專利名稱：：脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬生物基因工程
技術領域：
，涉及一種利用新的脆壁克魯維酵母基因構(gòu)建的重組多核苷酸載體和可用于該載體轉(zhuǎn)化的脆壁克魯維酵母受體菌株，以及脆壁克魯維酵母高效的轉(zhuǎn)化方法。脆壁克魯維酵母(Kluyveromyecsfragilis)是食品工業(yè)中一種重要的生產(chǎn)菌株，它傳統(tǒng)地應用于生產(chǎn)乙醇、乳糖酶和單細胞蛋白等產(chǎn)品。近年的研究發(fā)現(xiàn)，這種酵母菌具有生長迅速、生物量大、營養(yǎng)要求簡單和蛋白分泌能力強的生理特點。因此它具有被發(fā)展成為一種能大量表達異源蛋白的基因工程生產(chǎn)菌株的潛在價值。要把脆壁克魯維酵母發(fā)展成一個生產(chǎn)異源蛋白的基因工程生產(chǎn)菌株，首先必須建立脆壁克魯維酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。一個轉(zhuǎn)化系統(tǒng)最基本的組成要素包括1.合適的受體菌株；2.適合于這個菌株的重組載體；3.便于分離篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標記；4.將該載體引入受體細胞的有效方法。雖然在乳酸克魯維酵母(Kluyveromyecslactis)的某些菌株中(Bianchi，M.M.etalCurrentGenetics1987，12185-192)和馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyecsmarxianus)的某些菌株中(Iborra，F(xiàn).CurrentGenetics1993，24181-183)已建立了高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，但到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)有人報道在脆壁克魯維酵母(KluyveromyecsfragilisCBS397)中建立起高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(通過光盤檢索1966-1996年間的Medline)。Das，S等人在J.Bacteriology(1984)1581165-1167中敘述了脆壁克魯維酵母(KluyveromyecsfragilisC21)的轉(zhuǎn)化方法。但是他們使用的載體是pGL2，采取的是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，得到的轉(zhuǎn)化效率非常低(20個轉(zhuǎn)化子/每10微克質(zhì)粒DNA)。Chen，X.J.等人在CurrentGenetics(1989)1695-98中報道了用pKD1衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多種酵母菌株的研究，其中包括對脆壁克魯維酵母K.fragilisCBS397，K.fragilisATCC36907和SaccharomycesfragilisATCC12424的轉(zhuǎn)化嘗試。結(jié)果在上述三個菌株中都沒得到轉(zhuǎn)化子。以往人們未能在脆壁克魯維酵母建立起高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的主要原因有以下幾方面1.沒有合適的受體菌株；2.缺乏理想的載體；3.缺少有效的選擇標記；4.沒有適合于脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化方法。這些都是建立脆壁克魯酵母高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的難點所在。國際上長期以來在脆壁克魯維酵母中未能建立起高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，嚴重限制了它在遺傳工程中的應用價值。本發(fā)明的目的在于建立一種能夠解決上述難點的脆壁克魯維酵母高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。發(fā)明者應用現(xiàn)代分子遺傳學的理論和方法針對上述難點開展研究，最終很好地解決了這些問題，并創(chuàng)立了脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其中包括(1).構(gòu)建了合適的脆壁克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型受體菌株K.fragilisHKY0039；(2).利用脆壁克魯維酵母的26SrRNA基因片斷構(gòu)建了脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)和pGEr-11；(3).建立了利用上述載體對脆壁克魯維酵母典型菌株和基因突變菌株的高效轉(zhuǎn)化方法。具體地說，本發(fā)明提出的脆壁克魯維酵母高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)包括適合于高效轉(zhuǎn)化的脆壁克魯維酵母受體菌株、用于該菌株的重組多核苷酸載體以及將該載體引入脆壁克魯維酵母受體菌株的高效方法。其中(1).所述的受體菌株為脆壁克魯維酵母的典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397和其突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039(CCTCC編號為No.M97003)。(2).所述的重組多核苷酸載體為帶有脆壁克魯維酵母26SrRNA基因片斷序列的pPru16(X1)(CCTCCNo.M97005)和pGEr-11(CCTCCNo.M97004)之任一種。(3).所述的轉(zhuǎn)化方法是利用上述重組多核苷酸載體轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397或其突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039(CCTCC編號為No.M97003)并得到轉(zhuǎn)化菌株的方法。下面對本
