專利名稱：自我增強的藥物學(xué)上可控制的表達系統(tǒng)的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及含有至少一個與至少一個結(jié)構(gòu)基因和至少一個轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因偶聯(lián)的調(diào)節(jié)序列的自我增強的核酸構(gòu)建體。
盡管基因治療中采取了各種途徑，至今得到的預(yù)臨床和臨床研究的結(jié)果表明兩個基本的問題仍未解決。一個是由于細胞內(nèi)的中止過程，不能從體外或體內(nèi)的靶細胞充分地進行轉(zhuǎn)基因表達。第二個是轉(zhuǎn)基因表達的不適當?shù)目刂啤?br> 在嘗試糾正現(xiàn)有技術(shù)的這些缺點時，Rivera等(自然醫(yī)學(xué)2，1028(1996))，Belshaw等(PNAS USA 93,4604(1996))和Ho等(自然382,822(1996))已經(jīng)開發(fā)了第一個外部控制轉(zhuǎn)基因表達的技術(shù)。這些途徑的基礎(chǔ)是加入活性化合物納巴霉素，該化合物將兩個亞基偶聯(lián)在一起。得到的偶聯(lián)產(chǎn)物的作用是轉(zhuǎn)錄因子。第一個亞基構(gòu)成在DNA結(jié)合蛋白和FK506結(jié)合蛋白(FKBP)之間形成的融合蛋白，該蛋白也結(jié)合納巴霉素。第二個亞基是在也結(jié)合納巴霉素的蛋白質(zhì)FRAP和轉(zhuǎn)錄因子蛋白NF-kB的活性序列之間形成的融合蛋白。
由這兩個亞基與納巴霉素偶聯(lián)產(chǎn)生的功能轉(zhuǎn)錄因子蛋白依次激活轉(zhuǎn)移基因的序列以激活結(jié)構(gòu)基因。
該外部途徑的優(yōu)點在于結(jié)構(gòu)基因的表達可以通過分別加入或除去活性化合物納巴霉素打開或關(guān)上。但是該途徑不能解決結(jié)構(gòu)基因不適當表達的問題。因而，仍然需要提高轉(zhuǎn)基因表達的途徑。
本發(fā)明的概述本發(fā)明通過提供核酸構(gòu)建體，含有該構(gòu)建體的組合物和利用它們獲得高轉(zhuǎn)基因表達的方法滿足了本領(lǐng)域未滿足的需要。本發(fā)明通過在核酸構(gòu)建體本身內(nèi)摻入陽性反饋系統(tǒng)來完成。本文將得到的系統(tǒng)稱為“自我增強表達系統(tǒng)”。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供的核酸構(gòu)建體包括至少一個編碼活性化合物的第一個結(jié)構(gòu)基因；至少一個編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的第二個結(jié)構(gòu)基因；和至少一個由至少一個與轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合的序列和至少一個啟動子序列組成的活化序列；其中每個活化序列激活結(jié)構(gòu)基因的表達和轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供的核酸構(gòu)建體包含至少一個編碼活性化合物的第一個結(jié)構(gòu)基因；至少一個編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的第二個結(jié)構(gòu)基因；和至少一個由至少一個與所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合的序列和至少一個藥物學(xué)控制單位組成的活化序列，該藥物學(xué)控制單位依次包括，至少一個啟動子，至少一個編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活化區(qū)和編碼偶聯(lián)物質(zhì)蛋白的融合蛋白基因，至少一個啟動子，至少一個編碼DNA結(jié)合蛋白和編碼第二個偶聯(lián)物質(zhì)蛋白的融合蛋白基因，和至少一個含有DNA結(jié)合蛋白位點的活化序列，其中每個活化序列激活結(jié)構(gòu)基因的表達和轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達。
仍然是本發(fā)明的另一個實施方案中，提供的核酸構(gòu)建體包括至少一個編碼活性化合物的第一個結(jié)構(gòu)基因；至少一個編碼至少一個含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活化區(qū)和結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)的序列的第一個融合蛋白的第二個結(jié)構(gòu)基因；至少一個編碼至少一個含有結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)的蛋白和DNA結(jié)合蛋白的第二個融合蛋白的第三個結(jié)構(gòu)基因；至少一個由至少一個結(jié)合所述的通過偶聯(lián)物質(zhì)與所述的第一個融合蛋白偶聯(lián)的第二個融合蛋白結(jié)合的序列和至少一個啟動子序列組成的活化序列；其中每個活化序列激活至少一個所述結(jié)構(gòu)基因的表達。
在閱讀了本說明書和附加的權(quán)利要求后，其它實施方案對技術(shù)人員將是容易明白的。
自我增強表達系統(tǒng)在它的最簡單的實施方案中，新的自我增強表達系統(tǒng)包括下面成份a)至少一個序列a)和/或a’)以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)，b)至少一個啟動子序列b)和/或b’)，c)至少一個編碼活性化合物的結(jié)構(gòu)基因c)，和d)至少一個編碼結(jié)合成份a)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的基因。
依照本發(fā)明，成份a)和/或a’)和b)和/或b’)構(gòu)成激活結(jié)構(gòu)基因c)的轉(zhuǎn)錄和激活轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的表達的序列。
在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選形式中，這些成份可以如

圖1描述排列。
結(jié)合序列a)和a’)可以是相同的或不同的，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子d)。
啟動子序列[成份b)和b’)]可以相同或不同。啟動子序列b)和b’)的低水平活化導(dǎo)致低水平地表達結(jié)構(gòu)基因[成份c)]和轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)[成份d)]的基因的低水平表達。由此制造的轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)依次結(jié)合于結(jié)合序列[成份a)和a’)]。這一結(jié)合依次激活啟動子序列b)和b’)，引起結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的基因的增強表達。這一增強表達本身導(dǎo)致更大量的轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)，反饋和進一步刺激該系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明，可以在結(jié)構(gòu)基因的3’末端用編碼核輸出信號(NES)和核輸出因子(NEF)的基因補充(即，“附加”在上游末端)如圖1描述的成份的排列。NEF的表達是在附加的啟動子(成份b)的控制下的。該附加啟動子序列可以與圖2顯示的活化序列[成份a)和b)和/或a’)和b’)]的任何部分相同或不同。
核輸出信號(NES)是妨礙與它連接的前信使RNA運輸通過核膜的核苷酸序列。因此NES獨立地構(gòu)成核滯留信號(NRS)。但是，如果NRS結(jié)合本文稱為“核輸出因子”或“NEF”的輸出蛋白，NRS就獲得NES的功能。這是因為核輸出因子(NEF)介導(dǎo)含NES的前信使或信使RNA運出細胞核并進入細胞質(zhì)的運輸。因此如Fischer等，細胞82，475(1995)所述通過與NEF結(jié)合，含NES的前信使或信使RNA被分泌出細胞核。
根據(jù)本發(fā)明，成份c)和d)也可以通過內(nèi)部核糖體入口位點(IRES)而不是通過與成份a’)和b’)鍵合彼此連接(即，“相互連接”)。這樣的IRESs導(dǎo)致以IRES方式彼此連接的兩個DNA序列的表達。
例如，如圖3描述可以實現(xiàn)以IRES方式的連接。
這樣的排列也在同樣的程度上保證了當對啟動子序列b)進行低水平激活時，也可以通過IRES序列表達轉(zhuǎn)錄因子蛋白[成份d)]的基因。這一表達發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因[成份c)]被表達時。另外，轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合結(jié)合序列a)，該結(jié)合序列增強啟動子序列b)的活化，增強結(jié)構(gòu)基因c)的表達和，又一次通過IRES序列也增強轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)基因的表達。
根據(jù)本發(fā)明，圖1-3描述的各個成份的排列是如圖4顯示起操作作用的自我增強的表達系統(tǒng)。通過將幾個相同或不同的結(jié)構(gòu)基因[成份c)，c’)和c”)]的序列排列在一起使自我增強表達系統(tǒng)得到伸展。通過相同或不同的IRES序列或通過結(jié)合序列a)，啟動子序列b’)和啟動子序列b”)將這些結(jié)構(gòu)基因互相連接起來。圖5描述了一個代表性的排列。通過將幾個相同或不同的轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)[成份d)，d’)和d”)]的基因排列在一起也可以使自我增強表達系統(tǒng)得到伸展。圖6顯示了一個代表性的例子，它指出了通過IRES序列的連接?？蛇x擇地，IRES序列可以是相同的序列。
結(jié)合序列a)優(yōu)選地是所有活化序列中的一種類型。所有轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)，d’)和d”)應(yīng)與該結(jié)合序列結(jié)合。當結(jié)合序列不是同一類型(如，當成份a與成份a’不同時)，則轉(zhuǎn)錄因子蛋白[成份d)，d’)和d”)]應(yīng)與所有結(jié)合序列結(jié)合。優(yōu)選地設(shè)計或選擇活化序列使它們被所有轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)，d’)和d”)的產(chǎn)物識別。
以圖2顯示的同樣方式，用編碼核輸出信號(NES)和核輸出因子的基因可以補充圖3的成份。圖7顯示了結(jié)構(gòu)基因[成份c)]的3’末端帶有NES基因和帶有NEF基因的這一排列。在這個最后的例子中，通過其它啟動子序列成份b)獨立地將NEF激活。成份b序列可以與成份a)和b)相同或不同。
藥物學(xué)上可控制的啟動子單位以最簡單的形式，新藥物學(xué)可控制啟動子單位(“藥物學(xué)控制單位”)包括下面成份e)至少一個啟動子序列，f)至少一個編碼融合蛋白f)的基因，該融合蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活化區(qū)和結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]的蛋白質(zhì)A，g)至少一個其它的啟動子序列[相同或不同于成份e)]或至少一個IRES，h)至少一個編碼融合蛋白h)的基因，該融合蛋白包括DNA結(jié)合區(qū)和結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]的蛋白質(zhì)B，i)至少一個含有結(jié)合融合蛋白h)的位點的活化序列，和j)至少一個包括融合蛋白f)[成份f)的表達產(chǎn)物]中的結(jié)合蛋白A的位點A)和融合蛋白h)[成份h)的表達產(chǎn)物]中的結(jié)合蛋白B)的位點B)的偶聯(lián)物質(zhì)j)。
成份e-i)可以根據(jù)如圖8所示方案成序列地排列。這一排列保證當啟動子序列e)和g)激活時，表達融合蛋白f)和h)[成份f)和h)]。當存在偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]時，兩個融合蛋白彼此連接(“相互連接”)形成功能轉(zhuǎn)錄因子蛋白以激活活化系列[成份i)]。在本發(fā)明的這一實施方案中，在存在偶聯(lián)物質(zhì)如成份j)時，由單個成份組成的啟動子單位起作用。該單位在附加了偶聯(lián)物質(zhì)成份j)的基礎(chǔ)上變成有功能。圖9顯示了這一實施方案的例子。
自我增強的，藥物學(xué)上可控制的表達系統(tǒng)自我增強的表達系統(tǒng)可以與藥物學(xué)上可控制的啟動子單位組合。通過例如在自我增強表達系統(tǒng)(參見圖1，2，3或7)中插入藥物學(xué)上可控制的啟動子單位[成分e)到i)]代替啟動子系列(成份b)和/或b’))就實現(xiàn)這種組合。通過圖10中的例子說明了這一組合的核苷酸序列的構(gòu)建。在該例子中，結(jié)構(gòu)基因只在融合蛋白f)和h)[成份f)和h)的表達產(chǎn)物]被偶聯(lián)物質(zhì)成份j)連接時轉(zhuǎn)錄形成轉(zhuǎn)錄因子蛋白。
可替代地，或附加地，藥物學(xué)上可控制的啟動子單位可以插入到自我增強表達系統(tǒng)替代轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基因[成份d)]，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的序列[成份a)]和啟動子序列b)[成份b)]。在這種情況下，至少應(yīng)該將結(jié)合成份h)位點的5’末端連接于啟動子序列e)和g)中的一個上。圖11例舉了這一組合核苷酸序列的構(gòu)建。
自我增強系統(tǒng)也可以以其它方式與藥物學(xué)上可控制的啟動子單位組合。例如，圖8顯示了藥物學(xué)上可控制的啟動子單位可以替代NEF的啟動子序列(成份b))(參見圖2或7)。圖12顯示了構(gòu)建這一核苷酸序列的一個方式。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體有利的是由DNA組成。術(shù)語“核酸構(gòu)建體”指含有核酸并可以在靶細胞中轉(zhuǎn)錄的人工結(jié)構(gòu)。核酸構(gòu)建體有利的是能插入載體中。在本文中，質(zhì)粒載體或病毒載體是特別如人所愿的。
根據(jù)啟動子序列的選擇，一個新核酸構(gòu)建體可以非特異地用于表達結(jié)構(gòu)基因[成份c)]?？商娲兀ㄟ^細胞特異性，病毒特異性，特定條件，或細胞周期條件可進一步控制表達。結(jié)構(gòu)基因優(yōu)選地編碼藥物學(xué)活性化合物或切割藥物的非活性前體形成活性藥物的酶。進一步可以設(shè)計結(jié)構(gòu)基因表達酶-配體融合蛋白。在這種情況下，配體可以結(jié)合到細胞表面。在本文中最優(yōu)選的是結(jié)合到增殖的內(nèi)皮細胞或腫瘤細胞表面的配體。
本發(fā)明還涉及含有新核酸構(gòu)建體的細胞，特別是酵母或哺乳動物細胞。在特別如人所愿的實施方案中，將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入通過偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]的加入或給藥轉(zhuǎn)染的細胞系。加入偶聯(lián)物質(zhì)刺激結(jié)構(gòu)基因的表達。含有這些結(jié)構(gòu)的細胞可用于制備藥物組合物。但是細胞也可以作為治療劑，或藥物組合物對病人給藥以治療疾病?？商娲?，新核酸構(gòu)建體可以摻入載體和直接地給藥，局部地或腸胃外地進入病人。在使用時，為特定的疾病設(shè)計構(gòu)建體，以致構(gòu)建體表達一種或多種防止或改善一種或多種疾病癥狀的蛋白質(zhì)或核酸。如技術(shù)人員所知，由給藥途徑，病人的狀態(tài)，疾病的性質(zhì)確定本文中所用的核酸構(gòu)建體的量。
