專利名稱：新穎的雌激素受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于核激素受體總科的受體，特別是甾類受體領(lǐng)域。本發(fā)明涉及編碼新穎甾類受體的DNA，所述受體的制備，該受體蛋白及其應(yīng)用。
甾類激素受體屬于基因表達(dá)的配體依賴轉(zhuǎn)錄控制中所涉及的核激素受體總科。此外，此總科由非甾類激素如維生素D、甲狀腺激素和類視黃素的受體所組成(Giguere等人《自然》(Nature)330，624-629，1987；Evans，R.M.，《科學(xué)》(Science)240，889-895，1988)。而且，核受體樣序列的范圍業(yè)已鑒定，它編碼所謂的“孤獨(dú)”受體這些受體結(jié)構(gòu)上與核受體相關(guān)，因此劃分入核受體，雖然還沒(méi)有推斷的配體被鑒定出來(lái)(B.W.O＇Malley，《內(nèi)分泌學(xué)》(Endocrinology)125，1119-1170，1989；O.J.Mangelsdorf和R.M.Evans，《細(xì)胞》(細(xì)胞)83，841-850-1995)。
核激素受體總科共享有這樣一種組件結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中顯示六個(gè)截然不同的結(jié)構(gòu)與功能區(qū)，A至F(Evans，《科學(xué)》(Science)240，889-895，1988)。核激素受體的特征在于，可變N-末端區(qū)(A/B功能區(qū))，接著是位于中央的，高度保守的DNA-結(jié)合功能區(qū)(下文稱作DBD；C功能區(qū))，可變鉸鏈區(qū)(D功能區(qū))，保守的配體結(jié)合功能區(qū)(下文稱作LBD；E功能區(qū))和可變C-末端區(qū)(F功能區(qū))。
N-末端區(qū)在大小和序列上高度可變，在該總科的不同成員間保守性差。受體的這一部分參與轉(zhuǎn)錄活化的調(diào)控(Bocquel等人，《核酸研究》(Nucl.Acid Res)，17，2581-2595，1989；Tora等人)，《細(xì)胞》(Cell)59，477-487，1989)。
DBD由大致66至70個(gè)氨基酸組成，且主管DNA結(jié)合活性它使受體定向于稱作激素效應(yīng)元件(下文稱作HRE)的特異性DNA序列，而HRE在染色質(zhì)上的特異性靶基因之轉(zhuǎn)錄控制單位內(nèi)(Martinez和Wahli，《核激素受體》(Nuclear Hormone Receptors)，Acad.Press，125-153，1991)。
LBD位于受體的C-末端部分，且主管配體結(jié)合活性。以這種方式，LBD是識(shí)別和結(jié)合激素配體所必需的，且此外具有轉(zhuǎn)錄活化功能，因此決定受體激素應(yīng)答的特異性和選擇性。雖然在結(jié)構(gòu)上中度保守，但已知LBD在核激素受體總科的各個(gè)成員間的同源性上有相當(dāng)大的變化(Evans，《科學(xué)》(Science)240，889-895，1988；P.J.Fuller，F(xiàn)ASEB J.，5，3092-3099，1991；Mangelsdorf等人，《細(xì)胞》(Cell)，Vol.83，835-839，1995)。
存在于N-末端區(qū)、LBD和DBD上的功能可相互獨(dú)立地操作，且業(yè)已顯示，這些功能區(qū)可以在核受體間交換(Green等人，《自然》(Nature)，Vol.325，75-78，1987)。這就導(dǎo)致嵌合核受體，如在例如WO-A-8905355中所描述的。
當(dāng)核受體的激素配體通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞并被LBD識(shí)別時(shí)，它將結(jié)合到特異性受體蛋白上，因此起動(dòng)受體蛋白的變構(gòu)變化。這種變化的結(jié)果是，配體/受體配合物變換至轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)，且因此而能夠通過(guò)存在的高親合性DBD結(jié)合到在染色質(zhì)DNA上的相應(yīng)HRE上(Martinez和Wahli，NuclearHormone Receptors，125-153，Acad.Press，1991)。以這種方式，配體/受體配合物調(diào)控特異性靶基因的表達(dá)。通過(guò)此科的受體獲得的變異是其應(yīng)答不同配體能力的結(jié)果。
甾類激素受體是截然不同的一類核受體總科，其特征在于配體是甾類激素。糖皮質(zhì)激素(GR)、鹽皮質(zhì)激素(MR)、孕甾酮(PR)、雄激素(AR)和雌激素(ER)的受體是典型的甾類受體。再者，活化時(shí)，甾類受體具有結(jié)合至回文DNA序列的獨(dú)特的能力，回文DNA序列被稱作HRE，為同型二聚體。GR、MR、PR和AR識(shí)別相同的DNA序列，而ER識(shí)別不同的DNA序列(Beato等人，Cell，Vol，83，851-857，1995)。結(jié)合DNA后，甾類受體被認(rèn)為是與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的組分相互作用，且?guī)в行蛄刑禺惖霓D(zhuǎn)錄因子，因此調(diào)控特異性靶基因的表達(dá)。
業(yè)已鑒定出幾種HRE，它們應(yīng)答激素/受體配合物。這些HRE位于下列各種靶基因的轉(zhuǎn)錄控制單位內(nèi)，靶基因如哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素基因(應(yīng)答糖皮質(zhì)激素、雌激素、睪甾酮)、哺乳動(dòng)物催乳素基因和孕甾酮受體基因(應(yīng)答雌激素)、鳥(niǎo)類卵清蛋白基因(應(yīng)答孕甾酮)、哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白基因(應(yīng)答糖皮質(zhì)激素)和哺乳動(dòng)物肝α2u-球蛋白基因(應(yīng)答雌激素、睪甾酮、糖皮質(zhì)激素)。
業(yè)已知道，胚胎發(fā)育、成年體內(nèi)平衡以及器官生理學(xué)中涉及甾類激素受體。各種疾病和異常歸因于甾類激素途徑紊亂。由于甾類激素行使其作為激素活化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控器的作用，因此可以預(yù)料到，這些受體的突變和缺陷，以及這些受體的過(guò)刺激或阻遏或許是這種改變類型的潛在原因。對(duì)于這些受體，其作用機(jī)制和結(jié)合所述受體的配體機(jī)制的更好的了解，會(huì)有助于更好地認(rèn)識(shí)激素信號(hào)轉(zhuǎn)錄途徑的潛在機(jī)制，最終將實(shí)現(xiàn)對(duì)與改變的激素/受體功能有關(guān)的疾病和異常更好的治療。
因?yàn)檫@種原因，幾種哺乳動(dòng)物包括人的甾類和幾種其它核受體的cDNA業(yè)已被分離出來(lái)，且相應(yīng)的氨基酸序列已被推導(dǎo)出來(lái)，例如人甾類受體PR、ER、GR、MR和AR，維生素D的人非甾類受體、甲狀腺激素、和類視黃素如視黃醇A和視黃酸。此外，業(yè)已分離出編碼超過(guò)100種哺乳動(dòng)物孤獨(dú)受體的cDNA，但對(duì)于它們而言，推斷配體仍是未知的(Mangelsdorf等人，Cell，Vol.83，835-839，1995)。然而，為了闡明這些受體在正常的生理學(xué)和病理學(xué)上所起的各種作用，對(duì)其它核受體的闡述仍有著極大的需求。
本發(fā)明提供這樣的新穎核受體。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供新穎的具有雌激素介導(dǎo)活性的甾類受體。所說(shuō)的新穎甾類受體是新穎的雌激素受體，該雌激素受體能夠結(jié)合并被例如雌甾二醇、雌甾酮和雌甾三醇活化。
根據(jù)本發(fā)明，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，新穎的雌激素受體作為8kb轉(zhuǎn)錄物在人胸腺、脾、外周血淋巴細(xì)胞(PBL)、卵巢和精巢中表達(dá)。再者，業(yè)已鑒定另外的轉(zhuǎn)錄物。另一大約10kb的轉(zhuǎn)錄物在卵巢，胸腺和脾中鑒定。在精巢中，檢測(cè)到一另外的1.3kb的轉(zhuǎn)錄物。這些轉(zhuǎn)錄物或許是通過(guò)編碼根據(jù)本發(fā)明的新穎雌激素受體之基因的交替拼接而產(chǎn)生的。
克隆編碼本發(fā)明之新穎雌激素受體的cDNA揭示，可以區(qū)別出所述受體的幾種拼接變異體。在蛋白質(zhì)水平上，這些變異體只是在C-末端部分上有所不同。
編碼ER的cDNA業(yè)已分離出來(lái)(Green等人，Nature，320，134-139，1986；Gveene等人，Science 231，1150-1154，1986)，且相應(yīng)的氨基酸序列業(yè)已推導(dǎo)出。然而，這種受體和本發(fā)明受體是截然不同的，且由不同核酸序列的不同基因所編碼?，F(xiàn)有技術(shù)中的ER(下文稱作典型的ER)與本發(fā)明ER不僅是在氨基酸序列上有所不同，它們也位于不同的染色體上。編碼典型ER的基因位于染色體6上，而發(fā)現(xiàn)編碼本發(fā)明ER的基因位于染色體14上。本發(fā)明ER與典型的ER之不同還在于組織分布上的不同，這表明，這些受體在雌激素發(fā)信號(hào)水平上可能會(huì)有重大的區(qū)別。
此外，業(yè)已描述二種具有雌激素受體相關(guān)結(jié)構(gòu)的孤獨(dú)受體，ERRα和ERRβ(Giguere等人，Nature 331，91-94，1988)。然而，沒(méi)有報(bào)道說(shuō)這些孤獨(dú)受體能夠結(jié)合雌甾二醇或任何其它的結(jié)合至典型的ER上的激素，且尚未發(fā)現(xiàn)與這些受體結(jié)合的其它配體。本發(fā)明之新穎雌激素受體與這些受體有著明顯的區(qū)別，因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)它結(jié)合雌激素。
已發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明之新穎ER的事實(shí)全然出乎人的意料之外，因?yàn)樵诳茖W(xué)文獻(xiàn)中沒(méi)有任何另外的雌激素受體存在的跡象分離的典型ER或者孤獨(dú)受體ERRα和ERRβ均未給出跡象或暗示另外的雌激素受體如本發(fā)明之受體的存在。另外的ER之鑒定將會(huì)是朝向現(xiàn)今之臨床治療邁進(jìn)的一大步，而現(xiàn)今之臨床治療是以一種ER的存在為基礎(chǔ)的，且因此將含有雌激素介導(dǎo)的異常和/或疾病歸因于這一受體。本發(fā)明受體會(huì)在開(kāi)發(fā)激素類似物上有用，所述的激素類似物選擇性地活化典型的ER或者本發(fā)明之新穎雌激素受體。這點(diǎn)應(yīng)被認(rèn)為是本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)之一。