發(fā)明內(nèi)容進一步作具體說明1.構(gòu)建了合適的營養(yǎng)缺陷型受體菌株K.fragilisHKY0039以往人們在進行脆壁克魯維酵母細胞的轉(zhuǎn)化研究時，由于沒有現(xiàn)成的營養(yǎng)缺陷型受體菌株可供利用，所以不得不用帶有抗生素抗性基因(如抗G418的基因Tn903)的載體去轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母的野生型菌株。因為G418(Geneticin)是一種氨基糖苷類抗生素，不同的菌株對它的天然抗性有很大差異。當用量不足時，許多非轉(zhuǎn)化菌落也混雜于轉(zhuǎn)化子中間；而當用量過多時，由于其藥物的毒性作用，許多真正的轉(zhuǎn)化子也難以生長，導致轉(zhuǎn)化頻率偏低。所以在轉(zhuǎn)化子的篩選中使用并不方便。此外，G418價格昂貴，而且需依賴進口，實非一般單位長期使用所能承受。根據(jù)前人的研究，一定濃度的5-氟乳清酸(5-fluorooroticacid，5-FOA)能抑制野生型酵母菌的生長，而不影響某些尿嘧啶合成基因突變(如ura3，ura5)酵母菌株的生長(Boeke，.J.D.etal.，Mol.Gen.Genet.1984，197345-346)。本發(fā)明利用酵母菌的這個生理特點，對脆壁克魯維酵母的典型菌株(KluyveromyecsfragilisCBS397)進行了突變改造，得到了它的突變菌株K.fragilisHKY0039(CCTCCNo.M97003)。這個突變菌株的遺傳特點是帶有嘧啶合成代謝途徑中ura3基因功能缺陷的表型。它的乳清酸核苷5_磷酸脫羧酶(orotidine-5’-Pdecarboxylase，4.1.1.23)是沒有功能的。因此它在沒有尿嘧啶(uracil)的合成培養(yǎng)基中不能生長。這就首次在脆壁克魯維酵母中建立了一個營養(yǎng)缺陷型受體菌株。利用它可以非常簡便、有效地在合成培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化細胞。因為只要通過轉(zhuǎn)化方法把帶有正常URA3基因的載體引人該營養(yǎng)缺陷型受體細胞，就能依靠基因功能補償?shù)淖饔檬贡晦D(zhuǎn)化細胞獲得在無尿嘧啶的合成培養(yǎng)基上生長的能力。所以，本發(fā)明構(gòu)建的K.fragilisHKY0039菌株是至今第一個可以在合成培養(yǎng)基上通過基因功能補償作用進行轉(zhuǎn)化子篩選的脆壁克魯維酵母受體菌株。它的建立為創(chuàng)建脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)奠定了有利的基礎。K.fragilisHKY0039突變菌株的構(gòu)建與鑒定方法如下1).突變菌株的構(gòu)建將YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時的脆壁克魯維酵母(K.fragilisCBS397)細胞用無菌NS溶液洗滌。然后懸浮于NS溶液，置于一塊無菌培養(yǎng)皿中。在無菌室內(nèi)打開培養(yǎng)皿蓋子，用230nM波長的紫外線燈照射。取被照射過的菌液，轉(zhuǎn)接入YEPD培養(yǎng)基內(nèi)，于30℃搖床培養(yǎng)12-14小時。細胞經(jīng)NS溶液洗滌后，均勻涂布在SDUF選擇培養(yǎng)基，置于28-30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7-10天。凡能在SDUF選擇培養(yǎng)基上生長的菌落就是發(fā)生了尿嘧啶合成基因突變的細胞。2).突變菌株的鑒定對得到的突變菌株必須作進一步檢驗，以排除雜菌污染的可能。這些檢驗包括細胞顯微形態(tài)的觀察，細胞生長譜的驗證和回復突變率的測定等。此外，由于有兩種尿嘧啶合成基因的突變(ura3和ura5)都可產(chǎn)生這種表型，而我們需要的只是ura3基因突變菌株，所以還需用帶URA3基因的載體去轉(zhuǎn)化已得到的這些突變菌株。只有能經(jīng)該載體轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化子的菌株，才是真正的ura3基因突變菌株。本突變菌株鑒定所用的轉(zhuǎn)化載體pPru16(X1)和轉(zhuǎn)化方法都是本發(fā)明的組成部分(下詳)。經(jīng)過上述所有步驟的鑒定結(jié)果表明，我們成功地構(gòu)建了脆壁克魯維酵母的ura3基因突變菌株K.fragilisHKY0039。脆壁克魯維酵母ura3基因突變菌株K.fragilisHKY0039的特征如下1.在顯微鏡下，YEPE培養(yǎng)基中生長的細胞形態(tài)以橢圓形為主，間或有少量卵園形和園筒形細胞。細胞以出芽方式增殖，生長旺盛的細胞通常有1-2個或更多的芽體。2.在YEPD固體培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)為白色或乳白色園形突起，表面光滑。3.能以乳糖為唯一碳源生長。在以乳糖為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時間長的菌落中心突起，邊緣略有扇形溝槽。4.不能在缺尿嘧啶的酵母基本培養(yǎng)基上生長。5.能在含0.005％尿嘧啶和0.1％5-氟乳清酸的酵母基本培養(yǎng)基上生長。6.該菌ura3基因的回復突變頻率為10-8。