專(zhuān)利名稱(chēng)：蛹蟲(chóng)草等蟲(chóng)草的人工培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于真菌培養(yǎng)領(lǐng)域。特別是關(guān)于穩(wěn)定、連續(xù)、批量地培養(yǎng)日本棒束孢(Isaria japonica Yasuda)、蟲(chóng)花棒束孢(Isaria farinosa(Hol.)Fr.)、蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris(L)Link)以及高雄山蟲(chóng)草(Cordycepstakaomontana(Yakushiji et Kumazawa))(以下統(tǒng)稱(chēng)“蟲(chóng)草”)的方法。
蛹蟲(chóng)草，自古以來(lái)就是中國(guó)的珍貴中藥。近年來(lái)的大量研究表明，它還具有抗癌等重要的藥用價(jià)值。此外，日本的學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，作為蟲(chóng)草屬真菌之一的日本棒束孢和蟲(chóng)花棒束孢，也同樣具有著增強(qiáng)免疫及抗癌的功能。因此，這些蟲(chóng)草在日本受到了人們的極大關(guān)注。
但是，由于這些蟲(chóng)草的野生量有限，且采集困難，所以人們?cè)缇烷_(kāi)始了人工培養(yǎng)方面的研究。其中，在日本提出的方法有一、將“冬蟲(chóng)夏草”的菌絲或子座孢子接種在既成食品的大蒜、醬油及砂糖的滅菌液體培養(yǎng)基上，或者將該液體培養(yǎng)基附著在大米、麥子及玉米等谷物或蠶、蟬等節(jié)肢動(dòng)物昆蟲(chóng)類(lèi)的成蟲(chóng)、蛹及幼蟲(chóng)上進(jìn)行固體培養(yǎng)的方法(日本專(zhuān)利、特開(kāi)昭54-80486號(hào)公報(bào))。
二、將“冬蟲(chóng)夏草”的菌絲體接種到由糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)、維生素類(lèi)及核酸類(lèi)等其中的一種或數(shù)種物質(zhì)為主要成分、并在其內(nèi)加入谷物類(lèi)而形成的立體固狀培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，然后再將在該立體固狀培養(yǎng)基上培養(yǎng)成的菌絲移植到由糖類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)、維生素類(lèi)及核酸類(lèi)等其中的一種或數(shù)種物質(zhì)為主要成分、并在其內(nèi)加入氨基酸類(lèi)的一種或數(shù)種物質(zhì)、以水為基質(zhì)PH值為4.0～7.0的液體培養(yǎng)基上進(jìn)行靜置培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)基的表面形成菌座的培養(yǎng)的方法(日本專(zhuān)利、特公昭6153033號(hào)公報(bào))。
三、將“冬蟲(chóng)夏草”的菌絲體直接接種在活著的昆蟲(chóng)上、或者含有三分之一量的昆蟲(chóng)組織體的瓊脂純粹分離培養(yǎng)基上的方法。這里所使用的活昆蟲(chóng)是吐絲前的蠶(日本專(zhuān)利、特開(kāi)昭62-107725號(hào)公報(bào))。
四、將在野外采集到的“冬蟲(chóng)夏草”，用瓊脂培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基繁殖其菌絲和分生孢子，最后在野外進(jìn)行大規(guī)模的栽培方法(日本專(zhuān)利、特開(kāi)平6-233627號(hào)公報(bào))。
五、以鱗翅目昆蟲(chóng)為“冬蟲(chóng)夏草”菌的寄主，特別是使用自然狀態(tài)的地蠶蛾和蠶蛾類(lèi)的方法(日本專(zhuān)利、特開(kāi)平8-75號(hào)公報(bào)；特開(kāi)平8-172903號(hào)公報(bào))。