在直接對病人給藥的情況中，為了表達結(jié)構(gòu)基因，偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]可以附加地給藥。如圖9所示，通過將融合蛋白f)與融合蛋白h)在轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)偶聯(lián)，偶聯(lián)物質(zhì)導(dǎo)致形成完全的轉(zhuǎn)錄因子蛋白。因此，只要體內(nèi)存在偶聯(lián)物質(zhì)轉(zhuǎn)染細胞只表達結(jié)構(gòu)基因。通過施用偶聯(lián)物質(zhì)可以控制表達的持續(xù)性和強度。
結(jié)果是，隨著藥物的供應(yīng)，包括通過施用偶聯(lián)物質(zhì)，在靶細胞中導(dǎo)入核酸構(gòu)建體和以非特異的，特異于病毒的或特異于靶細胞的和/或特異于細胞周期的方式表達構(gòu)建體，新核酸構(gòu)建體的優(yōu)選用途包含于疾病的治療中。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以用于通過細胞內(nèi)合成的方式制備藥物組合物。在本文中，用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細胞。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細胞，得到細胞的克隆，從而產(chǎn)生多拷貝的DNA構(gòu)建體。優(yōu)選地，利用基因擴增增加每個細胞中的DNA構(gòu)建體的拷貝數(shù)。在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞得到多拷貝的DNA構(gòu)建體后，可以從培養(yǎng)細胞中純化DNA構(gòu)建體。大腸桿菌是優(yōu)選的得到多拷貝的DNA構(gòu)建體的培養(yǎng)細胞。通過與其它物質(zhì)如本領(lǐng)域已知的緩沖液，鹽，或其它賦形劑混合可以將純化的DNA用作藥物組合物中的成份。
在自然界中，新核酸構(gòu)建體不以這種形式，即活性化合物或酶或配體/酶融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因不是天然地與新核酸序列組合形成自我增強的表達系統(tǒng)，存在。該系統(tǒng)也不天然地與藥物學(xué)上可控制的啟動子單位組合。
摻入自我增強的，藥物學(xué)上可控制的表達系統(tǒng)的優(yōu)選的結(jié)構(gòu)基因編碼藥物學(xué)活性化合物。這些活性化合物是從包括細胞因子，生長因子，受體細胞因子或生長因子，抗體或抗體片段，具有抗增殖或抑制細胞生長效應(yīng)的蛋白質(zhì)，血管生成抑制劑，誘導(dǎo)血栓形成的蛋白質(zhì)，血凝固抑制劑，血漿蛋白，補體活化蛋白，病毒和細菌包被物質(zhì)，激素，具有循環(huán)效應(yīng)的肽，神經(jīng)肽，酶和介導(dǎo)物的組中選擇的蛋白質(zhì)和糖蛋白和包含至少這些蛋白質(zhì)或糖蛋白中的兩個的融合蛋白。
自我增強的，藥物學(xué)上可控制的表達系統(tǒng)的成份的詳細敘述1)自我增強的表達系統(tǒng)的活化序列和轉(zhuǎn)錄因子蛋白在本發(fā)明的意義內(nèi)，轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)[成份d)的基因產(chǎn)物]特異地與相關(guān)的結(jié)合序列a)[成份a)]結(jié)合，其部分結(jié)合序列激活3’鄰接的啟動子序列b)(或b’或b”)。
所以，成份a)和成份b)構(gòu)成含有結(jié)合相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的序列的活化序列。
在另一方面，轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)必須含有特異于活化劑序列[成份a)]的對應(yīng)的結(jié)合序列的結(jié)合區(qū)，以及反式激活區(qū)。一個附加的核定位信號(NLS)促進與活化序列a)的相互反應(yīng)。
符合這一先決條件的核酸構(gòu)建體的實例是實施方案A)，包括1.活化序列，活化序列含有成份a)成份a)至少含有一個結(jié)合Gal4蛋白的序列[如，核苷酸序列5’-CGGACAACTGTT-GACCG-3’](Chasman和Kornberg，Mol.CellBiol.10,2916(1990))和在它的3’末端含有成份b)，成份b)含有基本的SV40啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，(1980)，紐約；冷泉港實驗室)，c-fos啟動子(Das等，自然374，657(1995))和在它的3’末端的HSV1 VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Treizenberg等，基因發(fā)展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5，190(1995))，U2snRNA啟動子和它的3’末端的HSV1 VP16 TAD或至少含有Oct-2的活化區(qū)(氨基酸438-479；Tanaka等，Mol.Cell Biol.14，6046(1994)；；Das等，自然374，657(1995))的序列或HSV TK啟動子(Papavassiliou等，J.Biol.Chem.265,9402(1990)；Park等，Molec.Endocrinol.7,319(1993))或另一個非特異的，特異于細胞的，特異于病毒的和特異于細胞周期的或可代謝激活的啟動子，和2.相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的基因[成份d)]含有Gal4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10.2916(1990))的cDNA，該cDNA的3’末端附著了SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))，該cDNA的3’末端附著了HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
實施方案B)含有1.含有成份a)的活化序列，成份a)至少含有一個結(jié)合LexA蛋白的序列[如，核苷酸序列5’-TACTGTATGTACA-TACAGTA-3’][LexA操縱子；Brent等，自然612，312(1984)]和在它的3’末端的成份b)，成份b)含有SV40基本啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，(1980)紐約；冷泉港實驗室)或另一個啟動子(參見實施方案A)，和2.被接納的轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的基因[成份d)]，該基因含有LexA蛋白的DNA結(jié)合區(qū)(氨基酸1-81；Kim等，科學(xué)255，203(1992))或整個LexA蛋白(氨基酸1-202；Brent等，細胞43，729(1985))的cDNA，該cDNA的3’末端附著了SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS 16，478(1991))，該cDNA的3’末端附著了HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展，2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5，190(1995))。
實施方案C)含有1.含有成份a)的活化序列，成份a)至少含有一個結(jié)合lacI阻遏蛋白的lac操縱子序列(如，核苷酸序列5’-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3’)(Fuerst等，PNASUSA86，2549(1989)；Simons等，PNASUSA81，1624(1984))和它的3’末端的成份b)，成份b)含有SV40基本啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，紐約，(1980)冷泉港實驗室)或另一個啟動子(參見實施方案A)，和
2.被接納的轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的基因[成份d)]，該基因含有l(wèi)ac阻遏(lacI)蛋白的cDNA(Brown等，細胞49，603(1987)；Fuerst等，PNASUSA86，2549(1989))，該cDNA的3’末端附著了SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))，該cDNA的3’末端附著了HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展，2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
實施方案D)含有1.含有成份a)的活化序列成分a)至少含有一個結(jié)合四環(huán)素阻遏(tetR)蛋白的四環(huán)素操縱子(tetO)序列(如，核苷酸序列5’-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3’)和它的3’末端的成份b)，成份b)含有SV40基本啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，(1980)紐約，冷泉港實驗室)或另一個啟動子(參見實施方案A)和2.被接納的轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的基因[成份d)]，該基因含有四環(huán)素阻遏(tetR)蛋白的cDNA(Gossen等，PNAS USA89,5547(1992)；Dingermann等，EMBOJ.11,1487(1992))和它的3’末端的SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展，2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
實施方案E)含有1.含有成份a)的活化序列成分a)至少含有一個結(jié)合ZFHD-1蛋白的序列(如核苷酸序列5’-TAATGATGGGCG-3’)(Pomerantz等，科學(xué)267，93(1995))和它的3’末端的成份b)，成份b)含有基本SV40啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，(1980)紐約，冷泉港實驗室)或另一個啟動子(參見實施方案A)和2.被接納的轉(zhuǎn)錄因子蛋白d)的基因[成份d)]，該基因含有ZFHD1蛋白的cDNA(Pomerantz等，科學(xué)267，93(1995))和它的3’末端的SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
2)藥物學(xué)上可控制的啟動子單位根據(jù)本發(fā)明，下面的基因是藥物學(xué)上可控制的啟動子單位的特異成份(參見圖8和9)對于融合蛋白f)[成份f)]轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活化區(qū)的基因，和至少一個結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)j)的蛋白質(zhì)A的基因，其中適當補充了核定位信號(NLS)。
對于融合蛋白h)[成份h)]至少一個結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)j)的蛋白質(zhì)B的基因和結(jié)合活化序列的DNA的蛋白質(zhì)的基因[成份i)]。
對于偶聯(lián)物質(zhì)成份j)至少含有一個結(jié)合蛋白質(zhì)A和結(jié)合蛋白質(zhì)B的位點。
對于成份i)，活化序列含有結(jié)合融合蛋白h)[成份h)]的位點和啟動子元件。
偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]的選擇不可避免地確定分別在成份f)和h)中的結(jié)合成份j)的蛋白質(zhì)A和B的特性。在本文中，在成份f)和h)中的結(jié)合成份j)的蛋白質(zhì)A和B可以是相同的或不同的。特別當偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]具有幾個相同結(jié)合位點時可以利用相同的結(jié)合成份j)的蛋白質(zhì)A和B。但是，在本發(fā)明的意義內(nèi)，不同的結(jié)合成份j)的蛋白質(zhì)A和B優(yōu)選的是在成份f)和h)中。
這意味著偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]與融合蛋白f)[成份f)]在不同于與融合蛋白h)[成份h)]結(jié)合的位點上結(jié)合，以致融合蛋白f)和h)不會互相競爭結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)。
可以利用已知結(jié)合特殊細胞蛋白的偶聯(lián)物質(zhì)，在藥物學(xué)上可控制的啟動子的成份f)和h)中可以利用細胞蛋白的基因。
但是，本發(fā)明還特別涉及利用結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)j)的單克隆抗體，和起源于它們的重組抗體，或它們的片段。在融合蛋白f)和h)[成份f)和h)]中插入這些單克隆抗體特別是它們的重組Fv片段構(gòu)成了本發(fā)明的特定特征。在本文中，在融合蛋白[成份f)和h)]中優(yōu)選地利用識別偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]上不同結(jié)合位點(分別是結(jié)合A和B的位點的表位)的重組Fv片段。
在本發(fā)明的意義內(nèi)，可以利用鼠的和人的單克隆抗體。鼠單克隆抗體優(yōu)選地以人源化形式使用。以Winter等(自然349，293(1991))和Hoogenbooms等(Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36,19(1993))敘述的方式實現(xiàn)人源化。根據(jù)目前的工藝水平，例如以Winter等，自然349，293(1993)；Hoogenboom等，Rev.Tr.Trahsfus.Hemobiol.36,19(1993)；Girol.Mol.Immunol.28，1379(1991)和Huston等，Int.Rev.Immunol.10,195(1993)敘述的方式制備抗體片段。
利用噬菌體顯示技術(shù)(Smith，科學(xué)228，1315(1985))可以直接從現(xiàn)存的雜交瘤制備或從鼠或人的抗體片段文庫分離(Winter等，Annu.Rev.Immunol.12，433(1994))重組抗體片段。然后將這些抗體片段直接在遺傳水平用于與其它蛋白質(zhì)或肽[與轉(zhuǎn)錄因子蛋白(成份f)的活化區(qū)或與結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)(成份h)]融合。
為了從雜交瘤制備重組抗體片段，通過分離mRNA，逆轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA并且然后利用分別與可變片段(Orlandi等，PNAS-USA86，3833(1989))的5’和3’末端互補的低聚核苷酸以聚合酶鏈反應(yīng)(Saiki等，科學(xué)230，1350(1985))的途徑擴增cDNA獲得編碼抗體的抗原結(jié)合區(qū)(VH和VL)的遺傳信息。然后將VH和VL片段例如以Fv片段(Skerra和Plückthun，科學(xué)240，1038(1988))，單鏈Fv片段(scFv)(Bird等，科學(xué)242，423(1988)；Huston等，PNAS-USA85，5879(1988))或Fab片段(Better等，科學(xué)240，1041(1988))的形式克隆進細菌表達載體。
利用噬菌體顯示技術(shù)也可以直接從鼠或人起源的抗體文庫(免疫文庫或天然文庫)分離新抗體片段。在抗體片段的噬菌體顯示中，以scFv片段(McCafferty等，自然348，552(1990))或Fab片段(Hoogenboom等，核酸研究，19，4133(1991)；Barbas等，PNAS USA88,7978(1991))的形式將抗原結(jié)合區(qū)克隆進噬菌體基因組(McCafferty等，自然348，552(1990))或噬菌體質(zhì)粒載體(Breitling等，基因104，147(1991))與絲狀細菌噬菌體的g3P包衣蛋白一起成為融合蛋白。在負載抗原的塑料接收器(鍋)(Marks等，J.Mol.Biol.222,581(1991))上，在與抗原結(jié)合的，順磁性珠(Hawkins等，J.Mol.Biol.226,889(1992))上或通過結(jié)合到細胞表面(Marks等，Bio/Technol.11,1145(1993))上篩選結(jié)合抗原的噬菌體。