所用培養(yǎng)基及試劑成分YEPD培養(yǎng)基2％葡萄糖(glucose)，2％水解蛋白胨(polypeptone)，1％酵母抽提物(yeastextract)NS溶液0.85％氯化鈉(NaCl)SDF選擇培養(yǎng)基0.7％酵母基礎氮源(yeastnitrogenbasew/oaminoacids)，2％葡萄糖(glucose)，0.005％尿嘧啶(uracil)，0.1％5-氟乳清酸(5-FOA)2.構(gòu)建了脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)和pGEr-11以往人們在進行脆壁克魯維酵母細胞的轉(zhuǎn)化研究時使用的載體主要是游離型的穿梭質(zhì)粒載體。它主要由DNA復制系統(tǒng)，選擇標記和一些用于克隆的限制性核酸內(nèi)切酶位點構(gòu)成。它一般含有大腸桿菌和酵母菌這兩種不同的DNA復制系統(tǒng)，因而能在這兩種不同的宿主中復制。其中，酵母的復制系統(tǒng)可來源于酵母染色體或酵母天然質(zhì)粒的自我復制序列(AutonomoursReplicatingSequences，ARS)。而選擇標記則必須與被轉(zhuǎn)化菌株的基因型相匹配。如果沒有現(xiàn)成的營養(yǎng)缺陷型受體菌株可供利用，就不得不用抗生素抗性基因作為選擇標記。例如，Das，S等人使用的載體pGL2就是借用來源于乳酸克魯維酵母染色體的ARS。而Chen，X.J.等人使用的pKD1衍生質(zhì)粒則利用了果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)天然質(zhì)粒pKD1的DNA復制系統(tǒng)。這兩種復制系統(tǒng)在實際使用中都表現(xiàn)出較強的宿主專一性。即，在不同的酵母宿主中它們的DNA復制效率有明顯的差異。這也是前人在轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母時，或是轉(zhuǎn)化頻率極低，或是根本得不到轉(zhuǎn)化子的重要原因之一。此外，他們都是利用G418抗性基因作為選擇標記，這也增加了轉(zhuǎn)化子篩選的難度。本發(fā)明在構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母的新型載體時，采取了不同與前人的技術路線。這主要體現(xiàn)在以下兩個方面1).采用脆壁克魯維酵母的rRNA基因片段序列作為介導載體與受體細胞基因組DNA之間進行整合的靶序列酵母的rRNA基因在每個細胞的基因組中大約有150-200份拷貝。因此，利用rRNA基因片段構(gòu)建成的整合載體就能利用它所攜帶的rRNA基因片段與受體細胞基因組內(nèi)的rRNA基因之間發(fā)生同源重組，從而介導該載體有效地整合到受體細胞染色體上并隨染色體DNA同步復制。這種類型的整合載體以往曾在釀酒酵母(Lopes，T.S.etal.，Gene1989，79199-206)和乳酸克魯維酵母的轉(zhuǎn)化中報道過(Ronald，J.M.etal.，CurrentGenetics1992，21365-370)，但至今未在脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化中報道過。其原因之一，是因為至今沒有其他人克隆到脆壁克魯維酵母的rRNA基因；其原因之二，是因為至今沒有其他人建立起高效的脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化方法。眾所周知，整合轉(zhuǎn)化頻率要比一般轉(zhuǎn)化頻率低得多，沒有高效的轉(zhuǎn)化方法是很難得到整合型轉(zhuǎn)化子的。我們利用現(xiàn)代分子生物學的DNA重組技術克隆到了脆壁克魯維酵母的26SrRNA基因片段，測定了它的核苷酸序列(見附圖1)，并首次成功地用它構(gòu)建了脆壁克魯維酵母的整合型載體pPru16(X1)和pGEr-11。A.脆壁克魯維酵母26SrRNA基因的克隆方法制備脆壁克魯維酵母典型菌株K.fragilisCBS397的基因組總DNA，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切后，先用瓊脂糖凝膠電泳分離，再印漬轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以放射性同位素α-32pdATP標記的釀酒酵母26SrRNA基因片段作為探針進行分子雜交。根據(jù)雜交信號確定脆壁克魯維酵母26SrRNA基因在膠上的位置，割膠回收該區(qū)域的DNA并與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用釀酒酵母26SrRNA基因片段作為探針雜交篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，并對該克隆進行DNA抽提、純化和DNA序列測定。將測定結(jié)果與釀酒酵母26SrRNA基因序列進行同源性比較。結(jié)果表明我們成功地克隆到了脆壁克魯維酵母26SrRNA基因中一個3.9kb的EcoRI片段。B.脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)的構(gòu)建將脆壁克魯維酵母26SrRNA基因3.9kbEcoRI片段用DNA限制性內(nèi)切酶BamHI和BglII同時酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并回收約1.2kbrDNA片段，與已經(jīng)BamHI酶切并去磷酸化的載體pPU連接(pPU是我們以pUC19質(zhì)粒為基本框架構(gòu)建的含有釀酒酵母URA3基因的質(zhì)粒載體)構(gòu)建成脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)(CCTCCNo.M97005)，其結(jié)構(gòu)見附圖2。該載體適合于轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母ura3基因突變菌株，它具有以下特征1.