專(zhuān)利名稱(chēng)：來(lái)自芳族新陳代謝/i的物質(zhì)的微生物制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物制備物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)特別是按照權(quán)利要求1-23、36和37的芳族氨基酸，涉及按照權(quán)利要求24-29的基因結(jié)構(gòu)，和涉及按照權(quán)利要求30-35的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
由于例如對(duì)氨基酸的需求持續(xù)增加，故微生物制備諸如精細(xì)化學(xué)藥品的物質(zhì)，特別是芳族氨基酸，有巨大的經(jīng)濟(jì)利益。因此，例如用L-苯丙氨酸制備藥物，具體地說(shuō)，也用于制備增甜劑天冬苯丙二肽酯(α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)。需要L-色氨酸作為藥物和作為動(dòng)物飼料的添加劑；對(duì)于L-酪氨酸，也同樣有作為藥物的需要，并也有作為制藥工業(yè)中的原料的需要。除了從天然材料中分離，生物技術(shù)制備也是在經(jīng)濟(jì)許可的情況下獲得希望的光學(xué)活性形式的氨基酸的很重要的方法?；蛘呤褂妹?，或者使用微生物實(shí)現(xiàn)生物技術(shù)制備。后一種微生物制備享有以下優(yōu)點(diǎn)即可以使用簡(jiǎn)單和價(jià)廉的原料。雖然以各種各樣的方式控制在細(xì)胞中生物合成氨基酸，但是，人們已經(jīng)進(jìn)行大量嘗試，以增加產(chǎn)物生成。因此，例如為了切斷生物合成的調(diào)節(jié)，使用氨基酸類(lèi)似物。例如，根據(jù)對(duì)苯丙氨酸類(lèi)似物(GB-2,053,906)的抗性通過(guò)選擇獲得允許L-苯丙氨酸生產(chǎn)增加的大腸桿菌(E.coli)的突變體。相似的策略也產(chǎn)生棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(JP-19037/1976和JP-39517/1978)和芽孢桿菌屬(Bacillus)(EP-0,138,526)的過(guò)量生產(chǎn)菌株。而且，已知使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的微生物，在所述微生物中同樣消除了生物合成的調(diào)節(jié)，具有克隆并表達(dá)的編碼不再受反饋抑制的關(guān)鍵酶的基因。作為原型，EP-0,077,196描述了一種生產(chǎn)芳族氨基酸的方法，其中在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)不再受反饋抑制的3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸(arabinoheptulosonate)-7-磷酸合酶(DAHP合酶)。EP-0,145,156描述了一種大腸桿菌菌株，其中為了生產(chǎn)L-苯丙氨酸，另外過(guò)量表達(dá)分支酸變位酶/預(yù)苯酚鹽脫水酶。
上述策略共有的特征是用于提高產(chǎn)量的干涉只限于對(duì)芳族氨基酸特有的生物合成途徑。然而，為了更進(jìn)一步增加產(chǎn)量，必需努力提高生產(chǎn)芳族氨基酸所需的初級(jí)代謝物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤蘚糖4-磷酸(Ery4P)的供給。
PEP是糖酵解產(chǎn)物丙酮酸的活化前體；Ery4P是戊糖磷酸途徑的中間體。
已進(jìn)行不同的嘗試以使初級(jí)代謝物Ery4P的供給獲得明確的增加。在大腸桿菌中通過(guò)關(guān)閉磷酸葡糖異構(gòu)酶，使通過(guò)戊糖磷酸途徑的碳流增加；這導(dǎo)致色氨酸生成(Mascarenhas D.等，Appl.Environ.微生物57(1991)2995-99)。US-A-5,168,056公開(kāi)了利用重組DNA技術(shù)使轉(zhuǎn)酮酶過(guò)量表達(dá)，這使獲得Ery4P的供給增加成為可能，從而增加了作為產(chǎn)物的L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的生成。Draths K.M.等(J.Am.Chem.Soc.114(1992)3956-62)和Flores N.等(Nat.Biotechnol.14(1996)620-3)都證實(shí)了相同的結(jié)果。然而，如Feldmann指出，在沒(méi)有轉(zhuǎn)醛酶活性的活動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)菌株中僅僅增加轉(zhuǎn)酮酶活性，導(dǎo)致在細(xì)胞中戊糖磷酸途徑代謝物富集，并因此對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有負(fù)面影響(Feldmann S.D.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，38(1992)354-61)。該生理效應(yīng)可能是由于細(xì)胞內(nèi)景天庚酮糖-7-磷酸濃度過(guò)量造成的。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌tal+菌株中由于轉(zhuǎn)酮酶過(guò)量表達(dá)造成的相應(yīng)的生物質(zhì)生長(zhǎng)抑制。
所以本發(fā)明的目的是使得生產(chǎn)物質(zhì)、特別是生產(chǎn)芳族氨基酸的的可選方法可利用，該方法的區(qū)別在于，增加細(xì)胞內(nèi)這些物質(zhì)合成的代謝物中間體的供給，而沒(méi)有由于只增加轉(zhuǎn)酮酶的活性造成的上述方法缺點(diǎn)。
令人驚訝的是，按照本發(fā)明，通過(guò)利用微生物制備物質(zhì)的方法達(dá)到了該目的，在所述方法中，由于在該微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)活性存在、降低或消失，增加生產(chǎn)這些物質(zhì)的微生物中的轉(zhuǎn)醛酶活性。
該結(jié)果特別令人驚訝之處在于，轉(zhuǎn)醛酶在微生物生長(zhǎng)和在其生產(chǎn)這些物質(zhì)時(shí)起重要作用決不是不證自明的。這特別適用于在己糖上生長(zhǎng)的情況。因此，例如已知的酵母菌株，盡管在轉(zhuǎn)醛酶基因中有突變，但仍然能夠在葡萄糖中生長(zhǎng)(Schaaff L.等，Eur.J.Biochem.188(1990)597-693)。所以，轉(zhuǎn)醛酶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)應(yīng)該沒(méi)有施加任何實(shí)質(zhì)影響。這有下述事實(shí)支持，即在沒(méi)有轉(zhuǎn)醛酶的情況下，也已知細(xì)菌物種能夠生長(zhǎng)(Feldmann S.D.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.38(1992)354-62)。
另外，與木糖和其它戊糖相比，諸如葡萄糖的己糖也可以通過(guò)與戊糖代謝途徑不同的降解途徑代謝。所以轉(zhuǎn)醛酶在葡萄糖降解上起實(shí)質(zhì)作用決不是不證自明的。
也可以注意到，在玻璃試管內(nèi)，在轉(zhuǎn)醛酶活性增加的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞的提取物中檢測(cè)作為戊糖磷酸途徑的酶流的增加(Senac T.等，Appl.Environ.Microbiol.57(1991)1701-6)。然而，在該研究中選擇的實(shí)驗(yàn)條件不允許任何對(duì)出現(xiàn)在活微生物中、特別是細(xì)菌中天然的代謝生理學(xué)現(xiàn)象結(jié)果的轉(zhuǎn)移。另外，可以注意到Liao J.C.等(Biotechn.Bioeng.52(1996)129-140)指出，當(dāng)轉(zhuǎn)醛酶和AroG的活性同時(shí)增加時(shí)，DAHP生成增加。該結(jié)果主要是由于AroG活性增加造成的。像由于轉(zhuǎn)醛酶活性增加，物質(zhì)產(chǎn)量增加這樣的，沒(méi)有公開(kāi)或表明。所以一點(diǎn)也不希望在微生物中轉(zhuǎn)醛酶活性增加和用于提高物質(zhì)產(chǎn)量的Ery4P的供給之間有因果關(guān)系。根據(jù)本發(fā)明增加轉(zhuǎn)醛酶活性(過(guò)量表達(dá))使得可獲得一種可選的方法，以實(shí)現(xiàn)通過(guò)戊糖磷酸途徑的碳流的增加，并因此實(shí)現(xiàn)了所述初級(jí)代謝物Ery4P供給的增加。所以Ery4P的增加量可用于下述物質(zhì)的微生物合成，在所述物質(zhì)合成中，至少涉及一個(gè)戊糖磷酸途徑的中間體，具體地說(shuō)是Ery4P。本發(fā)明人已指出，Ery4P的利用率增加，既可以在PEP依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)的活性存在或減少的微生物中產(chǎn)生，也可以在不存在這樣的活性的微生物中產(chǎn)生。因此，按照本發(fā)明不但可以使用仍然具有活性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)或活性降低的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(pts+菌株)的生物，而且可以使用關(guān)閉PTS的生物(pts-菌株)。
