專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蘭科植物的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因蘭科植物的方法，具體地說(shuō)，涉及利用含目的基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蘭科植物的方法。
當(dāng)今，在植物生物技術(shù)領(lǐng)域中，有關(guān)于植物轉(zhuǎn)化技術(shù)的報(bào)道，其中包括原生質(zhì)體法、基因槍法、農(nóng)桿菌感染法等。
所謂原生質(zhì)體法是指利用電穿孔或聚乙二醇技術(shù)將目的DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體，然后從所述原生質(zhì)體再生植株。不過(guò)，問(wèn)題在于此方法不能用于那些還沒(méi)有建立起由原生質(zhì)體再生為植株的植物品系，此外，用這種方法導(dǎo)入基因的效率也較低?；驑尫▌t是將吸附有目的基因的金屬粒子高速射入細(xì)胞從而進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法，此方法原則上可以用于任何植物的組織和細(xì)胞并且轉(zhuǎn)化效率高，然而它需要基因槍這種專(zhuān)門(mén)的昂貴裝置。
另一方面，用感染性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的方法則已廣泛地用于雙子葉植物如煙草、kalanchoe等。盡管一般認(rèn)為農(nóng)桿菌的寄主限于雙子葉植物而非單子葉植物，近年來(lái)，已報(bào)導(dǎo)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化包括水稻、小麥、大麥以及玉米等禾本科植物在內(nèi)的單子葉植物(EP 0 672 752 A1和EP 0 604 662 A1)。這些方法是用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的禾本科植物去分化組織或非去分化發(fā)育不完全的胚以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物體。盡管此方法可產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)化率，但還未證實(shí)以上方法可用于禾本科以外的單子葉植物。
蘭科植物屬單子葉植物，因此據(jù)認(rèn)為其不為農(nóng)桿菌的寄主。事實(shí)上，我們前期的實(shí)踐也表明農(nóng)桿菌不能感染培養(yǎng)的蘭科植物去分化組織，也不能感染非去分化發(fā)育不完全的胚(未發(fā)表的資料)。因?yàn)樘m科植物很難由原生質(zhì)體再生成植株，所以，迄今為止要得到其轉(zhuǎn)化植株，本領(lǐng)域所知唯一有效的方法是利用基因槍向如蘭科植物胚狀體的上皮導(dǎo)入有用的基因(日本專(zhuān)利公開(kāi)No.07255300 A)。
本發(fā)明的目的是提供一種利用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因蘭科植物的方法。因此，此發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化蘭科植物的方法。該方法包括利用含有待導(dǎo)入蘭科植物基因組的基因的農(nóng)桿菌感染來(lái)源于蘭科植物的組織。此方法使得首次利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了蘭科植物。
在本發(fā)明中，蘭科植物的組織優(yōu)選是由蘭科植物的花梗節(jié)所長(zhǎng)出的芽。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選培養(yǎng)感染的組織以產(chǎn)生胚狀體(PLB)，然后，再由PLB再生為成熟的蘭科植物。根據(jù)本方法，很容易獲得經(jīng)過(guò)同源轉(zhuǎn)化的成熟蘭科植物。
本發(fā)明的另一目的是提供包含有目的基因的轉(zhuǎn)基因蘭科植物。因此，該發(fā)明也提供了由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因蘭科植物。
根據(jù)本發(fā)明，欲用本方法轉(zhuǎn)化的蘭科植物可以是蘭科中的任何品系，包括Phalaenopsis，Dortitaenopsis，Doritis，Paraphalaenopsis，Euphalaenopsis及相關(guān)種。
