專利名稱：促紅細(xì)胞生成素基因的克隆及其表達細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說涉及一種編碼中國人的EPO基因組DNA，以及將中國人的促紅細(xì)胞生成素基因轉(zhuǎn)移到BHK細(xì)胞中和能夠生產(chǎn)有生物活性的多肽促紅細(xì)胞生成素的哺乳動物細(xì)胞系。
促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin.EPO)是由腎臟產(chǎn)生的一種酸性糖蛋白類激素，作用于造血干細(xì)胞，促進紅細(xì)胞的生成。1985年EPO基因已被克隆，國內(nèi)外許多學(xué)者都進行了EPO表達的研究。所用的材料涉及EPO的cDNA、基因組基因以及EPO基因的PCR產(chǎn)物。表達載體所用的啟動子有SV40及Ad-MLP等。所選用的細(xì)胞系有淋巴母細(xì)胞、CHO dhfr缺陷型細(xì)胞和COS-7細(xì)胞等。表達量從數(shù)十個毫單位每毫升細(xì)胞增減液到幾千單位不等。腎臟疾病會引起促紅細(xì)胞生成素合成不足，從而引起貧血。用基因工程方法從培養(yǎng)的細(xì)胞系中生產(chǎn)的重組的促紅細(xì)胞生成素，可以用來治療多種貧血疾病。如慢性腎功能性貧血、癌癥病人放化療后引起的貧血、以及手術(shù)后貧血的恢復(fù)等。經(jīng)臨床證實其療效確實可靠，并基本上沒有副作用因此具有非常好的應(yīng)用前景。關(guān)于促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)國內(nèi)外已有多項專利申請，內(nèi)容涉及EPO的基因、對EPO的基因的改造、以及在dhfr缺陷型CHO細(xì)胞表達EPO的方法等。
本發(fā)明的目的在于提供了一種用于定向篩選目的基因的基因文庫的構(gòu)建方法，并從這一文庫中克隆了中國人EPO的基因組基因以及通過本發(fā)明構(gòu)建了EPO表達細(xì)胞系；該細(xì)胞系可以用于生產(chǎn)，提取到有生物活性的促紅細(xì)胞生成素，應(yīng)用于臨床，治療各種貧血疾病。建立了利用非dhfr缺陷型細(xì)胞表達EPO基因的方法，可解決生產(chǎn)上缺陷型細(xì)胞較難培養(yǎng)的困難。
本發(fā)明的內(nèi)容1 構(gòu)建了基因組不完全文庫，進行定向篩選，使EPO基因在文庫中得以富集，順利的獲得了包括5′-調(diào)控成分及3′-側(cè)翼序列12.5Kb長的中國人EPO基因組基因。見

圖1。在EPO基因的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)有兩個核苷酸的差異，在第90位的核苷酸處有一個G的缺失，在第一個內(nèi)含子666位的核苷酸處有一個C的插入。其序列詳見表1。這兩個核苷酸的差異改變了5′-調(diào)控區(qū)的ORF。表2列舉了這4個ORF。
2 構(gòu)建了在非dhfr缺陷型細(xì)胞中表達的EPO表達載體。
(1)將2.4Kb的EPO基因編碼區(qū)插入到質(zhì)粒pRSV/CAT中，構(gòu)建了G418抗性的表達載體pRSV/EPO。這一載體帶有RSV-LTR的啟動子及SV40的一個內(nèi)含子，可進行誘導(dǎo)表達。
(2)為了能在BHK細(xì)胞中進行加壓培養(yǎng)，構(gòu)建了帶有潮霉素-B抗性基因和二氫葉酸還原酶基因(dhfr)的表達載體pHY/dhfr。通過與pRSV/EPO共轉(zhuǎn)染，經(jīng)潮霉素-B和G418雙抗性篩選，可獲得既表達EPO又表達dhfr的細(xì)胞株，在MTX的壓力下可提高EPO的表達量。
3 EPO高效穩(wěn)定表達細(xì)胞株的克隆。
用表達載體pRSV/EPO經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選，獲得了表達量為180單位/106細(xì)胞的克隆B8細(xì)胞株。對該細(xì)胞株進行第二次轉(zhuǎn)染，將pHY/dhfr質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞，經(jīng)潮霉素-B篩選后，在MXT壓力下，獲得了表達量為1600單位/106細(xì)胞的克隆B812細(xì)胞株，該細(xì)胞株已經(jīng)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記注冊編號為CGMCC NO.0306。這一細(xì)胞株經(jīng)高密度培養(yǎng)，可獲得超過20000單位/毫升的產(chǎn)量。即可以從每升細(xì)胞培養(yǎng)液中得到超過200毫克的名義產(chǎn)量。
