧乙烯衍生物。將載玻片培養(yǎng)物46放入含有Tween 80介質(zhì)92的無菌帶塞試管91并在37℃下培養(yǎng)。陽(yáng)性反應(yīng)表現(xiàn)為，在5天內(nèi)載玻片46的彎月面膜94處出現(xiàn)紅色著色物93。已知載玻片中若出現(xiàn)紅色著色物就指示載玻片上沒有MAI。
應(yīng)懂得應(yīng)進(jìn)行至少一種MAI鑒定試驗(yàn)(亞碲酸鹽還原、硝酸鹽還原、脲水解或“Tween 80”水解)，其中亞碲酸鹽還原試驗(yàn)是四種試驗(yàn)中最重要的。優(yōu)選應(yīng)進(jìn)行所有這四種試驗(yàn)以更準(zhǔn)確地物種形成和鑒定MAI。
圖7示出本發(fā)明的抗微生物劑敏感性測(cè)試分析100。本方法和相關(guān)裝置測(cè)試了MAI對(duì)不同抗微生物劑和/或抗微生物劑的劑量的敏感性。該分析優(yōu)選包括六支試管110-115，每支含有一定量蔡氏培養(yǎng)液120-125和一定量含待測(cè)MAI的樣品。培養(yǎng)液121-125含有均勻遞增濃度的待測(cè)抗微生物劑。培養(yǎng)基120不含抗微生物劑，因?yàn)樵嚬?10將作為“對(duì)照”試管。試管110優(yōu)選含有一定量鹽水。
按前述方法制備石蠟載玻片培養(yǎng)物130-135。分別將這些載玻片培養(yǎng)物130-135放入相應(yīng)試管110-115中。然后在37℃下培養(yǎng)試管110-115中的載玻片培養(yǎng)物130-135并在第6天、第7天、第8天和第10天檢查。通過觀測(cè)各載玻片培養(yǎng)物130-135的石蠟表面上MAI生長(zhǎng)情況140-144，就能確定防止在石蠟培養(yǎng)物載玻片130-135上MAI生長(zhǎng)所需抗微生物劑的最小抑菌濃度(“MIC”)。對(duì)于圖7來說，試管115中的是MIC濃度，因?yàn)樵谳d玻片135上未生長(zhǎng)MAI。
由此可見，本發(fā)明的方法和裝置提供了測(cè)定MAI對(duì)不同抗微生物劑及其預(yù)定量的敏感性的高效、經(jīng)濟(jì)的手段。然而，本發(fā)明并不限于MAI，還對(duì)任何親石蠟性微生物有效。本文應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)“親石蠟性”表示這種有機(jī)體，即它可用石蠟為基本鹽培養(yǎng)基中的碳源，其中沒有其它形式的碳。該有機(jī)體可以是細(xì)菌或真菌。
應(yīng)懂得，雖然示出的裝置50具有多個(gè)容器和多個(gè)載玻片80-85，但本發(fā)明不限于多個(gè)容器和多個(gè)載玻片，而是還包括單個(gè)容器和單個(gè)載玻片。
本發(fā)明的方法可用于測(cè)定下組親石蠟性微生物中至少一種的抗生敏感性石蠟微球菌(Micrococcus Paraffinae)；單純棒狀桿菌(Corynebacterium Simplex)；Ahnl；丹砂枝球菌(紅球菌)(Mycococcus(Rhodococcus)Cinnabareus)；Ahnl.絳紅枝球菌(紫紅紅球菌)(Mycococcus(Rhodoc)Rhodochrous)；崎嶇分枝桿菌Athanicum變種(Mycobact.Perrugosum Var.Athanicum)；紅色分枝桿菌Propanicum變種(Mycobact.Rubrum Var.Propanicum)；透明分枝桿菌(Mycobacterium Hyalinum)；乳生分枝桿菌(MycobacteriumLacticola)；白色分枝桿菌(Mycobacterium Album)，藤黃分枝桿菌(M.Luteum)；田鼠分枝桿菌(Mycobacterium Microti)；紅色分枝桿菌(Mycobacterium Rubrum)，草分枝桿菌(MycobacteriumPhlei.)；草分枝桿菌，包皮垢分枝桿菌(M.Smegmatis)；龜分枝桿菌(Mycobacterium Testudo)；胞內(nèi)鳥分枝桿菌(Mycobacterium-Avium-Intracellulare)；諾卡氏菌(Nocardia Spp.)；放線菌屬(Actinomyces)；解脂假絲酵母(Candida Lipolytica)；熱帶假絲酵母，球擬酵母(Torulopsis Colliculosa)；叢梗孢菌(Monila Sp.)，漢遜酵母菌(Hansenula Sp.)，Torula rossa；青霉菌(PenicilliumSp.)；IHNL.黃曲霉(IHNL.Aspergillus Flavus)；曲霉菌(AspergillusSp.)，青霉菌(Penicillum Sp.)；桔霉菌(Citromyces Sp.)，帚霉菌(Scopulariopsis Sp.)；熒光假單胞菌Liquefaciens(PseudomonasFluorescens Liquefaciens)；Ahnl，Pem.Fluorescens Denitrificans；銅綠假單胞菌。