該載體為5.5kb的雙鏈環(huán)狀DNA。2.帶有脆壁克魯維酵母26SrRNA基因片段作為酵母整合轉(zhuǎn)化時介導載體與受體細胞染色體DNA之間同源重組的靶序列。3.帶有釀酒酵母的URA3基因，作為酵母轉(zhuǎn)化時的選擇標記。4.帶有氨卞青霉素抗性基因，作為大腸桿菌轉(zhuǎn)化時的選擇標記。5.帶有大腸桿菌質(zhì)粒ColE1的復制起始區(qū)，使該載體能在大腸桿菌中高拷貝地擴增。6.帶有多個可用于分子克隆操作的DNA限制性內(nèi)切酶單切位點，如BamHI，EcoRI，SacI，SmaI，SalI和SphI等。7.用XbaI將該載體切成線性后再轉(zhuǎn)化酵母，可大幅度提高轉(zhuǎn)化頻率。C.脆壁克魯維酵母整合型載體pGEr-11的構(gòu)建將脆壁克魯維酵母26SrDNA基因3.9kbEcoRI片段用DNA限制性內(nèi)切酶BamHI和BglII同時酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并回收約1.2kbrDNA片段，與已經(jīng)BamHI酶切并去磷酸化的載體pGE連接(pGE是我們以pUC19質(zhì)粒為基本框架構(gòu)建的含有G418抗性基因的質(zhì)粒載體)構(gòu)建成脆壁克魯維酵母整合型載體pGEr-11(CCTCCNo.M97004)，其結(jié)構(gòu)見附圖3。該載體適合于轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母野生型菌株，它具有以下特征1.該載體為4.9kb的雙鏈環(huán)狀DNA。2.帶有脆壁克魯維酵母26SrRNA基因片段作為酵母整合轉(zhuǎn)化時介導載體與受體細胞染色體DNA之間同源重組的靶序列。3.帶有G418抗性基因，作為酵母轉(zhuǎn)化時的選擇標記。4.帶有氨卞青霉素抗性基因，作為大腸桿菌轉(zhuǎn)化時的選擇標記。5.帶有大腸桿菌質(zhì)粒ColE1的復制起始區(qū)，使該載體能在大腸桿菌中高拷貝地擴增。6.帶有多個可用于分子克隆操作的DNA限制性內(nèi)切酶單切位點，如BamHI，EcoRI，SacI，SmaI，SalI和SphI等。7.用NcoI將該載體切成線性后再轉(zhuǎn)化酵母，可大幅度提高轉(zhuǎn)化頻率。2).采用釀酒酵母的URA3基因作為選擇標記釀酒酵母的URA3基因已被證明能在多種宿主的ura3基因缺陷株中產(chǎn)生功能補償作用，因此許多酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的載體都采用它作為選擇標記。用URA3基因作為選擇標記的優(yōu)點在于(1).便于轉(zhuǎn)化釀酒酵母的URA3基因很小，只有1.1kb。因此不會象某些選擇標記那樣過于增大載體規(guī)模以致影響到細胞對載體DNA的攝入效率。(2).便于篩選帶UR3基因的載體被引入ura3基因缺陷細胞后，便通過功能補償作用使受體細胞獲得在無尿嘧啶合成培養(yǎng)基上生長的能力。因此凡是轉(zhuǎn)化之后能在該培養(yǎng)基上生長的受體細胞就是真正的轉(zhuǎn)化子。不會發(fā)生在使用抗性選擇標記時經(jīng)常出現(xiàn)的由于抗生素加入量過多或過少而引起轉(zhuǎn)化結(jié)果含糊不清的狀況。(3).便于使用利用URA3基因作為轉(zhuǎn)化的選擇標記，其選擇培養(yǎng)基的配制非常簡便。只需在蒸餾水中加入適量的酵母基本氮源和碳源即成。無須其他任何價格昂貴的添加物。盡管用URA3基因作為選擇標記有諸多優(yōu)點，然而至今沒有其他人報道在脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中用它作為構(gòu)建載體的選擇標記。原因在于要利用URA3基因作為載體的選擇標記，必須具備一個不可缺少的前提條件。即必須先要有ura3基因缺陷的受體菌株可資利用。本發(fā)明通過對脆壁克魯維酵母典型菌株K.fragilisCBS397進行改造得到了ura3基因功能缺陷的脆壁克魯維酵母突變菌株K.fragilisHKY0039，這為在脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中利用URA3基因作為選擇標記提供了重要的前提條件，為創(chuàng)建脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)奠定了有利的基礎。3.建立了利用前述載體對脆壁克魯維酵母典型菌株和突變菌株的高效轉(zhuǎn)化方法對于酵母與真菌類低等真核生物細胞的轉(zhuǎn)化，目前國際上常用的有三種方法。即原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法和完整細胞轉(zhuǎn)化法。這三種方法各有利弊。原生質(zhì)體法的優(yōu)點是轉(zhuǎn)化頻率較高，不需要特殊的儀器設備。缺點是操作步驟繁瑣，通常需要4-5個小時，并且影響轉(zhuǎn)化成敗的因素很多，技術要領也較難掌握。其中酶解細胞壁的處理是關鍵，酶處理過度或不足都會嚴重影響轉(zhuǎn)化結(jié)果。整個細胞轉(zhuǎn)化操作過程必須在低溫和等滲透壓的條件下進行。另外，轉(zhuǎn)化子的生長也很緩慢，通常需5-7天才能觀察到結(jié)果。電擊轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點是簡便省時，操作過程通常只需2小時左右，只要所選定的條件得當，一般可以達到很高的轉(zhuǎn)化頻率。此法的不足之處，一是需要配備特定的儀器設備。二是對細胞預處理和電沖擊的條件控制要求很嚴格，而這些因素在不同細胞的轉(zhuǎn)化條件中各不相同，較難掌握，常常導致轉(zhuǎn)化的失敗。完整細胞轉(zhuǎn)化法是一種最簡便有效的酵母細胞轉(zhuǎn)化方法。它既不需要對細胞進行酶解處理，也不需要特定的儀器設備。整個轉(zhuǎn)化過程通常只需2小時即可完成。