專利名稱：疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水痘帶狀皰疹病毒(VZV)前早蛋白質(zhì)175和其衍生物以及包括這些蛋白質(zhì)的疫苗在預(yù)防和治療VZV感染中的應(yīng)用。
水痘帶狀皰疹病毒(VZV)是人皰疹病毒，它是水痘和帶狀皰疹的病原體。初期感染或原發(fā)感染導(dǎo)致水痘，通常在幼年時感染上，此時為相對良性的。然而，對于幼年時未接觸過水痘的成年人，以及被免疫包容的個體有時可以是致命的。同樣，VZV感染對于新生兒可以是致命的，因?yàn)樵摬《灸艽┰教ケP。人們知道，水痘是極易通過直接接觸而傳染的疾病。
與大多數(shù)皰疹病毒一樣，VZV趨向于感染某些病毒發(fā)育在其中受到抑制的細(xì)胞。一段不同的潛伏期之后，水痘帶狀皰疹(VZ)病毒可被釋放，開始感染其它細(xì)胞。這種VZ病毒的重新激活每年大約引起5百萬例帶狀皰疹(Plotkinetal.Postgrad.Med.J.61155-63(1985))。帶狀皰疹特征是大腦神經(jīng)節(jié)和末梢神經(jīng)發(fā)炎并伴有劇痛。目前，重新激活該病毒的因素尚不清楚。
現(xiàn)已表明，用VZV減毒品系接種的人從VZV感染獲得了保護(hù)性免疫力(Arbeter et al.，J.pediatr 100，886-93(1982)and Brunell etal.，Lancetu1069-72(1982))。這種方法雖是有效的，但由于繁殖水痘帶狀皰疹病毒有困難而受到限制。在簽定VZ病毒的抗原成分上人們做了一定的努力。為了開發(fā)改良的VZ疫苗特別是亞單位疫苗，分離VZV被膜蛋白是很重要的。Forghani等人(J.Virol. 5255-62(1984)，OKuno等從(Virol.129357-68(1983))和Keller等人(J.Virol.52293-7(1984))已從VZV感染的細(xì)胞和VZ病毒粒子中鑒定出許多病毒特異性糖蛋白。
迄今，人們生產(chǎn)抗VZV的重組亞單位疫苗的努力集中在作為潛在糖蛋白的外被膜糖蛋白上。本發(fā)明明顯不同于這種方法，而是涉及采用VZV的前早非結(jié)構(gòu)蛋白來提供對抗繼后之VZV攻擊的保護(hù)作用。
由于胞毒性淋巴細(xì)胞CTL的抗原識別機(jī)理涉及將天然抗原分解成肽，使蛋白質(zhì)水解片段結(jié)合到MHC分子上并將復(fù)合物輸送到分子表面，故任何病毒編碼的多肽，而不是那些象糖蛋白一樣的整合膜蛋白，都可以是T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的潛在靶體。然而，由于VZV基因組除編碼外糖蛋白外，還編碼幾種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和內(nèi)病毒粒子蛋白質(zhì)，這樣就導(dǎo)致有大量的潛在CTL靶體，而不知哪種蛋白質(zhì)是最相關(guān)的。
VZV感染的特征是只有極微量的游離病毒存在。在潛伏期和重新激活期間，病毒主要是細(xì)胞內(nèi)的。由此，復(fù)發(fā)疾病即使是用高水平中和抗體也不能被阻止，而且病毒控制依賴于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性。因此，為了用免疫接種法獲得保護(hù)，人們不僅希望誘導(dǎo)出抗體反應(yīng)，而且還希望誘導(dǎo)出CTL反應(yīng)。有效的疫苗應(yīng)當(dāng)是只要潛伏病毒重激活信號一出現(xiàn)就能盡早發(fā)揮作用的預(yù)激態(tài)CTL。
為了鑒定用于預(yù)防或治療目的之疫苗的最重要的CTL靶抗原，本發(fā)明人考慮了VZV復(fù)制循環(huán)。包含病毒基因組之細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)合成開始時將產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)片段，該片段由MHC分子呈現(xiàn)于細(xì)胞表面上，使其成為適當(dāng)特異性的CTL的靶。VZV的復(fù)制循環(huán)持續(xù)約24小時并涉及α或前早(IE)β和γ或晚期(L)基因產(chǎn)物的有序表達(dá)。因此早期CTL攻擊和隨后的先于晚結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的感染細(xì)胞的溶胞能阻止新的病毒粒子產(chǎn)生，并由此防止病毒擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞。為了更為有用，CTL應(yīng)測檢到感染和重新激活后出現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)的最早的病毒蛋白質(zhì)。
IE蛋白質(zhì)IEP 175是由開放讀碼設(shè)計的ORF62編碼的，該蛋白質(zhì)本身有時稱作IE62。