通過PCR擴增來自免疫接種動物(Sastry等，PNAS-USA86,5728(1989)；Ward等，自然341,544(1989)；Clackson等，自然352,624(1991))或病人(Mullinax等，PNAS-USA87,8095(1990)；Barbas等，PNAS-USA88,7978(1991))的B淋巴細胞的可變抗體片段制備免疫文庫。為此，利用了特異于鼠(Orlandi等，PNAS-USA86,3833(1989)；Sastry等，PNAS-USA86,5728(1989))或人的免疫球蛋白基因(Larrick等，BBRC160，1250(1989))，或特異于人的免疫球蛋白基因家族(Marks等，Eur.J.Immunol.21,985(1991))的低聚核苷酸的組合。
利用非免疫接種供體作為免疫球蛋白基因的來源可以制備天然文庫(Marks等，J.Mol.Biol.222,581(1991))?？商娲?，免疫球蛋白種系基因可用于制備半合成抗體所有組成成分，而可變片段的互補決定區(qū)3通過利用簡并引物(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227,381(1992)；Barbas等，PNAS-USA89,4457(1992)；Nissim等，EMBOJ.13,692(1994)；Greffiths等，EMBO J.13,3245(1994))的PCR途徑得到擴增。與免疫文庫相比，所謂的單罐(single-pot)文庫具有的優(yōu)點是可以從一個單個文庫分離抗大量抗原的抗體片段(Nissim等，EMBOJ.13,692(1994))。
隨著通過任意的(Hawkins等，J.Mol.Biol.226,889(1992)；Gram等，PNAS-USA89,3576(1992))，基于密碼子的(Glaser等，免疫學(xué)雜志149,3903(1992))或位點特異性的誘變(Balint和Larrick，基因137,109(1993))的途徑，通過將單個區(qū)的鏈與天然所有組成成分的片段的鏈混合(Marks等，生物/技術(shù)10,779(1992))或通過利用細菌突變體菌株(Low等，J.Mol.Biol.260,359(1996))，并通過在嚴格條件下重選擇分離具有改良特性的抗體片段(Hawkins等，J.Mol.Biol.226,889(1992))，從預(yù)先存在的抗體片段中制備新文庫，仍然可以利用噬菌體顯示技術(shù)進一步提高抗體片段的親和性。另外，通過用人所有組成成分逐步替代可變區(qū)中的一個并且隨后利用原始抗體選擇(控制選擇)可以將鼠抗體片段人源化(Jespers等，Bio/Technol.12,889(1994))?？商娲?，通過用原始鼠抗體的對應(yīng)區(qū)特異地替代人抗體的超可變區(qū)可以將鼠抗體人源化(Jones等，自然321,522(1987))。
結(jié)果是，在本發(fā)明的意義內(nèi)，偶聯(lián)物質(zhì)基本包括能滲透進細胞的所有物質(zhì)。在本發(fā)明的意義內(nèi)，特別優(yōu)選的是那些已經(jīng)獨立地用作基因治療的藥品的偶聯(lián)物質(zhì)。
例如，這些偶聯(lián)物質(zhì)包括下面的偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]以及被接納的蛋白質(zhì)，它們結(jié)合特定的偶聯(lián)物質(zhì)并且為了分別表達融合蛋白f)和h)，它們的基因?qū)⒁徊迦氲匠煞輋)和h)中-偶聯(lián)物質(zhì)納巴霉素或納巴霉素類似物，如L685818(Becker等，J.Biol.Chem.268,11335(1993))，以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·FK506-結(jié)合蛋白(FKBP；Bierer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,9231(1990))·FKBP/納巴霉素相關(guān)蛋白，該蛋白結(jié)合納巴霉素/FKBP復(fù)合物，或它的結(jié)合納巴霉素/FKBP復(fù)合物的部分序列(FRAP；Brown等，自然369,756(1994)；Chui等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,12574(1994)；Sabatini等，細胞78,35(1994)；Sabers等，J.Biol.Chem.270,815(1995))。
·不利用FKBP和FRAP的基因，而利用結(jié)合納巴霉素和/或抑制FKBP或FRAP與納巴霉素的結(jié)合的重組Fv片段的基因。
-偶聯(lián)物質(zhì)FK506的二聚體(FK1012)(Spencer等，科學(xué)262,1019(1993)；Pruschy等，Chem.Biol.1,163(1994))以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·FK506-結(jié)合蛋白(FKBP，參見上面)；·calcineurin(Lin等，細胞66,807(1991))或它的結(jié)合FK506復(fù)合物的部分序列(Clipstone等，J.Biol.Chem.269,26431(1994))；和·抑制FK506與cakcineurin結(jié)合(Ho等，自然382,822(1996))并可以插入替代calcineurin基因的重組Fv片段的基因。
-偶聯(lián)物質(zhì)環(huán)孢菌素A的二聚體(Belshaw等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,4604(1996))以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)親環(huán)蛋白(Belshaw等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,4604(1996))；calcineurin或它的結(jié)合環(huán)孢菌素A/親環(huán)蛋白復(fù)合物(參見上面)的部分序列；和抑制環(huán)孢菌素A與親環(huán)蛋白的結(jié)合并且可以插入替代親環(huán)蛋白的基因的重組Fv片段的基因。
-偶聯(lián)物質(zhì)環(huán)孢菌素A的單體以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·親環(huán)蛋白；·結(jié)合親環(huán)蛋白/環(huán)孢菌素A復(fù)合物中的環(huán)孢菌素A的重組Fv片段的基因(Cacalano等，Molec.Immunol.29,107(1992))；·作為親環(huán)蛋白的替代，利用結(jié)合環(huán)孢菌素A的不同表位的不同重組Fv片段的基因(Vix等，蛋白質(zhì)15,339(1993)；Cacalano等，Mol.Immunol.29,107(1992)；Rauffer等，Molec.Immunol.31,913(1994))。
-偶聯(lián)物質(zhì)氨甲喋呤以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·抗氨甲喋呤的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Pimm等，Brit.J.Cancer61,508(1990)；Kato等，免疫方法雜志67,321(1984))；·抗喋啶基團的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Cot等，雜交瘤6,87(1987))；·抗苯基基團的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Cot等，雜交瘤6,87(1987))；和·二氫葉酸還原酶(Masters等，基因21,59(1983)；Swift等，Mol.Gen.Genetics 181,441(1981)；Goldsmith等，Mol.Cell Biol.6,878，(1986))。
-偶聯(lián)物質(zhì)慶大霉素以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·抗慶大霉素的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Sierra-Madero等，J.Clin.Microbiol.26,1904(1988)。
-偶聯(lián)物質(zhì)頭孢他啶以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·抗頭孢他啶的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Shimizu等，Int.Arch.Allergy Immunol.98,392(1992))。
-偶聯(lián)物質(zhì)頭孢氨芐以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·抗頭孢烯的C7位置的?；鶄?cè)鏈的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Nagakura等，Int.Arch.Allergy Applied Immunol.93,126(1990))。
-偶聯(lián)物質(zhì)葉酸以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·葉酸結(jié)合蛋白(Ratnam等，生物化學(xué)28,8249(1989)；Elwood，J.Biol.Chem.264,14893(1989)；Sadasivan等，Biochem.Biophys.Acta 1131,91(1992))；·抗葉酸的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Rayburn等，臨床化學(xué)，30,1007(1984))。
-偶聯(lián)物質(zhì)視黃酸以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·細胞的視黃酸結(jié)合蛋白的視黃酸結(jié)合區(qū)(Stoner等，癌癥研究49,1497(1989)；Eller等，臨床研究39,560A(1991))；和·抗視黃酸的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Twal等，生物學(xué)發(fā)展168,225(1995)；Zhou等，免疫方法雜志138,211(1991))。
-偶聯(lián)物質(zhì)青霉素以及下面的結(jié)合物質(zhì)(和它們的基因)·抗羥氨芐青霉素的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Mayorga等，Toxicol.97,225(1995)；Mayorga等，Int.Arch.Allergy AppliedImmunol.99,443(1992))；·抗芐青霉噻唑酰基團的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(de Haan等，Int.Arch.Allergy Applied Immunol.76,42(1985)；Fukushima等，Clin.Exp.Immun.68,427(1987))；·抗青霉素的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Sierra-Madero等，J.Clin.Microbiol.26,1904(1988))；和·青霉素結(jié)合蛋白(Popham等，細菌學(xué)雜志177,326(1995)；細菌學(xué)雜志176,7197(1994))。
-偶聯(lián)物質(zhì)4-羥基他莫昔芬或他莫昔芬以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·雌激素受體蛋白的雌激素結(jié)合區(qū)(Spreafico等，Eur.J.Pharmacol.227,353(1992)；Green等，自然320，134(1986))；和·抗雌激素受體/雌激素或4-羥基他莫昔芬復(fù)合物的抗體或抗體片段(重組Fv片段)(Giambiagi等，J.Steroid Biochem.30,213(1988)；Biochim.Biophys.Acta 883，559(1986)；Katzenellenbogen等，Biochem.26,2364(1987)；Tate等，乳腺癌研究以及治療3，267(1983))。
-偶聯(lián)物質(zhì)四環(huán)素以及下面的蛋白(和它們的基因)·四環(huán)素阻遏蛋白(Gossen等，PNASUSA89，5547(1992))；和·抗四環(huán)素的抗體或抗體片段。
-偶聯(lián)物質(zhì)四環(huán)素和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的結(jié)合物以及下面的結(jié)合蛋白(和它們的基因)·四環(huán)素阻遏蛋白(Gossen等，PNAS USA89,5547(1992))；和·lac阻遏(lacI)蛋白(Brow等，細胞49，603(1987))。
根據(jù)本發(fā)明，偶聯(lián)物質(zhì)[成份j)]結(jié)合蛋白A和B的基因-在融合蛋白f)[成份f)，蛋白質(zhì)A]中，與轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活化區(qū)的基因連接，和-在融合蛋白h)[成份h)，蛋白質(zhì)B]中，與DNA結(jié)合蛋白的基因連接，選擇該DNA結(jié)合蛋白使它與-活化序列[成份i)]特異地結(jié)合(參見圖8和9)。在本文中，“天然存在的蛋白質(zhì)”是在自然界中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。所以，來自“天然存在的蛋白質(zhì)”的結(jié)合區(qū)與人設(shè)計的結(jié)合區(qū)不同。從自然界發(fā)現(xiàn)和分離天然存在的蛋白質(zhì)?！敖Y(jié)合區(qū)”的核酸序列信息可以獨立地使用或與其它序列信息組合形成來自天然存在的蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)。
在本發(fā)明的意義內(nèi)，例如下面的序列可以用作成份f)中的活化區(qū)的核苷酸序列-皰疹病毒VP16反式激活區(qū)(Greaves等，病毒學(xué)雜志64,2716(1990)；65,6705(1991))；-NF-xB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的p65亞基(Schmitz等，EMBO J，10，3805(1991))；和-直接或間接地與Oct-2C末端脯氨酸豐富的Oct-2區(qū)連接的Oct-2N末端谷氨酰胺豐富的區(qū)(如，通過Gal4-結(jié)合蛋白)(Tanaka等，Mol.Cell Biol.14,6046(1994))。
例如，下面的可以用作融合蛋白h)[成份h)]中的DNA結(jié)合蛋白的核苷酸序列和用作為被接納的活化序列[成份i)]實施方案F)，包括1.在融合蛋白h)中的DNA結(jié)合蛋白的核苷酸序列，該序列包括·Gal4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1990))的cDNA和它的3’末端的SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
2.被接納的活化序列[成份i)]，該序列包括·至少一個結(jié)合Gal4蛋白的序列(如，核苷酸序列5’-CGGACAACTGTTCACCG-3’)(Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1989))和，它的3’末端的SV40基本啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，紐約；冷泉港實驗室)，或·c-fos啟動子(Das等，自然374,657(1995))和，它的3’末端的HSV1 VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))，或·U2 sn RNA啟動子和，它的3’末端的HSV1-VP16TAD或至少Oct-2活化區(qū)的序列(氨基酸438-479；Tanaka等，Mol.CellBiol.14,6046(1994)；Das等，自然374，657(1995))，或·HSV啟動子(Papavassiliou等，J.Biol.Chem.265,9402(1990)；Park等，Molec，.Endocrinol.7,319(1993))，或·任何其它能被非特異地，特異于細胞地，特異于病毒地和/或特異于細胞周期地激活的啟動子。