轉(zhuǎn)化子的生長也較快，一般只需2-3天就能觀察到結(jié)果。不足之處是它的轉(zhuǎn)化頻率往往不如前面兩種方法的高。而且，不同的酵母細胞對轉(zhuǎn)化條件的要求也各不相同。處理不好易造成轉(zhuǎn)化失敗。以上三種方法在乳酸克魯維酵母轉(zhuǎn)化中的應用都已有報道(Bianchietal.，1987，Curr.Genet.12，185-192；Meilhoc，E.，etal.，1990，Bio/Technology8，223-227.Sanchezetal.，1993，Appl.Environ.Microbiol.59，2087-2092.Menart&amp;Bolotin-Fukuharain“Genetics，Biochemistry，andMolecularBiologyofNon-ConventionalYeasts”editedbyK.Wolf(SpringerVerlag)p.30)。然而，以往人們在進行脆壁克魯維酵母細胞的轉(zhuǎn)化時，都是采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(Das，S.etal.，J.Bacteriology1984，1581165-1167.Chen，X.J.etal.，CurrentGenetics1989，1695-98)，結(jié)果轉(zhuǎn)化頻率很低或沒有轉(zhuǎn)化子。這除了有上面已經(jīng)分析過的受體細胞和載體兩方面的原因以外，沒有掌握脆壁克魯維酵母細胞轉(zhuǎn)化的最佳條件也是一個很重要的原因。本發(fā)明在深入研究分析了各種不同酵母轉(zhuǎn)化方法的利弊后，根據(jù)脆壁克魯維酵母的特點對以往的酵母完整細胞轉(zhuǎn)化法加以改進。創(chuàng)立了利用前述載體對脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化方法。其操作過程主要分為四個步驟1).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)2).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的制備3).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化4).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細胞的篩選下面分別對這些步驟中影響脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化效率的主要因素和具體操作進行說明1).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)是制備高質(zhì)量感受態(tài)細胞的前提。用于轉(zhuǎn)化的細胞處于何種生長狀態(tài)，對于轉(zhuǎn)化效率有重要影響。通常情況下，細胞接種于培養(yǎng)基后，其生長過程先后經(jīng)歷了延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期這樣幾個階段。因為在不同的生長階段中，細胞代謝和分裂的狀態(tài)不同，細胞壁的結(jié)構(gòu)組份也有不同的變化。因此，并非任何生長階段的細胞都是最適于進行轉(zhuǎn)化的。只有處在某一特定生長期的細胞才適合于制備感受態(tài)細胞。細胞生長周期中的這一轉(zhuǎn)化最適時態(tài)是依被轉(zhuǎn)化物種和所用轉(zhuǎn)化方法的不同而異的。例如，有的菌適合于在對數(shù)期制備感受態(tài)細胞，而有的菌適合于在穩(wěn)定期等等，各不相同。對于每一種菌都需要通過周密的研究才能找到其轉(zhuǎn)化的最適生長時態(tài)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脆壁克魯維酵母細胞轉(zhuǎn)化的最適生長時態(tài)是在穩(wěn)定期。當細胞培養(yǎng)至OD6005-6(每毫升約5×107細胞)時制備感受態(tài)細胞的效果最佳。2).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的制備脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的制備是決定轉(zhuǎn)化成敗的重要因素之一。這一步驟主要是利用某些化學試劑在一定溫度條件下作用于受體細胞，使細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的細微變化，因而處于一種易于吸附和攝取DNA的感受狀態(tài)。在目前通用的各類轉(zhuǎn)化方法中，常用的主要試劑是某些堿性陽離子(如鈣、鋰、銫等)的鹽溶液。這些鹽溶液的種類和濃度也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。因此，必須依據(jù)被轉(zhuǎn)化細胞的物種品系不同，通過一系列實驗研究找到對該菌轉(zhuǎn)化最適合的試劑進行處理。例如，目前對大腸桿菌轉(zhuǎn)化常用的條件是以0.1M氯化鈣溶液在冰浴作用。Ito，H.等用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母完整細胞的方法(Ito，H.etal.，JournalofBacteriology1983，153163-168)和Das，D.等用于轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母完整細胞的方法(Das，S.etal.，JournalofBacteriology1984，1581165-1167)中都是使用0.2M氯化鋰與70％聚乙二醇4000在30℃作用。本發(fā)明根據(jù)脆壁克魯維酵母的特點，采取在冰浴條件下先用1.2M山梨醇、二硫蘇糖醇和氯化鎂等試劑處理，再用0.1-0.4M醋酸鋰與40-70％聚乙二醇4000進行處理的步驟。