專利名稱：用線粒體翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組核酸分子的蛋白表達(dá)，特別是涉及在體外培養(yǎng)的動物組織中通過用病毒感染該宿主組織或用在一種病毒基表達(dá)載體中的重組核酸轉(zhuǎn)染該宿主組織，并利用在富含線粒體的組織中的翻譯生產(chǎn)蛋白質(zhì)，包括病毒蛋白。
先有技術(shù)描述從轉(zhuǎn)染的核酸翻譯蛋白通常是用存在于原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中的通用翻譯系統(tǒng)完成的(Sambrook等，Molecular Cloning,A LaboratoryManual，第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY,1989)。在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的線粒體有用于采用非通用遺傳密碼的內(nèi)源線粒體DNA(mtDNA)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)。然而，該線粒體翻譯系統(tǒng)尚未用于翻譯外源核酸。
線粒體是多層膜細(xì)胞器，它以協(xié)調(diào)程序生長和分裂，該協(xié)同作用需要來自細(xì)胞核中的遺傳系統(tǒng)和包含在線粒體中的獨立的遺傳系統(tǒng)的作用(Alberts等，Molecular Biology of The Cell，第二版，第387-401頁，Garland出版公司，紐約，NY)，大多數(shù)線粒體蛋白由核DNA編碼，也就是說，在細(xì)胞溶質(zhì)中轉(zhuǎn)錄、翻譯并輸送到線粒體中。相反，某些線粒體蛋白從mtDNA轉(zhuǎn)錄并用包括兩種核糖體RNA和22種tRNA的線粒體系統(tǒng)在細(xì)胞器本內(nèi)身翻譯。將線粒體基因序列與編碼蛋白的氨基酸序列比較顯示，與在真核細(xì)胞和大多數(shù)原核細(xì)胞中所用的通用密碼相比，線粒體中的遺傳密碼發(fā)生改變。例如在通用密碼中UGA密碼子是蛋白合成的終止密碼子，而在線粒體中UGA編碼色氨酸，在通用系統(tǒng)中密碼子AGA和AGG編碼精氨酸，但在哺乳類線粒體中是終止密碼子。
重組DNA可用于生產(chǎn)被轉(zhuǎn)運進(jìn)線粒體的蛋白質(zhì)。在一個表達(dá)系統(tǒng)中，用一個含線粒體黃素酶(MCAD)基因cDNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染猴腎細(xì)胞(COS-7細(xì)胞)(Jensen等，Biochim.et Biophys.Acta 1180:65-72,1992)。用轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄RNA和產(chǎn)生蛋白質(zhì)。該重組MCAD蛋白在線粒體細(xì)胞部分加工并濃縮，表明MCAD蛋白被轉(zhuǎn)運到線粒體中，在那里從細(xì)胞溶質(zhì)產(chǎn)生的蛋白中除去前導(dǎo)肽。
某些病毒的復(fù)制同細(xì)胞線粒體或在被感染細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的多層膜泡囊相關(guān)。在體外生長的并用甲型肝炎病毒(HAV)感染的猴腎細(xì)胞中，在含HAV抗原的膜結(jié)合的囊狀包涵體中發(fā)現(xiàn)病毒狀顆粒(Asher等，J.Virol.Meth.15:323-328,1987)。為塞姆利基森林病毒(SFV)的RNA合成所需的一種磷蛋白已被定位在SFV感染細(xì)胞和用編該磷蛋白的cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞中的大囊狀結(jié)構(gòu)(Peranen,J.,J.Gen.Virol.72:195-199,1991)。
抑制乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制的核苷類似物也損害在長期暴露于藥物后的線粒體功能，提示HBV和mtDNA有相似的DNA復(fù)制機(jī)制。類似物2’,3-’雙脫氧-3-硫代胞苷、5-氟-2’,3’-雙脫氧-3’-硫代胞苷和1-(2’-脫氧-2’-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶(即Fialuridine)抑制HBV復(fù)制(Doong等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8495-8499,1991；Colacmo等，Antimicrobial Agents and Chemother.38(9):1997-2002,1994)。其中，2’,3’-雙脫氧-3-硫代胞苷的(+)-對映體已表現(xiàn)出在體外獨立的線粒體中明顯抑制mtDNA合成(Chang等，J.Biol.Chem.267(31):22414-22420,1992)。