實施方案G)，包括1.在融合蛋白h)中的DNA結(jié)合蛋白的核苷酸序列，該序列包括·LexA蛋白的DNA結(jié)合區(qū)(氨基酸1-81；Kim等，科學(xué)255，203(1992))或整個LexA蛋白(氨基酸1-202；Brent等，細胞43，729(1985))的cDNA和它的3’末端的SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132如PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))和2.被接納的活化序列[成份i)]·結(jié)合Lex A蛋白(Lex A操縱子，Brent等，自然612，312(1984))的序列[如，核苷酸序列5’-TACTGTATGTACATACAGTA-3’)，它的3’末端附著的·SV40基本啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，紐約；冷泉港實驗室)或另一個啟動子(參見實施方案F)。
實施方案H)，包括1.在融合蛋白h)中的DNA結(jié)合蛋白的核苷酸序列，包括·lac阻遏(lacI)蛋白的cDNA(Brown等，細胞49，603(1987)；Fruerst等，PNAS USA86,2549(1989))和，它的3’末端的SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；如PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))，和2.被接納的活化序列(成份i))·至少含有結(jié)合lacI阻遏蛋白(Fuerst等，PNAS USA86，2549(1989)；Simons等，PNAS USA81,1624(1984))的lac操縱子序列(如核苷酸序列5’-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3’)和它的3’末端的SV40基本啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，N.Y.，冷泉港實驗室)或另一個啟動子(參見實施方案F)。
實施方案I)，包括1.在融合蛋白h)中的DNA結(jié)合蛋白的核苷酸序列，該序列包括·四環(huán)素阻遏(tetR)蛋白的cDNA(Gossen等，PNAS USA89,5547(1992)；Dingermann等，EMBO J.11,1487(1992))和它的3’末端的SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；如PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸405-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))，和2.被接納的活化序列[成份i)]·至少含有結(jié)合四環(huán)素阻遏(tetR)蛋白的四環(huán)素操縱子(tetO)序列(如核酸序列5’-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3’)和它的3’末端的·基本SV40啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，N.Y.，冷泉港實驗室)或另一個啟動子(參見實施方案F)。
實施方案J)，包括1.在融合蛋白h)中的DNA結(jié)合蛋白的核苷酸序列，該序列包括·ZFHD1蛋白的cDNA(Pomerantz等，科學(xué)267,93(1995))和它的3’末端的SV40核定位信號(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；如PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))，和2.被接納的活化序列[成份i)]，·至少包括一個結(jié)合ZFHD-1蛋白(Pomerantz等，科學(xué)267,93(1995))的序列(如核苷酸序列5’-TAATGATGGGCG-3’)和它的3’末端的基本SV40啟動子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，紐約；冷泉港實驗室)或另一個啟動子(可能參見F)。
3)啟動子序列在本發(fā)明的意義內(nèi)，將在結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白后激活定位于3’末端的鄰接位置的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列用作啟動子序列[成份b)，e)，g)和i)]。啟動子序列的選擇依賴于所治療的疾病和所轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細胞。所以，以不受限制的方式，以特異于靶細胞的方式，在特定的代謝條件下，以特異于細胞周期的方式或以特異于病毒的方式可以將啟動子序列激活。另外，相同或不同的啟動子序列可以用于成份b)，e)和/或g)和成份i)中。這些啟動子序列的例子，除了已經(jīng)在實施方案A)-J)中引用的啟動子序列以外，還有-可以以不受限制的方式激活的啟動子和激活劑序列·RNA聚合酶III啟動子·RNA聚合酶II啟動子·CMV啟動子和CMV增強子·SV40啟動子-病毒啟動子序列和激活劑序列，如·HBV·HCV·HSV·HPV·EBV·HTLV·HIV當利用HIV啟動子時，將包括TAR序列(位置≤-453-≥+80，Rosen等，細胞41,813(1985))的整個LTR序列用作特異于病毒的啟動子。
-可以從代謝上激活的啟動子序列或增強子序列，如可以被缺氧誘導(dǎo)的增強子或啟動子。
-可以以特異于細胞周期的方式激活的啟動子如cdc25C基因啟動子，細胞周期蛋白A基因啟動子，cdc2基因啟動子，B-myb基因啟動子，DHFR基因啟動子或E2F-1啟動子，或在細胞增殖過程中出現(xiàn)或激活的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的結(jié)合序列。這些結(jié)合序列包括，例如c-myc-蛋白的結(jié)合序列。這些結(jié)合序列也包括稱為myc E盒的核苷酸序列的單體或多體，如[5’-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3’，Blackwood和Eisenmann，科學(xué)251,1211，(1991))。
-可以被四環(huán)素激活的啟動子，如與對應(yīng)的阻遏物組合的四環(huán)素操縱子。
-嵌合啟動子。
嵌合啟動子構(gòu)成可以特異于細胞，代謝或特異于病毒激活的上游激活劑序列與可以結(jié)合CDF和CHF或E2F和CHF家族的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的下游啟動子單位的組合，并且因此能夠在細胞周期的G0和G1態(tài)時抑制上游激活劑序列的活化。
-雜交啟動子，例如以啟動子的TATA盒突變的形式，而TATA-結(jié)合蛋白的基因中的相應(yīng)的突變補償了該突變，并且該TATA-結(jié)合蛋白是在另一個啟動子的控制下的。
-可以以特異于細胞的方式激活的啟動子，這些啟動子優(yōu)選地包括啟動子或來自優(yōu)選地編碼選定細胞中的蛋白的基因的激活劑序列。
例如，在本發(fā)明的意義內(nèi)，可以優(yōu)選地利用下面細胞中的下面的蛋白的啟動子-在內(nèi)皮細胞中激活的啟動子序列或激活劑序列·特異于腦的，內(nèi)皮葡糖-1-轉(zhuǎn)運子·endoglin·VEGF受體1(flt-1)·VEGF受體2(flk-1，KDR)·til-1或til-2·B61受體(Eck受體)·B61·內(nèi)皮素，特別是·內(nèi)皮素B·內(nèi)皮素-1·內(nèi)皮素受體，特別是內(nèi)皮素B受體·IL-1α，IL-1β·IL-1受體
·血管細胞粘連分子(VCAM-1)·合成的激活劑序列作為天然的特異于內(nèi)皮的啟動子的另一種選擇，也可以利用合成激活劑序列，該序列包括優(yōu)選地或有選擇地在內(nèi)皮細胞中有活性的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的低聚化結(jié)合位點。這些轉(zhuǎn)錄因子蛋白的一個例子是轉(zhuǎn)錄因子蛋白GATA-2，它的在內(nèi)皮素-1基因中的結(jié)合位點例如是5’-TTATCT-3’。
-在鄰近活化內(nèi)皮細胞的細胞中活化的啟動子或激活劑序列·VEGFVEGF基因的基因調(diào)節(jié)序列是·5’側(cè)接區(qū)，或·3’側(cè)接區(qū)，或·c-Src基因，或·v-Scr基因。
類固醇激素受體和它們的啟動子元件(Truss和Beato，Endocr.Rev.14,459 (1993))，特別是鼠哺乳動物腫瘤病毒啟動子。
-在肌肉細胞，特別是平滑肌肉細胞中激活的啟動子或激活劑序列·原肌球蛋白·α-肌動蛋白·α-肌球蛋白·PDGF受體·FGF受體·MRF-4·磷酸果糖激酶A·磷酸甘油酸變位酶·肌鈣蛋白C·生肌素·內(nèi)皮素A的受體·結(jié)合蛋白
·VEGFVEGF基因的基因調(diào)節(jié)序列已經(jīng)列在題目為“在活化內(nèi)皮細胞的鄰近細胞中活化的啟動子”部分(參見上面)。
·“人工”啟動子據(jù)報道螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)家族(MyoD，Myf-5，生肌素和MRF4)的因子是特異于肌肉的轉(zhuǎn)錄激活劑。特異于肌肉的轉(zhuǎn)錄激活劑也包括鋅指蛋白GATA-4和MEF轉(zhuǎn)錄因子基團。
HLH蛋白和GATA-4不僅在有特異于肌肉基因的啟動子而且在有異源的即人工啟動子時顯示特異于肌肉的轉(zhuǎn)錄。這些人工啟動子的例子是·結(jié)合特異于肌肉的HLH蛋白的DNA位點的多重拷貝，如E盒(MyoD)(如4×AGCAGGTGTTGGGAGGC)·結(jié)合α-生肌素重鏈基因的GATA-4的DNA位點的多重拷貝(如5’-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3’)-在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中激活的啟動子和激活劑序列。這些分別特別包括來自例如編碼下面的蛋白質(zhì)的基因調(diào)節(jié)序列或元件·特異于Schwann細胞的蛋白質(zhì)periaxin·谷氨酰胺合成酶·特異于神經(jīng)膠質(zhì)細胞的蛋白質(zhì)(神經(jīng)膠質(zhì)的原纖維酸性蛋白＝GFAP)·神經(jīng)膠質(zhì)細胞蛋白S100b·IL-6(CNTF)·5-HT受體·TNFα·IL-10·類胰島素生長因子受體I和II·VEGF
VEGF基因的基因調(diào)節(jié)序列已經(jīng)列于上面。
-在造血細胞中激活的啟動子和激活劑序列。
這些基因調(diào)節(jié)序列包括細胞因子或它的受體的基因的啟動子序列，該基因在造血細胞或鄰近細胞如基質(zhì)中表達。
這些序列包括例如下面的細胞因子和它們的受體的啟動子序列·干細胞因子受體·干細胞因子·IL-1α·IL-1受體·IL-3·IL-3受體(α亞基)·IL-3受體(β亞基)·IL-6·IL-6受體·GM-CSF·GM-CFS受體(α鏈)·干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)IL-6激活I(lǐng)RF-1的啟動子到同樣于IFN-α，IFN-β或IFN-γ激活的程度。
·紅細胞生成素·紅細胞生成素受體-在淋巴細胞和/或巨噬細胞中激活的啟動子和激活劑序列這些包括例如，細胞因子，細胞因子受體和抗體的Fc片段的粘連分子和受體的基因的啟動子序列和激活劑序列。
后面這些的例子有·IL-1受體·IL-1α·IL-1β·IL-2
·IL-2受體·IL-3·IL-3受體(α亞基)·IL-3受體(β亞基)·IL-4·IL-4受體·IL-5·IL-6·干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)(IL-6激活I(lǐng)RF-1的啟動子到同樣于IFN-α或IFN-β激活的程度)。
·IFN-γ-反應(yīng)性啟動子·IL-7·IL-8·IL-10·IL-11·IFN-γ·GM-CSF·GM-CSF受體(α鏈)·IL-13·LIF·巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)受體·I和II型清除劑巨噬細胞受體·MAC-1(白細胞功能抗原)·LFA-1α(白細胞功能抗原)·p150,95(白細胞功能抗原)-在滑液細胞中激活的啟動子序列和激活劑序列這些包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)例如·MMP-1(間質(zhì)的膠原酶)
·MMP-3(基質(zhì)溶細胞因子/轉(zhuǎn)移素)的啟動子序列這些進一步包括金屬蛋白酶(TIMP)的組織抑制劑例如·TIMP-1·TIMP-2·TIMP-3的啟動子序列。
-在白血病細胞中激活的啟動子和激活劑序列這些包括例如，·c-myc·HSP-70·bcl-1/細胞周期蛋白D-1·bcl-2·IL-6·11-10·NFα，TNFβ·HOX-11·BCR-Ab1·E2A-PBX-1·PML-RARA(前髓細胞白血病-視黃酸受體)·c-myc的啟動子c-myc蛋白結(jié)合和激活稱為myc E盒的核苷酸序列的多體(如5’-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3’)-腫瘤細胞的啟動子或激活劑序列將與在腫瘤細胞中形成或是有活性的轉(zhuǎn)錄因子蛋白相互作用的基因調(diào)節(jié)核苷酸序列設(shè)想為啟動子序列或激活劑序列。
在本發(fā)明的意義內(nèi)，優(yōu)選的啟動子或激活劑序列分別包括來自編碼特別是在癌細胞或肉瘤細胞中形成的蛋白質(zhì)的基因的基因調(diào)節(jié)序列或元件。所以在小細胞支氣管癌的情況中，優(yōu)選的是利用N-CAM蛋白的啟動子，在子宮癌的情況中，優(yōu)選的是利用肝炎生長因子受體或L-網(wǎng)質(zhì)的啟動子，在胰腺癌的情況中，優(yōu)選的是利用L-網(wǎng)質(zhì)或多型核白細胞上皮粘蛋白(PEM)的啟動子。
4)核輸出信號和核輸出因子在本發(fā)明的意義內(nèi)，核輸出信號(NES)優(yōu)選地是逆轉(zhuǎn)錄病毒rev-應(yīng)答元件(RRE)序列。在HIV-1的情況中，該RRE是在env基因(Malim等，自然338,254(1989)；Kjem等，PNAS88,683(1991))中的243個核苷酸的序列(核苷酸7362-7595；Muesing等，自然313,450(1985))。但是，在本發(fā)明的意義內(nèi)，核輸出信號(NES)也可以是同源的和/或功能相似的(類似的)核苷酸序列如，HBV病毒RRE-等同元件(Huang等，Mol.Cell Biol.13,7476(1993))。
在新核酸構(gòu)建體中，核輸出因子(NEF)是編碼結(jié)合NRS的mRNA并介導(dǎo)含NRS的前信使RNA或信使RNA出細胞核進入細胞質(zhì)(或出細胞質(zhì)進入細胞核)的運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)的核苷酸序列。在本發(fā)明的意義內(nèi)，特別可利用專門來自HIV-1或HIV-2病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒的rev基因(Daly等，自然342,816(1989)；Emerman等，細胞57,1155(1989)；Felber等，PNAS86,1495(1989)；Fischer等，EMBOJ.13,4105(1994))。
逆轉(zhuǎn)錄病毒的rev基因的rev蛋白通過它的N-末端區(qū)(Zapp等，自然342,7154(1989)；Malim等，細胞65,241(1991))與前mRNA中的RRE結(jié)合(Iwai等，核酸研究20,6465(1992))。RRE和rev蛋白之間的結(jié)合促進了非拼接前信使RNA和任何其它含有RRE的RNA，出細胞核進入細胞質(zhì)的運輸(Fischer等，EMBOJ.13,4105(1994)；Fischer等，細胞82,475(1995))，從而實質(zhì)上增強了轉(zhuǎn)譯。
在本發(fā)明的意義內(nèi)，也可以利用編碼同源于和功能相似于HIV-1rev蛋白(Bogerd等，細胞82,485(1995))的蛋白質(zhì)的核苷酸序列如visna-maedi病毒(VMV；Tiley等，病毒學(xué)雜志65,3877(1991))rev基因或羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV；Tiley等，病毒學(xué)雜志65,3877(1991))rev基因作為NEF。