在上述培養(yǎng)的方法中，第三種方法的發(fā)明人指出了自己的第二種方法中的缺陷，即使用昆蟲(chóng)以外的成分為培養(yǎng)基，會(huì)出現(xiàn)藥理活性減退的問(wèn)題，作為連續(xù)的培養(yǎng)方法并非理想，同時(shí)提出了用與自然界中相同的活著的昆蟲(chóng)本體作培養(yǎng)基的方法。一般來(lái)講，野外昆蟲(chóng)的體表和體內(nèi)存在著各種雜菌，會(huì)降低蟲(chóng)草菌的感染率，所以第三種方法同樣也不可能穩(wěn)定地提供同一菌種。而上述的第四種方法中的野外栽培方式，也很難排除雜菌的感染，難以進(jìn)行穩(wěn)定的連續(xù)生產(chǎn)。同時(shí)，胞子的飛散還會(huì)給自然界造成影響。
在中國(guó)，至今也提出了很多人工培養(yǎng)的方法。其中，具有代表性的是中國(guó)專(zhuān)利CN1092105A。該專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)谥赋隽藢?zhuān)利CN1034390A中所存在的缺陷之后，提出了以桑葉育蠶蛹作為寄主，將蛹蟲(chóng)草菌液注入蛹體內(nèi)，待蠶蛹僵硬后用煤渣等多孔材料覆蓋其上，形成子實(shí)體的方法。
該方法由于使用的是桑葉育的蠶蛹，因此附著在桑葉以及蠶具上的雜菌，很容易使蠶蛹受到感染，從而引發(fā)蠶蛹的敗血病。而將煤渣等多孔材料覆蓋在蠶蛹上，又會(huì)給子實(shí)體收獲的分離工作帶來(lái)麻煩。此外，因受桑葉的季節(jié)限制，全年穩(wěn)定、連續(xù)地提供蠶蛹將很困難。
在日本目前繅絲后的蠶蛹經(jīng)洗凈、烘干用作家畜飼料。但在洗凈過(guò)程中所產(chǎn)生的清洗廢液流入河川，引起了污染。因此如何妥善地處理繅絲后的廢蛹已成了亟待解決的問(wèn)題。
本發(fā)明的目的就在于要克服上述技術(shù)的不足，提出一個(gè)防止藥理活性減退，提高蟲(chóng)草菌的感染率，并能穩(wěn)定、連續(xù)、批量地生產(chǎn)蟲(chóng)草的方法。為此，提出了用以蠶蛹的組成成分為主要成分的液體培養(yǎng)方法提供生產(chǎn)所需的孢子增殖源；以無(wú)菌蠶蛹作寄主進(jìn)行繼代培養(yǎng)的方法?，F(xiàn)就具體內(nèi)容說(shuō)明如下本發(fā)明中所指的蟲(chóng)草，包括完全型的Cordyceps屬和不完全型的Isaria屬。將在野外采集到的天然成熟的蟲(chóng)草，用瓊脂培養(yǎng)基按常法進(jìn)行分離純化，選出菌種。
一、以蠶蛹的組成成分為主要成分的液體培養(yǎng)方法作為液體培養(yǎng)基的成分所使用的蠶蛹，可以是吐絲后的活蛹，也可以是將繭干燥后的干燥蛹，或者是繅絲后的蛹?？壗z后的蛹中，除了含有60％的粗蛋白質(zhì)及9％的氮元素外，還含有很多蟲(chóng)草發(fā)育所需要的無(wú)機(jī)鹽、糖原等的營(yíng)養(yǎng)成分。蛹可以不經(jīng)處理直接使用，但將干燥的蛹粉碎后再進(jìn)行抽出，效果則更好。
蠶蛹組成成分的抽出方法，有煮和使用高壓滅菌器的方法。在沸騰以下的溫度抽出時(shí)，可采用煮的方法。使用高于100℃的溫度抽出時(shí)，可以使用高壓滅菌器，這樣能在短時(shí)間內(nèi)抽出蛹的有效成分。抽出時(shí)蛹和水的比例為1∶2～5，用作培養(yǎng)液時(shí)，將此抽出液再用水稀釋5～10倍。若不進(jìn)行稀釋?zhuān)部梢灾苯佑糜嫉?0～50倍的水進(jìn)行抽出。如使用煮的方法，還要補(bǔ)加因蒸發(fā)而失去的水量。
在上述的蛹抽出液內(nèi)，根據(jù)蟲(chóng)草的不同，需要加入適量的碳水化合物、氨基酸、無(wú)機(jī)元素以及維生素等物質(zhì)。其添加量約為蛹抽出液的2～8％。作為碳水化合物的有葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉等；作為無(wú)機(jī)元素的有磷、鈣、鉀、鈉、鎂等。最后將配好的液體裝瓶高溫滅菌，待自然冷卻后，即為液體培養(yǎng)基。
除了上述的抽出方法以外，還有將干燥蛹粉碎后滅菌，不經(jīng)加熱抽出，僅在其內(nèi)加入滅菌水，即為液體培養(yǎng)基的方法。同樣，根據(jù)蟲(chóng)草的不同，加入適量的碳水化合物、氨基酸類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)以及維生素類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，效果則更好。