在含大量線粒體的器官中，包括肝、胰腺和唾液腺中很容易發(fā)現(xiàn)HBV，但在幾乎不含線粒體的HBV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，HBV病毒顆粒和抗原很難檢測到。此外，某些HBV抗原可能為病毒復(fù)制所需要，因為不制造HBVe蛋白(HBe)的細(xì)胞系也不產(chǎn)生Dane顆粒。這可能是因為在常規(guī)組織或細(xì)胞培養(yǎng)中線粒體常被損害，導(dǎo)致HBV在培養(yǎng)細(xì)胞中的生長受限制。在常規(guī)富含線粒體細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)中缺氧似乎是導(dǎo)致線粒體的破壞。在常規(guī)組織培養(yǎng)系統(tǒng)中已發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞系(例如修飾的成人肝細(xì)胞、肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞和胎兒肝細(xì)胞)產(chǎn)生HBe抗原(Gripon等，Virol.192:534-540,1993；Ochiya等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1875-1879,1989)。這類細(xì)胞系可能含足夠的線粒體以允許用常規(guī)的組織培養(yǎng)方法產(chǎn)生HBe。
最近已構(gòu)建了HBV轉(zhuǎn)基因小鼠并用于檢查HBV蛋白的裝配、轉(zhuǎn)運、分泌和其它功能特性(Guidotti等，J.Virol.69:6158-6169,1995；Araki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:207-211,1989)。這種轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生的HBe抗原可能由用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的質(zhì)?；蛴蛇M(jìn)入線粒體的那些質(zhì)粒產(chǎn)生的RNA造成的。質(zhì)?？赡苓M(jìn)入線粒體的可能性基于線粒體的膜結(jié)構(gòu)與在某些條件下允許核酸通過的其它膜結(jié)構(gòu)相似的事實。在末端含豐余大于基因組長度的HBV構(gòu)建物的某些HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝和腎組織中已發(fā)現(xiàn)了高水平的HBV復(fù)制(Guidotti等，J.Virol.69:6158-6169,1995)。
在產(chǎn)生病毒顆粒的人類、細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動物中積極復(fù)制的HBV也總是產(chǎn)生HBe(Chisari,F.V.,Hepatology 22:1316-1325,1996)。對完全功能的HBV的復(fù)制，通用翻譯系統(tǒng)和線粒體翻譯系統(tǒng)都需要。在肝細(xì)胞中，似乎用線粒體翻譯系統(tǒng)比用通用翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生更多的HBV抗原，因為在培養(yǎng)的肝組織的線粒體部分中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)可溶的HBV抗原。(Paik等，Abstract,Am.Assoc.for the Smdy of Liveer Diseases,1995)。然而，由于在常規(guī)組織培養(yǎng)系統(tǒng)中線粒體經(jīng)常受損害，線粒體翻譯系統(tǒng)對病毒裝配和/或體內(nèi)免疫反應(yīng)的貢獻(xiàn)已很難確定。這種與常規(guī)組織培養(yǎng)方法相關(guān)的線粒體損害也可解釋為什么用細(xì)胞培養(yǎng)在體外很難繁殖HBV。
已公開了動態(tài)的器官培養(yǎng)系統(tǒng)，其中在控制條件下肝組織可維持大約24-48小時(Smith,P.F.等，Life Sci.36:1367,1985；S.S.Park,InjeMed.J.14(3):363-369,1993)。在鑒別潛在抗病毒劑的方法方面已經(jīng)描述了體外胸腺器官培養(yǎng)的應(yīng)用(公布的PCT申請WO9505453)。
本發(fā)明用一個生理培養(yǎng)系統(tǒng)(可從Leema Pharmed，南朝鮮，漢城得到)體外培養(yǎng)動物組織，用病毒(包括人類HBV或HCV)有效地感染該動物組織，以用一個真核細(xì)胞線粒體翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)病毒抗原。該系統(tǒng)也可用于生產(chǎn)其它非線粒體蛋白，通過用一種含重組DNA的人類肝炎病毒基載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，可在線粒體中翻譯這些蛋白。推薦的載體包含來自HBV的DNA和/或與HCV序列互補(bǔ)的DNA。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供一種在培養(yǎng)的動物組織中生產(chǎn)病毒抗原的方法，包含如下步驟在體外培養(yǎng)中提供來自動物的器官組織作為宿主組織，其中該宿主組織富含線粒體；在體外用病毒感染該宿主組織；體外培養(yǎng)感染的宿主組織，以在該宿主組織中用線粒體翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)病毒蛋白；以及從感染的和培養(yǎng)的宿主組織中分離病毒蛋白。在該方法的一個實施方案中，從選自肝、腎、胰腺和唾液腺的器官組織分離宿主組織。在另一個實施方案中，該動物選自人、大鼠、小鼠、狗、雞和蛙。在一個推薦實施方案中，該病毒是選自甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒和腦炎病毒的一種人類病毒。在一個實施方案中，病毒抗原在宿主組織的線粒體中產(chǎn)生。