該蛋白質(zhì)作為相對分子量為175 KDa的磷蛋白出現(xiàn)(Kincchnton etal J.of Virology Vol 66(1)(1992)P.359-366))，但推測的分子量為140KDa。它是由人T細(xì)胞識別的(Bergenetal Viral.Immunology 4(3)1991P151))并已提示是為重要的免疫靶體(Bergenetal J.Infectious Diseases(1990)162 P.1049))。
有許多系統(tǒng)可供本行業(yè)熟練技術(shù)人員采用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)，然而，其中大部分已被證實(shí)不能成功地生產(chǎn)全長度的IEP 175。例如該蛋白在昆蟲細(xì)胞中被降解。
然而，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在CHO細(xì)甩中表達(dá)可生產(chǎn)出天然IEP 175的功能等同物和結(jié)構(gòu)等同物(即正確的大小)。
因此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中提供了無VZV污染物的功能上等同于其天然蛋白質(zhì)的IEP 175。
本發(fā)明還擴(kuò)展到IEP 175的生理功能衍生物。
本發(fā)明的一個方面是提供沒有VZV污染物的具有與附

圖1中描述的順序基本上同源之氨基酸順序的IEP 175蛋白質(zhì)。
基本上同源是指本發(fā)明提供的功能等同物IEP 175蛋白質(zhì)至少有75％同源于圖1中的氨基酸順序，優(yōu)選80％，更優(yōu)選至少90％，且最優(yōu)選至少95％同源。
優(yōu)選的IEP 175衍生物是在大腸桿菌或CHO細(xì)胞中表達(dá)后得以分泌該蛋白質(zhì)的那種。特別是提供了其中氨基酸226至257和氨基酸648至733已缺失的可分泌衍生物。
典型的其它免疫原衍生物為含有附加順序的融合多肽。該附加順序可以攜帶一或多個抗原決定基，其來自其它VZV蛋白質(zhì)如VZV糖蛋白，例如gpI，gpII，gpIII，gpIV或9PV(有時稱為gcI，gcII，gcIII等)、其它VZV抗原、甚或其它非VZV抗原如乙肝表面或核心抗原。此外，本發(fā)明的免疫原衍生物可融合于具有免疫刺激特性的載體多肽如佐劑上，或提高對VZV蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，或可用于表達(dá)、純化或配制VZV蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的融合蛋白質(zhì)包括融合于上述可分泌形式之IEP 175的“無錨地”gpII。
另一方面，本發(fā)明提供在調(diào)節(jié)順序控制下可表達(dá)DNA分子編碼的能在異種宿主中發(fā)揮功能的IEP 175或其衍生物。特別是提供了基本上同源于附圖1中所示DNA順序的DNA分子?；旧贤词侵窪NA順序至少75％同源于圖1所示的DNA順序，優(yōu)選至少85％，更為優(yōu)選90％且最優(yōu)至少95％。
可采用本行業(yè)熟知的方法，通過加入、缺失、取代或重排堿基來制備編碼IEP 175或衍生物的DNA順序。圖1中，開頭的ATG編碼N末端蛋氨酸，且最后的TGA為轉(zhuǎn)譯終止(即停止)信號。
本發(fā)明的再一個方面是提供編碼水痘帶狀皰疹病毒IEP 175或其衍生物的重組DNA分子或包括DNA順序的媒體，它可操作地連于在真核宿主細(xì)胞中更好是在CHO細(xì)胞中起作用的調(diào)節(jié)區(qū)域。
本發(fā)明的另一方面是提供制備水痘帶狀皰疹病毒IEP 175或其衍生物的方法，該方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述的DNA順序并回收蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了用重組DNA分子轉(zhuǎn)化的重組CHO細(xì)胞系。
在另一個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明制備VZV IEP 175蛋白質(zhì)或衍生物的方法，該方法包括在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述蛋白質(zhì)或衍生物的DNA順序并回收所得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
本發(fā)明的方法可采用常規(guī)重組技術(shù)如Maniatis等人在MolecularCloning-A laboratory Manual；Cold Spring Harbor，1982和DNA CloningVolI，II和III卷(DM.Glovered，IRL Press Ltd)中描述的技術(shù)來完成。