但是，在本發(fā)明的意義內(nèi)，也可以利用那些編碼，當與rev蛋白只具有微小的，或沒有同源性時，是與HIV-1rev蛋白功能相似的蛋白質(zhì)的基因。
這些基因包括，例如，HTLV-1rev基因(Cullen，Microbiol.Rev.56,375(1992))和馬感染的貧血癥病毒(EIAV)和貓免疫缺陷病毒(FIV)(Manusco等，病毒學(xué)雜志68,1988(1994))的rev基因。
在可替代的實施方案中，NEFs也可以是編碼甚至不需要通過NRS保留于核中的RNA而實現(xiàn)將RNA分泌出核的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。這些蛋白質(zhì)包括，例如，轉(zhuǎn)錄因子蛋白TFIIIA(Gaddat等，細胞60,619(1990)；Drew等，基因159,215(1995))或異源的核核糖核蛋白A1(hnRNPA1蛋白；Pinol-Roma等，自然335,730(1992))。
在廣義上，核運輸?shù)鞍滓部梢园嵝菘说鞍?0(hsp70；Mandell等，J.Cell Biol.111,1775(1990))或蛋白激酶抑制劑CPKI(Fantozzi等，J.Biol.Chem.269,2676(1994)；Wen等，J.Biol.Chem.269,32214(1994))。
NEF和它的同源和類似蛋白共同具有的特征是存在將單體蛋白與NRS RNA結(jié)合的定位于更接近氨基末端的區(qū)(J.Virol.64,881(1990)；Kjems等，EMBOJ.11,119(1992))和通常有豐富的亮氨酸(hnRnPA1除外)并是NEF運輸功能必需的區(qū)(Wen等，細胞82,463(1995)；Fischer等，細胞82,475(1995)；Malim等，病毒學(xué)雜志65,4248(1991)；Venkatesh等，病毒學(xué)178,327(1990))。
在本發(fā)明的意義內(nèi)，NEF基因的表達是在定位于NEF基因的5’末端(參見圖2和7，和已經(jīng)敘述在上面的)或藥物學(xué)上可控制的啟動子單位(參見圖8和9)的5’末端的上游的啟動子序列(成份b))的控制下的。
5)內(nèi)部核糖體入口位點(IRES)內(nèi)部核糖體入口位點使表達兩個通過IRES彼此連接(“相互連接”)的DNA序列成為可能。
例如Montford和Smith TIG11,179(1995)；Kaufman等，核酸研究19,4485(1991)；Morgan等，核酸研究20,1293(1992)；Dirks等，基因128,247(1993)；Pelletier和Sonenberg，自然334,320(1988)和Sugitomo等，生物技術(shù)12,694(1994)敘述過這一特性的IRES。
所以，例如可以利用脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES序列的cDNA(5’UTR的位置≤140-≥630(Pelletier和Sonenberg，自然334,320(1988))將成份c)的DNA與成份d)的DNA連接。
6)結(jié)構(gòu)基因在本發(fā)明的意義內(nèi)，結(jié)構(gòu)基因[成份c)]編碼預(yù)防和/或治療疾病的活性化合物。針對疾病治療的特性和考慮將要轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細胞選擇結(jié)構(gòu)基因和啟動子序列。
例如，下面選擇的啟動子序列(實施例，參見部分3)和結(jié)構(gòu)基因的組合與下面的疾病有關(guān)a)腫瘤的治療-靶細胞·增殖的內(nèi)皮細胞，或·與內(nèi)皮細胞鄰接的基質(zhì)細胞和肌肉細胞，或·腫瘤細胞或白血病細胞-啟動子·特異于內(nèi)皮細胞和特異于細胞周期，或·非特異于細胞或特異于肌肉細胞和特異于細胞周期，或·特異于腫瘤細胞(固態(tài)腫瘤和白血病)-編碼細胞增殖的抑制劑，例如·成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(pKb＝p110)或相關(guān)的p107和p130蛋白·p53蛋白·p21(WWAF-1)蛋白·p16蛋白·其它cdk抑制劑
·GADD45蛋白·bak蛋白·被磷酸化失活的成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(pRb/p110)和相關(guān)的p107和p130蛋白的結(jié)構(gòu)基因。
優(yōu)選的是利用那些編碼這些細胞周期抑制劑的基因，這些抑制性顯示沒有因此損害這些蛋白的功能的表達蛋白的失活位點的突變。這些突變的例子已經(jīng)敘述在p110的情況中。
p107蛋白或p130蛋白的DNA序列以類似的方式突變。
·在細胞中，通過結(jié)合特殊的蛋白如MDM2或通過去磷酸化的C末端的絲氨酸392使p53寡聚化失活p53蛋白。所以，優(yōu)選的是利用編碼p53蛋白的DNA序列，該蛋白已經(jīng)通過去除C末端的絲氨酸392被截短。
-誘導(dǎo)凝血的因子和血管生成抑制劑，例如·纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)·PAI-2·PAI-3·angiostatin·干擾素，特別是*IFNα*IFNβ*IFNγ*血小板因子4*IL-12*TIMP-1*TIMP-2*TIMP-3*白血病抑制因子(LIF)*組織因子(TF)和它的凝血活性片段的結(jié)構(gòu)基因-編碼抑制細胞生長的和有細胞毒性的蛋白，例如
·穿孔素·粒酶·IL-2·IL-4·IL-12·干擾素，如*IFNα*IFNβ*IFNγ·TNF，特別是*TNFα*TNFβ·制瘤素M·鞘磷脂酶·爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物的結(jié)構(gòu)基因-編碼抑制細胞生長或有細胞毒性的抗體和結(jié)合抗原的抗體片段和抑制細胞生長的，有細胞毒性的或誘導(dǎo)炎癥的蛋白或酶之間的融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因·例如Burrows等(藥物治療64,155(1994))，Hughes等，(癌癥研究49,6214(1989))和Maruyama等，(PNAS USA87,5744(1990))所述，抑制細胞生長的或有細胞毒性的抗體包括針對于內(nèi)皮細胞膜結(jié)構(gòu)的那些。這些抗體特別包括抗VEGF受體的抗體。
·這些抗體進一步包括抗腫瘤細胞的膜結(jié)構(gòu)的抑制細胞生長的或有細胞毒性的抗體。例如Sedlacek等，Contrib.to Oncol.32，KargerVerlag，Munich(1988)和Contrib.to Oncol.43，Karger Verlag，Munich(1992)總結(jié)了這一特性的抗體。其它例子是抗下列物質(zhì)的抗體* 唾液酸Lewis* T細胞識別的腫瘤上的肽
*癌基因表達的蛋白質(zhì)*神經(jīng)節(jié)苷脂如GD3，GD2，GM2，9-0-乙酰基GD3，巖藻糖GM1*血液基團抗原和它們的前體*多型核上皮粘蛋白上的抗原*熱休克蛋白上的抗原·這些抗體進一步包括針對于白血病細胞的膜結(jié)構(gòu)的抗體。已經(jīng)有敘述大量的這一特性的單克隆抗體用于診斷和治療方法(Kristensen，丹麥醫(yī)學(xué)手冊41,52(1994)；Schranz，Therapia Hungarica 38,3(1990)；Drexler等，Leuk.Res.10,279(1986)；Naeim，Dis.Markers 7,1(1989)；Stickney等，Curr.Opin.Oncol.4,847(1992)；Drexler等，Blut57,327(1988)；Freedman等，癌癥研究9,69(1991))。依據(jù)白血病的類型，例如下面的單克隆抗體，或它們的結(jié)合抗原的抗體片段適于用作配體
以類似于制備重組Fv片段(參見部分2)已經(jīng)敘述的方法進行鼠抗體的人源化，和編碼Fab和重組Fv片段的基因的制備和最佳化。根據(jù)技術(shù)人員已知的目前工藝水平將重組FV片段與編碼抑制細胞生長的，有細胞毒性的或誘導(dǎo)炎癥的蛋白或酶的基因融合。
-編碼在結(jié)合靶細胞的配體和抑制細胞生長和有細胞毒性的蛋白之間的融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因。
·這些包括結(jié)合內(nèi)皮細胞上的膜結(jié)構(gòu)或膜受體的所有物質(zhì)。例如，它們包括結(jié)合內(nèi)皮細胞表達的受體如PDGF，bFGF，VEGF和TGFβ的IL-1或生長因子，或它們的片段或其部分的序列(Pusztain等，J.Pathol.169,191(1993))。
·它們進一步包括結(jié)合激活的和/或增殖的內(nèi)皮細胞的粘連分子。這一特性的粘連分子如Slex，LFA-1，MAC-1，LECAM-1，VLA-4或玻璃體結(jié)合蛋白已有敘述(Augustin-Voss等，細胞生物學(xué)雜志119,483(1992)，Pauli等，Cancer Metast.Rev.9,175(1990)，Honn等，CancerMetast.Rev.11,353(1992)和Varner等，Cell Adh.Commun.3,367(1995)中的綜述)。
·它們進一步包括結(jié)合腫瘤細胞或白血病細胞的膜結(jié)構(gòu)或膜受體的物質(zhì)。例如它們包括結(jié)合白血病細胞或腫瘤細胞表達的受體的生長因子或它們的片段或其部分的序列。
這一特性的生長因子已有敘述(Cross等，細胞64,271(1991)，Aulitzky等，藥物48,667(1994)，Moore，癌癥臨床研究1，3(1995)和Van Kooten等，Leuk.Lymph.12,27(1993)中的綜述)。
·根據(jù)利用技術(shù)人員已知的方法的目前工藝水平將結(jié)合靶細胞的這些配體的基因與抑制細胞生長的，有細胞毒性的或誘導(dǎo)炎癥的蛋白或酶的基因融合。
-編碼炎癥的誘導(dǎo)物，例如·RANTES(MCP-2)·單細胞趨藥性的和活化因子(MCAF)·IL-8·巨噬細胞炎癥蛋白-1(MIP-1α，-β)·嗜中性白細胞活化蛋白-2(NAP-2)·IL-3·IL-5·人白血病抑制因子(LIF)·IL-7
·IL-11·IL-13·GM-CSF·G-CSF·M-CSF·眼鏡蛇毒液因子(CVF)，或CVF的部分序列，它們功能上對應(yīng)于人補體因子C3b，即能結(jié)合補體因子B并且在因子D切割后構(gòu)成C3轉(zhuǎn)化酶。
·人補體因子C3或它的部分序列C3b。
·在功能上和結(jié)構(gòu)上與CVF相似的人補體因子C3的切割產(chǎn)物。
·激活補體或引發(fā)炎癥的細菌蛋白如鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白，金黃色葡萄球菌凝集因子，調(diào)節(jié)素，特別是革蘭氏陰性細菌，軍團菌或B型流感嗜血菌或克雷伯氏菌的主要的外膜蛋白或G組鏈球菌的M分子的結(jié)構(gòu)基因。
-編碼活化抑制細胞生長的試劑的前體的酶如裂解無活性的前體物質(zhì)(前藥物)從而形成有活性的抑制細胞生長試劑(藥物)的酶的結(jié)構(gòu)基因。
Deonarain等(Br.J.Cancer 70,786(1994))，Mullen(藥物治療63,199(1994))和Harris等(基因治療1,170(1994))已經(jīng)總結(jié)了這一特性的物質(zhì)和在每種情況下接納的前藥物和藥物。例如，將用到下面的酶中的一個的DNA序列·單純皰疹病毒胸苷激酶·水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶·細菌硝基還原酶·細菌β-葡糖苷酸酶·來自Secale谷物的植物β-葡糖苷酸酶·人β-葡糖苷酸酶·人羧肽酶(CB)，例如乳腺細胞CB-A
*胰腺CB-B*細菌β-內(nèi)酰胺酶*細菌羧肽酶*細菌胞嘧啶脫氨酶*人觸酶或過氧化物酶*磷酸酶，特別是*人堿性磷酸酶*人酸性前列腺磷酸酶*5型酸性磷酸酶*氧化酶，特別是*人賴氨酰氧化酶*人酸性D-氨基氧化酶·過氧化物酶，特別是*人谷胱甘肽過氧化物酶*人嗜曙紅細胞過氧化物酶*人甲狀腺過氧化物酶·β-半乳糖苷酶b)自身免疫疾病和炎癥的治療-靶細胞·增殖的內(nèi)皮細胞，或·巨噬細胞和/或淋巴細胞，或·滑膜細胞-啟動子·特異于內(nèi)皮細胞和特異于細胞周期的，或·特異于巨噬細胞和/或特異于淋巴細胞和/或特異于細胞周期的·特異于滑膜細胞和/或特異于細胞周期的-用于治療變態(tài)反應(yīng)，例如·IFN-β·IFN-γ
·IL-10·抗IL-4的抗體或抗體片段·可溶的IL-4受體·IL-12·TGFβ的結(jié)構(gòu)基因-用于防止移植的器官的排斥性如，·IL-10·TGFβ·可溶的IL-1受體·可溶的IL-2受體·IL-1受體拮抗物·可溶的IL-6受體·通過例如根據(jù)Marasco等敘述的方法制備的接頭連接的免疫阻遏抗體或它們的含VH和VL的片段或它們的VH和VL片段(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,7889(1993))的結(jié)構(gòu)基因。免疫抑制抗體的例子是*特異于T細胞受體或它的CD3復(fù)合物*抗CD4或CD8的抗體，和另外*抗IL-2受體，IL-1受體或IL-4受體，或*抗粘連分子CD2，LFA-1，CD28或CD40的抗體。
-用于治療抗體介導(dǎo)的自身免疫疾病，如·TFGβ·IFN-α·IFN-β·IFN-γ·IL-12·可溶的IL-4受體·可溶的IL-6受體·免疫抑制抗體或它們的含VH和VL的片段的結(jié)構(gòu)基因-用于細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的治療如
·IL-6·IL-9·IL-10·IL-13·TNFα·IL-4·TNFβ·免疫抑制抗體或它含VH和VL的片段的結(jié)構(gòu)基因-編碼細胞增殖的抑制劑，抑制細胞生長或有細胞毒性的蛋白質(zhì)和用于激活抑制細胞生長的試劑的前體的酶的結(jié)構(gòu)基因。
編碼這一特性的蛋白質(zhì)的基因的實例已經(jīng)引入題目為“治療腫瘤的結(jié)構(gòu)基因”的章節(jié)中。
在本發(fā)明的意義內(nèi)，在這點上可以以同樣于已經(jīng)敘述的形式利用那些結(jié)構(gòu)基因，它們編碼包括特異于靶細胞的抗體，或這些抗體的Fab片段或重組Fv片段，或其它配體的融合蛋白質(zhì)，和上面提到的細胞因子，生長因子，受體，抑制細胞生長的或有細胞毒性的蛋白質(zhì)和酶。
-用于治療關(guān)節(jié)炎的結(jié)構(gòu)基因在本發(fā)明的意義內(nèi)，選擇它的表達蛋白直接或間接抑制例如關(guān)節(jié)的炎癥，和/或促進關(guān)節(jié)的細胞外基質(zhì)(軟骨和結(jié)締組織)重組的結(jié)構(gòu)基因。
這些蛋白的例子是·IL-1受體拮抗物(IL-1-RA)；IL-1-RA抑制IL-1α和IL-1β的結(jié)合·可溶的IL-1受體；可溶的IL-1受體結(jié)合和激活I(lǐng)L-1·IL-6；IL-6增強TIMP和超氧化物的分泌，并降低滑膜細胞和軟骨細胞分泌IL-1和TNFα·可溶的TNF受體；可溶的TNF受體結(jié)合和激活TNF。
·IL-4；IL-4抑制IL-1，TNFα和MMP的形成和分泌·IL-10；IL-10抑制IL-1，TNFα和MMP的形成和分泌并且增強TIMP的分泌·類胰島素生長因子(IGF-1)；IGF-1刺激細胞外基質(zhì)的合成·TGFβ，特別是TGFβ1和TGFβ2；TGFβ刺激細胞外基質(zhì)的合成·超氧化物歧化酶·TIMP(金屬蛋白酶的組織抑制劑)，特別是*TIMP-1*TIMP-2*TIMP-3c)造血缺陷的治療-靶細胞·造血系統(tǒng)的增殖的，未成熟的細胞，或·其定位鄰接造血細胞的基質(zhì)細胞-啟動子·特異于造血細胞和/或特異于細胞周期的·非特異于細胞的-用于治療貧血癥例如·促紅細胞生成素的結(jié)構(gòu)基因-用于治療白細胞減少例如·G-CSF·GM-CSF的結(jié)構(gòu)基因-治療血小板減少例如·IL-3·白血病抑制因子(LIF)·IL-11·血小板生成素的結(jié)構(gòu)基因d)神經(jīng)系統(tǒng)損壞的治療-靶細胞·神經(jīng)膠質(zhì)細胞，或
·增殖的內(nèi)皮細胞-啟動子·特異于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，或·特異于內(nèi)皮細胞和特異于細胞周期，或·非特異和特異于細胞周期-編碼神經(jīng)元生長因子，例如·FGF·神經(jīng)生長因子(NGF)·起源于腦的嗜神經(jīng)組織因子(BDNF)·嗜神經(jīng)組織素-3(NT-3)·嗜神經(jīng)組織素-4(NT-4)·睫狀嗜神經(jīng)組織因子(CNTF)的結(jié)構(gòu)基因-酶例如·酪氨酸羥化酶·多巴脫羧酶的結(jié)構(gòu)基因-編碼抑制或中和TNFα的神經(jīng)毒性效應(yīng)的細胞因子和它們的抑制劑例如·TGFβ·可溶的TNF受體；TNF受體中和TNFα·IL-10；IL-10抑制IFNγ，TNFα，IL-2和IL-4的形成·可溶性IL-1受體·IL-1受體I·IL-1受體II；·可溶的IL-1受體中和IL-1的活性·IL-1受體的拮抗物·可溶的IL-6受體的結(jié)構(gòu)基因e)血液凝固系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)紊亂的治療