因此，本發(fā)明的另一方面提供分離的編碼新穎甾類受體的cDNA。尤其是，本發(fā)明提供分離的編碼新穎雌激素受體的cDNA。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供一種分離的cDNA，該cDNA編碼具有N-末端功能區(qū)、DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)的甾類受體蛋白，其中所述的受體蛋白的所述DNA結(jié)合功能區(qū)之氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO3中的氨基酸序列至少80％同源性，而所述受體蛋白的所述配體結(jié)合功能區(qū)之氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO4中的氨基酸序列至少70％同源性。
尤其是，該分離的DNA編碼具有N-末端功能區(qū)、DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)之甾類受體蛋白，其中所述受體蛋白的所述DNA結(jié)合功能區(qū)之氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO3中的氨基酸序列至少90％，優(yōu)選95％，更優(yōu)選98％，最優(yōu)選100％同源性。
更具體的是，該分離的DNA編碼具有N-末端功能區(qū)、DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)的甾類受體蛋白，其中所述受體蛋白的所述配體結(jié)合功能區(qū)之氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO4中的氨基酸序列至少75％，優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選100％同源性。
本發(fā)明之優(yōu)選的分離的DNA編碼具有示于SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO21或SEQ ID NO25中的氨基酸序列的甾類受體蛋白。
本發(fā)明之更優(yōu)選的分離的DNA是一種這樣的分離的DNA，該DNA包含示于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO20或SEQ ID NO24之核苷酸序列。
本發(fā)明之DNA可由cDNA獲得。另外，該編碼序列也許是基因組DNA，或采用DNA合成技術(shù)制備。
本發(fā)明之DNA在以充分量和以基本上純的形式體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明之新穎受體蛋白上將會(huì)是非常有用的。
本發(fā)明的另一方面提供包含被上述DNA分子編碼的氨基酸序列之甾類受體。
本發(fā)明之甾類受體具有N-末端功能區(qū)、DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)，其中所述受體的所述DNA結(jié)合功能區(qū)之氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO3中的氨基酸序列至少80％同源性，且所述受體的所述配體結(jié)合功能區(qū)之氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO4中的氨基酸序列至少70％同源性。
尤其是，本發(fā)明之甾類受體具有N-末端功能區(qū)、DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)，其中所述受體的所述DNA結(jié)合功能區(qū)之氨基酸序列與示于SEQ ID NO3中的氨基酸序列至少90％、優(yōu)選95％、更優(yōu)選98％、最優(yōu)選100％同源性。
更特別的是，本發(fā)明之甾類受體具有N-末端功能區(qū)、DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)，其中所述受體的配體結(jié)合功能區(qū)之氨基酸序列與示于SEQ ID NO4中的氨基酸序列至少75％、優(yōu)選80％、更優(yōu)選90％、最優(yōu)選100％同源性。
包含組合的DBD和LBD的甾類受體蛋白優(yōu)選，且編碼這些受體的DNA是本發(fā)明之主題，這兩點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
優(yōu)選的是，本發(fā)明甾類受體包含示于SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO21或SEQ ID NO25之氨基酸序列。
甾類受體蛋白也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，該甾類受體蛋白包含DBD和LBD的氨基酸序列變化，而不減損其各自的DNA結(jié)合或配體結(jié)合活性。這些可以發(fā)生在氨基酸序列上的變化包括所述序列上的一或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入、倒位或增加，所述的變化導(dǎo)致在整個(gè)序列上的氨基酸不同。這些氨基酸不同導(dǎo)致氨基酸序列與它們所從中衍生的天然氨基酸序列不同但仍同源，這點(diǎn)是蛋白和肽領(lǐng)域中所熟知的。
預(yù)料基本上不改變生物和免疫活性的氨基酸取代業(yè)已由例如DayhofM.D.描述于“蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖表冊(cè)”，《天然生物藥學(xué)研究·實(shí)踐》(Atlas of protein sequence and structure，Nat.Biomed.Res.Found.)，Washington D.C.1978，VOl.5，suppl 3中。相關(guān)氨基酸間的氨基酸替代或在進(jìn)化時(shí)已頻繁發(fā)生的替代是，其中包括Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Arg/Lys、Asp/Asn、Ile/Val。根據(jù)這一信息，Lipman和Pearson開(kāi)發(fā)出一種迅速靈敏的蛋白比較法(Science227，1435-1441，1985)，并且測(cè)定同源多肽間的功能相似性。
本發(fā)明DBD之氨基酸序列上的變化產(chǎn)生與SEQ ID NO3序列至少80％同源的氨基酸序列，這種變化將導(dǎo)致受體仍具有足夠的DNA結(jié)合活性。本發(fā)明LBD之氨基酸序列上的變化產(chǎn)生與SEQ IDNO4序列至少70％同源的氨基酸序列，這種變化將導(dǎo)致受體仍具有足夠的配體結(jié)合活性。
本文中所定義的同源性用百分率表示，由PCGENE確定。同源性以排列上與本發(fā)明序列有相同殘基的百分率計(jì)算。允許有缺口以獲得最大的排列。
典型ER和本發(fā)明ER之氨基酸序列的比較揭示它們?cè)诟髯缘腄BD上有高度的相似性。主管典型ER與靶DNA元件的實(shí)際相互作用的P-框(氨基酸E-G-X-X-A)的保守性(Zilliacus等人，Mol.Endo9，389，1995；Glass，End，Rev.15，391，1994)，表示雌激素效應(yīng)元件(ERE)被本發(fā)明之ER識(shí)別。本發(fā)明受體確實(shí)顯示出在含ERE報(bào)道基因構(gòu)建體上的配體依賴反式激活作用。因此，典型ER和本發(fā)明新穎ER也許具有重疊靶基因特異性。這或許表示，在其共用表達(dá)各自ER的組織中，這些受體競(jìng)爭(zhēng)ERE。本發(fā)明ER可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，它不同于典型的ER調(diào)節(jié)，或者本發(fā)明ER可通過(guò)占有雌激素效應(yīng)元件而簡(jiǎn)單地阻遏典型ER起作用。另外，轉(zhuǎn)錄也許會(huì)受不同受體的異二聚化作用影響。
因此，本發(fā)明之優(yōu)選甾類受體包含DNA結(jié)合功能區(qū)之一P-框內(nèi)的氨基酸序列E-G-X-X-A，其中X是指任一氨基酸。分離的編碼這一受體的DNA也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
制備本發(fā)明受體的方法是本領(lǐng)域已知的(Sambrook等，MolecularCloninga Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，1989)。最實(shí)際的方法是通過(guò)表達(dá)編碼所需蛋白之DNA來(lái)生產(chǎn)這些受體。
各種各樣的宿主細(xì)胞和克隆載體組合可用于克隆編碼本發(fā)明受體之核酸序列。例如，有用的克隆載體可包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，如各種已知的細(xì)菌質(zhì)粒和由質(zhì)粒與噬菌體或病毒DNA組合所衍生的更寬的宿主范圍質(zhì)粒和載體。有用的宿主可包括細(xì)菌宿主、酵母和其它真菌、植物或動(dòng)物宿主。如中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或猴細(xì)胞和其它宿主。
用于表達(dá)本發(fā)明配體結(jié)合功能區(qū)的載體還進(jìn)一步包含可操作地連于編碼配體結(jié)合功能區(qū)之核酸序列的控制序列。這類控制序列通常包含啟動(dòng)子序列和調(diào)節(jié)和/或提高表達(dá)水平的序列。再者復(fù)制起點(diǎn)和/或域選擇標(biāo)記經(jīng)常存在于這些載體上。當(dāng)然控制序列和其它序列可以根據(jù)所選擇的宿主細(xì)胞而變化。
轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的(參見(jiàn)，例如，Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarborLaboratony，1989)。