應(yīng)明白在臨床醫(yī)療應(yīng)用中，有些場(chǎng)合既有攜帶單種親石蠟性微生物(例如MAI)的患者，又有攜帶多種親石蠟性微生物(例如MAI和堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium Kansasii))的患者。很有必要處理所有親石蠟性微生物，因?yàn)槊恳环N都可能成為患者的致病原因。因此，如果免疫受損害的患者患有肺、肝或腎膿腫，則醫(yī)師對(duì)于能抑制所有細(xì)菌在載玻片上生長(zhǎng)的抗微生物劑感興趣，不管生長(zhǎng)的細(xì)菌包括一種還是多種親石蠟性微生物。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果A.原料1.菌株下列實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的MAI株最初是從下列單位的AIDS患者分離而得到的St.Vincent’s Hospital and Medical Center of New York和Memorial Sloan-Kettering Cancer Center。得自兩個(gè)研究機(jī)構(gòu)的菌株通過慣常的形態(tài)方法和微生物方法鑒定，由DNA雜交(Gene Probe KitBiogen)確證為鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)。在St.Vincent’s Hospital分離的菌株為10,000；1762；1516；15113；8515；6475；5097；8197；和4861。得自Memorial Sloan-KetteringCancer Center的那些是SK015；SK016；SK095；SK069；SK034；SK060；和SK024。所有菌株都分離自患AIDS病的患者并被鑒定為鳥分枝桿菌種；只有SK069是胞內(nèi)分枝桿菌，它是從患空洞肺病(cavitarypulmonary disease)的免疫活性患者分離而得的。
2.抗微生物劑制備化療劑貯備液。將阿米卡星(Bristol-Myers)溶于蒸餾水并過濾除菌；將阿齊紅霉素(Pfizer)溶于95％乙醇并過濾除菌；還將環(huán)丙氟哌酸(Miles Laboratories)溶于蒸餾水并過濾除菌。
B.石蠟載玻片培養(yǎng)物分析按本發(fā)明的方法，用圖7所示裝置，針對(duì)前述菌株和前述抗微生物劑進(jìn)行石蠟載玻片培養(yǎng)物分析以分析抗生敏感性。
將標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡載玻片縱向割開、消毒、并涂覆一薄層Paraplast化合物(組織級(jí)石蠟加塑性聚合物-Monoject Scientific Division ofSherwood Medical，St.Louis，Missouri 63103，USA)。最佳石蠟涂層是極薄的涂層。這可通過將載玻片迅速浸入熔化的石蠟中并迅速取出而形成。當(dāng)石蠟涂層太厚時(shí)，則在37℃下長(zhǎng)期培養(yǎng)后石蠟層常會(huì)脫落。涂覆后，將載玻片貯存于無菌的封有棉塞的試管內(nèi)備用。
1.環(huán)丙氟哌酸-HCL應(yīng)用圖7的裝置，往試管111-115中各加入0.5ml感染接種物，初始抗微生物工作液，石蠟涂覆的載玻片131-135和4.5ml蔡氏培養(yǎng)基。對(duì)照試管110中含有0.5ml感染接種物，0.5ml生理鹽水和4.5ml蔡氏培養(yǎng)基。對(duì)照試管110還包含石蠟涂覆的載玻片130。試管111-115中各含有遞增濃度的抗微生物劑，其中試管111含有3.6微克/ml；試管112含有7.3微克/ml；試管113含有10.9微克/ml；試管114含有14.5微克/ml；而試管115含有18.2微克/ml。