在上述的液體培養(yǎng)基上，接種分離菌株。培養(yǎng)溫度為15℃～25℃，濕度為75％～95％，自然光下進(jìn)行。
以上僅對(duì)液體培養(yǎng)基作了說(shuō)明，這對(duì)加入瓊脂的固體培養(yǎng)基也同樣適用。
二、以無(wú)菌蠶的蠶蛹作為培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法本發(fā)明中所說(shuō)的無(wú)菌蠶，主要是指排除了引起蠶發(fā)病的主要病原體的蠶。通常采用人工飼料無(wú)菌養(yǎng)蠶法可以得到。即將蠶卵的表面消毒，在無(wú)菌的蟻蠶上，投放蒸煮滅菌后的飼料，并在無(wú)菌裝置內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。當(dāng)然，用其他方法得到的不含有病原體的蠶也可視為無(wú)菌蠶。
而用來(lái)作培養(yǎng)基的，是按上述方法飼養(yǎng)的蠶化蛹后的蛹(以下簡(jiǎn)稱(chēng)無(wú)菌蛹)。其中以復(fù)眼著色前的初化蛹為最理想。將菌株直接接種在蛹體上，在溫度為15℃～25℃，濕度為75％～95％，自然光下培養(yǎng)。
以下結(jié)合具體的實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1用蛹抽出液為主要成分的液體培養(yǎng)基人工培養(yǎng)日本棒束孢。蛹抽出液是用干燥蛹的5倍量的沸騰水，煮2小時(shí)后得到的。然后，將此抽出液再稀釋5倍制成液體培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基上接種日本棒束孢菌。接種2～3日后在液體培養(yǎng)基上開(kāi)始形成菌絲，一周后形成菌絲層，兩周后開(kāi)始出現(xiàn)子座原基。45～60日后形成4～8厘米的子實(shí)體并成熟。培養(yǎng)溫度為15℃～25℃、濕度為75％～95％、自然光照下進(jìn)行。此外，在蛹抽出液內(nèi)加入適量的葡萄糖和無(wú)機(jī)元素后，與不添加的相比子實(shí)體苗壯色艷。
用同樣的方法，對(duì)蟲(chóng)花棒束孢也進(jìn)行了培養(yǎng)。將蟲(chóng)花草棒束孢分離菌株接種3日后，開(kāi)始形成白菌絲，11日后開(kāi)始出現(xiàn)子座原基。45～50日后形成2～3厘米的細(xì)的子實(shí)體、呈淡黃色。此外，在該蛹抽出液內(nèi)加入碳水化合物后，子實(shí)體可生長(zhǎng)到3～4厘米，呈淡褐色，色澤鮮艷。
實(shí)施例2回收上述方法得到的日本棒束孢孢子、制成菌液，接種在無(wú)菌蛹上。接種2～3日后蠶體變硬，從蛹體表的關(guān)節(jié)膜、氣門(mén)處開(kāi)始長(zhǎng)出菌絲，感染率在99.5％以上。12～13日后出現(xiàn)子座原基，30～50日后形成5～7.5厘米長(zhǎng)的子實(shí)體并成熟。此外，花草棒束孢也得到了相似的結(jié)果。
對(duì)用上述方法所得到的日本棒束孢的成分進(jìn)行了分析，其結(jié)果如表1所示。作為比較例使用了中國(guó)西藏產(chǎn)的干燥后的冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis(Berk)Sacc)。對(duì)被認(rèn)為具有抗癌效果和增強(qiáng)免疫功能的硒元素、β-葡聚糖和麥角甾醇進(jìn)行了分析。
實(shí)施例3比較了蛹蟲(chóng)草菌對(duì)無(wú)菌蛹和桑葉育蛹的感染率。將蛹蟲(chóng)草菌直接接種在無(wú)菌蛹和桑葉育蛹的蛹體上，培養(yǎng)條件與實(shí)施例1相同，其感染結(jié)果如表2所示。其中，無(wú)菌蛹的感染率非常高，接近100％，并形成了子實(shí)體。而桑葉育蛹的雜菌感染率卻高達(dá)85％。通過(guò)分析認(rèn)為這些雜菌主要是來(lái)源于桑葉和蠶具上的細(xì)菌，在上述的濕度溫度條件下引起了蠶蛹的敗血癥。
實(shí)施例4對(duì)人工飼料無(wú)菌養(yǎng)蠶法得到的熟蠶和無(wú)菌蛹接種，作了比較試驗(yàn)。使用的菌種為高雄山蟲(chóng)草菌，培養(yǎng)條件與實(shí)施例1相同，其結(jié)果是無(wú)菌蛹的感染率為100％，子實(shí)體形成率為97％。接種15日后開(kāi)始出現(xiàn)子座原基，40～50日后形成子實(shí)體并成熟。子實(shí)體為棍棒形、呈淡黃色，平均高為5厘米左右。而熟蠶的感染率為80％，子實(shí)體形成率為66％，接種18日后開(kāi)始出現(xiàn)子座原基，但60日后的子實(shí)體也僅為2厘米左右。