包含本發(fā)明DNA的重組表達(dá)載體以及用所述DNA或所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的再一方面提供具有N-末端功能區(qū)、DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)的嵌合受體蛋白，其特征在于這些功能區(qū)之至少一個(gè)來(lái)源于本發(fā)明受體蛋白，且所述嵌合蛋白的其它功能區(qū)之至少一個(gè)來(lái)源于另一來(lái)自核受體總科的受體蛋白，其條件是，所述嵌合受體蛋白的DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)來(lái)源于不同的蛋白。
尤其是，本發(fā)明之嵌合受體包含本發(fā)明之LBD，所述LBD具有這樣一種氨基酸序列，該氨基酸序列顯示出與示于SEQ ID NO4中的氨基的序列至少70％同源性。在這種情況下，N-末端功能區(qū)和DBD應(yīng)衍生自另一核受體，如PR。以這種方式，構(gòu)建嵌合受體，且它被本發(fā)明之ER的配體活化，并以孕甾酮效應(yīng)元件控制下的基因?yàn)榘畜w。具有本發(fā)明之LBD的嵌合受體可用于篩選這樣的一類化合物，其可鑒別能夠活化本發(fā)明ER的新穎配體或激素類似物。
此外，包含本發(fā)明DBD和LBD以及(任選的)衍生自另一核受體的N-末端功能區(qū)之嵌合受體可以成功地用于鑒定所述核受體之新穎配體或激素類似物，上述DBD所具有的氨基酸序列顯示出與示于SEQ ID NO3中的氨基酸序列至少80％同源性。這些嵌合受體特別是在鑒定孤獨(dú)受體的各個(gè)配體上有用。
由于甾類受體有具有不同功能的三種功能區(qū)，這些功能或多或少是獨(dú)立的，因此所有這三種功能區(qū)衍生自該甾類受體總科的不同受體，這點(diǎn)是可能的。
含有不同起源之部分的分子稱作嵌合。這樣的包含本發(fā)明配體結(jié)合功能區(qū)和/或DNA結(jié)合功能區(qū)的嵌合受體可由化學(xué)鍵產(chǎn)生，但最優(yōu)選的是在DNA水平，用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法，通過(guò)融合編碼所需甾類受體功能區(qū)之核酸序列來(lái)完成這種偶聯(lián)。這樣，編碼本發(fā)明嵌合受體蛋白的DNA也是本發(fā)明的主題。
這些嵌合蛋白可以通過(guò)將編碼這些嵌合受體蛋白的DNA轉(zhuǎn)染至適合的宿主細(xì)胞，并在適合的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞來(lái)制備。
如果緊接在表達(dá)甾類受體的信息之后，宿主細(xì)胞也可用載有報(bào)道分子信息的載體來(lái)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染是極其實(shí)用的。這種編碼報(bào)道分子的載體其特征在于具有啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列含有功能性地連接于可操作報(bào)道基因的一或多個(gè)激素效應(yīng)元件(HRE)。這種HRE是活化的甾類受體之DNA靶標(biāo)，且結(jié)果是，它提高對(duì)編碼報(bào)道分子的DNA的轉(zhuǎn)錄。在甾類受體的體內(nèi)環(huán)境中，報(bào)道分子包含對(duì)配體刺激的細(xì)胞應(yīng)答。然而，也可能在體外，將受體的配體結(jié)合功能區(qū)結(jié)合至其它甾類受體的DNA結(jié)合功能區(qū)和轉(zhuǎn)錄活化功能區(qū)上，因此而能夠應(yīng)用其它HRE和報(bào)道分子體系。一種這樣的體系是通過(guò)存在于MMTV-LTR中的HRE建立的(MMTV-LTR-鼠乳腫瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列，與象熒火蟲(chóng)熒光素酶基因或CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)的細(xì)菌基因一樣的報(bào)道分子相連)。其它的可用HRE是大鼠催產(chǎn)素啟動(dòng)子、視黃酸效應(yīng)元件、甲狀腺激素效應(yīng)元件、雌激素效應(yīng)元件，以及合成效應(yīng)元件，以上HRE均已被描述(例如Fuller，同前，p3096)?？梢允褂孟嗨朴贑AT和熒光素酶β-半乳糖苷酶的報(bào)道分子。
本發(fā)明的甾類激素受體和嵌合受體可以用于新穎配體或激素類似物的體外鑒定。為此目的，可以用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或包含本發(fā)明DNA的表達(dá)載體進(jìn)行結(jié)合研究，所述細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的甾類受體或嵌合受體。
本發(fā)明之新穎甾類激素受體和嵌合受體以及本發(fā)明配體結(jié)合功能區(qū)，可以用在鑒定核受體的功能配體或激素類似物的測(cè)定中。
因此，本發(fā)明提供鑒定本發(fā)明之甾類受體和嵌合受體的功能配體的方法，所述的方法包括如下步驟a)向適合的宿主細(xì)胞引入1)本發(fā)明之DNA或表達(dá)載體，和2)功能性地連接于可操作激素效應(yīng)元件的報(bào)道基因，所述的HRE能夠被由所述DNA編碼的受體蛋白之DNA-結(jié)合功能區(qū)所活化；b)將來(lái)自步驟a)的宿主細(xì)胞與潛在的配體接觸，所述的配體將可能結(jié)合至由來(lái)自步驟a)的所述DNA編碼的受體蛋白的配體結(jié)合功能區(qū)上；c)監(jiān)控由來(lái)自步驟a)的所述DNA編碼的受體蛋白表達(dá)。
如果對(duì)于基礎(chǔ)表達(dá)(無(wú)配體)而言報(bào)道基因的表達(dá)被誘導(dǎo)，則功能配體可被認(rèn)為是興奮劑；如果報(bào)道基因的表達(dá)未變或?qū)τ诨A(chǔ)表達(dá)而言被降低，則功能配體可以是適合的(部分)拮抗劑。
在進(jìn)行這類調(diào)研時(shí)，業(yè)已用編碼功能甾類受體的載體和具有激素效應(yīng)元件信息和連接的報(bào)道分子的載體兩者轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。加入將活化受體的適合的配位體后，報(bào)道分子的產(chǎn)量將會(huì)提高，其產(chǎn)量可簡(jiǎn)單地通過(guò)對(duì)報(bào)道分子具有敏感性的測(cè)定來(lái)確定。參見(jiàn)例如WO-A-8803168。使用已知甾類受體的測(cè)定業(yè)已有描述(例如S.Tsai等人，Cell57，443，1989；M.Meyer等人，Cell57，433，1989)。附圖簡(jiǎn)述

圖1新穎的雌激素受體(ERβ)的Northern分析。使用ERβ的特異性探針與兩種不同多組織Northern印跡(Clontech)雜交(見(jiàn)實(shí)施例)。表明人組織是RNA的來(lái)源和在以千個(gè)堿基(Kb)計(jì)的大小標(biāo)記的位置。圖2顯示17β-雌甾二醇，雌甾三醇和雌甾酮對(duì)由ERβ介導(dǎo)的熒光素酶活性有3至4倍刺激效果的柱形圖。編碼ERβ的表達(dá)載體，與含有在熒火蟲(chóng)熒光素酶編碼序列前的大鼠催產(chǎn)素啟動(dòng)子的報(bào)道基因構(gòu)建體一起，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞(參見(jiàn)實(shí)施例)。圖317β-雌甾二醇(E2)單獨(dú)或與抗-雌激素ICI-164384(ICI)結(jié)合對(duì)ERα和ERβ的作用。ERα(典型的ER)和ERβ的表達(dá)構(gòu)建體與描述于實(shí)施例中的大鼠催產(chǎn)素啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞。測(cè)定熒光素酶活性，重復(fù)三次，且通過(guò)在相同的溶胞產(chǎn)物中測(cè)定β-半乳糖苷酶來(lái)使轉(zhuǎn)染效率正?；?。圖4用RT-PCR分析測(cè)定在多種細(xì)胞系中ERα和ERβ的表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例)。所用的細(xì)胞系衍生自不同的組織/細(xì)胞類型子宮內(nèi)膜(ECCl，Ishikawa，HEC-1A，RL95-2)，骨肉瘤(SA DS-2，U2-OS，HOS，MG63)；乳房腫瘤(MCF-7，T47D)；內(nèi)皮(HUV-EC-C，BAEC-1)；平滑肌(HISM，PAC-1，A7R5，A10，RASMC，Cava SMC)；肝(HepG2)，結(jié)腸(CaCo2)；和陰道(Hs-760T，SW-954)。
所有的細(xì)胞系均為人的，除了PAC-1，A7R5，A10和RASMC，它們是鼠源，BAEC-1為牛源和CavaSMC為豚鼠源。圖5使用表達(dá)ERα或ERβ的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系與大鼠催產(chǎn)素-螢光素酶雌激素效應(yīng)報(bào)道基因一起做的反式激活檢測(cè)(詳情參見(jiàn)實(shí)施例)。測(cè)定了17β-雌甾二醇和Org4094的激素依賴的反式激活曲線。對(duì)于ER拮抗劑雷洛昔芬，將細(xì)胞用2×10-10mol/L 17β-雌甾二醇與持續(xù)增加的雷洛昔 芬濃度一起處理。最大應(yīng)答值人為地設(shè)定為100％。實(shí)施例A 新穎雌激素受體的分子克隆兩種含有肌苷的簡(jiǎn)并寡核苷酸(I)是以人甾類激素受體的DNA-結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)的保守區(qū)為基礎(chǔ)的。