山梨醇溶液的作用是使細胞處于高滲透壓環(huán)境下。二硫蘇糖醇能修飾酵母細胞壁上的甘露糖蛋白復合物，改變其完整性，使胞壁產(chǎn)生微孔，利于高分子量的DNA穿透，具有保護載體DNA分子，減少其被核酸酶降解和促進細胞吸收DNA的作用。3).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化酵母的轉(zhuǎn)化是通過感受態(tài)細胞對載體DNA的攝入實現(xiàn)的。在這一過程中，作用于細胞的溫度和時間是影響轉(zhuǎn)化成敗的重要因素。本發(fā)明根據(jù)脆壁克魯維酵母的生理特點，先使細胞在冰浴作用30-60分鐘，然后再加入載體DNA在40-45℃作用20-60分鐘可達到最佳轉(zhuǎn)化效果。4).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細胞的篩選轉(zhuǎn)化細胞的篩選方法對轉(zhuǎn)化效率有直接的影響。而篩選方法是取決于被轉(zhuǎn)化細胞的遺傳背景和所用轉(zhuǎn)化載體的選擇標記的。目前在酵母細胞轉(zhuǎn)化中，對于野生型菌株的轉(zhuǎn)化通常必須用抗菌素進行篩選。轉(zhuǎn)化子細胞由于攝入了帶有抗性基因的載體DNA，因而能在含有一定濃度抗菌素的選擇培養(yǎng)基上生長。常用于酵母轉(zhuǎn)化子篩選的抗菌素有G418和放線菌酮等。但因抗菌素對細胞的生理影響較大，因此轉(zhuǎn)化效率往往較低。對有基因功能缺陷的酵母突變菌株(如his3，lys2，trp1等)，則可以通過基因功能補償?shù)姆椒ㄟM行篩選。例如，通過轉(zhuǎn)化將帶有正常基因(如HIS3，LYS2，TRP1等)的載體導入相應的酵母突變細胞，就能使被轉(zhuǎn)化細胞獲得載體上正常基因功能的補償。由于這種方法對于細胞的正常功能沒有影響，因而轉(zhuǎn)化效率通常較高。本發(fā)明構(gòu)建的兩種脆壁克魯維酵母整合型載體pGEr-11和pPrul6(X1)分別帶有G418抗性基因和酵母URA3基因這樣兩種選擇標記，因而可用于具有不同遺傳背景的脆壁克魯維酵母菌株的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法中所用培養(yǎng)基和化學試劑的成分如下1.受體菌培養(yǎng)使用YEPD液體培養(yǎng)基2％葡萄糖(glucose)，2％水解蛋白胨(polypeptone)，1％酵母抽提物(yeastextract)。2.脆壁克魯維酵母ura3基因突變菌株(K.fragilisHKY0039)轉(zhuǎn)化篩選使用SD固體培養(yǎng)基0.7％酵母基礎氮源(yeastnitrogenbasew/oaminoacids)，2％葡萄糖(glucose)，1.5％瓊脂(agar)。3.脆壁克魯維酵母的典型菌株(K.fragilisCBS397)轉(zhuǎn)化篩選使用含G418的YEPD固體培養(yǎng)基2％葡萄糖(glucose)，2％水解蛋白胨(polypeptone)，1％酵母抽提物(yeastextract)，1.5％瓊脂(agar)。抗菌素G418的使用詳見“脆壁克魯維酵母完整細胞轉(zhuǎn)化方法”。4.1.2M山梨醇溶液21.8g山梨醇(sorbitol)溶于87ml無菌雙重蒸餾水。5.1M二硫蘇糖醇溶液154.3mg二硫蘇糖醇(dithiothreitol)，溶解于1ml無菌雙重蒸餾水，經(jīng)0.2μm微孔瀘膜過瀘除菌。6.TM溶液2.5mM三羥基氨基甲烷(Tris)pH8.0，2mM氯化鎂(MgCl2)。7.LAP溶液40％聚乙二醇4000(polyethylenglycol4000)，0.2M醋酸鋰(LiAc)。8.變性小牛胸腺DNA10mg小牛胸腺DNA溶解于1ml無菌雙重蒸餾水，經(jīng)超聲波變性處理。9.用于轉(zhuǎn)化的載體DNA純度應為電泳純，濃度應為每微升0.2-0.5μg之間，每次轉(zhuǎn)化用量范圍以0.2-1μg之間為宜，過多或過少都會影響轉(zhuǎn)化效果。以上所有培養(yǎng)基和試劑(除1M二硫蘇糖醇溶液)都應經(jīng)過15磅，20分鐘濕熱滅菌處理。實施例一脆壁克魯維酵母突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039的轉(zhuǎn)化(一).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)1.接種脆壁克魯維酵母突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039于YEPD(2％葡萄糖，2％水解蛋白胨，1％酵母抽提物)培養(yǎng)基中，30-37℃搖床培養(yǎng)至OD6005-6，細胞數(shù)約5×107/每毫升。2.取1.5毫升培養(yǎng)物在臺式離心機于15,000rpm離心，棄去上清液。3.用無菌蒸餾水洗滌細胞兩次。(二).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的制備1.細胞懸浮于200微升1.2M山梨醇溶液，加2微升1M二硫蘇糖醇溶液，混合均勻。置于冰浴10分鐘以上。2.反應物在臺式離心機于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。3.細胞懸浮于1毫升TM溶液(2.5mM三羥基氨基甲烷pH8.0，2mM氯化鎂)，在臺式離心機于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。4.細胞懸浮于150微升TM溶液，置于冰浴30-60分鐘。5.反應物在臺式離心機于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。6.細胞懸浮于50微升1M二硫蘇糖醇溶液，混合均勻后再加入450微升LAP溶液(0.2M醋酸鋰，40％聚乙二醇4000)，混合均勻。(三).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化1.