按照本發(fā)明的定義，物質(zhì)可以理解為例如精細(xì)化學(xué)藥品，諸如芳族氨基酸、靛藍(lán)、吲哚乙酸、己二酸、黑色素、醌和苯甲酸，也包括它們的潛在衍生物和次級(jí)產(chǎn)物，或者在一般意義上說(shuō)，為戊糖磷酸途徑的中間體的次級(jí)產(chǎn)物。然而，這也應(yīng)當(dāng)包括供給4-磷酸赤蘚糖促進(jìn)其生物化學(xué)合成的所有化合物，例如吡哆醇及其衍生物。在本發(fā)明范圍內(nèi)，也認(rèn)為所有這些物質(zhì)是來(lái)自芳族新陳代謝的物質(zhì)。可以注意到在該范圍內(nèi)，除用于制備靛藍(lán)、己二酸和其它非天然次級(jí)產(chǎn)物的新干涉之外，還需要對(duì)產(chǎn)生該物質(zhì)的微生物做進(jìn)一步的遺傳改變。按照本發(fā)明的方法特別適合于用微生物制備物質(zhì)，所述微生物在增加所述轉(zhuǎn)醛酶活性之前，沒(méi)有從預(yù)先含有磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(pts+菌株)的菌株作為磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)關(guān)閉(pts-菌株)的菌株進(jìn)行選擇。在這方面可以注意到，未預(yù)先公開(kāi)的專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)WO-96/34961描述了這樣一個(gè)從先前的pts+菌株中的選擇，但是在該研究中，該選擇在增加轉(zhuǎn)酮酶和轉(zhuǎn)醛酶活性之前。
關(guān)于增加轉(zhuǎn)醛酶活性，提供的優(yōu)選是增加大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶活性，特別是增加大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶B(TalB)活性。當(dāng)使用相應(yīng)的talB基因時(shí)，該基因優(yōu)選來(lái)源于大腸桿菌K12或由其衍生的菌株。然而，除此之外，任何其基因產(chǎn)物催化下述反應(yīng)的基因也是合適的，所述反應(yīng)相當(dāng)于轉(zhuǎn)醛酶催化的由7-磷酸景天庚酮糖加3-磷酸甘油醛向Ery4P和果糖-6-磷酸的轉(zhuǎn)化的反應(yīng)。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，除了增加轉(zhuǎn)醛酶活性，也增加轉(zhuǎn)酮酶活性。在存在戊糖的情況下，轉(zhuǎn)酮酶基因自身的表達(dá)導(dǎo)致在戊糖磷酸途徑中累積代謝物(Feldmann S.D.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，38(1992)354-61)。這對(duì)所述細(xì)胞有有害作用，特別是對(duì)以遞減速率生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞有有害作用。在葡萄糖中生長(zhǎng)并顯示轉(zhuǎn)酮酶活性增加的大腸桿菌菌株中，本發(fā)明人也觀察到同樣的效果。然而，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在增加轉(zhuǎn)醛酶活性的同時(shí)增加轉(zhuǎn)酮酶活性，對(duì)提供Ery4P很有利，也沒(méi)有顯示出僅過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)酮酶的負(fù)面影響。由于增加轉(zhuǎn)醛酶活性，所以增加轉(zhuǎn)酮酶活性時(shí)發(fā)生的戊糖磷酸途徑代謝物的累積不能實(shí)現(xiàn)，其結(jié)果是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的損害不僅停止，而且轉(zhuǎn)變成生長(zhǎng)增加。因此，結(jié)果是特別是在轉(zhuǎn)醛酶活性增加的菌株中按照本發(fā)明增加轉(zhuǎn)酮酶活性，是明智的方法。
關(guān)于增加轉(zhuǎn)酮酶活性，優(yōu)選增加大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶活性，特別是增加大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶A(TktA)活性。當(dāng)使用相應(yīng)的tktA基因時(shí)，該基因優(yōu)選來(lái)源于大腸桿菌K12或由其衍生的菌株。然而，除此而外，任何其基因產(chǎn)物催化下述反應(yīng)的基因也是合適的，所述反應(yīng)對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)酮酶催化的由5-磷酸核糖加5-磷酸木酮糖向7-磷酸景天庚酮糖加3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化，或者由5-磷酸木酮糖加Ery4P向6-磷酸果糖加3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化的反應(yīng)。
在本發(fā)明另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，除了增加轉(zhuǎn)醛酶活性或增加轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶的活性，也增加用于PEP不依賴(lài)性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和/或使相應(yīng)的糖磷酸化的激酶的活性。在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的情況下，將該蛋白的活性理解為是蛋白介導(dǎo)吸收速率。額外增加后面這些蛋白(即轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和所述激酶)中一種或這兩種的活性，由于增加PEP的提供量，用于同Ery4P縮合，以形成生物合成芳族化合物(即脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP))的通用途徑的初級(jí)代謝物，使得獲得甚至更高的物質(zhì)(特別是芳族氨基酸)的產(chǎn)量成為可能。
使用易化蛋白(facilitator)作為PEP不依賴(lài)性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是合理的，易化蛋白是按照蛋白介導(dǎo)的易化擴(kuò)散的原理起作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。特別是，使用來(lái)自活動(dòng)發(fā)酵單胞菌的葡糖易化蛋白(Glf)是合適的。當(dāng)使用后者時(shí)，從例如活動(dòng)發(fā)酵單胞菌ATCC 10988、ATCC29191或ATCC 31821中獲得蛋白編碼基因glf。然而，下述其它細(xì)菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因也適合于新方法，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)例如葡萄糖、果糖或蔗糖，并在這樣做時(shí)不使用任何PEP，例如來(lái)自大腸桿菌的GalP系統(tǒng)。一般也可以使用來(lái)自諸如釀酒酵母、(pichiastipitis)或克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis)的真核微生物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因(諸如HXT1至HXT7)或來(lái)自其它生物的糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因，只要這些基因在所述微生物中以功能方式表達(dá)，以及所述基因產(chǎn)物可以在前后序列中起作用，而不使用PEP轉(zhuǎn)運(yùn)糖。在氨基酸生產(chǎn)微生物(氨基酸生產(chǎn)者)中表達(dá)糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因可能特別合理。
所以，在按照所述新方法制備芳族氨基酸時(shí)，使用由活動(dòng)發(fā)酵單胞菌ATCC 31821分離的易化基因glf吸收諸如葡萄糖、果糖或甘露糖是特別合適的。(Parker C.等，Mol.Microbiol.15(1995)795-802；Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4)。按照本發(fā)明的方法特別適用于用微生物制備芳族氨基酸，在所述微生物中，PTS系統(tǒng)的活性降低或完全沒(méi)有。在這種情況下，不但在增加轉(zhuǎn)醛酶活性之前，而且在此之后，可以降低或關(guān)閉PTS系統(tǒng)。
特別是，為了避免由于膜蛋白的過(guò)量表達(dá)產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞的有害影響，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選將glf基因以低基因拷貝數(shù)插入。因此例如對(duì)于glf基因，優(yōu)選的基因拷貝數(shù)是2-5。將glf基因插入到ptsHI-crr操縱子基因中，例如插入到ptsI基因中是特別有利的。