根據(jù)本發(fā)明，欲用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染的組織可以是如下蘭科植物的組織分化出的幼葉離體培養(yǎng)的原胚體、胚狀體及由花梗節(jié)所長(zhǎng)出的芽。芽為最優(yōu)選。如何由花梗切段誘導(dǎo)出芽的方法在本領(lǐng)域中是已知的(M.Tanaka等，“園藝科學(xué)”(Scientia Horticulture)，35(1988)117-126)。簡(jiǎn)言之，將蘭科植物的花梗節(jié)切成約1-3厘米的片段，切點(diǎn)位于梗節(jié)附近，切段培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)基中。優(yōu)選用于從花梗切段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基包括Vacin-Went培養(yǎng)基、Murashige-Skoog培養(yǎng)基、Linsmaier-Skoog培養(yǎng)基及其它類(lèi)似的但含低濃度鹽培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基添加本領(lǐng)域已知的適當(dāng)成分。最優(yōu)選的培養(yǎng)基是Vacin-Went培養(yǎng)基，其由以下成分組成0.2g/l磷酸鈣、0.525g/l硝酸鉀、0.25g/l磷酸二氫鉀、0.5g/l硫酸銨、0.028g/l檸檬酸鐵(III)水合物、0.0075g/l四水硫酸錳以及20g/l蔗糖。
花梗切段可在約20-30℃，約50-90％的相對(duì)濕度下培養(yǎng)。通常在培養(yǎng)一至三個(gè)月后，切段節(jié)上發(fā)芽。優(yōu)選用所述得到的芽來(lái)以農(nóng)桿菌感染。眾所周知，農(nóng)桿菌的感染發(fā)生在植物的傷口處，因此就必須先損傷植物，用細(xì)菌處理受傷部位。譬如，為用農(nóng)桿菌感染芽，可以尖部涂有農(nóng)桿菌的竹針損傷芽。
農(nóng)桿菌已被用作雙子葉植物基因工程的載體。本說(shuō)明書(shū)中，“農(nóng)桿菌”表示農(nóng)桿菌屬或其衍生株系。根據(jù)本發(fā)明，農(nóng)桿菌可以是本領(lǐng)域中已知的用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物的任何株系，如Agrobacterium rhizogenes、Agrobacteriumtumefaciens，及其衍生株系。有許多可從市面上買(mǎi)到的株系。本說(shuō)明書(shū)中的“衍生株系”一詞可以是來(lái)導(dǎo)入目的基因或促進(jìn)細(xì)菌中所含的Ti/Ri質(zhì)粒的毒力的天然突變體和由本領(lǐng)域已知的任何方法得到的菌株的突變體。
當(dāng)植物感染農(nóng)桿菌后，其Ti/Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)就會(huì)轉(zhuǎn)移并整合到植物細(xì)胞的基因組中。通常質(zhì)粒的T-DNA位點(diǎn)含有決定植物激素生物合成的基因，因而感染的宿主基因的T-DNA區(qū)的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)致感染位點(diǎn)瘤形成的植物組織的異常生長(zhǎng)，使感染部位產(chǎn)生腫瘤。為了向宿主植物導(dǎo)入外源基因，必須將目的基因?qū)爰?xì)菌Ti/Ri質(zhì)粒的T區(qū)。
向質(zhì)粒的T-DNA區(qū)導(dǎo)入外源基因的方法在本領(lǐng)域中是熟知的(Y.Hiei等，“植物雜志”(The Plant Journal)(1994)6(2)271-282，EP 0 672-752 A1，EP 0604 662 A1及Y.NIWA，“農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞的相互作用”BISEIBUTSU(1987)3(4)407-417)。例如，用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖邢碌奈⑸铩⒅参锘騽?dòng)物的目的基因可連結(jié)到同種限制酶切割的農(nóng)桿菌質(zhì)粒的T-DNA區(qū)。或者，該區(qū)的不需要的基因也可用與上述方法相同的方法除去。另外，也可使用能買(mǎi)到的含有目的基因的菌株。
根據(jù)本發(fā)明，欲向蘭科植物導(dǎo)入的基因可以是任何目的基因，如決定抗病的、抗病毒的、抗蟲(chóng)的、矮化的、控制花色的和抗寒的基因。