在一個推薦實施方案中，該方法還包括將分離的病毒抗原導(dǎo)入一個動物以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在另一個推薦實施方案中，按照該方法生產(chǎn)適用于疫苗的病毒抗原。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種在培養(yǎng)的動物組織中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包含以下步驟在體外培養(yǎng)中提供來自動物的器官組織作為宿主組織，其中該宿主組織富含線粒體；體外用一個含病毒DNA和重組DNA的DNA載體轉(zhuǎn)染該宿主組織；體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的宿主組織，以在宿主組織中用一個線粒體翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)由轉(zhuǎn)染的DNA載體編碼的蛋白質(zhì)；以及從培養(yǎng)的和轉(zhuǎn)染的宿主組織中分離由轉(zhuǎn)染的DNA載體編碼的蛋白。在該方法的一個實施方案中，從選自肝、腎、胰腺和唾液腺的器官組織分離宿主組織。在另一個實施方案中，該動物選自人、大鼠、小鼠、狗、雞和蛙。在一個推薦實施方案中，該病毒DNA是人類乙肝病毒DNA。該方法還可以包括用一個輔助病毒感染或轉(zhuǎn)染宿主組織的步驟。在一個實施方案中，在宿主組織的線粒體中生產(chǎn)蛋白。另一個實施方案是，按照該方法生產(chǎn)適用于疫苗的病毒抗原。推薦實施方案包括按照該本方法生產(chǎn)蛋白，其中該病毒DNA是人類乙肝病毒DNA，并且其中該DNA載體含有一個插入編碼非結(jié)構(gòu)病毒蛋白的人類病毒DNA序列中的重組DNA。
附圖簡述

圖1表示組織樣品體外自動培養(yǎng)裝置。
圖2圖示一個HBV基表達(dá)載體。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明關(guān)于用常規(guī)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)不易生產(chǎn)的天然蛋白和來自病毒的蛋白的方法，其中該病毒的病毒核酸含大量線粒體的細(xì)胞中進(jìn)行體外翻譯，而這些細(xì)胞被維持在一個自動動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中。
本發(fā)明可供體外維持的組織的雜交種病毒感染使用，以使從感染病毒中能生產(chǎn)蛋白質(zhì)。這對于動物細(xì)胞中的人類病毒的翻譯特別重要，但它對用人類或非人類病毒和人類或非人類組織作為宿主組織的細(xì)胞的任何雜交種感染也有用。例如可用人類HBV感染大鼠肝的切片并將該肝組織維持在體外使病毒抗原能表達(dá)的自動動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中。
用標(biāo)準(zhǔn)外科方法從諸如大鼠的動物中分離器官組織。一般該器官是已知線粒體豐富的一種器官，如肝、腎、胰腺和唾液腺。將該組織切成大約260μm厚2cm2大的切片，并通過將該組織切片與一種病毒(如HBV)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用該病毒感染。HBV是得自感染的人類病人中獲得的活檢肝組織。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，也可用其它病毒如甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、腦炎病毒和類似的動物病毒取代HBV。作為對照，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)不暴露于該病毒的相同類型的動物組織切片。
在自動器官培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)感染的器官切片。參考圖1，在這個培養(yǎng)系統(tǒng)中，在一個位于培養(yǎng)管12內(nèi)的多孔容器11中培養(yǎng)組織切片10，培養(yǎng)管12是可旋轉(zhuǎn)的(見箭頭)，以允許當(dāng)培養(yǎng)管12旋轉(zhuǎn)時該組織被周期性地浸入組織培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)試管12中的氣體交換以有規(guī)律的時間間隔發(fā)生，其中氣體混合物通過位于培養(yǎng)管12末端的端口13、16導(dǎo)入培養(yǎng)管。取出分析樣品或?qū)肱囵B(yǎng)基或其它試劑是通過位于培養(yǎng)管12壁中的樣品端口14進(jìn)入培養(yǎng)管12內(nèi)完成的。通過將該培養(yǎng)系統(tǒng)置于培養(yǎng)箱中使它維持37℃恒溫。
于37℃在修飾的Waymouth氏MB752/1培養(yǎng)基中，在pH7.0、1.6-2個大氣壓的5％CO2和95％O2的混合氣體下培養(yǎng)該組織切片，雖然那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，也能等同地使用其它培養(yǎng)基和氣體混合物。將該病毒感染組織培養(yǎng)通常大約1至48小時，最好培養(yǎng)大約24小時。
在培養(yǎng)階段完成后，收集組織，用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用來分析或制備蛋白質(zhì)。例如，在感染組織中通過組織切片和用抗-HBsAg抗體染色用標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)方法對HBV蛋白進(jìn)行監(jiān)測。