引物#15＇-GGIGA(C/T)GA(A/G)GC(A/T)TCIGGITG(C/T)CA(C/T)TA(C/T)GG-3＇(SEQ ID NO7)引物#25＇-AAGCCTGG(C/G)A(C/T)IC(G/T)(C/T)TTIGCCCAI(C/T)TIAT-3＇(SEQ ID NO8)作為模板，采用的是來(lái)自人EBV刺激的PBL(外周血白細(xì)胞)的cDNA。將1微克總RNA在含下列物質(zhì)的20μl反應(yīng)物中反轉(zhuǎn)錄50mM KCl、10mM Tris-HCl pH8.3，4mMMgCl2，1mM dNTP(Pharmacia)、100pmol隨機(jī)六核苷酸(Pharmacia)，30單位RNAse抑制劑(Pharmacia)和200單位M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)。反應(yīng)混合物在37℃溫育30分鐘，并在100℃熱滅活5分鐘。所得的cDNA用于含下列物質(zhì)的100μl PCR反應(yīng)中10mM Tris-HCL pH8.3，50mM KCl，1.5mMMg Cl2、0.001％明膠(w/v)，3％DMSO、1微克引物#1和引物#2和2.5單位的Amplitaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)。PCR反應(yīng)在Perkin Elmer 9600熱循環(huán)器中進(jìn)行。初始變性(94℃下4分鐘)后，接著用下列條件進(jìn)行35次循環(huán)30秒94℃，30秒45℃，1分鐘72℃和7分鐘后72℃，將反應(yīng)物貯存于4℃下。這些反應(yīng)物的等份試樣在1.5％瓊脂糖凝膠上分析。感興趣的片段從凝膠上切下，用相同的PCR條件再擴(kuò)增，并用QiaexII(Qiagen)純化。在pCRII載體上克隆片段，并用TA克隆試劑盒(Invitrogen)轉(zhuǎn)化入細(xì)菌。采用Qiagen質(zhì)粒midi方案(Qiagen)將質(zhì)粒DNA分離用于核苷酸序列分析。核苷酸序列分析是利用具有載體特異性或片段特異性引物的T7 DNA測(cè)序試劑盒(Pharmacia)用ALF自動(dòng)測(cè)序儀(Pharmacia)來(lái)進(jìn)行的。
一種克隆片段相對(duì)于與典型雌激素受體非常相關(guān)的新穎雌激素受體(ER)?？寺〉男路f雌激素受體片段部分(SEQ ID 1中的核苷酸466至797)通過(guò)采用寡核苷酸#3 TGTTACGAAGTGGGAATGGTGA(SEQ ID 79O9)和寡核苷酸#2的PCR(Clontech#HL1010b)中的人精巢cDNA庫(kù)。將重組噬菌體以每135mm平皿40.000pfu(噬菌斑形成單位)的密度制成平板(采用生長(zhǎng)于添加有0.2％麥芽糖的LB培養(yǎng)基上的Y1090細(xì)菌)，并用供應(yīng)商描述的方法制作復(fù)制濾膜(Hybond-N，Amersham)。濾膜在65℃下于含有0.5M磷酸緩沖液(pH7.5)和7％SDS的溶液中預(yù)雜交至少30分鐘。DNA探針用Qiaex II(.Qiagen)純化，用Decaprime試劑盒(Ambion)進(jìn)行32P-標(biāo)記，且加入預(yù)雜交作用的溶液中。濾膜在65℃下雜交過(guò)夜，之后在65℃下于0.5×SSC/0.1％SDS中洗滌。鑒定出兩陽(yáng)性噬菌斑，這兩噬菌斑可能顯示是相同的。這些克隆通過(guò)再篩選一次來(lái)純化。在噬菌體上的PCR反應(yīng)用λgt 11-特異的引物#45＇-TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3＇(SEQ IDNO10)和#55＇-GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG-3＇(SEQ ID NO11)洗脫，產(chǎn)生在兩種克隆上的1700個(gè)堿基對(duì)的片段。隨后的PCR反應(yīng)采用帶有λgt11引物#4的基因特異引物#65＇-GTACACTGATTTGTAGCTGGAC-3＇(SEQ ID NO12)與帶有λgt11引物#5的基因特異引物#75＇-CCATGATGATGTCCCTGACC-3＇(SEQ ID NO13)結(jié)合，分別產(chǎn)生大致為450bp和1000bp的片段，這些片段克隆于pCRH載體中，并用于核苷酸序列分析。這些PCR反應(yīng)的條件除了引物濃度(200ng的各引物)和退火溫度(60℃)如上文所描述。由于在此cDNA克隆中與ER的同源性在相應(yīng)于ER上的外顯子7/外顯子8界限的位點(diǎn)處(在SEQ ID NO1的核苷酸1247和1248間)完全損失，這就示意這一序列相應(yīng)于新穎ER基因的內(nèi)含子7。為了確定此cDNA克隆的核苷酸序列，采用校正pfu聚合酶(Stratagene)，在帶有相應(yīng)于外顯子7的3＇端5＇-TCGCATGCCTGACGTGGGAC-3＇(SEQ ID NO14)的基因特異引物#8的λgt11引物#4的cDNA克隆上產(chǎn)生一1200bp的片段。此片段也克隆于pCRII載體中，并完全測(cè)序，該片段與前面獲得的序列相同。
為獲得外顯子7之新穎ER下游的核苷酸序列，與采用精巢cDNA作模板(Marathon ready精巢cDNA，Clontech Cat#7414-1)的基因特異寡核苷酸#105＇-GGAAGCTGGCTCACTTGCTG-3＇(SEQID NO16)一起，使用以典型ER的AF-2區(qū)(#95＇-GGC(C/G)TCCAGCATCTCCAG(C/G)A(A/G)CAG-3＇；SEQ ID NO15)為基礎(chǔ)的簡(jiǎn)并寡核苷酸。將相應(yīng)于SEQ ID NO1中的核苷酸1112至1332的特異220bp片段克隆并測(cè)序。核苷酸1112至1247與cDNA克隆的相應(yīng)序列相同。其序列下游與典型ER中的相應(yīng)區(qū)高度同源。為了獲得此AF-2區(qū)的新穎ER下游之序列，采用Marathon ready精巢cDNA(Clontech)作模板進(jìn)行RACE(快速擴(kuò)增cDNA末端)PCR反應(yīng)。采用寡核苷酸#115＇-TCTTGTTCTGGACAGGGATG-3＇(SEQ ID NO17)與提供于試劑盒中的AP1引物組合，進(jìn)行起始PCR。采用寡核苷酸#10(SEQ ID NO16)與提供于試劑盒中的寡dT引物組合，在此反應(yīng)的等份小樣上進(jìn)行嵌套式PCR。隨后，將此反應(yīng)的等份小樣用于采用與寡dT引物組合的寡核苷酸#125＇-GCATGGAACATCTGCTCAAC-3＇(SEQ ID NO18)的嵌套式PCR中。所獲得的特異片段(相應(yīng)于SEQ ID NO1中的核苷酸1256至1431)的核苷酸序列分析揭示出編碼新穎配體結(jié)合功能區(qū)的羧基末端的序列，該序列包括F功能區(qū)和翻譯終止密碼子和不包括在SEQ ID NO1中的3＇未翻譯序列的一部分。推演的氨基酸序列示于SEQ ID NO5中。
為了研究新穎雌激素受體具有附加的上游翻譯起始密碼子的可能性，采用Marathon ready精巢cDNA(C1ontech Cat.#7414-1)進(jìn)行RACE-PCR實(shí)驗(yàn)。首先采用寡核苷酸SEQ ID NO12(相應(yīng)于SEQ ID NO1中核苷酸416-395的反義)和AP-1(提供于試劑盒)中進(jìn)行一次PCR。之后采用具有SEQ ID NO27的寡核苷酸(相應(yīng)于SEQ ID NO1中核苷酸254-231的反義)與AP-2(提供于試劑盒中)進(jìn)行嵌套式PCR。從獲得的涂片上，將相應(yīng)于大于300堿基對(duì)的片段的區(qū)切下，用Geneclean II試劑盒(Bio101)純化，并用TA-克隆試劑盒(Clontech)克隆。通過(guò)采用基因特異的引物SEQ ID NO22和SEQ ID NO28篩選這些克隆。將含最大插入物的克隆測(cè)序。核苷酸序列相當(dāng)于SEQ ID NO24中的核苷酸1至490。由此序列清楚可知，第一框內(nèi)上游翻譯起始密碼子存在于SEQ ID NO24中的77-79的位置。此翻譯起始密碼子的上游存在一框內(nèi)終止密碼子(SEQ ID NO24中的11-13)。所以，新穎雌激素受體的讀框是530個(gè)氨基酸(示于SEQ ID NO25)且具有59.234KD的計(jì)算分子量。
為確認(rèn)通過(guò)5＇RACE獲得的核苷酸序列，獲得并分析了人基因組克隆。在λEMBL3(Clontech HL 1067J)中的人基因組庫(kù)用相當(dāng)于SEQ ID NO1中核苷酸1-416的探針篩選。噬菌斑純化強(qiáng)雜交克隆，并用標(biāo)準(zhǔn)方案分離DNA(Sambrook等人，1989)。DNA用幾種限制性內(nèi)切酶消化，在瓊脂糖凝膠上電穿孔，并印跡到尼龍濾膜上。與相當(dāng)于上述RACE片段(SEQ ID NO24中的核苷酸1-490)探針的印跡雜交揭示了大約800堿基對(duì)的雜交Sau 3A片段。將此片段克隆到pGEM3Z的BamH1位點(diǎn)并測(cè)序。該核苷酸序列含有一個(gè)堿基差異，該差異或許是RACE片段上的PCR-誘導(dǎo)的點(diǎn)突變。核苷酸172為5＇RACE片段的G殘基，但在幾種獨(dú)立的基因組亞克隆中為A殘基。B 新穎雌激素受體的兩種拼接變體的鑒定用相當(dāng)于SEQ ID NO1中的核苷酸918至1246的探針重篩選精巢cDNA庫(kù)，產(chǎn)生兩種雜交克隆，其3＇端用PCR(基因特異引物#105＇-GGAAGCTGGCTCACTTGCTG-3＇(SEQ ID NO16)與引物#4，SEQ ID NO10一起)擴(kuò)增、克隆并測(cè)序。一個(gè)克隆顯示含有新穎ER的替代外顯子8(外顯子8B)。在SEQ ID NO.2中，示出了此拼接變體的編碼蛋白的部分和終止密碼子。作為通過(guò)替代拼接反應(yīng)引入此外顯子的結(jié)果是，編碼此新穎ER的讀框立即終止，由此產(chǎn)生新穎ER羧基末端的截短(SEQ ID NO6)。
用相應(yīng)于SEQ ID NO1中的核苷酸918至1246的探針篩選人胸腺cDNA庫(kù)(Clontech HL 1074a)，得到另一拼接變體。用帶λgt10特異引物#135＇-AGCAAGTTCAGCCTGTTAAGT-3＇(SEQ ID NO19)的引物#10(SEQ ID NO16)將一雜交克隆之3＇端擴(kuò)增，克隆并測(cè)序。獲得的外顯子7/外顯子8界限的核苷酸序列上游與前面鑒定的克隆相同。然而，替代外顯子8(外顯子8C)存在于編碼兩個(gè)C一末端氨基酸的3＇-端處，緊接著一個(gè)終止密碼子。此拼接變體的蛋白編碼部分的核苷酸序列示于SEQ ID NO20中，相應(yīng)的蛋白序列是SEQ ID NO21。