-靶細胞·內(nèi)皮細胞，或·增殖的內(nèi)皮細胞，或·鄰近內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的體細胞，或·巨噬細胞-啟動子·不特異于細胞的，或·不特異于細胞和特異于細胞周期的，或·特異于內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞或巨噬細胞，或·特異于內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞或巨噬細胞和特異于細胞周期的-用于抑制凝血或促進血纖維蛋白溶解例如·組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)·尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)·tPA和uPA的雜合物·蛋白質(zhì)C·水蛭素·絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpins)，如*C-1S抑制劑*α1-抗胰蛋白酶*抗凝血酶素III·組織因子途徑抑制劑(TFPI)的結(jié)構(gòu)基因-促凝血例如·FVIII·FIX·von Willebrand因子·FXIII·PAI-1·PAI-2的結(jié)構(gòu)基因-編碼血管生成因子例如
·VEGF·FGF的結(jié)構(gòu)基因-用于降低血壓例如·激肽釋放酶·內(nèi)皮細胞-氧化氮合成酶的結(jié)構(gòu)基因-在損害內(nèi)皮層后抑制平滑肌細胞增殖例如·抗增殖，抑制細胞生長或有細胞毒性的蛋白質(zhì)，或如上面已經(jīng)引證用于(在腫瘤)裂解抑制細胞生長劑前體，從而形成抑制細胞生長劑的酶，和這些活性化合物以及特異于肌肉細胞的抗體或抗體片段的融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因。
-編碼其它血漿蛋白例如·清蛋白·C1失活劑·血清膽堿酯酶·轉(zhuǎn)鐵蛋白·α1-抗胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)基因f)代謝疾病和遺傳疾病的治療-靶細胞·內(nèi)皮細胞·肌肉細胞·肝細胞·支氣管上皮細胞·基質(zhì)細胞，或·巨噬細胞-啟動子·特異于非靶細胞，或·特異于靶細胞-編碼例如·與膽囊纖維變性相關(guān)的跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)物(CFTCR)
·Faneoni’s貧血癥的基因·尿卟啉原III合成酶·艾杜糖醛酸2-硫化酶(II型粘多糖病)·β-葡糖苷酸酶(粘多糖病VIII)·葡糖腦苷脂酶(Gaucher’s病)·苯丙氨酸羥化酶·營養(yǎng)不良癥(Duchenne型肌肉營養(yǎng)不良)·胰島素受體·人生長激素·與表面活性劑SP-A和SP-B相關(guān)的蛋白質(zhì)·LDL受體·編輯家族性載脂蛋白B mRNA的蛋白質(zhì)·腺苷脫氨酶的結(jié)構(gòu)基因g)接種-靶細胞·肌肉細胞，或·巨噬細胞-啟動子·特異于非靶細胞，或·特異于靶細胞，或·特異于靶細胞和特異于細胞周期-用于感染疾病的預(yù)防的結(jié)構(gòu)基因制備有效的疫苗的可能性通常是受限制的(Brown，Int.J.Technol.Assessm.Health Care10，161(1994)，Ellis，Adv.Exp.Med.Biol.327，263(1992)，Arnon等，F(xiàn)ASEBJ.6,3265(1992))。
結(jié)果是開發(fā)了DNA疫苗的技術(shù)。但是，這些DNA疫苗存在有關(guān)加強它們的效力的問題(Fynan等，Int.J.Immunopharm.17,79(1995)；Donnelly等，Immunol.2,20(1994))。
根據(jù)本發(fā)明，自我增強表達系統(tǒng)增強DNA疫苗的效力。
被選擇作為活性物質(zhì)的DNA是編碼由感染試劑形成的蛋白質(zhì)的DNA，并且所述蛋白質(zhì)通過引發(fā)免疫反應(yīng)，即通過抗體結(jié)合和/或通過有細胞毒性的T淋巴細胞，導(dǎo)致該試劑的中和和/或分解。所謂這一特性的中和抗原已經(jīng)用作接種抗原(參見Ellis，Adv.Exp.Med.Biol.327，263(1992)的綜述)。下面的研究提供了編碼中和抗原的DNA序列的實例·流行性感冒A病毒抗原(Ulmer等，科學(xué)259,1745(1993)，Robinson等，疫苗11,957(1993)，F(xiàn)ynan等，Int.J.Immunopharmac.17,79(1995))·HIV抗原(Wang等，PNAS USA90,4156(1993))·狂犬病病毒抗原(Donnelly等，Immunol.2/1,20(1994))·HSV(單純皰疹病毒)抗原(Fleckenstein等，自然274,57(1978))·RSV(呼吸合胞體病毒)抗原(Du等，生物/技術(shù)12,813(1994)，Hall，科學(xué)265,1393(1993))·副流行性感冒病毒抗原(Du等，生物/技術(shù)12,813(1994))·輪狀病毒抗原(Albert等，J.Clin.Microbiol.25,183(1987)，Anderson等，J.Infect.Dis.153,823(1986)，Battaglia等，J.Infect.Dis.155,140(1987)，Chanock等，J.Infct.Dis.148,49(1983)，Dyall-Smith等，病毒學(xué)雜志38,1099(1981)，Glass等，科學(xué)265,1389(1994))·VZV(水痘帶狀病毒)抗原(Straus等，Ann.Intern.Med.109,438(1988)，Gershon.Pediatr.Infect.Dis.2,171(1991)，Kinchington等，J.Virol.64,4540(1990))·CMV(細胞肥大病毒)抗原(Plotkin，科學(xué)265,1383(1994))·麻疹病毒抗原(Katz和Kellin，科學(xué)265,1391(1994))·HPV(人乳頭狀瘤病毒)抗原(Tindl和Frazer，Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.186,217(1994))·HBV(乙型肝炎病毒)抗原(Valenzuela等，自然280,815(1979)，Heerman等，病毒學(xué)雜志52,396(1984))
·HCV(丙型肝炎病毒)抗原(Cerny等，Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.189,169(1994)，Esteban等，Progr，Liver Dis.10，253(1992)，Jung等，Eur.J.Clin.Invest.24,641(1994))·HDV(丁型肝炎病毒)抗原(Iwarson，Scand.J.Infect.Dis.24,129(1992)，Consolo等，Nephron.61，251(1992))·HEV(戊型肝炎病毒)抗原(Iwarson，Scand.J.Infect.Dis.24,129(1992)，Consolo等，Nephron.61,251(1992))·HAV(甲型肝炎病毒)抗原(d’Hondt，疫苗10,48(1992)，Andre，J.Infect.Dis.171,33(1995)，Lemon等，疫苗10,40(1992)，Melnick等，疫苗10,24(1992)，F(xiàn)lehmig，BaillieresClin.Gastroenterol.4,707(1990))·霍亂弧菌抗原(Levine和Kaper，疫苗11,207(1993))·包柔氏螺旋體菌burgdorferi抗原(Schaible等，Immunol.Letters36,219(1993).Wallich等，Lab.Med.17,669(1993))·幽門螺旋菌抗原(Crabtree等，Lancet338,332(1991)，Blaser，J.Infect.Dis.161.626(1990)，Cover和Blaser，J.Biol.Chem.267,10570(1993)，Cover等，Infect.Immunol.58，603(1990)，Dunn等，J.Biol.Chem.265,9464(1990)，Dunn等，Infect.Immunnol.60,1946(1992)，Lage等，Acta Gastroenterol.Belg.56(suppl.)，61(1993)，Mobley等，Scand.J.Gastroint.26(suppl.187)，39(1991))·瘧疾抗原(Nussenzweig和Long，科學(xué)265,1381(1994)，Maurice，科學(xué)267,320(1995)，Enders等，疫苗10,920(1992)，Knapp等，Infect.Imm.60,2397(1992))。
但是，在本發(fā)明的意義內(nèi)，這一特性的活性物質(zhì)也包括抗個體基因型抗體，或它的抗原結(jié)合片段的DNA，它的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)(互補決定區(qū))構(gòu)成感染劑的中和抗原的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或碳水化合物結(jié)構(gòu)的拷貝。
特別是，這一特性的抗個體基因型抗體可以替代細菌感染劑中的碳水化合物抗原。
Hawkins等(免疫治療雜志14,273(1993))和Westerink和Apicella(Springer Seminars in Immunopathol.15,227(1993))已經(jīng)綜述了這一特性的抗個體基因型抗體和它們的裂解產(chǎn)物。
-編碼“腫瘤疫苗”的結(jié)構(gòu)基因；這些包括腫瘤細胞上的抗原。例如Sedlacek等，Contrib.to Oncol.32，Karger Verlag，Munich(1988)和Contrib.to Oncol43，Karger Verlag，Munich(1992)已經(jīng)綜述了這一特性的抗原。
其它實例由下面的抗原或?qū)?yīng)于下面的抗原的抗個體基因型抗體的基因構(gòu)成·唾液酸Lewis·T細胞識別的腫瘤上的肽·癌基因表達的蛋白質(zhì)·血液基團抗原和它們的前體·多型核上皮粘蛋白和其它與腫瘤相關(guān)的粘蛋白上的抗原·熱休克蛋白上的抗原·神經(jīng)節(jié)苷脂h)慢性感染疾病的治療-靶細胞·肝細胞·淋巴細胞和/或巨噬細胞·上皮細胞·內(nèi)皮細胞-啟動子·特異于病毒的·特異于細胞的·特異于病毒或特異于細胞和特異于細胞周期-編碼例如·顯示抑制細胞生長的或有細胞毒性效應(yīng)的蛋白質(zhì)(有細胞毒性或抑制細胞生長的蛋白質(zhì)的例子已經(jīng)引入題目為腫瘤治療的章節(jié))·切割抗病毒或有細胞毒性的物質(zhì)的前體從而形成活化物質(zhì)的酶(在這點上，參見題目為腫瘤治療的章節(jié))的結(jié)構(gòu)基因。-編碼抗病毒蛋白的結(jié)構(gòu)基因·具有抗病毒活性的細胞因子和生長因子，這些的例子是*IFN-α*IFN-β*IFN-γ*TNFβ*TNFα*IL-1*TGFβ·具有失活通過接頭連接的相關(guān)病毒或它的含VH和VL的片段，或它的VH和VL片段的特異性的抗體，它的片段可以如章節(jié)2)所述制備。
抗病毒抗原的抗體的例子是*抗-HBV*抗-HCV*抗-HSV*抗-HPV*抗-HIV*抗-EBV*抗-HTLV*抗-Coxsackie病毒*抗-漢坦病毒rev結(jié)合蛋白。這些蛋白結(jié)合rev RNA和在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因表達中抑制依賴rev的轉(zhuǎn)錄后步驟。結(jié)合rev蛋白的例子有*RBP9-27*RRP1-8U
*RBP1-8D*RBP1-8的假基因消化細胞周期控制蛋白的基因的mRNA或病毒的mRNA的核酶。例如Christoffer-sen等，J.Med.Chem.38,2033(1995)已經(jīng)總結(jié)了催化HIV的核酶。
-抗細菌蛋白的結(jié)構(gòu)基因抗細菌蛋白的實例有中和細菌毒素或調(diào)理細菌的抗體。這些抗體的例子有抗·C或B腦膜炎球菌·大腸桿菌·包柔氏螺旋菌·假單胞菌·幽門螺旋菌·金黃色葡萄球菌的抗體7)相同或不同的結(jié)構(gòu)基因的組合本發(fā)明進一步涉及自我增強的，適當?shù)乃幬飳W(xué)上可控制的表達系統(tǒng)，其中組合了兩個相同或兩個不同的結(jié)構(gòu)基因[成份c)和c’)]的DNA序列。為了表達這兩個DNA序列的目的，優(yōu)選地將內(nèi)部核糖體入口位點(IRES)的cDNA作為調(diào)節(jié)元件插入兩個結(jié)構(gòu)基因之間。
章節(jié)C5)已經(jīng)敘述了這一特性的IRES序列的實例。
在本發(fā)明的意義內(nèi)，下面是用于-腫瘤治療·不同的抗增殖，抑制細胞生長，有細胞毒性，誘導(dǎo)炎癥的蛋白，或·裂解抑制細胞生長劑的前體的相同的酶-自身免疫疾病的治療·具有抑制細胞和/或腫瘤的免疫反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)的不同的細胞因子或受體，或·不同或相同的TIMP
-造血缺陷的治療·不同的，成等級地相鄰的細胞因子，如IL-1，IL-3，IL-6或GM-CSF和成紅細胞生成素，G-CSF或血小板生成素-神經(jīng)細胞損壞的治療·神經(jīng)元生長因子和細胞因子或細胞因子的抑制劑-血液凝固系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)的紊亂的治療·抗血栓形成劑和纖維蛋白溶解劑(tPA或uPA)，或·抗增殖，抑制細胞生長或有細胞毒性的蛋白質(zhì)(或酶)和抗血栓形成劑或纖維蛋白溶解劑-接種·抗原和刺激免疫的細胞因子，如*IL-1α*IL-1β*IL-2*GM-CSF*IL-3，或*IL-4受體·不同抗原*一種感染劑或不同感染劑的，或*一種腫瘤類型或不同腫瘤類型的-病毒感染性疾病的治療·抗病毒蛋白和抑制細胞生長或有細胞毒性的蛋白質(zhì)·抗一種病毒或幾種病毒的不同表面抗原的抗體-細菌感染性疾病的治療·抗有機體的不同表面抗原和/或毒素的抗體的結(jié)構(gòu)基因的優(yōu)選組合的例子8)信號序列和跨膜區(qū)的插入-為了促進結(jié)構(gòu)基因的表達產(chǎn)物的分泌，可以用改善細胞外分泌的異源信號序列替代可能存在于結(jié)構(gòu)基因的DNA序列中的同源信號序列。
所以，例如，可以插入免疫球蛋白的信號序列(DNA位置≤63-≥107；Riechmann等，自然332,323(1988))或CEA的信號序列(DNA位置≤33-≥134；Schrewe等，Mol.Cell Biol.10,2738(1990)；；Berling等，癌癥研究50,6534(1990))或人呼吸合胞體病毒糖蛋白的信號序列(氨基酸≤38-≥50或48-65的cDNA；Lichtenstein等，J.Gen.Virol.77,109(1996))。
-可替代地，或另外，為了在形成活化化合物的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的細胞膜中固定活化化合物可以在信號序列中插入跨膜區(qū)的序列。
所以，例如，可以在啟動子序列和結(jié)構(gòu)基因的序列之間插入刺激人巨噬細胞集落的因子的跨膜序列(DNA位置≤1485-≥1554；Cosman等，Behring Inst.Mitt.83,15(1988))或人呼吸合胞體病毒(RSV)糖蛋白G(氨基酸1-63或它們的部分序列，氨基酸38-63；Vijaya等，Mol.Cell Biol.8,1709(1988)；Lichtenstein等，J.Gen.Virol.77,109(1996))，或流行性感冒病毒神經(jīng)氨酸酶的信號和跨膜區(qū)的DNA序列(氨基酸7-35或部分序列氨基酸7-27；Brown等，病毒學(xué)雜志62，3824(1988))。
-為了增強轉(zhuǎn)譯，例如可以在啟動子序列的3’末端和緊接信號序列或跨膜序列的起始信號(ATG)的5’末端插入核苷酸序列GCCACC或GCCGCC(Kozak，細胞生物學(xué)雜志108,209(1989))。
-但是，為了在正在形成活性化合物的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的細胞膜中固定活化化合物也可以插入糖磷脂的錨狀物的核苷酸序列。