通常，在不到24小時的培養(yǎng)后，在動物細(xì)胞中檢測到病毒蛋白。感染的組織用抗-HBsAg抗體不均勻地染色，在該組織中線粒體豐富的區(qū)域與該組織的其它部分相比染色更強(qiáng)。對照組織只顯示背景染色。
當(dāng)用電子顯微鏡檢查切片的病毒感染的動物組織時，檢測到含病毒蛋白的多層膜線粒體狀細(xì)胞器，表明病毒感染的效力與該動物組織中的線粒體濃度相關(guān)。因此，用HBV證實了人類病毒的雜交種病毒感染到動物組織中，因為組織用抗-HBsAg抗體免疫染色強(qiáng)顯示，HBV能在具有足夠的線粒體以使病毒能復(fù)制的動物器官中感染并復(fù)制。
用特異性地識別HBsAg和核心抗原的免疫化學(xué)鑒定出，通過電鏡檢查的用HBV感染后6至24小時的感染的大鼠肝組織，它含有含大量乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的具雙層膜的細(xì)胞器。某些免疫染色結(jié)構(gòu)類似破壞的線粒體的嵴截面。因為已知線粒體有獨立于細(xì)胞質(zhì)翻譯系統(tǒng)的一個翻譯系統(tǒng)，因此在線粒體狀細(xì)胞器中存在HBsAg提示該蛋白質(zhì)是由線粒體系統(tǒng)翻譯。這種翻譯將從HBV產(chǎn)生與用細(xì)胞胞漿中的通用密碼使用系統(tǒng)翻譯的相同RNA不同的分泌抗原。
從感染的大鼠組織分離的HBV蛋白用標(biāo)準(zhǔn)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示出比通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的HBV蛋白更復(fù)雜的病毒蛋白的特征輪廓。免疫染色結(jié)果提示，用本方法生產(chǎn)的HBV蛋白是用線粒體翻譯系統(tǒng)翻譯的，而不是用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞核糖體翻譯系統(tǒng)翻譯的。因此，用本方法生產(chǎn)的蛋白更象在正常感染中產(chǎn)生的病毒蛋白，因而具有如同感染中發(fā)生的抗原特性。用本方法生產(chǎn)的這類蛋白可用于在哺乳類中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且抗原決定簇與用依靠細(xì)胞的核糖體翻譯的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的蛋白上的抗原決定簇相比，可能更近似于在感染中產(chǎn)生的那些抗原決定簇。
本發(fā)明也包括從含于一個病毒基載體中的克隆DNA生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其中翻譯發(fā)生在體外用該載體轉(zhuǎn)染的線粒體豐富的動物細(xì)胞中，其中細(xì)胞在自動動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中維持。一個有效的HBV基表達(dá)系統(tǒng)用于生產(chǎn)依賴于在線粒體豐富組織中翻譯的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的該實施方案中，含插入HBV結(jié)構(gòu)基因中的一個克隆的編碼DNA序列的HBV基表達(dá)載體用于在用推薦的自動培養(yǎng)系統(tǒng)體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的動物器官組織中指導(dǎo)克隆DNA的基因表達(dá)。
雙鏈HBV DNA(含“負(fù)”鏈和“正”鏈DNA序列)用于構(gòu)建一個環(huán)狀DNA載體，用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法在其中可插入其它編碼的DNA序列。該HBV基載體也含來自原核生物質(zhì)粒、允許個載體在原核生物中復(fù)制以擴(kuò)增DNA的序列。該載體含一個抗藥性基因(如對潮霉素B的抗性)，以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提供一個選擇性標(biāo)記。插入的編碼DNA序列插入一個在轉(zhuǎn)染的動物細(xì)胞中對復(fù)制不需要的HBV結(jié)構(gòu)基因。插入的編碼DNA序列可以是另一病毒基因序列、真核生物基因、cDNA、通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的DNA或合成的DNA序列，用切割和連接的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法完成插入，以將插入的DNA置于允許來自HBV序列表達(dá)的適當(dāng)框架和取向中。
因為在含末端豐余大于基因組長度的HBV構(gòu)建物的某些轉(zhuǎn)基因小鼠的肝和腎組織中已發(fā)現(xiàn)了HBV復(fù)制(Guidotti等，J.Vrol.69:6158-6169,1995)，這些結(jié)果提示該轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物可能已對線粒體轉(zhuǎn)染而不是對核轉(zhuǎn)染。因此，含大于基因組長度的HBV的重組構(gòu)建物可能對用本系統(tǒng)轉(zhuǎn)染體外維持的組織也有用并且被認(rèn)為功能上等同于此處討論的用于本方法的構(gòu)建物。
通過以下代表推薦實施方案的實施例能更好地理解本發(fā)明。