用同樣的方法，對(duì)蛹蟲(chóng)草菌也進(jìn)行了試驗(yàn)。其結(jié)果是無(wú)菌蛹的感染率為100％，子實(shí)體的形成率為99.5％。而熟蠶的感染率為82％，子實(shí)體的形成率為74％。
實(shí)施例5
對(duì)液體培養(yǎng)基中的蛹抽出液，作了抽出溫度和時(shí)間的試驗(yàn)。在每單位的蛹中加入其5倍量的水加熱抽出，然后將該抽出液再用8倍的水稀釋?zhuān)瞥梢后w培養(yǎng)基。使用日本棒束孢菌的結(jié)果如表3所示。可以看出抽出溫度為100℃、抽出時(shí)間在2小時(shí)以上的試驗(yàn)區(qū)的結(jié)果較好，5小時(shí)以上的區(qū)最理想。抽出溫度高于100℃時(shí)，抽出時(shí)間至少需10分鐘以上，其中以20分鐘以上的區(qū)最理想。
實(shí)施例6對(duì)繅絲后的濕蛹也作了抽出溫度和時(shí)間的比較。在每單位的蛹中加入其3倍量的水加熱抽出。然后將該抽出液再用2倍的水稀釋?zhuān)瞥梢后w培養(yǎng)基。使用日本棒束孢菌的結(jié)果如表4所示?？梢钥闯鲈诔槌鰷囟葹?00℃時(shí)、抽出時(shí)間為1～4小時(shí)、107℃時(shí)30～60分、120℃時(shí)20～40分的范圍內(nèi)，日本棒束孢的感染率均為100％，子實(shí)體的形成率達(dá)到98％以上，45～60日后形成4～8cm的子實(shí)體。
實(shí)施例7在蛹的組成成分的抽出方法中，對(duì)干燥蛹里加水煮的方法、將蛹粉碎后再加水煮的方法、以及粉碎蛹里加水的方法進(jìn)行了比較。
用煮的方法抽出時(shí)、是在每一單位的干燥蛹里加入其5倍量的水，熱水抽出。然后將抽出液再用8倍的水稀釋?zhuān)瞥梢后w培養(yǎng)基。粉碎蛹中加水的方法是先將蛹粉碎后，再高壓滅菌，在滅菌蛹中加入蛹的40倍重的無(wú)菌水，即為液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)方法等與實(shí)施例1相同。
結(jié)果表明，上述的每種方法都能形成良好的子實(shí)體，但以粉碎蛹里加無(wú)菌水的方法為最好，而用將干燥蛹粉碎后再煮的方法比直接煮干燥整蛹的方法所得到的結(jié)果好。
人工飼料無(wú)菌養(yǎng)蠶可以不受季節(jié)的限制，進(jìn)行工廠化的高密度養(yǎng)蠶，目前在日本所進(jìn)行的工廠養(yǎng)蠶中，每天都能獲得一定數(shù)量的蠶蛹。以無(wú)菌蠶蛹作為寄主生產(chǎn)蟲(chóng)草的方法，可以防止雜菌的繁殖，提高蟲(chóng)草菌的感染率。該方法同野外栽培方式相比，一年中會(huì)獲得其數(shù)萬(wàn)倍的產(chǎn)量。而且，在相同的空間、時(shí)間內(nèi)所取得的效果，也是其他方法所不能比擬的。本發(fā)明中的液體培養(yǎng)方法，可以利用繰絲后的蠶蛹來(lái)降低蟲(chóng)草的生產(chǎn)成本，同時(shí)解決了藥理活性減退的問(wèn)題。按照本發(fā)明生產(chǎn)出的蟲(chóng)草可以直接進(jìn)行干燥或制成干粉，也可以根據(jù)需要抽出其有效成分，提供高純度的產(chǎn)品。此外，還可以從子實(shí)體的殘?jiān)芭囵B(yǎng)液中抽出有效的代謝成分。[表1]日本棒束胞和冬蟲(chóng)夏草的成分比較< 無(wú)菌蠶蛹和桑育蠶蛹對(duì)蛹蟲(chóng)草菌的感染 蠶蛹的不同溫度和時(shí)間的抽出對(duì)日本棒束孢成長(zhǎng)的影響
干燥后的重量比是將各試驗(yàn)區(qū)的菌絲體和子實(shí)體干燥后，以最重的區(qū)(120℃60分)為100，而求出的百分比。注子實(shí)體的狀態(tài) 平均高為7cm以上時(shí)為 ◎4～6cm ○2～4cm △2cm以下時(shí)為 ×。[表4]繅絲后的蛹的不同溫度和時(shí)間的抽出對(duì)日本棒束孢成長(zhǎng)的影響
注子實(shí)體的狀態(tài)平均為7cm以上時(shí)為 ◎4～6cm ○2～4cm △2cm以下時(shí)為 ×。
權(quán)利要求