包含有這種編碼順序DNA分子可以采用已知技術(shù)(例如由mRNA模板制造互補(bǔ)物或CDNAs)或從VZV基因組DNA分離得到。參見Eckeretal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79156-160(1982)，Strans等，Proc.Natl.Acad.Sci USA.79L 993-7(1982)，Stransetal.，J.Gen.Virol.641034-41(1983)和Davisonetal.，J.Gen.Virol.641811-1814(1983))。此外，可用標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)合成編碼gpI、gpII和gpIII的DNA分子。
由此本發(fā)明還提供了通過縮合適當(dāng)?shù)囊弧⒍蚬丫酆塑账釂挝粊碇苽銬NA順序。
制備可以化學(xué)方法、酶方法、或上述兩種方法的組合在體外或適合時在體內(nèi)進(jìn)行。由此DNA順序可以采用常規(guī)方法如DM Roberts等人在Biochemistry 1985，24，5090-5098中所描述的方法，用酶連接適合的DNA片段來制備。
經(jīng)用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化含有所需核苷酸順序的DNA、化學(xué)合成、酶促聚合，或這些方法的組合，可以獲得該DNA片段。
用限制性內(nèi)切酶消化可在適合的緩沖液中在20℃-70℃溫度下，通常在含有0.1-10Aμg DNA的50μl或更小的體積中進(jìn)行。
DNA的酶促聚合可在體外進(jìn)行，采用DNA聚合酶如DNA聚合酶I(Klenow片段)在含有所需要之核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP的適當(dāng)緩沖液中，在10-37℃下，通常在50μl或更小的體積中進(jìn)行。
DNA片段的酶促連接可采用DNA連接酶如T4 DNA連接酶在適合的緩沖液中，4℃至室溫下，通常為50μl或更小的體積中進(jìn)行。
DNA順序或片段的化學(xué)合成可采用下列文獻(xiàn)中描述的固相技術(shù)，通用常規(guī)磷酸三酯，亞磷酸鹽或氨基亞磷酸鹽化學(xué)法來完成“Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A LaboratoryManual”(ed H.G.Gassen and A.Lang)，Verlag Chemie，Weinheim(1982)，或其它科學(xué)出版物，例如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat，and R.C.Titmas，Nucleic Acids Research，1982，10，6243；B.S.Sproat and W.Bannwarth，Tetrahedron Letters，1983，24，5771；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters，1980，21，719；M.D＞Matteucci and M.H.Caruthers Journal of the American Chemical Sociery，1981，1033185；S.P.Adamsetal.Joumal of the American ChemicalSociety，1983，105，661；N.D.Sinha，J.Biemat，J.McMannus，and H.Koester，Nucleic Acids Research，1984，12，4539；和H.W.D.Matthesetal.，EMBO Journal，1984，3,801。優(yōu)選采用自動DNA分析儀。
該DNA順序優(yōu)選由兩個或更多個DNA分子連接而制得，這些DNA分子合在一起包含編碼該蛋白質(zhì)的DNA順序。
DNA分子可以經(jīng)用適合的限制性內(nèi)切酶消化攜帶所需編碼順序的載體而獲得。
DNA分子的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)以及獲得它們的途徑依據(jù)所需蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)而定。構(gòu)建編碼蛋白質(zhì)之DNA分子的適宜策略的設(shè)計對本專業(yè)熟練技術(shù)人員來說是易于作到的。
裂解與宿主細(xì)胞相容的載體以提供線性DNA片段，并將所述的線性片段與一或多個(與所述線性片段一起在連接條件下編碼IE 175蛋白質(zhì)或衍生物的)DNA分子結(jié)合而制得本發(fā)明的表達(dá)載體。線性片段與一個以上DNA分子的連接可同時或按所需順序進(jìn)行。因此，該DNA順序可以按需要在構(gòu)建載體期間或之前制成。