每個轉(zhuǎn)化反應管中依次加入100微升感受態(tài)細胞，50微克變性小牛胸腺DNA，1微克轉(zhuǎn)化載體DNApPru16(X1)?；旌暇鶆蚝笾糜?2℃，30分鐘。2.轉(zhuǎn)化物在臺式離心機于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。3.用無菌蒸餾水洗滌細胞一次，然后將細胞懸浮于100微升無菌蒸餾水。(四).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細胞的篩選1.把轉(zhuǎn)化細胞均勻涂布于酵母固體選擇培養(yǎng)基(0.7％酵母基礎氮源，2％葡萄糖，1.5％瓊脂)上。2.置30℃恒溫培養(yǎng)箱中，三天后即可觀察結(jié)果。實施例二脆壁克魯維酵母典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397的轉(zhuǎn)化(一).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)1.接種脆壁克魯維酵母典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397于YEPD(2％葡萄糖，2％水解蛋白胨，1％酵母抽提物)培養(yǎng)基中，30-37℃搖床培養(yǎng)至OD6005-6，細胞數(shù)約5×107/每毫升。2.取1.5毫升培養(yǎng)物在臺式離心機于15,000rpm離心，棄去上清液。3.用無菌蒸餾水洗滌細胞兩次。(二).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的制備1.細胞懸浮于200微升1.2M山梨醇溶液，加2微升1M二硫蘇糖醇溶液，混合均勻。置于冰浴10分鐘以上。2.反應物在臺式離心機于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。3.細胞懸浮于1毫升TM溶液(2.5mM三羥基氨基甲烷pH8.0，2mM氯化鎂)，在臺式離心機于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。4.細胞懸浮于150微升TM溶液，置于冰浴30-60分鐘。5.反應物在臺式離心機于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。6.細胞懸浮于50微升1M二硫蘇糖醇溶液，混合均勻后再加入450微升LAP溶液(0.2M醋酸鋰，40％聚乙二醇4000)，混合均勻。(三).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化1.每個轉(zhuǎn)化反應管中依次加入100微升感受態(tài)細胞，50微克變性小牛胸腺DNA，1微克轉(zhuǎn)化載體DNApGEr-1?；旌暇鶆蚝笾糜?2℃，30分鐘。2.轉(zhuǎn)化物在臺式離心機于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。3.用無菌蒸餾水洗滌細胞一次，然后將細胞懸浮于100微升無菌蒸餾水。(四).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細胞的篩選1.把轉(zhuǎn)化細胞均勻涂布在預先制備的酵母YEPD固體培養(yǎng)基底層平板上，再在其上覆蓋一層(約10ml，45℃保溫)YEPD固體培養(yǎng)基。待凝固后，置30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24小時。然后在上層培養(yǎng)基表面均勻涂布一定量的G418溶液，使整塊轉(zhuǎn)化平板的終濃度達到每毫升200微克。2.置30℃恒溫培養(yǎng)箱中，三天后即可觀察結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點可以概括如下1.由于構(gòu)建了適合脆壁克魯維酵母高效轉(zhuǎn)化的受體菌株HKY0039，因而可以在脆壁克魯維酵母中利用缺陷基因功能補償作為轉(zhuǎn)化子篩選的手段。2.克隆并利用了脆壁克魯維酵母的26SrDNA基因片斷作為介導載體與受體細胞基因組之間進行同源整合的靶序列，因而可得到拷貝數(shù)多、穩(wěn)定性好的整合型轉(zhuǎn)化子。3.利用上述受體菌株和載體建立了適合于脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化方法。該方法具有操作簡便，費用低廉，效果優(yōu)良的特點。使用本發(fā)明提供的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以使脆壁克魯維酵母的轉(zhuǎn)化頻率大幅度超過前人的結(jié)果，具體可見下表。表1.本發(fā)明與前人方法對脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化效率的比較<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="760">菌株載體選擇標記轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化子數(shù)/xugDNAK.fragilisATCC36907pCXJ-KanlG418原生質(zhì)體法0/5ugofplasmidDNAS.fragilisATCC12424pCXJ-KanlG418原生質(zhì)體法0/5ugofplasmidDNAK.fragilisCBS397pCXJ-KanlG418原生質(zhì)體法0/5ugofplasmidDNAK.fragilisC21pGL2G418完整細胞法20/10ugofplasmidDNAK.fragilisHKY0039pGEr-11G418完整細胞法5000/lugofplasmidDNAK.fragilisHKY0039pPru16(X1)URA3完整細胞法5000/lugofplasmidDNA</table></tables>圖1為脆壁克魯維酵母(KluyveromyecsfragilisCBS397)26S核糖體RNA基因片斷的脫氧核糖核酸(DNA)序列。