1.人工培養(yǎng)日本棒束孢(Isaria japonica Yasuda)、蟲(chóng)花棒束孢(Isaria farinosa(Hol.)Fr.)、蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris(L.)Link以及高雄山蟲(chóng)草(Cordyceps takaomontana(Yakushiji et Kumazawa))的方法，其特征在于使用以蠶蛹的組成成分為主要成分的培養(yǎng)基。
2.按照權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于所使用的蠶蛹是繅絲后的蛹。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于培養(yǎng)基是用水高溫加熱抽出蠶蛹的組成成分的抽出液。
4.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于抽出液是將每單位的蛹用其2～50倍重量的水，在沸騰溫度下煮2小時(shí)以上而得到的。
5.按照權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于抽出液是將每單位的蛹用其2～50倍重量的水，在沸騰以上的溫度下煮20分鐘以上而得到的。
6.按照權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于培養(yǎng)基是將蠶蛹粉碎后再在其內(nèi)加水制成的液體培養(yǎng)基。
7.按照權(quán)利要求3至6所述的任何一種培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于培養(yǎng)基中至少添加了碳水化合物、氨基酸類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、或維生素類(lèi)中的一種物質(zhì)。
8.按照權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于蛹抽出液與上述添加量的重量比為100比2～8。
9.人工培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于以無(wú)菌蠶蛹作為培養(yǎng)基，在蛹體上接種日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的子囊孢子或分生孢子。
10.按照權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于所用的蠶蛹是初化蛹。
11.人工培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的方法，其特征在于先用以蠶蛹的組成成分為主要成分的液體培養(yǎng)基繁殖日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草的的子囊孢子或分生孢子；然后將這些子囊孢子或分生孢子接種于無(wú)菌蠶蛹上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于人工培養(yǎng)日本棒束孢、蟲(chóng)花棒束孢、蛹蟲(chóng)草以及高雄山蟲(chóng)草等蟲(chóng)草的方法。將上述菌株接種于以蠶蛹的組成成分為主要成分的液體培養(yǎng)基上，或用人工飼料無(wú)菌養(yǎng)蠶法得到的蠶蛹上，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下培養(yǎng)成與天然蟲(chóng)草相同的子實(shí)體。本發(fā)明可以利用繅絲后的蠶蛹，降低蟲(chóng)草的生產(chǎn)成本，防止藥理活性的減退。此外，通過(guò)以無(wú)菌蠶蛹作為寄主，提高蟲(chóng)草菌的感染率，是穩(wěn)定、連續(xù)、批量地生產(chǎn)蟲(chóng)草的有效方法。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1167825SQ97113190
公開(kāi)日1997年12月17日 申請(qǐng)日期1997年5月27日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月27日
發(fā)明者陳瑞英, 一田昌利, 荒武義信, 松原藤好 申請(qǐng)人:日原町