載體的選擇將部分地取決于宿主。更具體地說，本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。本發(fā)明宿主細(xì)胞的適合載體包括質(zhì)粒和裝配型質(zhì)粒。
為制備IE 175表達(dá)載體，可采用適合的酶，按照例如上面提到的Maniatis等描述的步驟經(jīng)限制、聚合和連接DNA而常規(guī)完成。聚合和連接可以按上述制備DNA聚合體的方法進(jìn)行。用限制性內(nèi)切酶消化可在適當(dāng)?shù)木彌_液中于20-70℃下，通常在含有0.1-10μg DNA的50μl或更小體積中進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明，重組宿主細(xì)胞通過在轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化帶有本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞制備。適宜的轉(zhuǎn)化條件為常規(guī)的且描述于例如上面提到的Maniatis等人的文獻(xiàn)中，或“DNA Cloning”VolII，D.M.Glovered.，IRL Press Ltd，1985中。
培養(yǎng)物中的哺乳動物細(xì)胞可以通過將載體DNA鈣共沉淀到細(xì)胞上或經(jīng)電穿孔而被轉(zhuǎn)化。
在允許表達(dá)DNA順序的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是按照例如描述于上面提到的Maniatis等人的文獻(xiàn)和“DNA Cloning”中的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行的。因此，細(xì)胞最好補(bǔ)充營養(yǎng)素并在45℃以下培養(yǎng)。
根據(jù)宿主細(xì)胞和產(chǎn)物是否為被分泌的或是否為經(jīng)化學(xué)或酶釋放并由所得溶胞物中分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而用常規(guī)方法回收該VZV 175蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物。如當(dāng)產(chǎn)物是可分泌的，則產(chǎn)物通常可從營養(yǎng)培養(yǎng)基中分離。
可將DNA順序組裝到設(shè)計來分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)化之哺乳動物細(xì)胞系表達(dá)IEP 175蛋白質(zhì)的載體中；例如牛乳頭狀瘤病毒或在中國倉鼠細(xì)胞中擴(kuò)增的載體(DNA Cloning Vol.II，D.M.ed.IRL Press 1985；Kaufman，R.J.etal，Molecular and Cellular Biology 5，1750-1759，1985；Pavlakis G.N.and Hamer，D.H.，Proceedings of the National Acdemy of Sciences(USA)80，397-401，1983；Goddel，D.V.etal.，European PatentApplication No.0093619，1983)。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，VZV IEP 175蛋白質(zhì)在CHO細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)IEP 175蛋白質(zhì)，優(yōu)選采用Tad表達(dá)質(zhì)粒。在此系統(tǒng)中，表達(dá)暗盒(包含VZV蛋白質(zhì)編碼順序)被可操作地連接于勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子上。該載體含有足夠量的細(xì)菌DNA，得以在大腸桿菌或其它適合的原核宿主中繁殖。這種穿梭載體還含有足夠的真核DNA側(cè)接于VZV編碼順序上，以便可重組到真核宿主的基因組內(nèi)并使用氨甲蝶呤作選擇劑擴(kuò)增整合的DNA。
優(yōu)選RSV啟動子，因?yàn)榕c其它啟動子相比，它在啟動轉(zhuǎn)錄上是有很高效率的。
優(yōu)選CHO DHFR細(xì)胞，因其對氨甲蝶呤敏感。
通過常規(guī)蛋白分離技術(shù)，例如選擇性沉淀、吸收光譜，和親和層析包括單克隆抗體親和柱層析將VZV IEP 175蛋白質(zhì)或衍生物從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化出來。