根據(jù)本發(fā)明，質(zhì)粒的T-DNA區(qū)優(yōu)選還含有一個(gè)基因標(biāo)記以便篩選和驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。標(biāo)記基因的例子在本領(lǐng)域中熟知，包括抗生素抗性基因，如抗卡那霉素、G418、氯霉素及氨芐青霉素等的抗性基因。另外，因?yàn)檗r(nóng)桿菌的Ti/Ri質(zhì)粒本身具有決定感染部位形成瘤的基因，所以感染成功的植物中會(huì)觀察到瘤或腫脹。例如，用Agrobacterium rhizogenes感染時(shí)，約三周后就可以觀察到瘤的形成。因此檢測(cè)用細(xì)菌處理過(guò)的部位腫脹或瘤的形成可以進(jìn)行第一次篩選，來(lái)篩選感染成功的芽。被感染的芽在含有抗生素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-6周以清除感染的農(nóng)桿菌。用于除去農(nóng)桿菌的抗生素的例子包括Claforan，其在本領(lǐng)域中是熟知的。
當(dāng)細(xì)菌清除結(jié)束后，立即將感染部位(即芽的腫脹部分)切下并培養(yǎng)于PLB誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生胚狀體。蘭科植物的胚狀體被認(rèn)為是和不定胚相關(guān)的組織，不定胚由諸如芽尖、由花梗培養(yǎng)物而來(lái)的葉裂片或根尖的外植體誘導(dǎo)。并且認(rèn)為每個(gè)PLB來(lái)源于外植體的單個(gè)細(xì)胞，因此，轉(zhuǎn)化的PLB再生為成熟的植株，獲得的植株的所有細(xì)胞可能都是被同源轉(zhuǎn)化過(guò)了的。
Michio TANAKA 1987年曾在“Kagawa大學(xué)農(nóng)學(xué)教師備忘錄”(MemoirsofFaculty of Agriculture)(Vol.49，pp1-85)上報(bào)導(dǎo)過(guò)用片段誘導(dǎo)生成PLB的具體方法。簡(jiǎn)言之，將芽的腫脹部分切下并切成1厘米見(jiàn)方的片段，再將得到的片段移植到PLB誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并在約25℃，光照強(qiáng)度為2000-3000勒克斯下培養(yǎng)。在本發(fā)優(yōu)選使用的PLB誘導(dǎo)培養(yǎng)基的例子由以下成份組成3.5g/lHyponex(N∶P2O5∶K2O＝7∶6∶19)、100mg/l肌醇、1mg/l煙酸、1mg/l鹽酸硫胺素、1mg/lα-萘乙酸(NAA)、10mg/l N6-苯甲基腺嘌呤(BA)、10mg/l腺嘌呤及20g/l蔗糖。在培養(yǎng)約100天后，可觀察到已形成PLB。
將得到的PLB分別移植到分化培養(yǎng)基中以獲得“幼態(tài)植株”，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)，“幼態(tài)植株”表示長(zhǎng)至1-2厘米高的植株。用于從PLB產(chǎn)生幼態(tài)植株的分化培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是已知的，例如，優(yōu)選的固體培養(yǎng)基由以下成分組成3g/l Hyponex、50g/l土豆浸出液和20g/l蔗糖。PLB可在本領(lǐng)域中已知的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
若農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)含有抗生素抗性基因，可在從PLB分化成的幼態(tài)植株之前或后篩選轉(zhuǎn)化體，篩選可以通過(guò)在含所述抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)PLB或獲得的幼態(tài)植株來(lái)進(jìn)行。
為驗(yàn)證所選擇的轉(zhuǎn)化體是否含有目的基因，在本領(lǐng)域中有一些已知的方法。例如，可將轉(zhuǎn)化子的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增(如利用PCR技術(shù))，再分析擴(kuò)增DNA以證實(shí)是否含目的基因。若感染的農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)含有瘤形成基因，由轉(zhuǎn)化的PLB再生出的幼態(tài)植株形成瘤可作為轉(zhuǎn)化的信號(hào)。此外，可以對(duì)PLB或幼態(tài)植株進(jìn)行組織學(xué)分析來(lái)驗(yàn)證GUS基因的表達(dá)。
通過(guò)培養(yǎng)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，可將已驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功的幼態(tài)植株培養(yǎng)成成熟植株。培養(yǎng)條件與從PLB分化為幼態(tài)植株所需的條件相同。