當(dāng)使用糖磷酸化激酶時(shí)，使用優(yōu)選的激酶己糖磷酸化激酶，特別是來(lái)自活動(dòng)發(fā)酵單胞菌的葡糖激酶是合適的。當(dāng)使用后者時(shí)，該蛋白編碼基因glk得自例如活動(dòng)發(fā)酵單胞菌ATCC 10988、ATCC 29191或ATCC 31821。來(lái)自細(xì)菌的己糖-磷酸化激酶的其它基因也適用于新方法，所述基因的基因產(chǎn)物(諸如果糖激酶或甘露糖激酶)在消耗ATP的同時(shí)使己糖磷酸化。此外，例如來(lái)自諸如釀酒酵母的真核微生物的激酶的基因，或以一般方式來(lái)自其它生物的糖磷酸化激酶的基因也是合適的，只要它們可以在所述微生物(具體地說(shuō)是在氨基酸生產(chǎn)者中)可以以功能方式表達(dá)，并在不使用PEP使所述糖磷酸化時(shí)所述基因可以起作用。使葡萄糖磷酸化的葡糖激酶基因glk特別適合于按照所述新方法制備芳族氨基酸，所述基因從活動(dòng)發(fā)酵單胞菌ATCC 29191中分離。
在增加朝向Ery4P的物質(zhì)流的微生物中可以限制用于生產(chǎn)芳族氨基酸代謝物的第一個(gè)中間體的PEP的利用率。在這些情況下，減少或完全關(guān)閉在所述新陳代謝中的其它PEP消耗反應(yīng)是有利的，所述反應(yīng)諸如PEP糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的反應(yīng)，如果存在該系統(tǒng)，則其催化PEP依賴(lài)性糖吸收。按照本發(fā)明，仍然具有活性PTS基因的微生物(pts+菌株)和pts的活性降低(在本例中也認(rèn)為是pts+)或所述pts關(guān)閉(pts-菌株)的pts突變體都可以用于進(jìn)一步改進(jìn)所述方法？?；蛘呖梢栽诿杆缴蠈?shí)現(xiàn)這種性質(zhì)的減少，或者通過(guò)使用遺傳方法實(shí)現(xiàn)這種性質(zhì)的減少，例如將glf和/或glk基因插入到染色體中，特別是插入到ptsI基因的基因座中，該方法同時(shí)在所述染色體中使重組DNA穩(wěn)定(分離穩(wěn)定性)，并因此意味著無(wú)需使用載體。本發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)表明，在增加所述轉(zhuǎn)醛酶活性之前，優(yōu)選不應(yīng)發(fā)生所述PTS活性的降低或消除。
按照本發(fā)明的定義，可以將對(duì)增加活性的措施理解為適用于對(duì)增加所述轉(zhuǎn)醛酶、所述轉(zhuǎn)酮酶、所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和所述激酶的活性的所有措施。下述措施尤其適用于該目的-引入基因，例如使用載體或溫和噬菌體；-增加基因拷貝數(shù)，例如為了將按照本發(fā)明的基因以增加的拷貝數(shù)引入到所述微生物中，使用質(zhì)粒，所述增加的拷貝數(shù)是稍微(例如2-5次)增加的拷貝數(shù)至大幅(例如15-50次)增加的拷貝數(shù)；-增加基因表達(dá)，例如通過(guò)提高轉(zhuǎn)錄速率，例如通過(guò)使用諸如Ptac、Ptet或其它調(diào)節(jié)核苷酸序列的啟動(dòng)子元件，和/或通過(guò)提高翻譯速率，例如通過(guò)使用共有核糖體結(jié)合位點(diǎn)；-增加現(xiàn)存酶的內(nèi)源活性，例如利用通過(guò)常規(guī)方法(例如使用紫外照射或激發(fā)突變的化學(xué)藥品)以隨機(jī)方式產(chǎn)生的突變，或者利用諸如缺失、插入和/或核苷酸交換的突變，所述突變是用遺傳工程方法以特異性方式產(chǎn)生；-通過(guò)改變酶的結(jié)構(gòu)增加酶的活性，例如利用使用物理、化學(xué)或分子生物學(xué)或其它微生物學(xué)方法的誘變；-用去調(diào)節(jié)的酶，例如不再受反饋抑制的酶；-引入相應(yīng)的編碼所述去調(diào)節(jié)酶的基因。
也可以使用上述方法和其它類(lèi)似方法的組合增加所述活性。例如通過(guò)使用上述方法克隆所述基因，或者例如通過(guò)選擇顯示增加底物轉(zhuǎn)運(yùn)的突變體，可以增加轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)源或引入的活性。
最好是通過(guò)將所述一種或多種基因整合到一個(gè)或幾個(gè)基因結(jié)構(gòu)中，并將一種或多種基因的每一個(gè)以單拷貝或以增加的拷貝數(shù)引入到所述基因結(jié)構(gòu)中。按照本發(fā)明的定義，可以將基因結(jié)構(gòu)理解為一個(gè)基因或具有按照本發(fā)明的基因的任何其它核苷酸序列。合適的核苷酸序列可以是，例如質(zhì)粒、載體、染色體、噬菌體或不是環(huán)狀閉合的其它核苷酸序列。
按照本發(fā)明定義的染色體是已插入至少一個(gè)按照本發(fā)明的基因的染色體，產(chǎn)生的核酸序列帶有至少一個(gè)基因或比該染色體中天然含有的拷貝多一個(gè)基因拷貝。另一方面，例如在基因基因座內(nèi)的同源重組產(chǎn)生不必與天然形式不同的染色體。所以，如果不超過(guò)同源基因的自然數(shù)目，就認(rèn)為通過(guò)同源重組制備的染色體與本發(fā)明不一致。
按照本發(fā)明的定義，也將基因結(jié)構(gòu)理解為諸如載體、染色體和溫和噬菌體的上述基因載體的組合，在所述基因載體上分布按照本發(fā)明的基因。例如，可以用載體將兩個(gè)tal基因引入到所述細(xì)胞中，或可以將兩個(gè)tal基因插入到染色體中。另外，例如可以用噬菌體將另一個(gè)基因引入到所述細(xì)胞中。這同樣適用于按照本發(fā)明的其它基因。這些例子不是將其它基因分布組合排除在本發(fā)明之外。在任何情況下，包含在按照本發(fā)明的微生物中的基因數(shù)超過(guò)相應(yīng)基因的天然數(shù)目是決定性的。例如，為了實(shí)現(xiàn)按照本發(fā)明的活性的增加，最好glf基因數(shù)增加2-5倍。在這些濃度下沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞毒性作用。然而，也可以設(shè)想將按照本發(fā)明的基因以最高達(dá)50個(gè)基因拷貝的更高拷貝數(shù)的具有同樣作用的形式引入到所述微生物中。
在所述生產(chǎn)物質(zhì)的新方法中，優(yōu)選使用另外參與合成所述物質(zhì)的一種或多種酶被去調(diào)節(jié)和/或活性增加的微生物。
這些酶特別是芳族氨基酸新陳代謝的酶，尤其是DAHP合酶、莽草激酶和分支酸變位酶/預(yù)苯酚鹽脫水酶，也是參與合成芳族新陳代謝中間體及其次級(jí)產(chǎn)物的所有其它酶。
除了按照本發(fā)明的酶，特別是去調(diào)節(jié)和過(guò)量表達(dá)DAHP合酶對(duì)制備諸如己二酸、膽汁酸和苯醌化合物以及它們的衍生物的物質(zhì)很重要。另外，為了實(shí)現(xiàn)超高水平合成例如色氨酸、酪氨酸、靛藍(lán)以及羥基苯甲酸和氨基苯甲酸和萘醌和蒽醌和它們次級(jí)產(chǎn)物的衍生物，應(yīng)當(dāng)去調(diào)節(jié)莽草激酶，并增加其活性。去調(diào)節(jié)和過(guò)量表達(dá)的分支酸變位酶/預(yù)苯酚鹽脫水酶對(duì)有效生產(chǎn)苯丙氨酸和苯丙酮酸以及它們的衍生物也額外或特別重要。然而，這也將包括其酶活性有助于下述物質(zhì)生物化學(xué)合成的所有其它酶，所述物質(zhì)是通過(guò)供給4-磷酸赤蘚糖增加其產(chǎn)量的化合物，例如吡哆醇及其衍生物?？梢宰⒁獾匠诵赂缮嬷猓瑸榱酥苽涞逅{(lán)、己二酸和其它非天然次級(jí)產(chǎn)物，需要對(duì)產(chǎn)生物質(zhì)的微生物做進(jìn)一步遺傳改變。
具體而言，所述新方法特別適用于制備芳族氨基酸，特別是苯丙氨酸。在后一種情況下，最好是增加去調(diào)節(jié)的DAHP合酶(例如大腸桿菌中的AroF或AroH)和/或同樣去調(diào)節(jié)的分支酸變位酶/預(yù)苯酚鹽脫水酶(PheA)的基因表達(dá)和/或酶活性。
埃希氏菌屬(Escherichia)物種，還有沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬(Corynebacterium)、棒狀桿菌屬(Brevibacterium)或短頸細(xì)菌屬的微生物，和由常規(guī)氨基酸方法可知的其它菌株，適合用作生產(chǎn)微生物。大腸桿菌特別適合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供合適的基因結(jié)構(gòu)和攜帶這些結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，這些使得能夠以特別成功的方式完成所述方法。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，現(xiàn)在可以得到新基因結(jié)構(gòu)，所述重組形式的基因結(jié)構(gòu)包括a)編碼轉(zhuǎn)醛酶的基因或編碼轉(zhuǎn)醛酶的基因和編碼轉(zhuǎn)酮酶的基因，以及b)至少一個(gè)編碼PEP不依賴(lài)性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、或編碼使糖磷酸化的激酶的基因。在這些基因結(jié)構(gòu)中，最好是所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因編碼易化蛋白，而所述激酶的基因編碼己糖-磷酸化激酶。具體而言，所述轉(zhuǎn)醛酶和所述轉(zhuǎn)酮酶的基因得自大腸桿菌，而所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和所述激酶的基因得自活動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
下述基因結(jié)構(gòu)特別有利，所述轉(zhuǎn)醛酶的基因是大腸桿菌talB，所述轉(zhuǎn)酮酶的基因是大腸桿菌tktA，而所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因是活動(dòng)發(fā)酵單胞菌glf，所述激酶的基因是活動(dòng)發(fā)酵單胞菌glk。