對(duì)每種菌株作實(shí)驗(yàn)，構(gòu)成一組實(shí)驗(yàn)。同樣的實(shí)驗(yàn)又重復(fù)一組。一般在37℃下培養(yǎng)5-10天后讀出每個(gè)實(shí)驗(yàn)中石蠟對(duì)照載玻片上的培養(yǎng)物，以8天為優(yōu)選的培養(yǎng)期。
表1列出了菌株并報(bào)告了MIC和每種菌株在每組實(shí)驗(yàn)中鋪滿的天數(shù)。MIC定義為抑制載玻片上細(xì)菌生長(zhǎng)所需抗微生物劑的最低濃度。測(cè)得的MIC以微克/ml為單位。
表1實(shí)驗(yàn)I組 實(shí)驗(yàn)II組菌株MIC 鋪滿的天數(shù)MIC 鋪滿的天數(shù)10.000 3.6 9 3.6 7176218.29 14.581516NG*NG3.6 815113 3.6 103.6 985157.3 9 7.3 864753.6 107.3 950973.6 107.3 881973.6 9 3.6 848613.6 103.6 8SK015 14.57 14.56SK016 7.3 7 7.3 6SK095 10.97 7.3 6SK069 18.28 ＞18.27SK037 18.27 14.57SK060 7.3 7 7.3 7SK024 7.3 7 3.6 6*NG＝未生長(zhǎng)用環(huán)丙氟哌酸-HCL從實(shí)驗(yàn)I組推知本發(fā)明的基本方法。正如所料，對(duì)照試管顯示在石蠟表面生出的菌最多。當(dāng)對(duì)照試管中見到細(xì)菌鋪滿石蠟載玻片表面時(shí)，就檢驗(yàn)含不同量稀釋劑或環(huán)丙氟哌酸的試管111-115?？汕宄姷竭f增濃度的環(huán)丙氟哌酸-HCL對(duì)石蠟載玻片上MAI生長(zhǎng)的影響。在含有最低抗微生物劑濃度的試管中，其中未見到石蠟涂覆的載玻片上生長(zhǎng)菌落，該試管中的環(huán)丙氟哌酸濃度定義為該系統(tǒng)的最小抑菌濃度(“MIC”)。該濃度下未長(zhǎng)菌是通過在顯微鏡下檢查用金楊氏抗酸染色法染過色的載玻片而確證的。本方法用于測(cè)定后續(xù)所有抗微生物敏感性試驗(yàn)組中的MIC。
關(guān)于環(huán)丙氟哌酸-HCL的II組和III組沒有明顯的統(tǒng)計(jì)上的變化(連續(xù)性修正常態(tài)近似值＝0.419，常態(tài)近似的兩尾p值＝0.68)。這就證實(shí)本方法在兩實(shí)驗(yàn)組之間的重復(fù)性。這些實(shí)驗(yàn)組中得到的MIC值與其他研究人員得到的很相似。例如參見Heifets，L.和Lindholm-Levy，P.“Comparison of Bactericical Activities of Streptomycin，Amikacin，Kanamycin And Capreomycin Against Mycobacteriumavium and M.tuberculosis”，Antimicrob，Ag.Chemother.1989331298-1301。
2.阿齊紅霉素試驗(yàn)也應(yīng)用圖7的裝置，往試管111-115中各加入0.5ml感染接種物、初始抗微生物工作液，石蠟涂覆的載玻片131-135和4.5ml蔡氏培養(yǎng)基。阿齊紅霉素的對(duì)照試管110含有于4.5ml蔡氏培養(yǎng)基中的0.5ml 95％乙醇和0.5ml感染接種物以及載玻片130。試管111-115各含有遞增濃度的抗微生物劑，其中試管111含有2.6微克/ml；試管112含有5.3微克/ml；試管113含有7.9微克/ml；試管114含有10.6微克/ml；而試管115含有13.2微克/ml。
對(duì)每種菌株作實(shí)驗(yàn)，構(gòu)成一組實(shí)驗(yàn)。同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)第二組，再重復(fù)第三組。一般在37℃下培養(yǎng)5-10天后讀出每個(gè)實(shí)驗(yàn)中石蠟涂覆的載玻片上的培養(yǎng)物，以8天為優(yōu)選的培養(yǎng)期。
表2列出了菌株并報(bào)告了MIC(以微克/ml表示)和每種菌株分別在實(shí)驗(yàn)組I、II和III中鋪滿的天數(shù)。