新穎雌激素受體的這兩種變體不含有AF-2區(qū)，且因此可能缺乏調(diào)控以配體依賴方式轉(zhuǎn)錄靶基因的能力。然而，這些變體可能潛在地干擾野生型典型ER和/或野生型新穎ER的功能，這種干擾是通過(guò)異二聚合作用或通過(guò)占據(jù)雌激素效應(yīng)元件或通過(guò)與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用。業(yè)已描述了一種典型ER(ER1-530)的突變體，該突變體與上面描述的新穎雌激素受體的兩種變體非常相似。ER1-530業(yè)已顯示出有負(fù)顯性受體的行為，即它可以調(diào)控野生型ER的細(xì)胞內(nèi)活性(Ince等人，J.Biol，Chem，268，14026-14032，1993)。C Northern印跡分析從Clontech購(gòu)得人多組織Northern印跡(MTN-印跡)，并在65℃下于含7％ SDS的0.5M磷酸緩沖液pH7.5中預(yù)雜交至少1小時(shí)。采用標(biāo)記試劑盒(Ambion)將用作探針的DNA片段(相應(yīng)于SEQ ID NO1中的核苷酸466至797)32P-標(biāo)記，經(jīng)煮沸變性，并加入預(yù)雜交溶液中。洗滌條件是室溫下3×SSC，接著65℃下3×SSC，最好65℃下1×SSC。之后將濾膜暴露于X射線膜一周。在胸腺、脾、卵巢和精巢中檢測(cè)到兩個(gè)大約8kb和10kb的轉(zhuǎn)錄物。此外，在精巢中檢測(cè)到1.3kb的轉(zhuǎn)錄物。D 在細(xì)胞系中表達(dá)ERα和ERβ的RT-PCR分析采用RNA zol B(Cinna/Biotecx)由許多人和動(dòng)物細(xì)胞系分離出RNA。按照廠家的說(shuō)明采用Superscript II試劑盒(BRL)用2.5微克總RAN制作cDNA。一部分cDNA用于片段的特異PCR擴(kuò)增，所述的片段相應(yīng)于編碼ER的mRNA或是相應(yīng)于新穎雌激素受體。(應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是所用的引物是以人或大鼠序列為基礎(chǔ)的，而某些細(xì)胞系不是大鼠或人的，參見(jiàn)圖4簡(jiǎn)述)。對(duì)ERα用的引物是有義-GATGGGCTTACTGACCAACC-3＇和反義5＇-AGATGCTCCATGCCTTT G-3＇，它們產(chǎn)生相應(yīng)于LBD部分的548個(gè)堿基對(duì)片段。對(duì)于ERβ有義5＇-TTCACCGAGGCCTCCATGATG-3＇和反義5＇-CAGATGTTCCATGCCCTTGTT-3＇，它們產(chǎn)生相應(yīng)于LBD部分的565個(gè)堿基對(duì)片斷。將PCR樣品在瓊脂糖上分析，印跡到尼龍膜上。采用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法(Sambrook等人，1989)將這些印跡與用上述的ERα和ERβ質(zhì)粒DNA上的引物產(chǎn)生的32P-標(biāo)記PCR片段雜交。E 由新穎雌激素受體蛋白活化的配體依賴轉(zhuǎn)錄細(xì)胞培養(yǎng)由ATCC(CCL61)得到中華倉(cāng)鼠卵巢(CHO K1)細(xì)胞，并將它于37℃潤(rùn)濕氣氛(5％CO2)中作為單層培養(yǎng)物在無(wú)fenolred的M505培養(yǎng)基中保持。后者培養(yǎng)基由Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Gibco 074-200)和添加下列物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)基F12(Ham＇s F12，Gibco 074-1700)的混合物(1∶1)組成2.5mg/ml碳酸鈉(Baker)、55μg/ml丙酮酸鈉(Fluka)、2.3μg/ml β-巰基乙醇(Baker)、1.2μg/ml乙醇胺(Baker)、360μg/ml L-谷氨酸(Merck、0.45μg/ml亞硒酸鈉(Fluka)、62.5μg/ml青霉素(Mycopharm)、62.5μg/ml鏈霉素(Serva)和5％木炭處理的小牛血清(Hyclone)。
重組載體ERβ編碼序列示于SEQ ID NO1中，該序列通過(guò)采用寡核苷酸5＇-CTTGGATCCATAGCCCTGCTGTGATGAATTACAG-3＇(SEQ ID NO22，下劃線是翻譯起始密碼子)與5＇-GATGGATCCTCACCTCAGGGCCAGGCGTCACTG-3＇(SEQ IDNO23)(下劃線是翻譯終止密碼子，反義)結(jié)合的PCR擴(kuò)增。之后將所得的BamHl片段(大約1450個(gè)堿基對(duì))克隆于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pNGV1(Genbank登記號(hào)X99274)中。
編碼示于SEQ ID NO24中的ERβ讀框的表達(dá)構(gòu)建體通過(guò)用相應(yīng)于SEQ ID NO24中的核苷酸77-316的BamH1-MsC1片段替換BamH1-Msc1片段(SEQ ID NO1中的核苷酸1-81)來(lái)制備。后一片段是用SEQ ID26與采用上述5＇RACE片段的SEQ ID NO28組合的PCR來(lái)制備的。
報(bào)道載體以連于熒火蟲(chóng)熒光素酶編碼序列的大鼠催產(chǎn)素基因調(diào)節(jié)區(qū)(位置-363/+16，為HindIII/MboI片段；R.Ivell和D.Richter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，2006-2010，1984)為基礎(chǔ)；該催產(chǎn)素基因的調(diào)節(jié)區(qū)顯示具有體外對(duì)大鼠(R.Adan等人Biochem.Biophys.Res.Comm.175.117-122，1991)和人(S.Richard和H.Zingg J.Biol.Chem.265，6098-6103，1990)的功能雌激素效應(yīng)元件。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將1×105個(gè)CHO細(xì)胞接種在6孔Nunclon組織培養(yǎng)板上，利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Lipofectin)(Gibco BRL)引入DNA。將此DNA(在250μLOptimem中的1μg受體和報(bào)道載體，Gibco BRI)與等體積的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(在250μL Optimem中7μL，Gibco)混合，并讓其在室溫下靜置15分鐘。用無(wú)血清培養(yǎng)基(M505)將細(xì)胞洗滌兩遍后，將新培養(yǎng)基(500μl Optimem，Gibco)加入此細(xì)胞中，接著滴加此DNA-脂質(zhì)轉(zhuǎn)染混合物。在37℃溫育5小時(shí)后，用無(wú)fenolred M505+5％木炭處理的小牛血清將細(xì)胞洗滌兩遍，并在37℃溫育過(guò)夜。24小時(shí)后，將激素加入此培養(yǎng)基(10-7mol/L)中。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過(guò)加入200μL溶細(xì)胞緩沖液(0.1M磷酸緩沖液pH7.8，0.2％ Triton X-100)制備細(xì)胞提取液。在37℃溫育5分鐘后，將細(xì)胞懸浮液離心(Eppendorf離心機(jī)，5分鐘)，并將20μl樣品加到50μL熒光素酶測(cè)定試劑(Promega)中。用發(fā)光計(jì)(Berthold Biolumat)于562nm處測(cè)量光發(fā)射量10秒鐘。
新穎雌激素受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染如先前所描述的(Theunissen等人，J.Biol.Chem.268，9035-9040，1993)，將編碼全長(zhǎng)ERβ1-530(參見(jiàn)上述)的表達(dá)質(zhì)粒在CHOK1細(xì)胞中穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染。這種方式所獲得的單細(xì)胞克隆用上面描述的報(bào)道質(zhì)粒(大鼠催產(chǎn)素-熒光素酶)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來(lái)篩選。選擇出的克隆用于大鼠催產(chǎn)素-熒光酶素報(bào)道質(zhì)粒與含有用于選擇的潮霉素抗性基因的質(zhì)粒pDR2A一起的第三次穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。測(cè)試所獲得的單細(xì)胞克隆對(duì)17β-雌甾二醇的應(yīng)答。隨后，將選擇出的單細(xì)胞克隆用于反式激活研究。簡(jiǎn)潔地說(shuō)，將細(xì)胞以(1.6×104細(xì)胞/孔)的密度接種于96孔板上。24小時(shí)后，不同濃度的激素用培養(yǎng)基稀釋，并加入這些孔中。作拮抗實(shí)驗(yàn)時(shí)，將2×10-10M的17β-雌甾二醇加入各個(gè)孔，并加入不同濃度的拮抗劑。溫育24小時(shí)后，用PBS將細(xì)胞洗滌一次，之后通過(guò)加入40微升溶細(xì)胞緩沖液(參見(jiàn)上述)來(lái)溶細(xì)胞。向各個(gè)孔中加入熒光素酶試劑(50微升)，并用Topcount(Packard)測(cè)量光發(fā)射量。
結(jié)果于CHO細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的兩種表達(dá)構(gòu)建體(SEQ ID NO1和SEQ ID NO24)之比較顯示出對(duì)許多興奮劑和拮抗劑應(yīng)答的相同反式激活作用。用ERβ表達(dá)載體和報(bào)道質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞顯示出在對(duì)17β-雌甾二醇應(yīng)答上有比未處理細(xì)胞高出3至4倍的熒光素酶活性增加(參見(jiàn)圖2)。在用雌甾三醇和雌甾酮的處理上，獲得相似的反式激活作用。這些結(jié)果表明，不僅新穎ER(ERβ)可以結(jié)合雌激素，而且此配體活化的受體可以結(jié)合到在大鼠催產(chǎn)素啟動(dòng)子內(nèi)的雌激素效應(yīng)元件(ERE)上，并活化熒光素酶報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。圖3顯示，獨(dú)立的相似實(shí)驗(yàn)中，10-9mol/L 17β-雌甾二醇用ERα給出18倍的刺激，而用ERβ給出7倍的刺激。此外，抗雌激素ICI-164384當(dāng)用17β-雌甾二醇活化時(shí)為ERα和ERβ的拮抗劑，而此拮抗劑單獨(dú)使用時(shí)則無(wú)效果。在此實(shí)驗(yàn)中，用0.25μg β-半乳糖苷酶載體共轉(zhuǎn)染，以便轉(zhuǎn)染效力上的差異正?；?br> 在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ERα和ERβ細(xì)胞系上進(jìn)行的反式激活研究給出相似的絕對(duì)熒光素酶值。17β-雌甾二醇的曲線非常相似，顯示出與ERβ相比，對(duì)于ERα用較低濃度的激素就可達(dá)到半最大反式激活(圖5)。對(duì)于Org 4094也是這種情況，但是所觀察到的效果更顯著。雷洛昔芬的曲線顯示此拮抗劑在阻遏對(duì)ERα反式激活上的效力要比其阻遏ERβ反式激活上的效力要更大。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱Akzo nobeI n.v.