本發(fā)明還涉及含有免疫保護(hù)量之本發(fā)明VXV IEP 175蛋白質(zhì)的疫苗。術(shù)語“免疫保護(hù)”是指足夠量的VZV IEP 175蛋白質(zhì)，當(dāng)施用于人時，足以避免或減輕疾病的產(chǎn)生保護(hù)性抗體或抗繼后VZV感染的免疫反應(yīng)。
因此，本發(fā)明提供了包含與藥用載體、賦形劑或稀釋劑混合之VZV IEP 175或其衍生物的疫苗制劑。
本發(fā)明的疫苗另外還含有其它抗原成分諸如VZV gpI、gpII、gpIII、gpIV和gpV或其截短的衍生物。特別是含有歐洲專利申請公開EP-A-0405867號中公開的截短之gpI，gpII或gpIII。本發(fā)明的最佳方案提供了含有與IEP 175或其衍生物結(jié)合的無錨地gpII組合物。EP-A-0405867號中公開的截短之gpII的疫苗組合物。
術(shù)語“無錨地”是指VZV糖蛋白衍生物基本上沒有所有的C末端錨地區(qū)域，且當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)時可以被分泌出來。這些蛋白描述在EP-A-0405867中。
在另一實(shí)施方案中，提供了包含融合蛋白質(zhì)的疫苗，該融合蛋白質(zhì)含有包容IEP 175或衍生物的氨基酸順序，以及包含gpI，gpII，gpIII，gpIV或gpV或其衍生物之一的氨基酸順序。
再一個實(shí)施方案中，涉及到VZV IEP 175或其衍生物在制造用于治療或預(yù)防VZV感染之疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了用于醫(yī)藥的VZV IEP 175或其衍生物。本發(fā)明的再一個方面提供了治療對VZV感染敏感或患有VZV感染之病人的方法。它包括使用安全且有效量的根據(jù)本發(fā)明的疫苗。
各疫苗劑量中蛋白質(zhì)的量是作為能在典型接種者中誘導(dǎo)無明顯不利副作用之免疫保護(hù)性反應(yīng)的量而選擇的。此量將根據(jù)所使用的特定免疫原和其怎么提供而有所不同。通常，期望各劑量含1-1000μg蛋白質(zhì)，優(yōu)選2-100μg，最優(yōu)選4-40μg。特定疫苗的最佳量可由涉及在被試對象身上觀察到的適當(dāng)免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)來確定。初始接種后，被試者可接受一次或幾次有足夠間隔的加強(qiáng)免疫接種。
為防止或顯著降低帶狀皰疹的復(fù)發(fā)、發(fā)作次數(shù)、嚴(yán)重程度或持續(xù)時間，除了給對VZV感染敏感的人進(jìn)行免疫接種外，本發(fā)明的藥用組合物還可用于處置、免疫治療患有VZV感染的病人。
本發(fā)明的疫苗中可直接使用ZVZ IEP 175蛋白質(zhì)的水溶液。另外，可將凍干或未預(yù)先凍干的VZV IEP 175蛋白質(zhì)混合在一起或與任何各種已知佐劑相混合。這些佐劑包括但不只限于氫氧化鋁，胞壁酰二肽和皂甙如OuiaA，特別是QS21或3脫?；?磷酰酸酯A(3D-MPL)。作為另一可替代的例子，可將該蛋白質(zhì)包裹于微顆粒如脂質(zhì)體中。在另一標(biāo)準(zhǔn)替代中，VZV IEP 175蛋白質(zhì)可被結(jié)合在免疫刺激性大分子上，如殺死的博德特氏桿菌或破傷風(fēng)類病毒上。
疫苗制備一般地描述于New Trends and Developments in Vaccines.Voller et al.(eds)，University Park Press，Baltimore，Maryland，1978中。在脂質(zhì)體中膠囊包裹由Fullerton在美國專利4,235,877中作了描述。將蛋白質(zhì)結(jié)合到大分子上公開于，例如，Likhite的美國專利4,372,954和Armor等的美國專利4,474,757中。Quil A的應(yīng)用已由Dalsgaard等人在Acta Vet Scand，18349(1977)中公開。3D-MPL可從Ribiimmunochem，USA得到，并公開于英國專利申請2,220211號和美國專利4912094號中。QS21公開于美國專利4,057,540號中。
下列實(shí)施例說明但不是限定本發(fā)明。限制性內(nèi)切酶或其它試劑基本上按照Vendors的說明書使用的。
實(shí)施例1在用牛痘病毒重組體感染的細(xì)胞中表達(dá)IEP 175VZV基因組DNA是從回收于水痘病人體內(nèi)的病毒中提取的(材料由Dr.Rentier(Institut de Pathologie，Univesite de Liege Sart-Tilman，Liege，Belgium)提供)。