根據(jù)本方法的一個(gè)實(shí)施方案，分別用幾種農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蘭科植物Phalaenopsis，所用的農(nóng)桿菌菌株分別為Agrobacterium rhizogenes R-1601，Agrobacterium rhizogenes 03-01724及ATCC No.15834的Agrobacteriumrhizogene系。這些菌株均有包含rol-C基因的Ri質(zhì)粒，該基因位于T-DNA區(qū)，決定植物的矮化。Agrobacterium rhizogenes R-1601菌株由美國(guó)華盛頓大學(xué)(Seattle，WA 98195，U.S.A.)生物化學(xué)系Gordon教授提供；Agrobacteriumrhizogenes 03-01724菌株來(lái)源于日本國(guó)立農(nóng)業(yè)生物資源研究院。
在梗節(jié)附近將Phalaenopsis的花梗節(jié)切成約1-3厘米長(zhǎng)的片段，浸于1％的芐基二甲基氯化銨(benzalkonium chloride)水溶液中10分鐘，再轉(zhuǎn)入氯氣有效濃度為1％的次氯酸水溶液中浸20分鐘以對(duì)切段表面進(jìn)行消毒，消毒好的切段置于Vacin-Went培養(yǎng)基上，此培養(yǎng)基由以下成分組成0.2g/l磷酸鈣、0.525g/l硝酸鉀、0.25g/l磷酸二氫鉀、0.028g/l檸檬酸鐵(III)水合物、0.0075g/l四水硫酸錳以及20g/l蔗糖。培養(yǎng)溫度28℃，相對(duì)濕度90％。培養(yǎng)1個(gè)月后的切段的節(jié)萌發(fā)出芽。用然后用涂有上述農(nóng)桿菌菌株的竹針刺傷芽使之感染，感染后的芽在同樣條件下培養(yǎng)。
感染三周后，芽的感染部位腫脹。選擇腫脹的芽(即作為感染成功的芽的候選物)并且再在含有500μg/l Claforan的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天以從芽清除農(nóng)桿菌。
細(xì)菌清除結(jié)束后，切下腫脹部分并切成1厘米見(jiàn)方的片段，再移植到PLB誘導(dǎo)培養(yǎng)基中固定培養(yǎng)以誘導(dǎo)PLB的形成，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000勒克斯，培養(yǎng)基由以下成分組成3.5g/l Hyponex、100mg/l肌醇、1mg/l煙酸、1mg/l鹽酸硫胺素、1mg/lα-萘乙酸、10mg/l苯甲基腺嘌呤、10mg/l腺嘌呤及20g/l蔗糖(Michio TANAKA，Memoirs of Faculty ofAgriculture，Kagawa University，Vol.49，pp1-85，1987)。將產(chǎn)生的PLB分別培養(yǎng)在含3g/l Hyponex、50g/l土豆浸出液和20g/l蔗糖的分化培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)幼態(tài)植株。
將產(chǎn)生的幼態(tài)植株移植到含有抗生素的選擇培養(yǎng)基以選擇抗生素抗性植株。再于與誘導(dǎo)幼態(tài)植株相同的條件下培養(yǎng)選擇的幼態(tài)植株。若農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)在幼株中成功表達(dá)，則可在選擇出的幼株中觀察到瘤。在相同條件下進(jìn)一步培養(yǎng)3-5個(gè)月后，即可得到成熟的矮化植株和成熟的合軸植株。
我們通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明而不是進(jìn)行限制。
實(shí)施例1在梗節(jié)附近將Phalaenopsis的花梗節(jié)切成約1-3厘米長(zhǎng)的片段，浸于1％的芐叉氯水溶液中10分鐘，再轉(zhuǎn)入氯氣有效濃度為1％的次氯酸水溶液中浸20分鐘以對(duì)切段表面進(jìn)行消毒，消毒好的切段置于Vacin-Went培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基由以下成分組成0.2g/l磷酸鈣、0.525g/l硝酸鉀、0.25g/l磷酸二氫鉀、0.028g/l檸檬酸鐵(III)水合物、0.0075g/l四水硫酸錳以及20g/l蔗糖。培養(yǎng)溫度28℃，相對(duì)濕度90％，時(shí)間為1個(gè)月。培養(yǎng)1個(gè)月后切段的節(jié)萌發(fā)出芽。用農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes R-1601感染芽并在同樣的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。本發(fā)明所用的Agrobacterium rhizogenes R-1601菌株由美國(guó)華盛頓大學(xué)(Seattle，WA 98195，U.SA.)生物化學(xué)系Milton P.Gordon教授購(gòu)得，對(duì)其性質(zhì)Pythoud等已于“生物技術(shù)”(Bio.Technology)，5,1323-1327(1987)上加以描述。該菌株的Ri質(zhì)粒中含特定的vir區(qū)，其增加細(xì)菌的毒力。另外，Ri質(zhì)粒中還含G418抗性區(qū)及rol-C基因，該基因位于T-DNA區(qū)，決定植物的矮化性狀。