本發(fā)明的優(yōu)點1 克隆了中國人EPO基因，用基因組基因做表達比cDNA的表達量高。
2 構(gòu)建的表達載體pRSV/EPO是在充分考慮了EPO基因的轉(zhuǎn)錄起始效率、內(nèi)含子的拼接、5′-非翻譯區(qū)和3′-非翻譯區(qū)對表達效率的影響等因素，為高效表達提供了基礎(chǔ)。
3 設(shè)計了pHY/dhfr表達載體，為在非dhfr陰性細(xì)胞中用MTX加壓培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)。
4 獲得了高效表達細(xì)胞株，表達量為1600單位/106細(xì)胞，在高密度培養(yǎng)時可獲得超過200mg/升的產(chǎn)量。
用下面的實施例對本發(fā)明做進一步說明。
1 不完全文庫的構(gòu)建從一個中國人提供的血液中分離白細(xì)胞，提取基因組DNA，片斷長度控制在100Kb以上，用BamHI進行完全酶切，回收10.5Kb的片斷，純化后，與入-EMBL3的BamHI臂相連接，用包裝提取物進行體外包裝，構(gòu)建了中國人基因組不完全基因文庫。文庫效價為3×105從這人基因文庫中可以定向篩選EPO基因。由于用BamHI對基因組DNA進行完全酶切，可以使EPO基因在文庫中得以富集。
2 表達載體的構(gòu)建質(zhì)粒pRSV/CAT(購于Stratagene公司)，經(jīng)Not I酶切去掉CAT基因，將EPO基因的2.4Kb片斷與載體進行平端連接。連接反應(yīng)條件載體與外源片斷的摩爾比為1∶10，16℃連接過夜，取5μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α受體菌，用原位雜交的方法篩選陽性菌落，獲重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定方向及系列酶切分析，獲得了重組的表達載體pRSV/CAT。選取帶有dhfr基因的質(zhì)粒pMT010/A+與帶有潮霉素-B抗性基因的質(zhì)粒p3′SS(購于Srtatagene公司)組建了表達載體pHY/dhfr。p3′SS用Bg1II和EcoR V雙酶切，去掉1694的片斷，pMT010/A+經(jīng)Sal I酶切后用TDNA聚合酶于12℃20分鐘補平，再用BgII切下900bp的dhfr基因，將dhfr基因與p3′SS的大片斷以平-粘端的方式相連接，獲重組質(zhì)粒pHY/dhfr。
3 EPO高效穩(wěn)定表達細(xì)胞株的克隆對培養(yǎng)的BHK細(xì)胞用脂質(zhì)體(Lipofectin)方法轉(zhuǎn)染表達載體pRSV/EPO，DNA的量為5μg，脂質(zhì)體為20μl，加無血清MEM2ml，37℃6小時，換正常培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度為30％，48小時后按1∶5的比例分細(xì)胞，用400mg/ml的G418篩選陽性細(xì)胞克隆，獲得了表達量為180單位/106細(xì)胞的克隆B8細(xì)胞株。用pHY/dhfr質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B8細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同前，經(jīng)200mg/ml潮霉素-B篩選后，在MXT壓力下，獲得了表達量為1600單位/106細(xì)胞的克隆--B812細(xì)胞株。在高密度培養(yǎng)條件下，可獲得超過200mg/升的產(chǎn)量。細(xì)胞系的培養(yǎng)條件37℃，5％的CO2濃度，細(xì)胞培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液，10％的新生牛血清。高密度培養(yǎng)時使用無血清培養(yǎng)液。