用EcoRI消化病毒DNA并分離約16.6Kb片段，其相當(dāng)于堿基100441至117034(Davisionetal，J.Gen.Virology，67，1759-1816，1986)，然后克隆到質(zhì)粒pUC9(一種標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌克隆載體)的EcoRI位點(diǎn)中。由此質(zhì)粒分離～7Kb SspI片段(102241至109293)并克隆到pUS19的incil位點(diǎn)中以產(chǎn)生質(zhì)粒PNIV2017。該質(zhì)粒編碼完整的IEP 175蛋白質(zhì)加上5 ′和3 ′未轉(zhuǎn)譯DNA。
然后用一套限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒pNIV2017。產(chǎn)生三個片段編碼蛋白質(zhì)N末端部分的有2199個堿基對的BstXI-BamHI片段、編碼蛋白質(zhì)C末端部分的1002個堿基對的BamIH-PpumI片段和728個堿基對的PpumI-MaeIII片段。將合成寡核苷酸加到這些片段上以產(chǎn)生由獨(dú)特限制性位點(diǎn)側(cè)接的編碼暗盒。將該編碼暗盒引入pUC19中儲存(質(zhì)粒pNIV2020)。進(jìn)一步確定寡核苷酸及其相鄰部分的順序。從pNIV2020中回收IEP 175編碼暗盒，然后插入轉(zhuǎn)移載體pULB5213(一種由Chakrabarti等描述的質(zhì)粒pSC11的衍生物(Molecular and CellularBiology 5,3403,3409，1985))中。最終構(gòu)建體pNIV2026示于圖2中。
將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pNIV2026轉(zhuǎn)染到牛痘病素感染的CV-1細(xì)胞中并在Bromo-Uridine篩選后分離重組病毒，并根據(jù)其在有X-gal存在時呈現(xiàn)的蘭色進(jìn)行噬斑純化。將其稱為VV 2026。對RAIZ工細(xì)胞的噬斑分析最好使用人H143成纖維細(xì)胞TK-細(xì)胞株。用于感染細(xì)胞的牛痘病毒為WR型(來源自Borgsiewicz L.K.)。步驟與前述獲得牛痘病毒重組體的步驟相同(Meckett，M.and Smith，G.L.，J.Gen，Virology 67，2067-2082，1986；Mackett，M.，Smith，G.L.and Moss，B.，J.Virology 49，857-864,1984)。
用重組牛痘病毒VV2026，以1(Moil)感染多重性感染培養(yǎng)物中的CV-1細(xì)胞。感染后16和17小時收集感染的細(xì)胞(約3×105個/每次測定)和使用過的培養(yǎng)基(約2ml)。經(jīng)Westem吸印試驗(yàn)鑒定IEP 175蛋白質(zhì)的存在。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分辨蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上并用抗IEP 175氨基酸順序衍生(αα 1299至1310)之合成肽的小鼠血清探查之。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用結(jié)合到堿性磷酸酶上的羊抗小鼠IgG和適當(dāng)?shù)纳孜餀z測復(fù)合物。
結(jié)果表明VV2026感染的細(xì)胞能有效地在細(xì)胞質(zhì)中積聚IEP175，但不能將它輸出到培養(yǎng)基中。重組蛋白質(zhì)大小約為150K。
a)PNIV 2026之DNA插入物的結(jié)構(gòu)描述于圖2中。
實(shí)施例2在重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)IEP 175鑒于生產(chǎn)出大量的重組IEP 175蛋白質(zhì)，我們采用了以桿狀病毒和在培養(yǎng)基中的混蟲細(xì)胞為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)。
從質(zhì)粒pVIV2020開始，用EcoRI和XbaI消化以回收編碼IEP 175的盒暗，并以鈍端插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAcYMI中，質(zhì)粒pAcYMI預(yù)先用BanHI切成平頭。因此所得的重組質(zhì)粒pNIV2038，在多角體啟動子的控制下并以正確的方向載帶編碼IEP 175的順序(圖3)。
質(zhì)粒pAcYMI是含有來自AcMNPY基因組(它包括多角體基因啟動子，但不包括多角體基因)的順序和來自高拷貝細(xì)菌質(zhì)粒pUC8的順序的桿狀病毒穿梭載體。參見Matauura et al，J.Gen.Virol. 68，1233-1250(1987)。