分離合適的基因，并按照通用的方法轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞來(lái)自大腸桿菌K12的talB和tktA的完整的核苷酸序列是已知(Yura T.等，Nucl.Acid Res.20(1992)3305-8；Sprenger G.A.，Biochim.Biophys.Acta 1216(1993)307-10；Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-9)，并儲(chǔ)存在諸如Heidelberg中的EMBL的數(shù)據(jù)庫(kù)中。當(dāng)克隆大腸桿菌talB基因時(shí)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法適用于例如用大腸桿菌K12菌株的染色體DNA特異性擴(kuò)增所述基因(Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-9)。例如，當(dāng)克隆大腸桿菌tktA基因時(shí)，轉(zhuǎn)酮酶缺陷型突變體的同源互補(bǔ)是適合的(SprengerG.A.，Bisswanger H.等，Biochemistry and physiology ofthiamine diphosphate enzymes，VCH(1991)322-6)。
例如，當(dāng)克隆活動(dòng)發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)運(yùn)基因glf或活動(dòng)發(fā)酵單胞菌葡糖激酶基因glk時(shí)，PCR例如適于用活動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株ATCC 29191或ATCC 31821的染色體DNA特異性擴(kuò)增所述基因，PTS功能有缺陷并因此例如不能轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的大腸桿菌突變體的異源互補(bǔ)也是合適的(Snoep J.L.等，J.Bacteriol.174(1994)1707-8；Parker C.等，Mol.Microbiol.15(1995)795-82；Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4)。在分離所述基因并在體外將其同已知低拷貝數(shù)的載體(諸如pACYC184、pACYC177、pSC101或pZY507(Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4))重組后，使用化學(xué)方法、電穿孔、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞。
可以將分離的轉(zhuǎn)醛酶基因與在本發(fā)明正文所述內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)基因，以任何組合一起整合到一個(gè)或幾個(gè)基因結(jié)構(gòu)內(nèi)。不考慮對(duì)基因結(jié)構(gòu)的精確定位，這產(chǎn)生了諸如talB、talB+tktA、talB+glf、talB+glk、talB+glf+glk、talB+tktA+glf、talB+tktA+glk或talB+tktA+glf+glk的組合。
包括至少一個(gè)分配給所述基因之一的調(diào)節(jié)基因序列的基因結(jié)構(gòu)是有利的。因此，最好可以在轉(zhuǎn)錄水平上，特別是通過(guò)強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄信號(hào)實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)元件的強(qiáng)化。這可以例如通過(guò)提高一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的活性而實(shí)現(xiàn)，而提高一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的活性通過(guò)改變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動(dòng)子序列，或通過(guò)用更有效的啟動(dòng)子完全替換所述啟動(dòng)子而實(shí)現(xiàn)。也可以通過(guò)在分配給所述基因的調(diào)節(jié)基因上施加合適的影響強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄；然而，除此之外，例如通過(guò)提高信使RNA(mRNA)的穩(wěn)定性，也可能強(qiáng)化翻譯。
最合適的基因結(jié)構(gòu)是那些基因結(jié)構(gòu)，在這些基因結(jié)構(gòu)中插入至少一個(gè)所述基因，以使所述基因處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制之下。當(dāng)在按照本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)上布置所述基因時(shí)，啟動(dòng)子可以位于基因上游，或作為共用啟動(dòng)子在幾個(gè)基因的上游定位，或者可以使用兩個(gè)方向相反的啟動(dòng)子，在這兩個(gè)啟動(dòng)子之間布置所述基因，使得以相反的方向讀取所述基因。在該前后序列中，例如可以將glf基因定位于相對(duì)較弱的啟動(dòng)子(例如Ptet)的下游，而其它基因可以處于tac啟動(dòng)子控制之下。可以將一個(gè)或多個(gè)DNA序列定位于包含在基因結(jié)構(gòu)中的所述基因的上游和/或下游，所述基因有或沒(méi)有上游啟動(dòng)子，或有或沒(méi)有分配的調(diào)節(jié)基因。通過(guò)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子元件，例如lacl/Ptac，例如通過(guò)加入諸如異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的化學(xué)誘導(dǎo)劑，可能開(kāi)通新功能(誘導(dǎo)酶合成)。
通過(guò)提供帶有可復(fù)制形式的本發(fā)明基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞也可以達(dá)到本發(fā)明的目的。
按照本發(fā)明的定義，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞理解為具有按照本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)的任何微生物，所述基因結(jié)構(gòu)在所述細(xì)胞中引起物質(zhì)生成增加。利用化學(xué)方法(Hanahan D.，J.Mol.Biol.166(1983)557-580)，也可以利用電穿孔、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化所述宿主細(xì)胞。
對(duì)于所述轉(zhuǎn)化，最好使用另外參與所述物質(zhì)合成的一個(gè)或多個(gè)酶去調(diào)節(jié)和/或活性增加的宿主細(xì)胞。用包含所述相關(guān)基因的基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)芳族氨基酸或按照本發(fā)明的另一物質(zhì)的微生物菌株，特別是大腸桿菌。對(duì)于用所述基因結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，最好是使用PEP依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)的活性(如果存在)降低或消除的宿主細(xì)胞。
具體而言，提供能夠生產(chǎn)芳族氨基酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，芳族氨基酸優(yōu)選是L-苯丙氨酸。
使用所述新方法和按照本發(fā)明的內(nèi)容轉(zhuǎn)化的微生物，可以用范圍廣泛的底物生產(chǎn)物質(zhì)。在本發(fā)明所述范圍內(nèi)，因此也提供微生物制備物質(zhì)的方法，在所述方法中，培養(yǎng)按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中存在一個(gè)基因結(jié)構(gòu)，所述基因結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)分配給一個(gè)所述基因中的調(diào)節(jié)基因系列，并在至少兩次細(xì)胞分裂后(指數(shù)生長(zhǎng)期的開(kāi)始)，在所述微生物中誘導(dǎo)酶的合成。因此，所述微生物的生產(chǎn)的增加可以獨(dú)立于其生長(zhǎng)。
在所述新方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用下述轉(zhuǎn)化細(xì)胞，除了戊糖磷酸途徑的中間體以外，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞也含有利用率增加的中心新陳代謝的其它代謝物。這些代謝物包括，例如來(lái)自糖酵解或葡糖異生作用的丙酮酸，或來(lái)自檸檬酸循環(huán)的草酰乙酸。此外，可以利用相關(guān)的化合物或其前體以通過(guò)喂養(yǎng)使細(xì)胞生長(zhǎng)，所述化合物是丙酮酸前體或檸檬酸循環(huán)代謝物的前體，諸如延胡索酸或蘋(píng)果酸。