表2實(shí)驗(yàn)I組實(shí)驗(yàn)II組實(shí)驗(yàn)III組菌株MIC 鋪滿的天數(shù) MIC鋪滿的天數(shù) MIC 鋪滿的天數(shù)10.000 2.66 2.66 2.6617625.37 2.66 5.3615162.68 2.68 5.3815113 5.38 5.310 2.6685155.38 2.66 2.6664752.68 2.68 2.6650977.96 2.66 5.3681975.37 2.66 2.6648615.310 2.66 2.66SK015 7.97 5.36 5.37SK016 7.910 10.6 6 5.38SK095 2.67 5.36 5.37SK069 2.67 2.66 5.38SK037 5.37 7.96 5.38SK060 2.67 7.96 2.66SK024 5.37 7.96 2.27在實(shí)驗(yàn)組之間沒有明顯的變化(對(duì)關(guān)系項(xiàng)作過修正的Friedman統(tǒng)計(jì)＝20.95，p＝0.14，樣本規(guī)模＝3，df＝15)。
對(duì)于阿齊紅霉素得到的MIC值不同于其他研究人員得到的值。例如參見，Inderlied，C.B.，Kolonoski，P.T.，Wu，M.和Young，L.S.，“In vitroand in vivo Activity of Azithromycin(CP62.993)Against theMycobacterium avium Complex”，J.Infect.Dis.，1989159994-997。關(guān)于這一點(diǎn)的一種解釋是，阿齊紅霉素對(duì)于pH變化很敏感。上述實(shí)驗(yàn)是在pH＝7.5時(shí)進(jìn)行的。在較低pH下，屬于大環(huán)內(nèi)酯抗生素的阿齊紅霉素被完全離子化，因此很難穿過胞質(zhì)膜。這轉(zhuǎn)化為要求更高濃度的阿齊紅霉素，于是導(dǎo)致更高的MIC值。此外，有關(guān)MAI對(duì)阿齊紅霉素的抗微生物敏感性沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。
3.阿米卡星試驗(yàn)應(yīng)用圖7的裝置，往試管111-115中各加入0.5ml感染接種物，初始抗微生物工作液，石蠟涂覆的載玻片131-135和4.5ml蔡氏培養(yǎng)基。試管110是對(duì)照試管，不含任何阿米卡星但含有于4.5ml蔡氏培養(yǎng)基中的0.5ml 95％乙醇和0.5ml感染接種物以及載玻片130。試管111-115各含有遞增濃度的阿米卡星抗微生物劑，其中試管111含有3.2微克/ml；試管112含有6.4微克/ml；試管113含有9.6微克/ml；試管114含有12.8微克/ml；而試管115含有16微克/ml。
對(duì)每種菌株做實(shí)驗(yàn)，構(gòu)成一組實(shí)驗(yàn)。同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)第二組，再重復(fù)第三組。一般在37℃下培養(yǎng)5-10天后讀出每個(gè)實(shí)驗(yàn)中石蠟載玻片上的培養(yǎng)物，以8天為優(yōu)選的培養(yǎng)期。
表3列出了菌株并報(bào)告了MIC和每種菌株在各組實(shí)驗(yàn)中鋪滿的天數(shù)。
表3實(shí)驗(yàn)I組實(shí)驗(yàn)II組 實(shí)驗(yàn)III組菌株MIC 鋪滿的天數(shù) MIC 鋪滿的天數(shù) MIC 鋪滿的天數(shù)10.000＞16.07 ＞16.07 3.2 51762 ＞16.07 12.07 3.2 515166.4 8 6.4 9 6.4 1215113 3.2 8 6.4 5 3.2 685156.4 7 3.2 5 3.2 5647512.07 3.2 5 3.2 55097NG*NG 6.4 5 6.4 58197 ＞16.07 ＞16.07 3.2 5486112.08 3.2 6 3.2 7SK015 6.4 6 6.4 6 3.2 5SK016 7.3 5 9.6 6 6.4 5SK095 3.2 5 6.4 6 6.4 5SK069 3.2 6 9.6 6 6.4 6SK037 9.6 5 ＞16.06 6.4 5
SK0606.456.473.25SK0246.459.663.25*NG＝未生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)I、II和III組沒有明顯的統(tǒng)計(jì)變化(對(duì)關(guān)系項(xiàng)作過修正的Friedman統(tǒng)計(jì)＝14.79，p＝0.39，樣品間隔＝3，df＝14)。這就證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)組之間的重復(fù)性。這些實(shí)驗(yàn)組中得到的MIC值與其他研究人員得到的很相似。例如參見，Inderlied，C.B.，Young，L.S.和Yamanda，J.K.，“Determination of in vivo Susceptibility ofMycobacterium avium Complex Isolates To Antimycobacterial AgentsBy Various Methods”，Antimicrob，Ag.Chemother，，1987321697-1702。