按公開的程序(Summer et al.，TAES Bulletin NR 1555，May 1987；Texas Agricultural Experimental Station)，與野生型DNA桿狀病毒共轉(zhuǎn)染，將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pNIV2038引入Spodoptera frugiperda(Sf9)昆蟲細(xì)胞中，各自的比例為50比1μg。Spodoptera frugiperda細(xì)胞(Sf9)可從ATCC(Rockville，Md，USA)得到。
收集上清液得到所產(chǎn)生的病毒顆粒。然后在噬斑檢測中，用含該病毒的培養(yǎng)基感染Sf9細(xì)胞。分離并純化出幾種重組桿狀病毒。然后用它們感染培養(yǎng)基中的Sf9細(xì)胞。感染后的不同時間內(nèi)回收被感染細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，采用對IEP 175具特異性的小鼠抗肽血清(參見上文)，用Western吸印法檢測IEP 175的存在。在所有情況下，我們都不能證明在此系統(tǒng)中有完整IEP 175的表達(dá)。但我們觀察到多種截短形式之蛋白質(zhì)的表達(dá)，表明在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生廣泛的蛋白水解降解作用。
重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pNIV2038描述于圖3中。
實(shí)施例3
在CHO細(xì)胞中表達(dá)IEP 175為了試驗(yàn)附加的表達(dá)系統(tǒng)以獲得IEP 175的大量表達(dá)，我們轉(zhuǎn)向CHO系統(tǒng)。
從質(zhì)粒pNIV2020開始，分離PstI(已切成平頭)-PvuII 3946 bp片段并插入質(zhì)粒TDN的BgIII(已切成平頭)和EcoRV位點(diǎn)之間，制成pNIV2042。質(zhì)粒TDN描述于Connors等人的DNA，765-661(1988)一文中。它攜帶RSV LTR啟動子、G418擇標(biāo)志和DHFR擴(kuò)增暗盒。pNVI12042編碼組織血纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA)的信號肽，接著是相應(yīng)于成熟tPA之N末端氨基酸殘基的4個氨基酸殘基，然后接著IEP 175天然的起始蛋氨酸和該蛋白質(zhì)的完整順序(圖1)。
通過電穿孔將質(zhì)粒pNIV2042引入CHO dhfr-細(xì)胞。用geneticin(G418)選擇重組細(xì)胞系并用氨甲碟呤進(jìn)行擴(kuò)增。所有的步驟均按Moguilevsdy等人(Eur.J.Biochem 197，605-614，1991)描述的步驟進(jìn)行。
采用上述系統(tǒng)獲得G418R克隆并檢測全長度IEP 175蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。顯示出產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的克隆用不同濃度(5至50nM)的氨甲蝶呤擴(kuò)增并重新檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)率。結(jié)果表明IEP可有效地在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生，即它可在細(xì)胞質(zhì)中積聚且其表觀分子量為大約175千道爾頓。與昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中觀察到的結(jié)果相反，在CHO表達(dá)系統(tǒng)中沒有蛋白水解降解作用。用50nM氨甲蝶呤擴(kuò)增后獲得最佳生產(chǎn)克隆18.5.22。用涉及兩種對蛋白質(zhì)(肽1299至1310和肽175-436)具有特異性的小鼠抗肽血清監(jiān)測IEP 175的產(chǎn)生。如上所述用Western吸印分析法確定重組IEP 175的結(jié)構(gòu)完整性。出乎預(yù)料的是，盡管IEP 175的DNA上存在信號肽順序，但重組IEP 175并沒有被分泌到CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中。
CHO細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒pNIV2042描述于圖4中。
為了證實(shí)該重組IEP蛋白質(zhì)不僅結(jié)構(gòu)上適合，而且還顯示有天然蛋白質(zhì)的已知調(diào)節(jié)功能，我們進(jìn)行了如下試驗(yàn)(參見Jackersetal.1992；Linyetal.1992)。