下文通過(guò)一些實(shí)行實(shí)施例更加詳細(xì)地解釋了本發(fā)明。下述菌種根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，保藏在德意志微生物保藏中心(DSM)DSM11210大腸桿菌AT2471/pZYTT7talDSM11209大腸桿菌AT2471/pZY557tkttalDSM11206大腸桿菌AT2471GP704glfint PTS+DSM11205大腸桿菌AT2471glfint PTS-使用的宿主細(xì)胞，即AT2471，已由Taylor和Trotter(Bacteriol.Rev.13(1967)332-353)保藏于CGSC中，保藏號(hào)為4510，并可免費(fèi)得到。
在表1中詳細(xì)描述了本專(zhuān)利申請(qǐng)范圍內(nèi)使用的所有微生物的特征和出處。
接下來(lái)的正文將表明使用的材料和方法，并以實(shí)驗(yàn)實(shí)施例和比較實(shí)施例支持本發(fā)明一般方法在所述遺傳研究中，除非另有說(shuō)明，否則一般在由Difco細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨(10g/l)、Difco酵母提取物(5g/l)和NaCl(10g/l)組成的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌菌種。根據(jù)所使用的菌種的抗性特性，如果必要，向所述培養(yǎng)基中加入羧芐青霉素(20-100mg/l)和/或氯霉素(17-34mg/l)。為此，首先將羧芐青霉素全部溶解在水中，將氯霉素溶解在乙醇中，在過(guò)濾除菌后，將所述溶液加入到預(yù)先高壓滅菌的培養(yǎng)基中。向所述LB培養(yǎng)基中加入Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(1.5％)，以制備瓊脂平板。使用市售的系統(tǒng)(Quiagen，Hilden)通過(guò)堿裂解法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA。如Chen和Kuo所述(Nucl.AcidRes.21(1993)2260)從大腸桿菌和活動(dòng)發(fā)酵單胞菌中分離染色體DNA。
按照生產(chǎn)商的說(shuō)明(Boehringer，Mannheim，德國(guó)或Promega，Heidelberg，德國(guó))使用限制酶、DNA聚合酶I、堿性磷酸酶、RNA酶和T4 DNA連接酶。對(duì)于限制性分析，在瓊脂糖凝膠(0.8％)中分離DNA片段，并使用市售的系統(tǒng)(Jetsorb Genomed，Bad Oeynhausen，德國(guó))通過(guò)提取從所述瓊脂糖中分離DNA片段。
對(duì)于DNA分析，用限制酶消化染色體DNA(10μg)，通過(guò)凝膠電泳按大小對(duì)染色體DNA分級(jí)分離，并通過(guò)真空介導(dǎo)的擴(kuò)散(VacuGene系統(tǒng)，Pharmacia，弗雷堡，德國(guó))將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Nytran 13，Schleicher and Schuell，Dassel，德國(guó))上。分離合適的DNA片段，以洋地黃毒苷-DUTP對(duì)其標(biāo)記，并將其用做探針。通過(guò)市售的標(biāo)記探測(cè)系統(tǒng)(Boehringer，Mannheim，德國(guó))進(jìn)行標(biāo)記、雜交、清洗步驟和探測(cè)。
對(duì)于轉(zhuǎn)化，在LB培養(yǎng)基中(5ml試管)于37℃和200rpm培養(yǎng)所述細(xì)胞2.5-3小時(shí)。在光密度(620nm)大約為0.4時(shí)，將所述細(xì)胞離心下來(lái)，并將其懸浮于十分之一體積的TSS(含有10％(w/v)PEG 8000、5％(v/v)DMSO和50mM MgCl2的LB培養(yǎng)基)中。于4℃同0.1-100ng的DNA溫育30分鐘后，接著于37℃溫育1小時(shí)后，在包含合適抗生素的LB培養(yǎng)基上將所述細(xì)胞鋪平板。實(shí)施例1制備pZY557tal、pBM20tal和pZY557tkttal，作為以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的按照本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)的原型和制備pZY557tat用限制酶BamHI和HindIII打開(kāi)質(zhì)粒pZY507(Weisser等，1995 J.Bacteriol 1773351-3345)，并分離較大的片段(10.1KB的DNA)。用BamHI和HindIII從載體pUCBM20(Boehringer Mannheim，德國(guó))切下一部分多克隆位點(diǎn)，并將其同大pZY507 BamHI/HindIII片段連接在一起，這產(chǎn)生載體pZY557，除了其它限制性切割位點(diǎn)之外，載體pZY557同載體pZY507相似。通過(guò)PCR由載體pGSJ451(Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-36)擴(kuò)增talB基因。為此，使用寡核苷酸I5′CCGCATGCTGTTTAAAGAGAAATA3′(此處帶有下劃線的堿基對(duì)對(duì)應(yīng)于Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-6所述talB序列的84至101堿基對(duì))，所述寡核苷酸I具有限制酶SphI的切割位點(diǎn)，并使用市售的M13/pUC測(cè)序引物(Boehringer Mannheim，德國(guó)，第1010093號(hào))作為寡核苷酸II。產(chǎn)生的擴(kuò)增DNA片段在每個(gè)末端包含一個(gè)SphI的切割位點(diǎn)，并用限制酶SphI切割。然后將該片段分別同載體pZY557和pUCBM20連接在一起，所述載體也已用SphI線性化。在用兩種連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌并克隆所述轉(zhuǎn)化體后，分別獲得重組質(zhì)粒pZY557tal和pBM20tal。通過(guò)PCR由載體pGSJ427(Sprenger G.A.等，Eur.J.Biochem.230(1995)525-32)擴(kuò)增tktA基因，所述基因在5′末端插入限制酶NotI的切割位點(diǎn)和在3′末端插入SphI酶的切割位點(diǎn)。在此情況下，使用寡核苷酸III5′TTAGCGGCCGCCCTTCATCATCCGATCT3′(此處帶有下劃線的堿基對(duì)對(duì)應(yīng)于Sprenger G.A.，Biochim.Biophys.Acta.1216(1993)307-10所述tktA序列的126至146堿基對(duì))，所述寡核苷酸III具有限制酶NotI的切割位點(diǎn)，和使用寡核苷酸IV5′ATAGCATGCTAATTACAGCAGTTC3′(此處帶有下劃線的堿基對(duì)對(duì)應(yīng)于Sprenger G.A.，Biochim.Biophys.Acta.1216(1993)307-10所述tktA序列的2018至2036堿基對(duì))，所述寡核苷酸IV具有SphI的切割位點(diǎn)。用NotI和SphI切割所得的PCR片段，并將其連接入以同樣方式處理的載體pZY557tkt，這產(chǎn)生載體pZY557tkt。然后用SphI打開(kāi)pZY557tkt，并將其同包含talB的SphI-切割PCR片段連接在一起。在轉(zhuǎn)化大腸桿菌并克隆所述轉(zhuǎn)化體之后(參見(jiàn)上文)，獲得包含tktA基因和talB基因的質(zhì)粒，所述tktA基因和talB基因在tac啟動(dòng)子的下游以相同的方向定位，并因此作為基因結(jié)構(gòu)pZY557tkttal使用。
將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體以甘油培養(yǎng)物(30％)的形式于-80℃在LB培養(yǎng)基中儲(chǔ)存。在需要時(shí)，使用前直接融化所述甘油培養(yǎng)物。實(shí)施例2增加轉(zhuǎn)醛酶活性對(duì)也增加轉(zhuǎn)酮酶活性的菌株生長(zhǎng)的影響在無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中研究大腸桿菌菌株AT2471、AT2471/pZY557tkt、AT2471/pZY557tal和AT2471/pZY557tkttal在葡萄糖上的生長(zhǎng)。所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)基包括檸檬酸鈉·3H2O(1.0g/l)、MgSO4·7H2O(0.3g/l)、KH2PO4(3.0g/l)、K2HPO4(12.0g/l)、NaCl(0.1g/l)、(NH4)2SO4(5.0g/l)、CaCl2·2H2O(15.0mg/l)、FeSO4·7H2O(0.75g/l)和L-酪氨酸(0.04g/l)。以微量元素溶液(1ml/l)的形式加入另外的無(wú)機(jī)物，所述溶液由Al2(SO4)3·18H2O(2.0g/l)、CoSO4·6H2O(0.7g/l)、CuSO4·5H2O(2.5g/l)、H3BO3(0.5g/l)、MnCl2·4H2O(20.0g/l)、Na2MoO4·2H2O(3.0g/l)、NiSO4·3H2O(2.0g/l)和ZnSO4·7H2O(15.0g/l)組成。在水中溶解維生素B1(5.0mg/l)，并通過(guò)過(guò)濾除菌后，將其加入到已高壓滅菌的培養(yǎng)基中，也加入羧芐青霉素和/或羧芐青霉素和氯霉素作為需要的arose。單獨(dú)將葡萄糖(30g/l)高壓滅菌，也將其加入到已高壓滅菌的培養(yǎng)基中。