在結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列的3’末端插入糖磷脂的錨狀物，而這一插入是除了信號序列的插入外可能產(chǎn)生的插入。
例如對于CEA(DNA位置≤893-≥1079；Berling等，癌癥研究50,6534(1990))，對于N-CAM(Cunningham等，科學(xué)236,799(1987))和對于其它膜蛋白如Thy-1(Clissold，Biochem.J.281,129(1992))或CD16(Selvaray等，自然333,565(1988))已經(jīng)敘述了糖磷脂的錨狀物。
Ferguson等(Ann.Rev.Biochem.57,285(1988))已經(jīng)發(fā)表了固定糖磷脂的膜蛋白的綜述。
-根據(jù)本發(fā)明，在細胞膜上固定活性化合物的另一個選擇是利用配體/活性化合物的融合蛋白的DNA序列。這一融合蛋白的配體的特異性針對于選定的靶細胞的細胞膜上的膜結(jié)構(gòu)。
結(jié)合細胞表面的配體的例子有抗例如；·內(nèi)皮細胞的表面的結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段，特別是包括抗VEGF受體的，·或肌細胞的表面的結(jié)構(gòu)的抗體或抗體片段，例如*抗肌動蛋白的抗體，或*抗血管緊張素II受體的抗體，或*抗生長因子的受體，如抗◆EGF受體◆或PDGF受體◆或FGF受體◆或抗內(nèi)皮素A受體的抗體。
鼠單克隆抗體優(yōu)選地以人源化形式使用。如上所述制備了Fab片段和重組Fv片段和它們的融合產(chǎn)物。
配體進一步包括所有結(jié)合特定選定細胞上的膜結(jié)構(gòu)或膜受體的活性化合物如細胞因子或粘連分子，生長因子，或它們的片段或其部分序列或介導(dǎo)體。這些配體的例子有內(nèi)皮細胞的配體，如IL-1，PDGF，bFGF，VEGF，TGGβ(Pusztain等，病理學(xué)雜志169,191(1993))或細胞分裂素，和細胞分裂素的衍生物或類似物。配體進一步包括粘連分子。對于內(nèi)皮細胞已經(jīng)敘述了這一特性的粘連分子如Slex，LFA-1，MAC-1，LeCAM-1，VLA-4或玻璃體結(jié)合蛋白，和玻璃體結(jié)合蛋白的衍生物或類似物(Augustin-Voss等，細胞生物學(xué)雜志119,483(1992)；Pauli等，Cancer Metast.Rev.9,175(1990)；Honn等，CancerMetast.Rev.11,353(1992)；Varner等，Cell Adh.Commun.3,367(1995)中的綜述)。
配體也包括抗腫瘤細胞膜上的特異于腫瘤或相關(guān)于腫瘤的抗原的抗體或它們的片段。在部分C6a)中已經(jīng)敘述了這一特性的抗體。
本發(fā)明還涉及包含新核酸構(gòu)建體和具有成份f)的蛋白質(zhì)A和成份h)的蛋白質(zhì)B的結(jié)合位點的偶聯(lián)物質(zhì)j)的組合物。偶聯(lián)物質(zhì)j)優(yōu)選地是藥物組合物，特別是能滲透過細胞膜并進入細胞的物質(zhì)，特別是納巴霉素，F(xiàn)K506，環(huán)孢菌素A，甲氨喋呤，葉酸，視黃酸，青霉素，4-羥基他莫昔芬，他莫昔芬或四環(huán)素或四環(huán)素/異丙基-β-D-硫代半乳糖苷結(jié)合物。
本發(fā)明還涉及含有新核酸構(gòu)建體的細胞，特別是酵母細胞或哺乳動物細胞并涉及制備新核酸構(gòu)建體的方法，其中單個成份相互連接。
本發(fā)明也涉及為了預(yù)防和/或治療腫瘤，白血病，自身免疫疾病，炎癥，神經(jīng)系統(tǒng)損壞，血液凝固系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)紊亂，代謝疾病，遺傳損壞，病毒或細菌感染疾病和/或造血缺陷和/或為了抗病毒，細菌或寄生感染和/或抗腫瘤的接種，利用新的核酸構(gòu)建體制備用于局部的如，經(jīng)皮的，鼻的，口服的，腸胃的，支氣管內(nèi)的，膀胱內(nèi)的，陰道內(nèi)的，子宮內(nèi)的，皮下的，肌肉內(nèi)的，皮內(nèi)的，關(guān)節(jié)周的或關(guān)節(jié)內(nèi)的給藥的藥物，用于進入腦脊髓液，進入腦，進入肝，進入腎，進入腸或進入舌的給藥的藥物，或用于腹膜內(nèi)的，胸膜內(nèi)的或全身的，如靜脈內(nèi)的，動脈內(nèi)的，門靜脈內(nèi)的或心臟內(nèi)的給藥的藥物，并涉及為了預(yù)防和/或治療疾病，利用根據(jù)本發(fā)明的細胞制備用于局部或全身給藥的藥物。
附圖的說明圖1顯示最簡單形式的新核酸構(gòu)建體的圖。圖2顯示用編碼核輸出信號(NES)的基因和編碼核輸出因子(NEF)的基因補充后，圖1所示的核酸構(gòu)建體的圖。圖3顯示通過IRES連接成份c)和成份d)的圖。圖4顯示圖1-3描述的單個成份反應(yīng)的方案的圖。圖5顯示用其它結(jié)構(gòu)基因增大核酸構(gòu)建體的圖。圖6顯示用其它轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基因增大核酸構(gòu)建體的圖。圖7顯示在用編碼NES和NEF的基因補充后的圖3中描述的核酸構(gòu)建體的圖。圖8顯示最簡單形式的藥物可控制啟動子單位的圖。圖9顯示圖8描述的單個成份反應(yīng)的方案的圖。圖10顯示自我增強，藥物學(xué)上可控制的表達系統(tǒng)的圖。圖11顯示用成份i)替代成份a)和b)和用IRES區(qū)以及用含有成份e)，f)，g)和h)的藥物學(xué)上可控制的啟動子單位替代成份d)的圖。圖12顯示用含有成份e)，f)，g)，h)和i)的藥物學(xué)上可控制的啟動子單位替代成份b)的圖。圖13顯示用于特異于細胞周期和特異于細胞的β-葡糖苷酸酶的表達的自我增強的表達系統(tǒng)的圖。圖14和15顯示兩個不是自我增強的表達系統(tǒng)的圖。圖16顯示用于特異于細胞周期和藥物學(xué)上可控制的β-葡糖苷酸酶的表達的自我增強，藥物學(xué)上可控制的表達系統(tǒng)。
本發(fā)明借助于下面實施例進行詳細的描述。
實施例1.自我增強的表達系統(tǒng)的構(gòu)建為了以特異于細胞周期和特異于細胞的方式表達β-葡糖苷酸酶，根據(jù)圖13描述的方案制備了自我增強的表達系統(tǒng)。
以5’-3’的方向?qū)蝹€成份的DNA序列如下結(jié)合在一起-成份a)·結(jié)合Gal4蛋白的序列[核苷酸序列5’-CGGACAACTGTTGACCG-3’](Chasman和Kornberg，Mol.CellBiol.10,2916(1990))-成份b)·cdc25C基因的啟動子序列[核酸-290-+121；Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995)；Zwicker等，核酸研究23,3822(1995)；EMBOJ.14,4514(1995))
-成份c)·序列GCCACC(Kodak，細胞生物學(xué)雜志108,229(1989))·免疫球蛋白信號肽的cDNA[核苷酸序列≤63-≥107；Riechmann等，自然332,323(1988))·人β-葡糖苷酸酶的cDNA[核苷酸序列≤93-≥1982；Oshima等，PNAS USA84,685(1987))-成份a’)·結(jié)合Gal4蛋白的序列(Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1990))-成份b’)·VEGF的受體基因的啟動子序列[核酸-1195-+≥110；Morishita等，J.Biol.Chem.270,27948(1995))-成份d)·Gal4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)[氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1990))的cDNA·SV40核定位信號(NLS)(SV40大T氨基酸126-132PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991))的cDNA·HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))的cDNA通過在PCR擴增過程中伴隨著導(dǎo)入在不同元件的末端的適當限制位點將構(gòu)建體單個成份連接起來。利用技術(shù)人員已知的特異于限制位點的酶和DNA連接酶將這些成份連接起來。這些酶可以從市場購買。
利用技術(shù)人員已知的方法用所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染保持在培養(yǎng)物中的人臍帶內(nèi)皮細胞和成纖維細胞(Wi-38)(Lucibello等，EMBO J.14,132(1995))并且利用4-甲基lumbelliferyl-β-葡糖苷酸作為底物測量內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的β-葡糖苷酸酶的量。
為了檢查細胞周期特異性，通過除去甲硫氨酸使內(nèi)皮細胞以G0/G1同步48小時。在用Hoeehst 33258(Hoeehst AG，F(xiàn)rankfurt)染色后，在熒光活化細胞分析器中確定細胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995))。
得到下面的結(jié)果與未轉(zhuǎn)染的成纖維細胞相比在轉(zhuǎn)染的成纖維細胞中不可能檢測到任何β-葡糖苷酸酶的增加。
轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞明顯地比未轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞表達更多的β-葡糖苷酸酶。
增殖的內(nèi)皮細胞(DNA＞2S)明顯地比以G0/G1同步的內(nèi)皮細胞(DNA＝2S)分泌更多的β-葡糖苷酸酶。
結(jié)果是，已經(jīng)敘述的自我增強的表達系統(tǒng)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因β-葡糖苷酸酶的特異于細胞的，依賴于細胞周期的表達。
現(xiàn)在將新的自我增強的表達系統(tǒng)的表達強度和兩個不是自我增強的表達系統(tǒng)的表達強度進行比較。這些后面的系統(tǒng)是根據(jù)圖14和15描述的方案制備的。
在這種情況中，如圖13描述的方案已經(jīng)敘述的，成份b)，b’)和c)的組成是相同的。
構(gòu)建體的這些各個成份通過在PCR擴增過程中伴隨著導(dǎo)入不同元件的末端的適當?shù)南拗莆稽c連接起來。利用技術(shù)人員已知的特異于限制位點的酶和DNA連接酶將這些成份連接起來。這些酶可以從市場購買。
將以這種方式制備的核苷酸構(gòu)建體克隆進pUC18/19或起源于Bluescript的質(zhì)粒載體。
利用技術(shù)人員已知的方法用所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染保持在培養(yǎng)物中的人臍帶內(nèi)皮細胞(Lucibello等，EMBO J.14,132(1995))并且利用4-甲基lumbelliferyl-β-葡糖苷酸作為底物測量內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的β-葡糖苷酸酶的量。
得到下面的結(jié)果用含有圖14和15描述的核酸構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的增殖的內(nèi)皮細胞明顯地比用含有圖13描述的新核酸構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的增殖的內(nèi)皮細胞表達更少的β-葡糖苷酸酶。
已經(jīng)敘述的自我增強的表達系統(tǒng)對結(jié)構(gòu)基因β-葡糖苷酸酶的表達明顯增強。
2.構(gòu)建自我增強的，藥物學(xué)上可控制的表達系統(tǒng)如圖16描述，制備了對應(yīng)于圖11的圖顯示的結(jié)構(gòu)的自我增強的，藥物學(xué)上可控制的表達系統(tǒng)用于特異于細胞周期和藥物學(xué)上可控制的β-葡糖苷酸酶的表達。
以5’-3’的方向如下將單個成份的DNA序列連接起來-成份i)·結(jié)合Gal4蛋白的序列[核苷酸序列5’-CGGACAACTGTTGACCG-3’](Chasman和Kornberg，Mol.CellBiol.10,2916(1990))·SV40基本啟動子[核苷酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，紐約，冷泉港實驗室)]-成份c)·序列GCCACC(Kodak，細胞生物學(xué)雜志108,229(1989))·免疫球蛋白信號肽的cDNA[核苷酸序列≤63-≥107；Riechmann等，自然332,323(1988)]·人β-葡糖苷酸酶的cDNA[核苷酸序列≤93-≥1982；Oshima等，PNAS USA84,685(1987)]-成份e)·結(jié)合Gal蛋白的序列(Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1990))·cdc25C基因的啟動子序列[核苷酸-290-+121；Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995)；Zwicker等，核酸研究23,3822(1995)；EMBO J.14,4514(1995)]-成份f).皰疹病毒VP16活化區(qū)的cDNA(Greaves等，病毒學(xué)雜志64,2716(1990)；65,6705(1991))
·重組抗-環(huán)孢菌素A Fv(A)(蛋白質(zhì)A)的cDNA-成份g)·對應(yīng)于成份e)-成份h)·重組的抗環(huán)孢菌素A Fv(B)(蛋白質(zhì)B)的cDNA·Gal4蛋白的DNA-結(jié)合區(qū)[氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，Mo1.Cell Biol.10,2916(1990)]的cDNA·SV40核定位信號(NLS)[SV40大T；氨基酸126-132PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991)]的cDNA·HSV-1VP16酸反式激活區(qū)(TAD)[氨基酸406-488；Triezenberg等，基因發(fā)展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995)]的cDNA。
如Cacalano等，分子免疫學(xué)29,107(1992)所述制備了抗環(huán)孢菌素A的抗體。為此，利用4-苯甲酰苯甲酸和UV光將環(huán)孢菌素A與牛血清白蛋白偶聯(lián)。對Balb/c鼠皮下施用偶聯(lián)產(chǎn)物幾次。在最后免疫后14天分離脾細胞。利用mRNA提取試劑盒(來自Pharmacia，F(xiàn)reiburg)從這些細胞中提取mRNA。然后在cDNA合成試劑盒和隨機的六低聚核苷酸(來自Pharmacia，F(xiàn)reiburg)的幫助下利用逆轉(zhuǎn)錄將該mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過利用特異引物(Clackson等，自然，352,624(1991)；Sastry等，PNAS USA86,5728(1989)；Ward等，自然341,544(1989)；Orlandi等，PNAS USA86,3833(1989))的聚合酶鏈反應(yīng)(Saiki等，科學(xué)230,1350(1985))將該cDNA作為起始物質(zhì)用于擴增免疫球蛋白的可變的重鏈或可變的輕鏈。
為了將這些片段克隆進細菌表達載體pHENIS(起源于pHEN1；Hoogenboom等，核酸研究19,4133(1991)；參見圖1))，在同時利用引物導(dǎo)入限制切割位點。這一載體含有用于周質(zhì)分泌的pelB信號序列，用于檢測單克隆抗體9E10的myc標記，用于通過固定金屬親和層析(IMAC)的純化的組氨酸標記，以及重鏈和輕鏈的克隆區(qū)和編碼14個氨基酸長度的甘氨酸-絲氨酸接頭的短序列。為了在噬菌體表面顯示的目的也進行與基因3蛋白質(zhì)(g3P)的融合。用適當?shù)南拗泼赶睾洼p鏈(用SfiI和ShoI對VH；用ApaLI和NotI對VL)并連續(xù)地克隆進載體。這產(chǎn)生了含有通過短肽序列共價地連接的可變重鏈和可變輕鏈的重組單鏈Fv片段。
依照抗體片段的噬菌體顯示，將結(jié)合抗原區(qū)以scFv片段(McCafferty等，自然348,552(1990))的形式，作為與絲狀噬菌體包衣蛋白g3P的融合蛋白克隆進噬菌粒載體(Breitling等，基因104,147(1994))。在負載環(huán)孢菌素A的塑料托盤(鍋)上選擇結(jié)合抗原的噬菌體(Marks等，J.Mol.Biol.222,581(1991))。