圖表說明表1中國人EPO基因全序列。
表2EPO基因的前4個ORF(小的開放閱讀框)。
圖1含有全長中國人EPO基因的克隆--λ-811的酶切圖譜。
(1)左臂(2)右臂(3)EPO基因及其5′和3′側(cè)翼(4)EPO基因圖2EPO表達載體pRSV/EPO的圖譜G418新霉素抗性基因RSV-LTRRSV的啟動子intronSV40的內(nèi)含子EPOEPO基因Amp氨芐青霉素抗性基因pASV40的多聚A區(qū)圖3潮霉素-B抗性質(zhì)粒pHY/dhfr的圖譜dhfr二氫葉酸還原酶基因pSV40SV40的啟動子pTKTK基因的啟動子Hygromyc in潮霉素-B抗性基因TKpATK基因的多聚A區(qū)Amp氨芐青霉素抗性基因。
表1中國人EPO基因全序列。

示EPO基因的5個ORF
示EPO的編碼序列g(shù)g ccc 示本基因與Lin FK的序列差異表2EPO基因的前4個ORF(小的開放閱讀框)ORP1 80 ATG CCC CCC AGG GAA GTG TCC GGG AGC CCA GCC TTT CCC AGATAG(14aa)ORF2 201 ATG ACC CAC ACG CAC GTC TGC ACC CCC GCT CAC GCC GCG AGCCTC AAC CCA GGC GTC CTG CCC CYG CYC TGA(25aa)ORF3 293 ATG CAG ATA……AAA CCT GAC CTG TGA(163aa)ORF4 557 ATG AGG GCC CCC GGT GTG GTC ACC CGG CGC GCC CCA GGT CGCTGA (14aa)
權(quán)利要求
1.編碼中國人的EPO基因組DNA，包括完整的編碼區(qū)及5′和3′側(cè)翼，在第90位的核苷酸處有一個G的缺失，在第一個內(nèi)含子666位的核苷酸處有一個C的插入，這兩個核苷酸的改變在5′調(diào)控區(qū)形成了4個以ATG起始的小開放閱讀框架，該DNA的全序列如表1。
2.一種表達載體，它是由EPO基因的2.4Kb的編碼區(qū)構(gòu)建的如附圖2所示的載體pRSV/EPO，它含有一個內(nèi)含子，可以進行誘導(dǎo)表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達載體，其特征是如附圖3所示的載體pHY/dhfr，是利用了B生基因進行篩選，與EPO表達載體pRSV/EPO共同使用，在非dhfr缺陷型細(xì)胞中表達EPO，并能通過MTX進行加壓培養(yǎng)。
4.一種利用人的基因組DNA序列、構(gòu)建表達載體、轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞系而能生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞株，其特征在于該細(xì)胞是B812，保藏號為CGMCCNO.0306。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠生產(chǎn)有生物活性的多肽促紅細(xì)胞生成素的哺乳動物細(xì)胞系。利用基因工程技術(shù)從中國人白細(xì)胞中提取DNA，構(gòu)建了基因文庫，克隆了促紅細(xì)胞生成素基因，通過特異的表達載體轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，獲得了穩(wěn)定高效生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞克隆。本發(fā)明具有利用非dhfr缺陷型細(xì)胞生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的特點。
文檔編號C12N15/85GK1168414SQ9711206
公開日1997年12月24日 申請日期1997年5月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月16日
發(fā)明者崔振中, 劉朋朋, 齊順章, 沈恒, 陸廷夷, 張希 申請人:中國農(nóng)業(yè)科大學(xué)