實施例1大鼠腎組織的體外HBV感染用乙醚普通麻醉一只混合飼養(yǎng)的白鼠并用本領(lǐng)域眾所周知的方法用外科手術(shù)打開腹部區(qū)域。然后，在切開腔靜脈以允許灌注后，將10ml冷的(大約4℃)Wisconsin溶液(Viaspan,DuPont)注射入主動脈。從無血區(qū)域取下腎并貯存在冷的Wisconsin溶液中(大約4℃)。制備腎組織切片(如大約260μm厚2cm2的片)并貯存在冷的培養(yǎng)基中。與得自感染病人活檢肝組織的HBV一起培養(yǎng)組織切片。通過將來自有乙肝表面抗原的病人肝活檢組織放在修飾的Waymouth氏MB752/1培養(yǎng)基中于37℃3小時制備HBV接種物；3小時后除去活檢樣品，然后在培養(yǎng)基中培養(yǎng)鼠器官組織切片。通常，活檢組織與培養(yǎng)基之比是5-20克組織對10ml培養(yǎng)基。作為對照，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尚未暴露于人肝活檢組織的鼠腎組織切片。
在圖1所示的自動器官培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)感染的腎器官切片，其中器官組織切片10置于一個多孔容器11內(nèi)，多孔容器11放在可旋轉(zhuǎn)的培養(yǎng)管12內(nèi)，培養(yǎng)管12至少有一個氣體、培養(yǎng)基、生長因子等進(jìn)入的入口13。多孔容器11由任何惰性材料組成，這些惰性材料包括但不限于塑料網(wǎng)、尼龍網(wǎng)或半透膜，但最好是正方形或長方形盒子形狀、平均孔徑大約為100-500μm的不銹鋼網(wǎng)。培養(yǎng)管12包括一個可重新封口的取樣口14，以取出組織培養(yǎng)基15的樣品。取樣口14也可用于注射培養(yǎng)基15、病毒顆粒、生長因子和其它培養(yǎng)試劑或物質(zhì)以體外處理組織。當(dāng)培養(yǎng)管12旋轉(zhuǎn)時，器官組織10被周期性地浸入組織培養(yǎng)基15中。當(dāng)培養(yǎng)管12旋轉(zhuǎn)時多孔容器11的盒子形狀促進(jìn)樣品的轉(zhuǎn)動，而不是容器停留在一個位置而培養(yǎng)管圍繞它轉(zhuǎn)動。培養(yǎng)管12中的氣體交換間歇性地發(fā)生，其中氣體混合物被導(dǎo)入入口13，并且氣體通過培養(yǎng)管12的出口16排出。培養(yǎng)管12維持在37℃恒溫(如在未顯示出的培養(yǎng)箱中)。在整個培養(yǎng)過程中最好自動進(jìn)行該器官培養(yǎng)過程，以在相同的條件下維持細(xì)胞。
在37℃、pH7.0下，在修飾的Waymouth氏MB752/1培養(yǎng)基中，在1.6-2.0個大氣壓5％CO2和95％O2下培養(yǎng)該組織切片。由WaymouthMB 752/1粉末培養(yǎng)基(Gibco)、10％胎牛血清、2.2％碳酸氫鈉、25mM D-葡萄糖、1μg/ml結(jié)晶牛鋅胰島素、含50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素(Gibco)的抗菌素混合物以及蒸餾水制備該培養(yǎng)基。進(jìn)行2.5分鐘間隔的氣體交換并通過轉(zhuǎn)動圖1所示的培養(yǎng)管，將組織每分鐘浸入培養(yǎng)基中4.5次。
HBV-感染的腎組織通常培養(yǎng)1至48小時，最好是大約24小時。然后通過組織切片并用抗-HBsAg抗體(從SIGMA,St.Louis,MO購買)染色，將該組織用標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)方法處理，以確定在感染組織中HBV的存在。
通常，在不到24小時的培養(yǎng)后，在腎細(xì)胞中檢測到HBsAg。感染的腎組織用抗-HBsAg抗體不均勻染色，與線粒體相對少的遠(yuǎn)端小管相比，線粒體豐富的近球小管顯示出更強(qiáng)的染色。當(dāng)用電子顯微鏡檢查切片的HBV感染的鼠腎組織時，在近球小管中比在遠(yuǎn)端小管中檢查到明顯更高濃度的含HBsAg的多層膜線粒體狀細(xì)胞器。因此，HBV感染的效率與動物組織中線粒體的濃度相關(guān)。這些結(jié)果也表明，與目前的雜交種病毒感染的概念相反，HBV可在有足夠線粒體以允許HBV復(fù)制的動物器官中感染和復(fù)制。
除了大鼠腎組織，用以上描述的自動培系統(tǒng)已經(jīng)成功培養(yǎng)了來自狗、小鼠、雞和蛙的肝組織。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，也可用HBV或其它人類或非人類病毒(如甲型肝炎和丙型肝炎病毒或腦炎病毒)感染這類動物組織，這些人類或非人類病毒感染線粒體豐富組織以允許病毒在該體外系統(tǒng)中復(fù)制。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，這類動物組織也可以包括用人類病毒或動物病毒感染的人類組織。
實施例2將肝組織的HBV感染定位于線粒體細(xì)胞器基本上用實施例1中描述的取腎的方法從混合飼養(yǎng)的白鼠用外科方法取出肝組織?；救鐚嵤├?所述，將肝組織切片并用HBV感染。然后在自動培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)感染的鼠肝組織24小時，并且用酶聯(lián)免疫吸收劑分析檢查該組織HBsAg和HBVe抗原(HBeAg)的存在，該酶聯(lián)免疫吸收劑分析用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)識別抗原(即可得自Abbott實驗室的HBV ELISA試劑盒)。感染的組織也用標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡技術(shù)(基本如Guidotti等，J.Virol.69:6158-6169,1995中描述)，通過DNA雜交分析HBV DNA。