將結(jié)合環(huán)孢菌素A的噬菌體克隆并增殖，然后再一次在負載環(huán)孢菌素A的塑料托盤上選擇。在選擇4次后，選擇兩個相互不抑制的結(jié)合環(huán)孢菌素A的克隆(蛋白質(zhì)A和B)。
通過用這一鼠重組Fv片段的對應(yīng)區(qū)(Jones等，自然321,522(1987))替代人抗體中的超可變區(qū)將鼠重組Fv片段(蛋白質(zhì)A和B)人源化。
通過在PCR擴增過程中在不同元件的末端導(dǎo)入適當?shù)南拗莆稽c將構(gòu)建體連接起來。利用特異于限制位點的酶和技術(shù)人員已知的DNA連接酶實現(xiàn)連接。這些酶可以從市場購買。
將以這種方式制備的核苷酸構(gòu)建體克隆進起源于pUC18/19或起源于Bluescript的質(zhì)粒載體。
利用技術(shù)人員已知的方法(Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995))用所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染保持在培養(yǎng)物中的人臍帶內(nèi)皮細胞并且利用4-甲基lumbelliferyl-β-葡糖苷酸作為底物測量有和沒有添加環(huán)孢菌素A(0.01-1.0μg/ml的培養(yǎng)基)的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的β-葡糖苷酸酶的量。
為了檢查細胞周期特異性，通過除去甲硫氨酸將內(nèi)皮細胞以G0/G1同步48小時。在用Hoechst 33258(Hoeehst AG，F(xiàn)rankfurt)染色后，在熒光活化細胞分析器中確定細胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995))。
得到下面的結(jié)果
在缺乏加入的環(huán)孢菌素A時，與未轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞相比，在轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞中不可能檢測到β-葡糖苷酸酶的任何增加。
在加入環(huán)孢菌素A后，轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞明顯地此未轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞表達更多的β-葡糖苷酸酶。
增殖的內(nèi)皮細胞(DNA＞2S)明顯地比以G0/G1同步的內(nèi)皮細胞(DNA＝2S)分泌更多的β-葡糖苷酸酶。
已經(jīng)敘述的自我增強的表達系統(tǒng)導(dǎo)致依賴于細胞周期的并通過加入環(huán)孢菌素A可控制的結(jié)構(gòu)基因β-葡糖苷酸酶的表達。
根據(jù)圖14描述的圖通過新的，自我增強的，藥物學(xué)上可控制的表達系統(tǒng)獲得的表達強度比通過實施例1)制備的非自我增強的表達系統(tǒng)獲得的表達強度大。
權(quán)利要求
1.核酸構(gòu)建體，它含有至少一個編碼活性化合物的第一個結(jié)構(gòu)基因；至少一個編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的第二個結(jié)構(gòu)基因；和至少一個由至少一個結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白的序列和至少一個啟動子序列組成的活化序列；其中每個活化序列激活結(jié)構(gòu)基因的表達和轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體，其中一個活化序列連接于第一個結(jié)構(gòu)基因的5’末端并且一個活化序列連接于轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因的5’末端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸構(gòu)建體，含有兩個相同的轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合序列和兩個不同的啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建體，進一步包括內(nèi)部核糖體入口位點，其中內(nèi)部核糖體入口位點參與活化序列對轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達的激活。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的核酸構(gòu)建體，進一步包括附加于第一個結(jié)構(gòu)基因上的核輸出信號序列；第三個啟動子；和核輸出因子基因序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的核酸構(gòu)建體，其中至少兩個結(jié)構(gòu)基因由IRES序列或由活化序列相互連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的核酸構(gòu)建體，其中至少兩個轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因由IRES序列或活化序列相互連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸構(gòu)建體，其中所述的轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因是不同的，并且從所述基因的轉(zhuǎn)錄因子蛋白在核酸構(gòu)建體中結(jié)合所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的核酸構(gòu)建體，進一步包括藥物學(xué)上可控制單位，該單位依次包括至少一個啟動子；至少一個融合蛋白基因，該基因包括轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活化區(qū)，和結(jié)合偶聯(lián)蛋白的序列；至少一個啟動子；至少一個融合蛋白基因，其中融合蛋白包括DNA結(jié)合蛋白，和結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)的蛋白；和至少一個包括DNA結(jié)合蛋白的位點的活化序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的核酸構(gòu)建體，包括至少一個編碼活性化合物的第一個結(jié)構(gòu)基因；至少一個編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的第二個結(jié)構(gòu)基因；和至少一個由至少一個結(jié)合所述的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的序列和至少一個依次包括至少一個啟動子，至少一個編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活化區(qū)和編碼偶聯(lián)物質(zhì)蛋白的融合蛋白基因，至少一個啟動子，至少一個編碼DNA結(jié)合蛋白和編碼第二個偶聯(lián)物質(zhì)蛋白的融合蛋白基因，和至少一個含有DNA結(jié)合蛋白位點的活化序列組成的活化序列，其中每個活化序列激活結(jié)構(gòu)基因的表達和轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的核酸構(gòu)建體，包括至少一個編碼活性化合物的第一個結(jié)構(gòu)基因；至少一個編碼至少一個第一個融合蛋白的第二個結(jié)構(gòu)基因，該融合蛋白含有轉(zhuǎn)錄因子蛋白的活化區(qū)和結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)的序列；至少一個編碼至少一個第二個融合蛋白的第三結(jié)構(gòu)基因，該融合蛋白包括結(jié)合偶聯(lián)物質(zhì)的蛋白和DNA結(jié)合蛋白；至少一個由至少一個結(jié)合所述第二個融合蛋白的活化序列，該融合蛋白通過偶聯(lián)物質(zhì)與所述的第一個融合蛋白偶聯(lián)，和至少一個啟動子序列組成的活化序列；其中每個活化序列激活至少一個所述結(jié)構(gòu)基因的表達。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項所述的核酸構(gòu)建體，其中所述的活化序列含有結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白的序列，選自含有Gal4蛋白基因，LexA蛋白基因，LacI阻遏蛋白基因，四環(huán)素阻遏蛋白基因，和ZFHD-1蛋白基因的組的序列；選自含有與HSV-1VP16的反式激活區(qū)結(jié)合的基本c-fos啟動子，與Oct-2活化區(qū)的序列結(jié)合的U2snRNA啟動子和HSV TK啟動子的組的啟動子序列；和選自含有Gal4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)，LexA蛋白的DNA結(jié)合區(qū)，LacI阻遏蛋白基因，四環(huán)素阻遏蛋白基因和ZFHD1蛋白基因的組的轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的核酸構(gòu)建體，其中所述的轉(zhuǎn)錄因子蛋白含有SV40核定位信號和HSV-1VP16酸反式激活區(qū)。
14.根據(jù)權(quán)利要求9-11任一項所述的核酸構(gòu)建體，其中所述第一個融合蛋白編碼序列選自含有皰疹病毒VP16反式激活區(qū)，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的p65亞基，和直接或間接地與Oct-2C末端脯氨酰胺豐富的Oct-2區(qū)連接的Oct-2N末端谷氨酰胺豐富區(qū)的組；所述的第二個融合蛋白編碼序列選自含有Gal4蛋白的DNA結(jié)合區(qū)，LexA蛋白的DNA結(jié)合區(qū)，LacI阻遏蛋白，四環(huán)素阻遏蛋白，ZFHD1蛋白的組；所述的結(jié)合蛋白的活化序列選自含有Gal4蛋白，LexA蛋白，LacI阻遏蛋白，四環(huán)素阻遏蛋白和ZFHD1蛋白的組；和其中結(jié)合蛋白質(zhì)的活化序列與選自含有基本SV40啟動子，與HSV-1VP16反式激活區(qū)結(jié)合的c-fos啟動子，與HSV-1VP16反式激活區(qū)或至少一個Oct-2活化區(qū)的序列結(jié)合的U2snRNA啟動子的組的啟動子，和HSV TK啟動子連接。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸構(gòu)建體，進一步包括SV40核定位信號和HSV-1VP16酸反式激活區(qū)，其中SV40核定位信號和HSV-1VP16酸反式激活區(qū)存在于編碼融合蛋白的基因中。
16.根據(jù)權(quán)利要求9-15之一所述的核酸構(gòu)建體，其中至少一個融合蛋白含有抗體或抗體片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸構(gòu)建體，其中所述的抗體片段含有具有可變鏈和輕鏈的單鏈Fv片段，其中可變和輕鏈與短肽序列共價地連接。
18.根據(jù)權(quán)利要求9-15之一所述的核酸構(gòu)建體，其中至少一個融合蛋白含有天然存在的蛋白的結(jié)合區(qū)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-18之一所述的核酸構(gòu)建體，其中至少一個啟動子選自含有RNA聚合酶III，RNA聚合酶II，CMV啟動子和增強子，SV40啟動子，HBV啟動子，HCV啟動子，HSV啟動子，HPV啟動子，EBV啟動子，HTLV啟動子，HIV啟動子，cdc25C啟動子，細胞周期蛋白A啟動子，cdc2啟動子，bmyb啟動子，DHFR啟動子和E2F-1啟動子的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建體，其中核輸出信號和對應(yīng)的核輸出因子選自逆轉(zhuǎn)錄病毒的rev-反應(yīng)元件/rev蛋白，該逆轉(zhuǎn)錄病毒選自含有HIV-1，HIV-2，HTLV-1和HBV的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20之一所述的核酸構(gòu)建體，其中結(jié)構(gòu)基因編碼選自含有細胞增殖抑制劑，抑制細胞生長或有細胞毒性的蛋白，切割前藥物的酶，抗體，抗體片段和其它蛋白質(zhì)之間的融合蛋白，細胞因子，生長因子，激素，細胞因子和生長因子的受體，細胞因子拮抗物，炎癥誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)凝固的因子，凝固抑制劑，誘導(dǎo)血纖維蛋白溶解的蛋白，血管形成抑制劑，血管形成因子，超張力的肽，血漿蛋白，胰島素受體，LDL受體，缺少時導(dǎo)致代謝疾病或免疫阻遏的酶，病毒抗原，細菌抗原，寄生抗原或腫瘤抗原，這些抗原的抗個體基因型抗體，和起源于這些的任何組合的融合蛋白的組的化合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求9-21之一的核酸構(gòu)建體，其中至少兩個結(jié)構(gòu)基因由IRES序列或活化序列相互連接。
23.含有根據(jù)權(quán)利要求1-22之一所述的核酸構(gòu)建體的載體。
24.含有根據(jù)權(quán)利要求1-22之一所述的核酸構(gòu)建體和藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的藥物組合物，進一步包括結(jié)合融合蛋白的偶聯(lián)物質(zhì)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述偶聯(lián)物質(zhì)滲透過細胞膜，進入細胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中所述偶聯(lián)物質(zhì)選自含有納巴霉素，F(xiàn)K506，環(huán)孢菌素A，氨甲喋呤，葉酸，視黃酸，青霉素，4-羥基他莫昔芬，他莫昔芬，四環(huán)素，和四環(huán)素/異丙基-β-D-硫代半乳糖苷結(jié)合物的組。
28.含有權(quán)利要求1-22之一所述的核酸構(gòu)建體的細胞。
29.制備權(quán)利要求1-22之一所述的核酸構(gòu)建體的方法，包括將結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白的序列與啟動子序列連接形成活化序列；和將活化序列與至少一個結(jié)構(gòu)基因和至少一個編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的基因連接。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-22之一所述的核酸構(gòu)建體，根據(jù)權(quán)利要求23所述的載體，根據(jù)權(quán)利要求24-27之一所述的藥物組合物，或根據(jù)權(quán)利要求28所述的細胞制備防止或改善疾病的藥物的應(yīng)用。
31.制備藥物組合物的方法，包括用權(quán)利要求1一22之一所述的DNA構(gòu)建體體外轉(zhuǎn)化細胞；培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞以獲得多重拷貝的DNA構(gòu)建體；和從培養(yǎng)細胞純化DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及構(gòu)成自我增強的表達系統(tǒng)并含有下面的成分的核酸構(gòu)建體:至少一個第一個編碼活性化合物的結(jié)構(gòu)基因;至少一個第二個編碼轉(zhuǎn)錄因子蛋白的結(jié)構(gòu)基因;和至少一個由至少一個結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子蛋白的序列和至少一個啟動子序列組成的活性序列;其中每個活性序列激活結(jié)構(gòu)基因的表達和轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達;并涉及利用核酸構(gòu)建體制備治療疾病的藥物。
文檔編號C12N15/63GK1191898SQ97120870
公開日1998年9月2日 申請日期1997年12月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月11日
發(fā)明者R·穆勒, H·H·塞德拉塞克 申請人:赫徹斯特股份公司