(B)街道Velperweg 76(C)城市Arnhem(E)國(guó)家荷蘭(F)郵編(ZIP)6824 BM(G)電話0412-666379(H)電傳0412-650592(I)電報(bào)37503 akpha nl(ii)發(fā)明名稱新穎的雌激素受體(iii)序列數(shù)28(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1434堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO1序列描述ATGAATTACA GCATTCCCAG CAATGTCACT AACTTGGAAG GTGGGCCTGG TCGGCAGACC60ACAAGCCCAA ATGTGTTGTG GCCAACACCT GGGCACCTTT CTCCTTTAGT GGTCCATCGC 120CAGTTATCAC ATCTGTATGC GGAACCTCAA AAGAGTCCCT GGTGTGAAGC AAGATCGCTA 180GAACACACCT TACCTGTAAA CAGAGAGACA CTGAAAAGGA AGGTTAGTGG GAACCGTTGC 240GCCAGCCCTG TTACTGGTCC AGGTTCAAAG AGGGATGCTC ACTTCTGCGC TGTCTGCAGC 300GATTACGCAT CGGGATATCA CTATGGAGTC TGGTCGTGTG AAGGATGTAA GGCCTTTTTT 360AAAAGAAGCA TTCAAGGACA TAATGATTAT ATTTGTCCAG CTACAAATCA GTGTACAATC 420GATAAAAACC GGCGCAAGAG CTGCCAGGCC TGCCGACTTC GGAAGTGTTA CGAAGTGGGA 480ATGGTGAAGT GTGGCTCCCG GAGAGAGAGA TGTGGGTACC GCCTTGTGCG GAGACAGAGA 540AGTGCCGACG AGCAGCTGCA CTGTGCCGGC AAGGCCAAGA GAAGTGGCGG CCACGCGCCC 600CGAGTGCGGG AGCTGCTGCT GGACGCCCTG AGCCCCGAGC AGCTAGTGCT CACCCTCCTG 660GAGGCTGAGC CGCCCCATGT GCTGATCAGC CGCCCCAGTG CGCCCTTCAC CGAGGCCTCC 720ATGATGATGT CCCTGACCAA GTTGGCCGAC AAGGAGTTGG TACACATGAT CAGCTGGGCC 780AAGAAGATTC CCGGCTTTGT GGAGCTCAGC CTGTTCGACC AAGTGCGGCT CTTGGAGAGC 840TGTTGGATGG AGGTGTTAAT GATGGGGCTG ATGTGGCGCT CAATTGACCA CCCCGGCAAG 900CTCATCTTTG CTCCAGATCT TGTTCTGGAC AGGGATGAGG GGAAATGCGT AGAAGGAATT 960CTGGAAATCT TTGACATGCT CCTGGCAACT ACTTCAAGGT TTCGAGAGTT AAAACTCCAA 1020CACAAAGAAT ATCTCTGTGT CAAGGCCATG ATCCTGCTCA ATTCCAGTAT GTACCCTCTG 1080GTCACAGCGA CCCAGGATGC TGACAGCAGC CGGAAGCTGG CTCACTTGCT GAACGCCGTG 1140ACCGATGCTT TGGTTTGGGT GATTGCCAAG AGCGGCATCT CCTCCCAGCA GCAATCCATG1200CGCCTGGCTA ACCTCCTGAT GCTCCTGTCC CACGTCAGGC ATGCGAGTAA CAAGGGCATG1260GAACATCTGC TCAACATGAA GTGCAAAAAT GTGGTCCCAG TGTATGACCT GCTGCTGGAG1320ATGCTGAATG CCCACGTGCT TCGCGGGTGC AAGTCCTCCA TCACGGGGTC CGAGTGCAGC1380CCGGCAGAGG ACAGTAAAAG CAAAGAGGGC TCCCAGAACC CACAGTCTCA GTGA 1434(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1251堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO2序列描述ATGAATTACA GCATTCCCAG CAATGTCACT AACTTGGAAG GTGGGCCTGG TCGGCAGACC 60ACAAGCCCAA ATGTGTTGTG GCCAACACCT GGGCACCTTT CTCCTTTAGT GGTCCATCGC 120CAGTTATCAC ATCTGTATGC GGAACCTCAA AAGAGTCCCT GGTGTGAAGC AAGATCGCTA 180GAACACACCT TACCTGTAAA CAGAGAGACA CTGAAAAGGA AGGTTAGTGG GAACCGTTGC 240GCCAGCCCTG TTACTGGTCC AGGTTCAAAG AGGGATGCTC ACTTCTGCGC TGTCTGCAGC 300GATTACGCAT CGGGATATCA CTATGGAGTC TGGTCGTGTG AAGGATGTAA GGCCTTTTTT 360AAAAGAAGCA TTCAAGGACA TAATGATTAT ATTTGTCCAG CTACAAATCA GTGTACAATC 420GATAAAAACC GGCGCAAGAG CTGCCAGGCC TGCCGACTTC GGAAGTGTTA CGAAGTGGGA 480ATGGTGAAGT GTGGCTCCCG GAGAGAGAGA TGTGGGTACC GCCTTGTGCG GAGACAGAGA 540AGTGCCGACG AGCAGCTGCA CTGTGCCGGC AAGGCCAAGA GAAGTGGCGG CCACGCGCCC 600CGAGTGCGGG AGCTGCTGCT GGACGCCCTG AGCCCCGAGC AGCTAGTGCT CACCCTCCTG 660GAGGCTGAGC CGCCCCATGT GCTGATCAGC CGCCCCAGTG CGCCCTTCAC CGAGGCCTCC 720ATGATGATGT CCCTGACCAA GTTGGCCGAC AAGGAGTTGG TACACATGAT CAGCTGGGCC 780AAGAAGATTC CCGGCTTTGT GGAGCTCAGC CTGTTCGACC AAGTGCGGCT CTTGGAGAGC 840TGTTGGATGG AGGTGTTAAT GATGGGGCTG ATGTGGCGCT CAATTGACCA CCCCGGCAAG 900CTCATCTTTG CTCCAGATCT TGTTCTGGAC AGGGATGAGG GGAAATGCGT AGAAGGAATT 960CTGGAAATCT TTGACATGCT CCTGGCAACT ACTTCAAGGT TTCGAGAGTT AAAACTCCAA 1020CACAAAGAAT ATCTCTGTGT CAAGGCCATG ATCCTGCTCA ATTCCAGTAT GTACCCTCTG 1080GTCACAGCGA CCCAGGATGC TGACAGCAGC CGGAAGCTGG CTCACTTGCT GAACGCCGTG 1140ACCGATGCTT TGGTTTGGGT GATTGCCAAG AGCGGCATCT CCTCCCAGCA GCAATCCATG 1200CGCCTGGCTA ACCTCCTGAT GCTCCTGTCC CACGTCAGGC ATGCGAGGTG A 1251(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度66氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO3序列描述Cys Ala Val Cys Ser Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp1 5 10 15Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His20 25 30Asn Asp Tyr Ile Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn35 40 45Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val50 55 60Gly Mer65(2)SEQ ID No4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度233氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID No4序列描述Leu Val Leu Thr Leu Leu Glu Ala Glu Pro Pro His Val Leu Ile Ser1 5 10 15Arg Pro Ser Ala Pro Phe Thr Glu Ala Ser Met Met Met Ser Leu Thr20 25 30Lys Leu Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met Ile Ser Trp Ala Lys Lys35 40 45Ile Pro Gly Phe Val Glu Leu Ser Leu Phe Asp Gln Val Arg Leu Leu50 55 60Glu Ser Cys Trp Met Glu Val Leu Met Met Gly Leu Met Trp Arg Ser65 70 75 80Ile Asp His Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ala Pro Asp Leu Val Leu Asp85 90 95Arg Asp Glu Gly Lys Cys Val Glu Gly Ile Leu Glu Ile Phe Asp Met100 105 110Leu Leu Ala Thr Thr Ser Arg Phe Arg Glu Leu Lys Leu Gln His Lys115 120 125Glu Tyr Leu Cys Val Lys Ala Met Ile Leu Leu Asn Ser Ser Met Tyr130 135 140Pro Leu Val Thr Ala Thr Gln Asp Ala Asp Ser Ser Arg Lys Leu Ala145 150 155 160His Leu Leu Asn Ala Val Thr Asp Ala Leu Val Trp Val Ile Ala Lys165 170 175Ser Gly Ile Ser Ser Gln Gln Gln Ser Met Arg Leu Ala Asn Leu Leu180 185 190Met Leu Leu Ser His Val Arg His Ala Ser Asn Lys Gly Met Glu His195 200 205Leu Leu Asn Met Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Val Tyr Asp Leu Leu210 215 220Leu Glu Met Leu Asn Ala His Val Leu225 230(2)SEQ ID No5信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度477氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ii)分子類型蛋白(xi)SEQ ID NO5序列描述Met Asn Tyr Ser Ile Pro Ser Asn Val Thr Asn Leu Glu Gly Gly Pro1 5 10 15Gly Arg Gln Thr Thr Ser Pro Asn Val Leu Trp Pro Thr Pro Gly His20 25 30Leu Ser Pro Leu Val Val His Arg Gln Leu Ser His Leu Tyr Ala Glu35 40 45Pro Gln Lys Ser Pro Trp Cys Glu Ala Arg Ser Leu Glu His Thr Leu50 55 60Pro Val Asn Arg Glu Thr Leu Lys Arg Lys Val Ser Gly Asn Arg Cys65 70 75 80Ala Ser Pro Val Thr Gly Pro Gly Ser Lys Arg Asp Ala His Phe Cys85 90 95Ala Val Cys Ser Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser100 105 110Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn115 120 125Asp Tyr Ile Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg130 135 140Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly145 150 155 160Met Val Lys Cys Gly Ser Arg Arg Glu Arg Cys Gly Tyr Arg Leu Val165 170 175Arg Arg Gln Arg Ser Ala Asp Glu Gln Leu His Cys Ala Gly Lys Ala180 185 190Lys Arg Ser Gly Gly His Ala Pro Arg Val Arg Glu Leu Leu Leu Asp195 200 205Ala Leu Ser Pro Glu Gln Leu Val Leu Thr Leu Leu Glu Ala Glu Pro210 215 220Pro His Val Leu Ile Ser Arg Pro Ser Ala Pro Phe Thr Glu Ala Ser225 230 235 240Met Met Met Ser Leu Thr Lys Leu Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met245 250 255Ile Ser Trp Ala Lys Lys Ile Pro Gly Phe Val Glu Leu Ser Leu Phe260 265 270Asp Gln Val Arg Leu Leu Glu Ser Cys Trp Met Glu Val Leu Met Met275 280 285Gly Leu Met Trp Arg Ser Ile Asp His Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ala290 295 300Pro Asp Leu Val Leu Asp Arg Asp Glu Gly Lys Cys Val Glu Gly Ile305 310 315 320Leu Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Thr Ser Arg Phe Arg Glu325 330 335Leu Lys Leu Gln His Lys Glu Tyr Leu Cys Val Lys Ala Met Ile Leu340 345 350Leu Asn Ser Ser Met Tyr Pro Leu Val Thr Ala Thr Gln Asp Ala Asp355 360 365Ser Ser Arg Lys Leu Ala His Leu Leu Asn Ala Val Thr Asp Ala Leu370 375 380Val Trp Val Ile Ala Lys Ser Gly Ile Ser Ser Gln Gln Gln Ser Met385 390 395 400Arg Leu Ala Asn Leu Leu Met Leu Leu Ser His Val Arg His Ala Ser405 410 415Asn Lys Gly Met Glu His Leu Leu Asn Met Lys Cys Lys Asn Val Val420 425 430Pro Val Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asn Ala His Val Leu Arg435 440 445Gly Cys Lys Ser Ser Ile Thr Gly Ser Glu Cys Ser Pro