可見本發(fā)明提供了測(cè)試MAI對(duì)抗微生物劑敏感性的方法和裝置。該裝置易于使用且價(jià)廉，本方法準(zhǔn)確而有效。
鑒于本文上面描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案是為了闡述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得，細(xì)節(jié)上可作很多改變而不會(huì)偏離后續(xù)權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.測(cè)定得自患者樣品的至少一種親石蠟性微生物對(duì)不同抗微生物劑及其預(yù)定量的敏感性的方法，該方法包括提供至少一個(gè)含一種水溶液的容器；用所述樣品接種該溶液；將(i)用于引誘該親石蠟性微生物、石蠟涂覆的載玻片和(ii)預(yù)定量的待測(cè)抗微生物劑放入該容器；和觀察該載玻片上親石蠟性微生物生長(zhǎng)與否，以確定預(yù)定量的該抗微生物劑在抑制載玻片上親石蠟性微生物的生長(zhǎng)方面是否有效。
2.權(quán)利要求1的方法，它包括應(yīng)用該方法測(cè)定下列微生物中的至少一種的抗生素敏感性石蠟微球菌；單純棒狀桿菌；Ahnl；丹砂枝球菌(紅球菌)；Ahnl.絳紅枝球菌(紫紅紅球菌)；崎嶇分枝桿菌Athanicum變種；紅色分枝桿菌Propanicum變種；透明分枝桿菌；乳生分枝桿菌；白色分枝桿菌，藤黃分枝桿菌；田鼠分枝桿菌；紅色分枝桿菌；草分枝桿菌；草分枝桿菌，包皮垢分枝桿菌；龜分枝桿菌；胞內(nèi)鳥分枝桿菌；諾卡氏菌；放線菌屬；解脂假絲酵母；熱帶假絲酵母，球擬酵母；叢梗孢菌，漢遜酵母菌，Torularossa；青霉菌；IHNL.黃曲霉；曲霉屬，青霉菌；桔霉菌，帚霉菌；熒光假單胞菌Liquefaciens；Ahnl，Pem.Fluorescens Denitrificans；銅綠假單胞菌。
3.權(quán)利要求1的方法，它包括提供多個(gè)各含有一種水溶液的容器；用一定量所述樣品接種各容器；將(i)分別用石蠟涂覆的載玻片和(ii)一定量待測(cè)抗微生物劑放入各容器，所述每個(gè)所述容器含有不同預(yù)定量的所述抗微生物劑；和觀察所述載玻片上該親石蠟性微生物生長(zhǎng)與否，以確定所述抗微生物劑抑制所述親石蠟性微生物生長(zhǎng)的最小抑菌濃度。
4.測(cè)定得自患者樣品的至少一種親石蠟性微生物對(duì)不同抗微生物劑及其預(yù)定量的敏感性的裝置，該裝置包括適于盛裝水溶液、一定量的待測(cè)抗微生物劑和所述樣品的容器；和適于放入所述容器的石蠟涂覆的載玻片，于是通過觀察所述載玻片上得自所述樣品的親石蠟性微生物的生長(zhǎng)情況就可確定抗所述親石蠟性微生物在所述載玻片上生長(zhǎng)所需的抗微生物劑濃度。
5.權(quán)利要求4的裝置，它包括每一個(gè)都適于盛裝水溶液、一定量的待測(cè)抗微生物劑和所述樣品的多個(gè)容器；和每一個(gè)都適于放入所述容器之一的多個(gè)石蠟涂覆的載玻片。
全文摘要
一種測(cè)定得自患者樣品的至少一種親石蠟性微生物對(duì)不同抗微生物劑及其預(yù)定量的敏感性的方法,該方法包括:提供至少一個(gè)含有一種水溶液的容器,然后用樣品接種該溶液。于是本方法包括將(i)用于引誘至少一種親石蠟性微生物、石蠟涂覆的載玻片和(ii)預(yù)定量的待測(cè)抗微生物劑放入該容器。然后觀察該載玻片上親石蠟性微生物生長(zhǎng)與否,以確定預(yù)定量的抗微生物劑在抑制載玻片上親石蠟性微生物的生長(zhǎng)方面是否有效。還提供了一種相關(guān)的裝置。
文檔編號(hào)C12M1/24GK1198774SQ96197439
公開日1998年11月11日 申請(qǐng)日期1996年9月25日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月4日
發(fā)明者R－A·奧拉 申請(qǐng)人:茵法克泰施公司