對(duì)于所述實(shí)驗(yàn)，以2ml甘油培養(yǎng)物接種搖瓶(1000ml，包含100ml無(wú)機(jī)培養(yǎng)基)，并于37℃和150rpm在定軌搖床中培養(yǎng)72小時(shí)。在光密度(620nm)達(dá)到約等于1后，通過(guò)加入15-100um IPTG誘導(dǎo)所述細(xì)胞。直到此時(shí)以固定的間隔檢測(cè)所述培養(yǎng)物的光密度。在上述條件下，宿主生物大腸桿菌AT2471的光密度在7.25小時(shí)后達(dá)到1.2。在突變體AT2471/pZY557tkt中增加所述轉(zhuǎn)酮酶活性導(dǎo)致生長(zhǎng)速率明顯降低；該菌株在7.25小時(shí)后光密度只達(dá)到0.49，而其在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和大腸桿菌AT2471具有相同的光密度。生長(zhǎng)抑制效應(yīng)可能是因?yàn)楹铣梢种茲舛鹊奈焯橇姿嵬緩降拇x中間體造成的。
在突變體AT2471/pZY557tal中增加所述轉(zhuǎn)醛酶活性也導(dǎo)致生長(zhǎng)速率明顯降低(幾乎和在轉(zhuǎn)酮酶情況下一樣明顯)；在7.25小時(shí)后光密度達(dá)到0.52。除了增加轉(zhuǎn)酮酶活性，還增加轉(zhuǎn)醛酶活性，在7.25小時(shí)后光密度可能達(dá)到1.1，這在大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal中實(shí)現(xiàn)。該結(jié)果使下述事實(shí)變得清楚了，即在轉(zhuǎn)酮酶活性增加的菌株中另外增加轉(zhuǎn)醛酶活性，消除了只增加轉(zhuǎn)酮酶活性的負(fù)面影響，實(shí)質(zhì)上允許非抑制生長(zhǎng)。實(shí)施例3測(cè)定所述轉(zhuǎn)醛酶的酶活性為了測(cè)定所述轉(zhuǎn)醛酶活性，如上所述培養(yǎng)大腸桿菌AT2471、AT2471/pZY507、AT2471/pZY557tal和AT2471/pZY557tkttal細(xì)胞，但向所述培養(yǎng)基加入3-(嗎啉代)丙磺酸(MPOS，16.7g/l)，而磷酸鹽濃度降到在生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中使用的磷酸鹽濃度的十分之一。為了檢查所述細(xì)胞的誘導(dǎo)，建立平行的實(shí)驗(yàn)混合物，通過(guò)在7次細(xì)胞分裂(OD≈1)后加入IPTG(20μm)，誘導(dǎo)所述混合物之一。在向相關(guān)搖瓶加入誘變劑之前和在誘導(dǎo)后3小時(shí)，直接從所有混合物中取出20ml培養(yǎng)液，于4℃以6000g沉淀所述細(xì)胞10分鐘。
在50mM、pH8.5的甘氨酰甘氨酸緩沖液中洗滌收獲的細(xì)胞，所述緩沖液包括1mM二硫蘇糖醇、10mM MgCl2和0.5mM二磷酸硫胺素。利用超聲處理(裝有微端(microtip)的Branson 250超聲波儀)，以25％超聲處理循環(huán)和40瓦強(qiáng)度，對(duì)每毫升細(xì)胞懸浮液處理4分鐘，破碎沉淀中的細(xì)胞。在以18,000g于4℃離心30分鐘后，使用上清液(粗提物)檢測(cè)所述轉(zhuǎn)醛酶活性。
使用酶試驗(yàn)測(cè)定所述粗提物中的轉(zhuǎn)醛酶活性，所述酶試驗(yàn)與NAD的生成光耦合。為此，在總體積為1ml的包含0.8mM 6-磷酸果糖、4mM 4-磷酸赤蘚糖和0.3mM NADH的緩沖液(50mM、pH8.5的甘氨酰甘氨酸、1mM二硫蘇糖醇、10mM MgCl2和0.5mM二磷酸硫胺素)中溫育所述粗提物。所得的3-磷酸甘油醛和也加入的丙糖磷酸異構(gòu)酶(9U)和3-磷酸甘油脫氫酶(3U)反應(yīng)，生成NAD。在340nm(ε＝6.3×103l/mol.cm)下分光光度監(jiān)視NADH的OD，1μmol NADH的轉(zhuǎn)化相等于消耗1μmol6果糖-磷酸。將每分鐘1μmol NADH的轉(zhuǎn)換定義為1U。
如Bradford所述(Anal.Biochem.72(1976)248-254)，使用市售的著色劑，測(cè)定粗提物中的蛋白濃度。使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。
表2顯示了在使用帶有質(zhì)粒pZY557、pZY557tal或pZY557tkttal之一的宿主菌株大腸桿菌AT2471及其突變體時(shí)酶檢測(cè)的結(jié)果。在誘導(dǎo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)宿主菌株和所述具有載體pZY557的菌株的轉(zhuǎn)酮酶活性大約為0.65U/毫克蛋白。如大腸桿菌AT2471/pZY557所示，由于生理性生長(zhǎng)，該值在3小時(shí)內(nèi)增加到0.8U/毫克蛋白。由于在使用的載體中不存在所述tal基因，因此預(yù)期在此實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行的誘導(dǎo)將沒(méi)有任何影響。
在平行的實(shí)驗(yàn)混合物中，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)時(shí)，大腸桿菌AT2471/pZY557tal的轉(zhuǎn)酮酶活性分別為0.53和0.61U/毫克蛋白。通過(guò)誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)醛酶活性值達(dá)到1.06U/毫克蛋白，而在沒(méi)有誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物時(shí)，轉(zhuǎn)醛酶活性值在3小時(shí)時(shí)只增加到0.6U/毫克蛋白。在其它實(shí)驗(yàn)混合物中，在其它相同的實(shí)驗(yàn)中使用大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal；在此情況下，轉(zhuǎn)醛酶活性在誘導(dǎo)所述細(xì)胞后的前3小時(shí)內(nèi)，由0.8增加至1.16U/毫克蛋白，和對(duì)應(yīng)的使用宿主菌株的實(shí)驗(yàn)相比，所述轉(zhuǎn)醛酶活性相當(dāng)于其一倍。實(shí)施例4使用菌株生產(chǎn)物質(zhì)，所述菌株除了轉(zhuǎn)醛酶活性增加外，還顯示轉(zhuǎn)酮酶活性增加使用用于生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基檢測(cè)合成效率。在光密度為1時(shí)誘導(dǎo)大腸桿菌AT2471和AT2471/pZY557tkttal的培養(yǎng)物，并將培養(yǎng)周期延長(zhǎng)至72小時(shí)。24小時(shí)和48小時(shí)后，檢測(cè)所述培養(yǎng)物的pH值，如果需要，通過(guò)加入KOH(45％)，使其恢復(fù)到7.2的起始值。另外，在24、48和72小時(shí)后取樣(2ml)，檢測(cè)光密度以及葡萄糖和L-苯丙氨酸的濃度。
通過(guò)高壓液相層析(HPLC，Hewlett Packard，慕尼黑，德國(guó))和熒光檢測(cè)(消光335nm，發(fā)射570nm)共同測(cè)定苯丙氨酸濃度。使用Nucleosil-120-8-C18柱(250×4.6毫米)作為固相；利用梯度洗脫所述柱(洗脫液A90％50mM磷酸，10％甲醇，pH2.5；洗脫液B20％50mM磷酸，80％甲醇，pH2.5；梯度0-8分鐘100％A，8-13分鐘0％A，13-19分鐘100％A)。將洗脫速率設(shè)定在1.0ml/分鐘；將柱溫設(shè)定在40℃。在室溫下于反應(yīng)毛細(xì)管(14米×0.35毫米)中使用鄰苯二醛進(jìn)行柱后衍生。在所述條件下發(fā)現(xiàn)L-苯丙氨酸的保留時(shí)間為6.7分鐘。
用酶測(cè)試條(strip)(Diabur，Boehringer Mannheim，德國(guó))檢測(cè)葡萄糖濃度，并根據(jù)其結(jié)果，接著加入2ml濃縮的葡萄糖溶液(500g/l)，確保在實(shí)驗(yàn)混合物中葡萄糖限制沒(méi)有提高。培養(yǎng)48小時(shí)后，誘導(dǎo)宿主菌株大腸桿菌AT2471后(苯丙氨酸)指示值達(dá)到119；此值是與未誘導(dǎo)的宿主菌株的苯丙氨酸值100相比得出。僅僅將質(zhì)粒pZY557tkttal引入到所述宿主菌株中，導(dǎo)致甚至在未誘導(dǎo)細(xì)胞中，描述苯丙氨酸濃度的該指示值增加到167。如本實(shí)驗(yàn)所示，誘導(dǎo)菌株大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal導(dǎo)致指示值進(jìn)一步增加到204。這和誘導(dǎo)的宿主菌株相比，相當(dāng)于增加71％。
該結(jié)果證明了按照本發(fā)明、在轉(zhuǎn)醛酶活性已經(jīng)增加的菌株中又增加轉(zhuǎn)酮酶活性、或在轉(zhuǎn)酮酶活性已經(jīng)增加的菌株中又增加轉(zhuǎn)醛酶活性的正面效應(yīng)，所述效應(yīng)增加了芳族化合物合成。實(shí)施例5使用轉(zhuǎn)醛酶活性增加的菌株生產(chǎn)物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)突變體大腸桿菌AT2471/pZY557tal，所述實(shí)驗(yàn)在其它方面同實(shí)施例4所述實(shí)驗(yàn)相同。48小時(shí)后，誘導(dǎo)所述菌株導(dǎo)致(苯丙氨酸)指示值，與未誘導(dǎo)菌株的苯丙氨酸值100相比，為131。