感染3個(gè)月后，芽的被感染部位出現(xiàn)腫脹。選擇腫脹的芽并進(jìn)一步地在含500μg/l Claforan的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，以清除芽中的農(nóng)桿菌。
當(dāng)細(xì)菌清除結(jié)束后，切下芽的腫脹部分并切成1厘米見(jiàn)方的片段，再移植到PLB誘導(dǎo)培養(yǎng)基中固定培養(yǎng)以產(chǎn)生PLB。培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000勒克斯。培養(yǎng)基由以下成分組成3.5g/l Hyponex、100mg/l肌醇、1mg/l酸、1mg/l鹽酸硫胺素、1mg/lα-萘乙酸、10mg/l苯甲腺嘌呤、10mg/l腺嘌呤及20g/l蔗糖。然后將產(chǎn)生的PLB分別培養(yǎng)到含3g/l Hyponex、50g/l土豆浸出液和20g/l蔗糖的分化培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)幼態(tài)植株。
產(chǎn)生的幼態(tài)植株移植到含有20μg/l G418的培養(yǎng)基上以篩選抗生素抗性植株，選擇出的幼態(tài)植株在與誘導(dǎo)幼態(tài)植株相同的條件下進(jìn)一步培養(yǎng)。觀察到選擇的幼態(tài)植株上的瘤的發(fā)生，證實(shí)農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)的基因在再生的植株中成功表達(dá)。選擇的幼態(tài)植株在相同條件下再培養(yǎng)3-5個(gè)月，結(jié)果得到成熟的矮化植株和成熟的合軸植株。
本發(fā)明首次提供了用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蘭科植物的方法。據(jù)本發(fā)明可容易地得到含目的基因的轉(zhuǎn)基因蘭科植物。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化蘭科植物的方法，其包括如下步驟利用農(nóng)桿菌感染所述蘭科植物的組織，其中該農(nóng)桿菌具有待導(dǎo)入該植物的基因。
2.權(quán)力要求1的方法，其中，所述蘭科植物的組織是指植物花梗節(jié)發(fā)的芽。
3.權(quán)力要求1的方法，其還包括如下步驟由感染組織誘導(dǎo)胚狀體(PLB)，再將所述胚狀體轉(zhuǎn)化為成熟的植株。
4.權(quán)力要求1的方法，其中，農(nóng)桿菌選自Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium tumefaciens及其衍生菌株。
5.權(quán)力要求4的方法，其中，農(nóng)桿菌是Agrobacterium rhizogenes及其衍生菌株。
6.權(quán)力要求1的方法，其中，蘭科植物是選自Phalaenopsis，Doritaenopsis，Doritis，Paraphalaenopsis，Euphalaenopsis及有關(guān)菌株。
7.權(quán)力要求4的方法，其中，蘭科植物是Phalaenopsis。
8.一種轉(zhuǎn)化的蘭科植物，其是通過(guò)一種方法轉(zhuǎn)化蘭科植物得到，該方法包括用具有待導(dǎo)入植物基因組的基因的農(nóng)桿菌感染所述蘭科植物的組織。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)化蘭科植物的方法,該方法包括用具有待導(dǎo)入植物的基因的農(nóng)桿菌感染所述蘭科植物的組織。因此使得首次用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化蘭科植物成為可能。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1193253SQ97190514
公開(kāi)日1998年9月16日 申請(qǐng)日期1997年3月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月28日
發(fā)明者三浦靖高, 山本好和 申請(qǐng)人:日本涂料株式會(huì)社