Ala Glu Asp450 455 460Ser Lys Ser Lys Glu Gly Ser Gln Asn Pro Gln Ser Gln465 470 475(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度416氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ii)分子類型蛋白(xi)SEQ ID NO6序列描述Met Asn Tyr Ser Ile Pro Ser Asn Val Thr Asn Leu Glu Gly Gly Pro1 5 10 15Gly Arg Gln Thr Thr Ser Pro Asn Val Leu Trp Pro Thr Pro Gly His20 25 30Leu Ser Pro Leu Val Val His Arg Gln Leu Ser His Leu Tyr Ala Glu35 40 45Pro Gln Lys Ser Pro Trp Cys Glu Ala Arg Ser Leu Glu His Thr Leu50 55 60Pro Val Asn Arg Glu Thr Leu Lys Arg Lys Val Ser Gly Asn Arg Cys65 70 75 80Ala Ser Pro Val Thr Gly Pro Gly Ser Lys Arg Asp Ala His Phe Cys85 90 95Ala Val Cys Ser Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser100 105 110Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn115 120 125Asp Tyr Ile Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg130 135 140Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly145 150 155 160Met Val Lys Cys Gly Ser Arg Arg Glu Arg Cys Gly Tyr Arg Leu Val165 170 175Arg Arg Gln Arg Ser Ala Asp Glu Gln Leu His Cys Ala Gly Lys Ala180 185 190Lys Arg Ser Gly Gly His Ala Pro Arg Val Arg Glu Leu Leu Leu Asp195 200 205Ala Leu Ser Pro Glu Gln Leu Val Leu Thr Leu Leu Glu Ala Glu Pro
215 220Leu Ile Ser Arg Pro Ser Ala Pro Phe Thr Glu Ala Ser230 235 240Ser Leu Thr Lys Leu Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met245 250 255Ala Lys Lys Ile Pro Gly Phe Val Glu Leu Ser Leu Phe160 265 270Arg Leu Leu Glu Ser Cys Trp Met Glu Val Leu Met Met280 285Grp Arg Ser Ile Asp His Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ala295 300Val Leu Asp Arg Asp Glu Gly Lys Cys Val Glu Gly Ile310 315 320Phe Asp Mer Leu Leu Ala Thr Thr Ser Arg Phe Arg Glu325 330 335Gln His Lys Glu Tyr Leu Cys Val Lys Ala Met Ile Leu340 345 350Ser Met Tyr Pro Leu Val Thr Ala Thr Gln Asp Ala Asp360 365Lys Leu Ala His Leu Leu Asn Ala Val Thr Asp Ala Leu375 380Ile Ala Lys Ser Gly Ile Ser Ser Gln Gln Gln Ser Met390 395 400Ash Leu Leu Met Leu Leu Ser His Val Arg His Ala Arg405 410 415(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型兩種(D)拓?fù)鋵W(xué)未知(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO7序列描述GGIGAYGARG CWTCIGGITG YCAYTAYGG(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO8序列描述AAGCCTGGSA YICKYTTIGC CCAIYTIAT(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO9序列描述TGTTACGAAG TGGGAATGGT GA(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO10序列描述TTGACACCAG ACCAACTGGT AATG(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO11序列描述
GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO12序列描述GTACACTGAT TTGTAGCTGG AC(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO13序列描述CCATGATGAT GTCCCTGACC(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO14序列描述TCGCATGCCT GACGTGGGAC(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征P(A)長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型核酸(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型(xi)SEQ ID NO15序列描述GGCSTCCAGC ATCTCCAGSA RCAG(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO16序列描述GGAAGCTGGC TCACTTGCTG(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO17序列描述TCTTGTTCTG GACAGGGATG(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO18序列描述GCATGGAACA TCTGCTCAAC(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO19序列描述AGCAAGTTCA GCCTGTTAAG T(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1257堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO20序列描述ATGAATTACA GCATTCCCAG CAATGTCACT AACTTGGAAG GTGGGCCTGG TCGGCAGACC 60ACAAGCCCAA ATGTGTTGTG GCCAACACCT GGGCACCTTT CTCCTTTAGT GGTCCATCGC 120CAGTTATCAC ATCTGTATGC GGAACCTCAA AAGAGTCCCT GGTGTGAAGC AAGATCGCTA 180GAACACACCT TACCTGTAAA CAGAGAGACA CTGAAAAGGA AGGTTAGTGG GAACCGTTGC 240GCCAGCCCTG TTACTGGTCC AGGTTCAAAG AGGGATGCTC ACTTCTGCGC TGTCTGCAGC 300GATTACGCAT CGGGATATCA CTATGGAGTC TGGTCGTGTG AAGGATGTAA GGCCTTTTTT 360AAAAGAAGCA TTCAAGGACA TAATGATTAT ATTTGTCCAG CTACAAATCA GTGTACAATC 420GATAAAAACC GGCGCAAGAG CTGCCAGGCC TGCCGACTTC GGAAGTGTTA CGAAGTGGGA 480ATGGTGAAGT GTGGCTCCCG GAGAGAGAGA TGTGGGTACC GCCTTGTGCG GAGACAGAGA 540AGTGCCGACG AGCAGCTGCA CTGTGCCGGC AAGGCCAAGA GAAGTGGCGG CCACGCGCCC 600CGAGTGCGGG AGCTGCTGCT GGACGCCCTG AGCCCCGAGC AGCTAGTGCT CACCCTCCTG 660GAGGCTGAGC CGCCCCATGT GCTGATCAGC CGCCCCAGTG CGCCCTTCAC CGAGGCCTCC 720ATGATGATGT CCCTGACCAA GTTGGCCGAC AAGGAGTTGG TACACATGAT CAGCTGGGCC 780AAGAAGATTC CCGGCTTTGT GGAGCTCAGC CTGTTCGACC AAGTGCGGCT CTTGGAGAGC 840TGTTGGATGG AGGTGTTAAT GATGGGGCTG ATGTGGCGCT CAATTGACCA CCCCGGCAAG 900CTCATCTTTG CTCCAGATCT TGTTCTGGAC AGGGATGAGG GGAAATGCGT AGAAGGAATT 960CTGGAAATCT TTGACATGCT CCTGGCAACT ACTTCAAGGT TTCGAGAGTT AAAACTCCAA 1020CACAAAGAAT ATCTCTGTGT CAAGGCCATG ATCCTGCTCA ATTCCAGTAT GTACCCTCTG 1080GTCACAGCGA CCCAGGATGC TGACAGCAGC CGGAAGCTGG CTCACTTGCT GAACGCCGTG 1140ACCGATGCTT TGGTTTGGGT GATTGCCAAG AGCGGCATCT CCTCCCAGCA GCAATCCATG 1200CGCCTGGCTA ACCTCCTGAT GCTCCTGTCC CACGTCAGGC ATGCGAGGTC TGCCTGA1257(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度418氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO21序列描述Met Asn Tyr Ser Ile Pro Ser Asn Val Thr Asn Leu Glu Gly Gly Pro1 5 10 15Gly Arg Gln Thr Thr Ser Pro Asn Val Leu Trp Pro Thr Pro Gly His20 25 30Leu Ser Pro Leu Val Val His Arg Gln Leu Ser His Leu Tyr Ala Glu35 40 45Pro Gln Lys Ser Pro Trp Cys Glu Ala Arg Ser Leu Glu His Thr Leu50 55 60Pro Val Asn Arg Glu Thr Leu Lys Arg Lys Val Ser Gly Asn Arg Cys65 70 75 80Ala Ser Pro Val Thr Gly Pro Gly Ser Lys Arg Asp Ala His Phe Cys85 90 95Ala Val Cys Ser Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser100 105 110Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser Ile Gln Gly His Asn115 120 125Asp Tyr Ile Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn Arg130 135 140Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly145 150 155 160Met Val Lys Cys Gly Ser Arg Arg Glu Arg Cys Gly Tyr Arg Leu Val165 170 175Arg Arg Gln Arg Ser Ala Asp Glu Gln Leu His Cys Ala Gly Lys Ala
180 185 190Lys Arg Ser Gly Gly His Ala Pro Arg Val Arg Glu Leu Leu Leu Asp195 200 205Ala Leu Ser Pro Glu Gln Leu Val Leu Thr Leu Leu Glu Ala Glu Pro210 215 220Pro His Val Leu Ile Ser Arg Pro Ser Ala Pro Phe Thr Glu Ala Ser225 230 235 240Met Met Met Ser Leu Thr Lys Leu Ala Asp Lys Glu Leu Val His Met245 250 255Ile Ser Trp Ala Lys Lys Ile Pro Gly Phe Val Glu Leu Ser Leu Phe260 265 270Asp Gln Val Arg Leu Leu Glu Ser Cys Trp Met Glu Val Leu Met Met275 280 285Gly Leu Met Trp Arg Ser Ile Asp His Pro Gly Lys Leu Ile Phe Ala290 295 300Pro Asp Leu Val Leu Asp Arg Asp Glu Gly Lys Cys Val Glu Gly Ile305 310 315 320Leu Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Thr Ser Arg Phe Arg Glu325 330 335Leu Lys Leu Gln His Lys Glu Tyr Leu Cys Val Lys Ala Met Ile Leu340 345 350Leu Asn Ser Ser Met Tyr Pro Leu Val Thr Ala Thr Gln Asp Ala Asp355 360 365Ser Ser Arg Lys Leu Ala His Leu Leu Asn Ala Val Thr Asp Ala Leu370 375 380Val Trp Val Ile Ala Lys Ser Gly Ile Ser Ser Gln Gln Gln Ser Met385 390 395 400Arg Leu Ala Asn Leu Leu Met Leu Leu Ser His Val Arg His Ala Arg405 410 415Ser Ala(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO22序列描述CTTGGATCCA TAGCCCTGCT GTGATGAATT ACAG(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO23序列描述GATGGATCCT CACCTCAGGG CCAGGCGTCA CTG(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1898堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型cDNA(xi)SEQ ID NO24序列描述CACGAATCTT TGAGAACATT ATAATGACCT TTGTGCCTCT TCTTGCAAGG TGTTTTCTCA 60GCTGTTATCT CAAGACATGG ATATAAAAAA CTCACCATCT AGCCTTAATT CTCCTTCCTC 120CTACAACTGC AGTCAATCCA TCTTACCCCT GGAGCACGGC TCCATATACA TACCTTCCTC 180CTATGTAGAC AGCCACCATG AATATCCAGC