該結(jié)果清楚證明增加轉(zhuǎn)醛酶活性對(duì)芳族物質(zhì)合成施加的正面效應(yīng)，尤其是在按照本發(fā)明的誘導(dǎo)之后。實(shí)施例6使用PTS-突變體生產(chǎn)物質(zhì)，在所述突變體中在引入PEP不依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)后，隨著轉(zhuǎn)酮酶活性增加，除了轉(zhuǎn)醛酶活性增加，還表達(dá)PEP不依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)。
如Weisser P.等所述(J.Bacteriol.177(1995)3351-54)，使用PCR(Mullis K.B.等，Meth.Enzymol.155(1987)335-50)獲得所述glf基因?？梢缘玫皆摶虻耐暾塑账嵝蛄?Barnell W.O.等，J.Bacteriol. 172(1990)7227-40)。用質(zhì)粒pZY600作為模板擴(kuò)增所述glf基因(Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-54)。
為了將所述glf基因整合到編碼大腸桿菌PTS系統(tǒng)元件的基因中，用BglII消化質(zhì)粒pPTS1(參見(jiàn)表1)，并對(duì)其用克列諾片段處理。唯一的切割位點(diǎn)位于ptsI基因中。從質(zhì)粒pBM20glfglk分離作為BamHI-KpnI片段的glf基因，并同樣對(duì)其用克列諾片段處理。通過(guò)平端連接獲得具有與ptsHI基因相同方向的glf的克隆。從所得的質(zhì)粒pPTSglf中獲得具有ptsH基因的3′區(qū)和包含整合的glf和crr的ptsI的4.6kb的PstI片段。將該片段連接入載體pGP704的EcoRV切割位點(diǎn)。因?yàn)樵撦d體只能在λpir菌株中復(fù)制，所以由轉(zhuǎn)化體將所述載體整合到染色體中，如果這些轉(zhuǎn)化體能在羧芐青霉素中生長(zhǎng)，則所述轉(zhuǎn)化體不含有該噬菌體。通過(guò)DNA印跡分析(Miller V.L.等，J.Bateriol.170(1988)2575-83)檢查所述整合。所得的轉(zhuǎn)化體除了包括glf基因，還包括完整的PTS基因。
可以第二次同源交換中重組所述載體部分，導(dǎo)致羧芐青霉素抗性喪失。因?yàn)樵谶@種情況下，通過(guò)插入glf基因間斷pts基因，所以在這些突變體中沒(méi)有以功能方式表達(dá)所述PTS。如下選擇所需的PTS-突變體在沒(méi)有抗生素的LB培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)仍然是PTS+的轉(zhuǎn)化突變體幾次后，將等分的細(xì)胞懸浮液在包含100μg/l磷霉素(phosphomycin)的LB板上倒平板。PTS突變體能夠在這些平板上生長(zhǎng)。在包含或者磷霉素或者20μg/l的羧芐青霉素的LB平板上將生長(zhǎng)的克隆劃線接種。從在磷霉素平板上仍顯示生長(zhǎng)、但在羧芐青霉素平板上不能生長(zhǎng)的克隆中分離染色體DNA。通過(guò)DNA分析證實(shí)了，glf基因整合到編碼PTS系統(tǒng)的基因中。以PTS-缺陷的表型鑒別對(duì)應(yīng)的突變體。選擇一個(gè)克隆作為宿主生物大腸桿菌 AT2471glfintPTS-，并將其用于用質(zhì)粒pZY557tal(參見(jiàn)上文)的轉(zhuǎn)化。按照實(shí)施例4和5所述實(shí)驗(yàn)條件，在兩個(gè)平行混合物中，在每種情況下培養(yǎng)PTS陰性突變體大腸桿菌AT2471glfintPTS-/pZY557tal和對(duì)應(yīng)的宿主菌株AT2471glfintPTS-，并在每種情況下大約7次分裂后，誘導(dǎo)一種混合物的細(xì)胞。
所述誘導(dǎo)將所述宿主菌株的合成效率降低到56，所述宿主菌株在沒(méi)有誘導(dǎo)時(shí)最初的指示值是100。通過(guò)對(duì)比，在轉(zhuǎn)化菌株AT2471glfintPTS-/pZY557tal的培養(yǎng)物中，所述誘導(dǎo)將苯丙氨酸指示值從73增加到103，并因此高于所述宿主菌株的起始值。
該結(jié)果證實(shí)，僅僅增加轉(zhuǎn)醛酶活性，甚至在那些微生物中對(duì)苯丙氨酸合成有正面效應(yīng)，在所述微生物中PTS系統(tǒng)活性減少，或者該系統(tǒng)完全關(guān)閉，同時(shí)已將PEP不依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)整合到其中。實(shí)施例7用PTS-突變體生產(chǎn)物質(zhì)，在所述突變體中除了增加轉(zhuǎn)醛酶活性，在引入PEP不依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)之前，隨著轉(zhuǎn)醛酶活性增加，還表達(dá)PEP不依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)如實(shí)施例1所述得到大腸桿菌AT2471/pZY557tal。接著在該菌株中將glf基因整合到編碼大腸桿菌PTS系統(tǒng)元件的基因中。如實(shí)施例6所述完成該整合。使用實(shí)施例4和5所述實(shí)驗(yàn)條件，培養(yǎng)這些PTS陰性大腸桿菌AT2471glfintPTS-/pZY557tal突變體。發(fā)現(xiàn)衍生突變體的生物合成效率相當(dāng)于實(shí)施例6所述菌株的合成效率。實(shí)施例8在發(fā)酵容器中使用轉(zhuǎn)醛酶活性增加的菌株和除了其轉(zhuǎn)醛酶活性增加、轉(zhuǎn)酮酶活性也增加的菌株生產(chǎn)物質(zhì)。
在發(fā)酵容器(反應(yīng)體積15升)中培養(yǎng)突變體大腸桿菌AT2471、大腸桿菌AT2471/pZY557tal和大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal。為此，使用兩個(gè)具有實(shí)施例2所述無(wú)機(jī)培養(yǎng)基(250ml)的搖瓶(2000ml)預(yù)培養(yǎng)。在該方法中，降低葡萄糖濃度至5.0g/l。用2ml甘油培養(yǎng)基接種所述搖瓶，并在定軌搖床上于37℃和150rpm培養(yǎng)所述搖瓶，直至光密度(600nm)達(dá)到3。
使用所述預(yù)培養(yǎng)物接種4.5升生產(chǎn)培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基包括MgSO4·7H2O(0.3g/l)、KH2PO4(3.0g/l)、NaCl(0.1g/l)、(NH4)2SO4(5.0g/l)、CaCl2·2H2O(15.0mg/l)、FeSO4·7H2O(0.75g/l)和L-酪氨酸(0.24g/l)。以微量元素溶液的形式(1.5ml/l)加入另外的無(wú)機(jī)物，所述溶液由Al2(SO4)3·18H2O(2.0g/l)、CoSO4·6H2O(0.7g/l)、CuSO4·5H2O(2.5g/l)、H3BO3(0.5g/l)、MnCl4·4H2O(20.0g/l)、Na2MoO4·2H2O(3.0g/l)、NiSO4·3H2O(2.0g/l)和ZnSO4·7H2O(15.0g/l)組成。將維生素B1(75.0mg/l)溶解在水中，并在過(guò)濾除菌后，將其加入到已高壓滅菌的培養(yǎng)基中。單獨(dú)將葡萄糖(15g/l)高壓滅菌，并也將其加入到已高壓滅菌的所述培養(yǎng)基中。通過(guò)加入NH4OH(25％)，將培養(yǎng)基的pH值控制在7，通過(guò)控制攪拌速度、供給的空氣體積和發(fā)酵容器內(nèi)壓力將氧分壓值控制在20％。通過(guò)加入葡萄糖溶液(700g/l)，將培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度值控制在5g/l左右。根據(jù)發(fā)酵時(shí)間，以可變濃度向葡萄糖溶液中加入L-酪氨酸，以避免L-酪氨酸限制。
在進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，按照本發(fā)明在6小時(shí)后通過(guò)加入50μMIPTG進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)36小時(shí)后，僅僅通過(guò)引入pZY557tal質(zhì)粒使(苯丙氨酸)指示值達(dá)到120；此值是與未誘導(dǎo)的宿主菌株大腸桿菌AT2471的(苯丙氨酸)指示值100相比得出。通過(guò)按照本發(fā)明誘導(dǎo)，該值可以進(jìn)一步升到153。通過(guò)單獨(dú)引入pZY557tkttal質(zhì)粒，并因此除了增加轉(zhuǎn)醛酶活性，還增加轉(zhuǎn)酮酶活性，與所述宿主菌株相比，(苯丙氨酸)指示值可以達(dá)到130。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，誘導(dǎo)菌株大腸桿菌AT2471/pZY557tkttal能夠進(jìn)一步將(苯丙氨酸)指示值增加到250。這同未誘導(dǎo)的菌株相比，相當(dāng)于增加了92％。
權(quán)利要求
1.微生物制備物質(zhì)的方法，其中在生產(chǎn)這些物質(zhì)的微生物中增加轉(zhuǎn)醛酶活性，而在所述微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)的活性存在、降低或消失。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在下述微生物中實(shí)現(xiàn)物質(zhì)制備，所述微生物在增加轉(zhuǎn)醛酶活性之前，沒(méi)有從先前帶有磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(pts+菌株)的菌株中將所述微生物作為磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)關(guān)閉的菌株(pts-菌株)進(jìn)行選擇。