用一套攜帶各種VZV啟動子DNA順序上游至報導(dǎo)基因氯霉素?；D(zhuǎn)移酶(CAT)之編碼順序的質(zhì)粒經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染表達(dá)IEP 175蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞(克隆18-5-22)和對照組CHO細(xì)胞。(上述質(zhì)?？傻米訮rofesseus B.Rentier，Istitut de Pathologie，Universite de Liege，Sart-Tilman，Liege，Belgium)。然后檢測所得被轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的酶促活性(CAT)，該酶促活性檢測法用于檢測IEP 175對VZV啟動子功能的潛在激活效果。
表1概括了這些試驗(yàn)的結(jié)果。由表中可見，CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的IEP 175蛋白質(zhì)，在幾種情況下能刺激啟動子活性。這表明重組IEP 175蛋白質(zhì)在此方面與其天然等同物的行為一樣。
表1用重組IEP 175功能性激活VZV啟動子成分(用CAT活性檢測法)由基因衍生的VZV啟動子成分 CHO細(xì)胞系對照 克隆18-5-22 結(jié)論無啟動子 - -CMV啟動子 +++ +++ 固有基因29(MDBP) - +++ 激活ORF4 +++ +++ 不激活+++ 強(qiáng)CAT活性；MDBP 主DNA結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)Po1RNA 聚合酶-沒有CAT活性實(shí)施例4構(gòu)建編碼缺乏親核特型之可分泌性IEP 175蛋白質(zhì)的DNA4a.質(zhì)粒pNIV2020(見實(shí)施例1)攜帶編碼完整IEP 175蛋白質(zhì)的順序，并包括兩個親核特型。它們具有下列氨基酸順序，特型1包含在氨基酸殘基226和254之間且含有親核氨基酸節(jié)段KSPKKKTLKVK；特型2包含在氨基酸殘基648和733之間且含有親核氨基酸節(jié)段PRKRKS。
用a)AatII和SphI，b)PpumI和BstEII消化pNIV2020，適當(dāng)?shù)匦蕹善筋^，連在一起以重新構(gòu)建缺乏含親核特型之DNA順序的質(zhì)粒(圖5)。
4b.回收編碼所得截短之IEP 75的暗盒并插入質(zhì)粒下游至指定tPA信號的順序。方式如實(shí)施例3所述。
用所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，可使IEP 175以可分泌的形式表達(dá)。
實(shí)施例5IEP 175 gcII融合體的構(gòu)建將4b中所述的片段作為融合體下游至編碼gcII的順序(EP-A-405867)插入質(zhì)粒。用所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，使之能夠表達(dá)IEP 175截短gcII的截短融合體蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種VZV IEP 175的生理學(xué)功能衍生物，它在表達(dá)后可由宿主分泌。
2.權(quán)利要求1的衍生物，其中缺失了親核區(qū)(Karophillic domains)。
3.權(quán)利要求1或2的衍生物，其中缺失了氨基酸226-257和648-733。
4.如權(quán)利要求1、2或3的衍生物，該衍生物是一種融合蛋白質(zhì)，它包含缺失了親核區(qū)并與第二種VZV蛋白融合的IEP 175衍生物。
5.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求的可分泌衍生物的方法，它包括用編碼所述衍生物的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并從上清液中收集該衍生物。
6.一種疫苗組合物，它包含與可藥用賦形劑、稀釋劑或載體混合的權(quán)利要求1-4的衍生物。
7.用作藥物的權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求的VZV IEP 175衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了生產(chǎn)水痘帶狀皰疹病毒前早蛋白質(zhì)175及其衍生物的方法。
文檔編號C12N15/63GK1189538SQ9711402
公開日1998年8月5日 申請日期1997年6月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月27日
發(fā)明者P·雅各斯, M·馬莎爾, M·豪蒙特, A·彼倫 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司