用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞分級分離方法(基本如Jensen等，Biochim.et.Biopys.Acta 1180:65-72,1992中描述)，將感染的鼠肝首先分級分離為可溶胞質(zhì)(細(xì)胞溶質(zhì))部分和含線粒體的沉淀。簡短地說，將感染的組織切片在緩沖液(0.25M蔗糖、0.1mM EDTA和1mM Tris-HCL,pH7.4)中勻漿并以低速(700×g)離心，除去核和任何未破碎的細(xì)胞(核部分)。上清液以高速(12,000×g)離心分離線粒體部分(在沉淀中)和細(xì)胞溶質(zhì)部分(在上清液中)。然后用檢測這兩種抗原的ELISA法測試核、線粒體和細(xì)胞溶質(zhì)部分HBsAg和HBeAg的存在。
線粒體部分含有的HBsAg比在核或細(xì)胞溶質(zhì)部分發(fā)現(xiàn)的HBsAg至少多10倍。HBeAg只在線粒體部分被檢測到，而在核或細(xì)胞溶質(zhì)部分中沒有發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明，在鼠肝組織中HBV主要是在線粒體或分級在一起的線粒體狀細(xì)胞器中復(fù)制，只有有限的HBV復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞核。
用標(biāo)準(zhǔn)凝膠分離和DNA雜交技術(shù)，在線粒體部分發(fā)現(xiàn)由小于或等于2.1Kb的HBV DNA組成的復(fù)制復(fù)合體。在細(xì)胞溶質(zhì)部分沒有檢測到HBV DNA，在核部分檢測到少量(不到在線粒體部分發(fā)現(xiàn)的量的10％)。
實施例3從人血漿分離的HBsAg與由重組DNA生產(chǎn)的HBsAg的比較用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)比較自人血漿獲得的疫苗中的HBsAg(得自南朝鮮Blue Cross的Hepavax)和用重組DNA技術(shù)制備的HBsAg(得自JEIL-JEDANG，南朝鮮，漢城)。將蛋白溶于含40mM Tris-HCl,pH6.8、1％SDS、0.35％β-巰基乙醇、5％甘油和溴酚藍(lán)的緩沖液中，在用標(biāo)準(zhǔn)方法(Laemmli,U.K.,Nature 227:680-685,1970)在10％SDS-PAGE凝膠上分離前煮沸5分鐘。電泳后，蛋白用眾所周知的方法和抗-HBsAg抗體(得自SIGMA,St.Louis,MO)進(jìn)行免疫分析印跡。
用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的HBsAg只顯示23Kd的單條帶，而從人血漿中分離的HBsAg顯示出在從大約20KD至30KD的寬的拖尾帶中廣譜的表面抗原。這些結(jié)果提示與通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的單一蛋白相比，許多天然產(chǎn)生的HBV抗原可能在線粒體中用核心抗原基因和線粒體特有的密碼子選擇生產(chǎn)。因為源于血漿的疫苗比通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的疫苗通常更有效，這些結(jié)果也提示在感染期間產(chǎn)生的多種不同形式的HBV表面抗原可以單獨或一起用作比通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的單個HBV抗原更好的免疫原。
實施例4用線粒體翻譯系統(tǒng)在線粒體中HBsAg的生產(chǎn)在哺乳動物線粒體的密碼子選擇系統(tǒng)中，密碼子AGA和AGG作為終止翻譯的終止密碼子。核心HBsAg基因含AGA和AGG密碼子，已經(jīng)推測它們?yōu)閷⒑诵目乖鞍准庸槌墒霩BsAg的切割位點。然而，當(dāng)在哺乳動物線粒體中翻譯時，核心HBsAg基因在AGA和AGG密碼子自然終止。在線粒體的遺傳密碼子選擇的基礎(chǔ)上，在HBsAg基因中有幾個其它預(yù)期的起始和終止密碼子(總結(jié)于表1)。對編碼稱為前S1和前S2和核心抗原(HBcAg)的HBV蛋白基因已作出同樣的確定，這些起始和終止密碼子位點也顯示在表1中(關(guān)于HBV蛋白的一般討論，參見Lau和Wright,Lancet342:1335-1340,1993)。
基本如實施例2所述，用HBV感染鼠肝組織，體外培養(yǎng)感染的鼠肝組織12-48小時。培養(yǎng)后，收集感染的鼠組織并在含40mM Tris-HCl，pH6.8、1％SDS、0.35％β-巰基乙醇、5％甘油和溴酚藍(lán)的緩沖液中裂解，將裂解液煮沸5分鐘，用標(biāo)準(zhǔn)方法(Laemmli,U.K.,Nature227:680-685,1970)在10％SDS-PAGE上分離。為了比較，在SDS-PAGE凝膠的一個相鄰泳道中包括用通過重組DNA技術(shù)制備的HBsAg作為對照。通過電泳分離后，蛋白用眾所周知技術(shù)，用抗-HBsAg抗體進(jìn)行免疫印跡和檢測。
在體外生長的感染的鼠組織中生產(chǎn)的HBsAg與在HBV慢性感染的人的血漿中檢測到的那些蛋白相似，含有大約20Kd至大約30Kd的蛋白。因此，在線粒體豐富組織中體外翻譯HBV基因產(chǎn)生多種模擬在感染的人中天然產(chǎn)生的那些抗原的分泌抗原。相反，通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的HBsAg表現(xiàn)出大約23Kd的單條帶。將通過體外鼠肝的感染生產(chǎn)的多種HBsAg蛋白分離用作抗HBV感染的一種疫苗。