3.按照權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，制備其合成涉及至少一個(gè)戊糖磷酸途徑的中間體的物質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述中間體是4-磷酸赤蘚糖(Ery4P)。
5.按照權(quán)利要求1或4的方法，其特征在于，增加大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶活性。
6.按照權(quán)利要求1-5之一的方法，其特征在于，增加大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶B(TalB)活性。
7.按照權(quán)利要求1-6之一的方法，其特征在于，額外增加轉(zhuǎn)酮酶活性。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，增加大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶活性。
9.按照權(quán)利要求7或8之一的方法，其特征在于，增加大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶A(TktA)活性。
10.按照權(quán)利要求1-9之一的方法，其特征在于，額外增加PEP不依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和/或使相關(guān)糖磷酸化的激酶的活性。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是易化蛋白(facilitator)。
12.按照權(quán)利要求11的方法，其特征在于，所述易化蛋白是活動(dòng)發(fā)酵單胞菌葡萄糖易化蛋白(Glf)。
13.按照權(quán)利要求10-12之一的方法，其特征在于，所述激酶是己糖磷酸化激酶。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其特征在于，所述激酶得自活動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其特征在于，所述激酶是活動(dòng)發(fā)酵單胞菌葡糖激酶(Glk)。
16.按照權(quán)利要求10-15之一的方法，其特征在于，如果存在PEP依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)，則另外降低或消除其活性。
17.按照權(quán)利要求1-16之一的方法，其特征在于，a)通過(guò)引入所述基因b)和/或通過(guò)增加所述基因拷貝數(shù)c)和/或通過(guò)增加基因表達(dá)d)和/或通過(guò)增加所述酶的內(nèi)源活性e)和/或通過(guò)改變酶的結(jié)構(gòu)f)和/或通過(guò)使用去調(diào)節(jié)的酶g)和/或通過(guò)插入編碼去調(diào)節(jié)酶的基因增加至少一個(gè)下述元件，即轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和激酶的活性。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其特征在于，通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)基因加入一個(gè)或幾個(gè)基因結(jié)構(gòu)中實(shí)現(xiàn)所述活性的增加，而所述一個(gè)或多個(gè)基因作為單拷貝或以增加的拷貝數(shù)引入到所述基因結(jié)構(gòu)中。
19.按照權(quán)利要求1-18之一的方法，其特征在于，使用另外參與所述物質(zhì)合成的一個(gè)或多個(gè)酶被去調(diào)節(jié)和/或顯示活性增加的微生物。
20.按照權(quán)利要求1-19的方法，其特征在于，制備的所述物質(zhì)是芳族氨基酸。
21.按照權(quán)利要求20的方法，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。
22.按照權(quán)利要求1-21之一的方法，其特征在于，使用的微生物屬于大腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽胞桿菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬。
23.按照權(quán)利要求22的方法，其特征在于，所述微生物是大腸桿菌。
24.重組形式的基因結(jié)構(gòu)，包括a)編碼轉(zhuǎn)醛酶的基因或編碼轉(zhuǎn)醛酶的基因和編碼轉(zhuǎn)酮酶的基因，和b)至少一個(gè)編碼PEP不依賴(lài)性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或編碼糖磷酸化激酶的基因。
25.按照權(quán)利要求24的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因編碼易化蛋白，而所述激酶的基因編碼己糖磷酸化激酶。
26.按照權(quán)利要求24或25的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)醛酶和所述轉(zhuǎn)酮酶的基因得自大腸桿菌，而所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和所述激酶的基因得自活動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
27.按照權(quán)利要求24-26的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，大腸桿菌轉(zhuǎn)醛酶的基因是talB，大腸桿菌轉(zhuǎn)酮酶的基因是tktA，活動(dòng)發(fā)酵單胞菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因是glf，活動(dòng)發(fā)酵單胞菌激酶的基因是glk。
28.按照權(quán)利要求24-27之一的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，所述基因結(jié)構(gòu)包括至少一個(gè)分配給所述基因之一的調(diào)節(jié)基因序列。
29.按照權(quán)利要求28的基因結(jié)構(gòu)，其特征在于，在所述基因結(jié)構(gòu)中至少加入一個(gè)所述基因，以使所述基因處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制之下。
30.轉(zhuǎn)化細(xì)胞，帶有可復(fù)制形式的按照權(quán)利要求24-29的基因結(jié)構(gòu)。
31.按照權(quán)利要求30的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，在所述細(xì)胞中，另外參與所述物質(zhì)合成的一個(gè)或多個(gè)酶被去調(diào)節(jié)和/或顯示活性增加。
32.按照權(quán)利要求30或31的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
33.按照權(quán)利要求30-32之一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，如果存在PEP依賴(lài)性糖吸收系統(tǒng)，那么降低或消除所述系統(tǒng)的活性。
34.按照權(quán)利要求30-33之一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，它能夠生產(chǎn)芳族氨基酸。
35.按照權(quán)利要求34的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。
36.按照權(quán)利要求1-23之一的微生物制備物質(zhì)的方法，其特征在于，培養(yǎng)含有按照權(quán)利要求29的基因結(jié)構(gòu)、按照權(quán)利要求30-35之一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并在最初的2次細(xì)胞分裂后進(jìn)行誘導(dǎo)。
37.按照權(quán)利要求36的方法，其特征在于，除了戊糖磷酸途徑的中間體，所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞也含有利用率增加的中心新陳代謝的其它代謝物。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)代謝中間體(具體地說(shuō)是赤蘚糖4－磷酸)的供應(yīng),使得可獲得供選擇的微生物制備物質(zhì)(特別是諸如L－苯丙氨酸的芳族氨基酸)的方法,在所述方法中,增加生產(chǎn)這些物質(zhì)的微生物中的轉(zhuǎn)醛酶活性。在本發(fā)明最佳實(shí)施方案中,又增加了轉(zhuǎn)酮酶活性,或增加了PEP依賴(lài)性糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和/或使相關(guān)糖磷酸化的激酶的活性。本發(fā)明也涉及基因結(jié)構(gòu),并涉及具有這些基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞,這使以特別成功的方式完成這些方法成為可能。
文檔編號(hào)C12R1/185GK1241214SQ97180908
公開(kāi)日2000年1月12日 申請(qǐng)日期1997年10月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月26日
發(fā)明者G·斯普倫格, R·斯維, H·薩姆, M·卡魯茨, T·松克 申請(qǐng)人:荷蘭加甜劑公司, 于利奇研究中心有限公司