圖2為脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)結(jié)構(gòu)圖。圖3為脆壁克魯維酵母整合型載體pGEr-11結(jié)構(gòu)圖。權利要求1.一種脆壁克魯維酵母高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，包括適合于高效轉(zhuǎn)化的脆壁克魯維酵母受體菌株、用于該菌株的重組多核苷酸載體以及將該載體引入脆壁克魯維酵母受體菌株的高效方法。其特征在于1).所述的受體菌株為脆壁克魯維酵母的典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397和其突變菌株Kluyveromyecs.fragilisHKY0039(CCTCC編號為No.M97003)。2).所述的重組多核苷酸載體為帶有脆壁克魯維酵母26SrRNA基因片斷序列的pPru16(X1)(CCTCCNo.M97005)和pGEr-11(CCTCCNo.M97004)之任一種。3).所述的轉(zhuǎn)化方法是利用上述重組多核苷酸載體轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母典型菌株Kluyveromyecs.fragiliaCBS397或其突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039(CCTCC編號為No.M97003)并得到轉(zhuǎn)化菌株的方法。2.根據(jù)權利1的要求，所述高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的重組多核苷酸載體，其特征為帶有脆壁克魯維酵母中的26SrRNA基因片斷序列。該基因片斷序列是利用分子克隆技術從脆壁克魯維酵母基因組中克隆到的。3.根據(jù)權利1和2的要求，所述高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的重組多核苷酸載體，其特征為脆壁克魯維酵母的26SrRNA基因片斷序列構(gòu)成該重組多核苷酸載體的組成部分。4.根據(jù)權利1-3的要求，所述高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的重組多核苷酸載體，其特征為帶有能在大腸桿菌中自主復制的多核苷酸序列和至少下述之一種選擇標記尿嘧啶合成基因功能補償(URA3)的和抗G418的。5.根據(jù)權利14的要求，所述高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法，其特征為脆壁克魯維酵母完整細胞的轉(zhuǎn)化。其操作過程分為四個步驟1).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)；2).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的制備；3).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化；4).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細胞的篩選。6.根據(jù)權利5的要求，所述脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)，其特征為將脆壁克魯維酵母典型菌株或脆壁克魯維酵母突變菌株HKY0039接種于YEPE培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD6005-6，細胞數(shù)約5×107/每毫升。7.根據(jù)權利5的要求，所述脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的制備，其特征為在冰浴條件下，先用1.2M的山梨醇、二硫蘇糖醇和氯化鎂等試劑處理，再用0.1-0.4M醋酸鋰與40-70％聚乙二醇4000進行處理。8.根據(jù)權利5的要求，所述脆壁克魯維酵母感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化，其特征為先使細胞在冰浴作用30-60分鐘，然后再加入載體DNA在40-45℃作用20-60分鐘。9.根據(jù)權利5的要求，所述脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細胞的篩選，其特征為通過酵母URA3基因的功能補償作用或G418抗性基因的抗G418作用實現(xiàn)的。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的脆壁克魯維酵母基因-26SrRNA基因片斷序列；利用該序列構(gòu)建的重組多核苷酸載體；可被該載體轉(zhuǎn)化的脆壁克魯維酵母受體菌株以及脆壁克魯維酵母完整細胞的高效轉(zhuǎn)化方法。以上內(nèi)容構(gòu)成脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，它可以利用缺陷基因功能補償作為轉(zhuǎn)化子篩選的手段，因而具有操作簡便、費用低廉、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點。作為本發(fā)明的例子是用于在脆壁克魯維酵母的典型菌株或其ura3突變菌株中高效獲得穩(wěn)定的抗氨基葡糖苷G418或尿嘧啶合成基因功能補償?shù)霓D(zhuǎn)化菌株。文檔編號C12N15/81GK1166527SQ9710640公開日1997年12月3日申請日期1997年4月24日優(yōu)先權日1997年4月24日發(fā)明者霍克克,唐南筠,袁漢英,王瓊慶,李育陽申請人:復旦大學