表1蛋白 大小 起始密碼子終止密碼子氨基酸號AUAAUGAUUAGAAGGHBsAg 226 28 1 21824 無19575 2262786103197198前S1 119 85 1 無 10411042114前S2 55 無 1 無 16 1848HBcAg 183 無 1 59 98 5610511212613315031在HBV的“adr”亞型中發(fā)現(xiàn)2在HBV的“adw”和“ayw”亞型中發(fā)現(xiàn)3這代表HBeAg的末端密碼子；先前假設(shè)是血漿或胞質(zhì)中的蛋白酶的切割位點。
實施例5在用HBV基表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的動物組織中蛋白的生產(chǎn)依靠在線粒體豐富組織中的翻譯，同樣可以使用一個有效的HBV-基表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。也就是，在如實施例1和2公開的體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染的鼠器官組織中，可以用HBV基表達(dá)載體指導(dǎo)克隆DNA的基因表達(dá)。
HBV是一個有3200個堿基基因組的病毒DNA，其基因組由一條“負(fù)”鏈和一條較短的“正”鏈組成，它們一起形成編碼結(jié)構(gòu)蛋白和病毒復(fù)制所需蛋白的部分雙鏈環(huán)狀DNA(Lau和Wright,Lancet 342:1335-1340,1993)。
一個HBV-基載體含來自原核生物質(zhì)粒pBR322的序列、HBV復(fù)制起點、一個截短的HBV聚合酶基因和一個抗藥性基因(如一個在HSV胸苷激酶調(diào)節(jié)序列控制下的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，提供對潮霉素B的抗性)。
參考圖2，該HBV-基載體稱為pHBVex，包括來自原核生物載體pBR322的DNA序列(標(biāo)記為“pBR”)以允許在原核細(xì)胞(包括大腸桿菌)復(fù)制載體、當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時給予氨芐青霉素抗性的序列(標(biāo)記為“AmpR”)；一個在HSV胸苷激酶啟動子(標(biāo)記為“HSV TK pro”)序列和終止序列(標(biāo)記為“HSV TK”)控制下的潮酶素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(標(biāo)記為“HYG”)，它使真核細(xì)胞表達(dá)對潮霉素B的抗性的；一個插入DNA序列(標(biāo)記為“insDNA”)，它可以是編碼在截短的HBV聚合酶基因(標(biāo)記為“HBVp”)控制下的將被表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因組序列或cDNA序列。HBV聚合酶基因的截短和外源DNA的插入發(fā)生在復(fù)制和包裝的末端蛋白和pre-S1基因起始之間的區(qū)域內(nèi)。質(zhì)粒的剩余部分由HBV“負(fù)”鏈DNA(標(biāo)記為“HBV-”)和它的標(biāo)準(zhǔn)互補(bǔ)DNA序列組成，互補(bǔ)DNA序列由標(biāo)準(zhǔn)分子遺傳學(xué)技術(shù)產(chǎn)生，這些技術(shù)包括反轉(zhuǎn)錄、由合成引物進(jìn)行DNA聚合和將代表HBV“負(fù)”鏈的雙鏈DNA連接到載體的剩余部分中(Sambrook等，Molecular Cloning,ALaboratory Manual(第二版)，第1-3卷，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)。
在pHBVex載體中，采用將插入DNA置于允許來自HBV調(diào)節(jié)序列表達(dá)的適當(dāng)框架和取向中的限制性內(nèi)切酶消化和連接的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manua第二版，第1-3卷，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)，用一外源DNA序列(一個病毒基因的或真核細(xì)胞基因、cDNA或通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的DNA)替代HBV聚合酶基因的編碼序列部分。環(huán)內(nèi)的箭頭表示DNA序列的取向(轉(zhuǎn)錄的方向)。
在一個等同的pHBVex載體中的其它DNA序列(沒有顯示)可能包括得自其它原核生物載體、甲肝病毒、丙肝病毒或包括EB病毒(EBV)、單純皰疹病毒(HSV)和腦炎病毒在內(nèi)的其它病毒的序列。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，其它HBV-基表達(dá)載體可以作為等同物取代圖示于圖2的載體。例如，一個與pHBVex相似的但在載體中含一個豐余大于單個HBV基因組構(gòu)建物載體對復(fù)制或基因表達(dá)可能是最適的，這類似在含豐余HBV構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因小鼠中得到的結(jié)果(Guidotti等，J.Virol.69:6158-6169,1995)。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員會進(jìn)一步理解，用pHBVex載體或一個等同的載體轉(zhuǎn)染也包括共轉(zhuǎn)染或用一個輔助病毒感染，以促進(jìn)或增強(qiáng)該載體DNA的復(fù)制或基因表達(dá)。