CATGACATTC TATAGCCCTG CTGTGATGAA 240TTACAGCATT CCCAGCAATG TCACTAACTT GGAAGGTGGG CCTGGTCGGC AGACCACAAG 300CCCAAATGTG TTGTGGCCAA CACCTGGGCA CCTTTCTCCT TTAGTGGTCC ATCGCCAGTT 360ATCACATCTG TATGCGGAAC CTCAAAAGAG TCCCTGGTGT GAAGCAAGAT CGCTAGAACA 420CACCTTACCT GTAAACAGAG AGACACTGAA AAGGAAGGTT AGTGGGAACC GTTGCGCCAG 480CCCTGTTACT GGTCCAGGTT CAAAGAGGGA TGCTCACTTC TGCGCTGTCT GCAGCGATTA 540CGCATCGGGA TATCACTATG GAGTCTGGTC GTGTGAAGGA TGTAAGGCCT TTTTTAAAAG 600AAGCATTCAA GGACATAATG ATTATATTTG TCCAGCTACA AATCAGTGTA CAATCGATAA 660AAACCGGCGC AAGAGCTGCC AGGCCTGCCG ACTTCGGAAG TGTTACGAAG TGGGAATGGT 720GAAGTGTGGC TCCCGGAGAG AGAGATGTGG GTACCGCCTT GTGCGGAGAC AGAGAAGTGC 780CGACGAGCAG CTGCACTGTG CCGGCAAGGC CAAGAGAAGT GGCGGCCACG CGCCCCGAGT 840GCGGGAGCTG CTGCTGGACG CCCTGAGCCC CGAGCAGCTA GTGCTCACCC TCCTGGAGGC 900TGAGCCGCCC CATGTGCTGA TCAGCCGCCC CAGTGCGCCC TTCACCGAGG CCTCCATGAT 960GATGTCCCTG ACCAAGTTGG CCGACAAGGA GTTGGTACAC ATGATCAGCT GGGCCAAGAA1020GATTCCCGGC TTTGTGGAGC TCAGCCTGTT CGACCAAGTG CGGCTCTTGG AGAGCTGTTG1080GATGGAGGTG TTAATGATGG GGCTGATGTG GCGCTCAATT GACCACCCCG GCAAGCTCAT1140CTTTGCTCCA GATCTTGTTC TGGACAGGGA TGAGGGGAAA TGCGTAGAAG GAATTCTGGA1200AATCTTTGAC ATGCTCCTGG CAACTACTTC AAGGTTTCGA GAGTTAAAAC TCCAACACAA1260AGAATATCTC TGTGTCAAGG CCATGATCCT GCTCAATTCC AGTATGTACC CTCTGGTCAC1320AGCGACCCAG GATGCTGACA GCAGCCGGAA GCTGGCTCAC TTGCTGAACG CCGTGACCGA1380TGCTTTGGTT TGGGTGATTG CCAAGAGCGG CATCTCCTCC CAGCAGCAAT CCATGCGCCT1440GGCTAACCTC CTGATGCTCC TGTCCCACGT CAGGCATGCG AGTAACAAGG GCATGGAACA1500TCTGCTCAAC ATGAAGTGCA AAAATGTGGT CCCAGTGTAT GACCTGCTGC TGGAGATGCT1560GAATGCCCAC GTGCTTCGCG GGTGCAAGTC CTCCATCACG GGGTCCGAGT GCAGCCCGGC1620AGAGGACAGT AAAAGCAAAG AGGGCTCCCA GAACCCACAG TCTCAGTGAC GCCTGGCCCT1680GAGGTGAACT GGCCCACAGA GGTCACAAGC TGAAGCGTGA ACTCCAGTGT GTCAGGAGCC1740TGGGCTTCAT CTTTCTGCTG TGTGGTCCCT CATTTGGTGA TGGCAGGCTT GGTCATGTAC1800CATCCTTCCC TCCACCTTCC CAACTCTCAG GAGTCGGTGT GAGGAAGCCA TAGTTTCCCT1860TGTTAGCAGA GGGACATTTG AATCGAGCGT TTCCACAC1898(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度530氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO25序列描述Met Asp Ile Lys Asn Ser Pro Ser Ser Leu Asn Ser Pro Ser Ser Tyr1 5 10 15Ash Cys Ser Gln Ser Ile Leu Pro Leu Glu His Gly Ser Ile Tyr Ile20 25 30Pro Ser Ser Tyr Val Asp Ser His His Glu Tyr Pro Ala Met Thr Phe35 40 45Tyr Ser Pro Ala Val Met Asn Tyr Ser Ile Pro Ser Asn Val Thr Asn50 55 60Leu Glu Gly Gly Pro Gly Arg Gln Thr Thr Ser Pro Asn Val Leu Trp65 70 75 80Pro Thr Pro Gly His Leu Ser Pro Leu Val Val His Arg Gln Leu Ser85 90 95His Leu Tyr Ala Glu Pro Gln Lys Ser Pro Trp Cys Glu Ala Arg Ser100 105 110Leu Glu His Thr Leu Pro Val Asn Arg Glu Thr Leu Lys Arg Lys Val
115 120 125Ser Gly Asn Arg Cys Ala Ser Pro Val Thr Gly Pro Gly Ser Lys Arg130 135 140Asp Ala His Phe Cys Ala Val Cys Ser Asp Tyr Ala Ser Gly Tyr His145 150 155 160Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser165 170 175Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Ile Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr180 185 190Ile Asp Lys Asn Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys195 200 205Cys Tyr Glu Val Gly Met Val Lys Cys Gly Ser Arg Arg Glu Arg Cys210 215 220Gly Tyr Arg Leu Val Arg Arg Gln Arg Ser Ala Asp Glu Gln Leu His225 230 235 240Cys Ala Gly Lys Ala Lys Arg Ser Gly Gly His Ala Pro Arg Val Arg245 250 255Glu Leu Leu Leu Asp Ala Leu Ser Pro Glu Gln Leu Val Leu Thr Leu260 265 270Leu Glu Ala Glu Pro Pro His Val Leu Ile Ser Arg Pro Ser Ala Pro275 280 285Phe Thr Glu Ala Ser Met Met Met Ser Leu Thr Lys Leu Ala Asp Lys290 295 300Glu Leu Val His Met Ile Ser Trp Ala Lys Lys Ile Pro Gly Phe Val305 310 315 320Glu Leu Ser Leu Phe Asp Gln Val Arg Leu Leu Glu Ser Cys Trp Met
325 330 335Glu Val Leu Met Met Gly Leu Met Trp Arg Ser Ile Asp His Pro Gly340 345 350Lys Leu Ile Phe Ala Pro Asp Leu Val Leu Asp Arg Asp Glu Gly Lys355 360 365Cys Val Glu Gly Ile Leu Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Thr370 375 380Ser Arg Phe Arg Glu Leu Lys Leu Gln His Lys Glu Tyr Leu Cys Val385 390 395 400Lys Ala Met Ile Leu Leu Asn Ser Ser Met Tyr Pro Leu Val Thr Ala405 410 415Thr Gln Asp Ala Asp Ser Ser Arg Lys Leu Ala His Leu Leu Asn Ala420 425 430Val Thr Asp Ala Leu Val Trp Val Ile Ala Lys Ser Gly Ile Ser Ser435 440 445Gln Gln Gln Ser Met Arg Leu Ala Asn Leu Leu Met Leu Leu Ser His450 455 460Val Arg His Ala Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Leu Asn Met Lys465 470 475 480Cys Lys Asn Val Val Pro Val Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu Asn485 490 495Ala His Val Leu Arg Gly Cys Lys Ser Ser Ile Thr Gly Ser Glu Cys500 505 510Ser Pro Ala Glu Asp Ser Lys Ser Lys Glu Gly Ser Gln Asn Pro Gln515 520 525Set Gln(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型其它核酸(xi)SEQ ID NO26序列描述GTGCGGATCC TCTCAAGACA TGGATATAAA(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型其它核酸(xi)SEQ ID NO27序列描述AGTAACAGGG CTGGCGCAAC GGTTC(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)直鏈(ii)分子類型其它核酸(xi)SEQ ID NO28序列描述ACTGGCGATG GACCACTAAA GG
權(quán)利要求
1.一種分離的DNA，該DNA編碼具有N-末端功能區(qū)、DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)的蛋白，其中所述蛋白的所述DNA結(jié)合功能區(qū)的氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO3中的氨基酸序列至少80％同源性，且所述蛋白的所述配體結(jié)合功能區(qū)的氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO4中的氨基酸序列至少70％同源性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA，其特征在于，所述蛋白的所述DNA結(jié)合功能區(qū)的氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO3中的氨基酸序列至少90％，優(yōu)選95％，更優(yōu)選98％，最優(yōu)選100％同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離的DNA，其特征在于，所述蛋白的所述配體結(jié)合功能區(qū)的氨基酸序列顯示與示于SEQ ID NO4中的氨基酸序列至少75％，優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選100％同源性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的分離的DNA，所述的DNA編碼包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO21或SEQ ID NO25的氨基酸序列的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的分離的DNA，其特征在于，所述的DNA包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO20或SEQ ID NO24的核酸序列。
6.一種重組表達(dá)載體，它包含根據(jù)權(quán)利要求1至5之任一的DNA。
7.一種用根據(jù)權(quán)利要求1至5的DNA或根據(jù)權(quán)利要求6的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求7的細(xì)胞，它是一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，該細(xì)胞系表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求9至11之任一的甾類受體蛋白。
9.一種蛋白，該蛋白是由根據(jù)權(quán)利要求1至5的DNA或根據(jù)權(quán)利要求6的表達(dá)載體編碼的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的蛋白，所述的蛋白包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO21或SEQ ID NO25的氨基酸序列。
11.具有N-末端功能區(qū)、DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)的嵌合蛋白，其特征在于，所述嵌合蛋白的所述功能區(qū)之至少一個(gè)來(lái)源于根據(jù)權(quán)利要求9或10的蛋白，且所述嵌合蛋白的其它功能區(qū)之至少一個(gè)來(lái)源于來(lái)自核受體總科的另一受體蛋白，其前提是，所述嵌合蛋白的DNA結(jié)合功能區(qū)和配體結(jié)合功能區(qū)來(lái)源于不同的蛋白。
12.編碼根據(jù)權(quán)利要求11蛋白的DNA。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至5或12的DNA、根據(jù)權(quán)利要求6的表達(dá)載體、根據(jù)權(quán)利要求7或8的細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求9至11的蛋白在鑒定新藥物的篩選測(cè)定中的用途。
14.一種鑒定根據(jù)權(quán)利要求9至11蛋白的功能配體的方法，所述的方法包括如下步驟a)向穩(wěn)定的宿主細(xì)胞引入1)根據(jù)權(quán)利要求1至5或12的DNA，和2)將適合的報(bào)道基因功能性地連接于可操作激素效應(yīng)元件，所述的HRE能夠被所述DNA編碼的蛋白之DNA結(jié)合功能區(qū)所活化；b)將來(lái)自步驟a)的宿主細(xì)胞與潛在的配體接觸，所述的配體將可能結(jié)合至由來(lái)自步驟a)的所述DNA編碼的蛋白的配體結(jié)合功能區(qū)；c)監(jiān)控由來(lái)自步驟a)的所述報(bào)道基因編碼的蛋白的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼新穎雌激素受體的分離DNA,由所述的DNA編碼的蛋白,包含所述新穎受體部分的嵌合受體及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1169472SQ9711160
公開(kāi)日1998年1月7日 申請(qǐng)日期1997年3月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月25日
發(fā)明者S·默斯勒曼, R·笛吉克馬 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司