基本如實施例1和2中所述，從線粒體豐富的器官分離并制備用于體外培養(yǎng)的動物組織。用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣沉淀、將組織細(xì)胞與含pHBVex-insDNA構(gòu)建物的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、用含pHBVex-insDNA序列的脂質(zhì)體處理該組織、DEAE葡聚糖促進(jìn)轉(zhuǎn)染、電穿孔和DNA的微注射，將含插入DNA的pHBVex載體轉(zhuǎn)染進(jìn)線粒體豐富的組織。
基本如實施例1中所述，在自動系統(tǒng)中體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的組織切片，以允許由線粒體豐富組織中轉(zhuǎn)染的DNA表達(dá)而產(chǎn)生蛋白。用包括親和層析的多種標(biāo)準(zhǔn)方法的任何一種純化該蛋白。用HBV基表達(dá)系統(tǒng)，可以生產(chǎn)出模擬那些在感染線粒體豐富組織的病毒(例如其它肝炎病毒或腦炎病毒)的天然感染期間產(chǎn)生的抗原的其它病毒抗原，以制備對這些病原體有效的疫苗。
實施例6在用HBV-基表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的動物組織中生產(chǎn)人類HCV抗原因為對獲得足夠的HCV抗原在動態(tài)組織培養(yǎng)系統(tǒng)中在動物組織中直接培養(yǎng)HCV可能仍是一個效率低的方法(如因為HCV復(fù)制相對地慢)，用基于另一病毒的載體對體外生產(chǎn)HCV抗原是一個有效的方案。pHBVex載體用于將人丙型肝炎病毒抗原的編碼基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入線粒體豐富的細(xì)胞，基本如實施例5中所述，用線粒體翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)天然抗原。因為丙型肝炎病毒是一種RNA病毒，用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)首先將編碼丙型肝炎病毒表面抗原(HCsAg)的RNA序列反轉(zhuǎn)錄成一個cDNA(Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第二版)，1-3卷，Cold Spring Harbor Larboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989)。用將載體DNA限制性消化和連接編碼HCsAg雙鏈cDNA(用合適限制性內(nèi)切酶酶切位點或平端連接)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將HCsAg cDNA插入pHBVex載體截短的HBV聚合酶基因中。用基本如實施例1、2和5中描述的方法，將pHBVex-HCsAg構(gòu)建物轉(zhuǎn)染進(jìn)鼠肝組織的單獨切片并體外培養(yǎng)24-48小時。在24-48小時的培養(yǎng)后，取出該組織，用包括親和層析的標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)，用結(jié)合HCsAg蛋白的抗體純化在轉(zhuǎn)染的組織中產(chǎn)生的HCsAg蛋白。
本發(fā)明包括制備在線粒體豐富細(xì)胞中天然產(chǎn)生的蛋白(如在肝或胰中產(chǎn)生的蛋白)的一種有用的方法。本發(fā)明的翻譯方法可用于生產(chǎn)在線粒體中翻譯的天然非線粒體蛋白。這可能在生產(chǎn)具有如依賴線粒體翻譯的加工或密碼子識別的免疫原特性的蛋白中特別重要。也就是說，本發(fā)明對生產(chǎn)在線粒體中復(fù)制的病毒天然抗原、或那些用常規(guī)組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)時復(fù)制太慢的病毒的天然抗原、或那些用常規(guī)重組DNA技術(shù)不能生產(chǎn)的病毒天然抗原是有用的。在一個體外系統(tǒng)中，需要生產(chǎn)來自傳染因子，特別是人類傳染因子的蛋白。最好是雜交種感染，因為它限制同種不希望有的產(chǎn)物污染所需產(chǎn)物的危險。例如，一種用不依賴人類細(xì)胞生長的人類傳染因子感染的方法限制來自其它人類傳染因子(如存在于人類組織中的HIV)的污染危險。同樣地，需要一個有效地模擬人類感染以產(chǎn)生類似在人類感染期間產(chǎn)生的免疫原的體外系統(tǒng)，這些免疫原用常規(guī)用于由重組DNA生產(chǎn)蛋白的技術(shù)是不可能生產(chǎn)的。本發(fā)明提供一種用重組HBV基載體生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，該方法可用于在轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞的線粒體中指導(dǎo)生產(chǎn)其它非線粒體蛋白。本發(fā)明也使人們能在一個體外系統(tǒng)中生長病毒，這對發(fā)現(xiàn)新的預(yù)防疾病的療法和改進(jìn)人類由病毒感染引起的病理疾病的現(xiàn)行療法是有用的。
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1．體外生產(chǎn)病毒抗原的方法，包括以下步驟提供得自非人類動物的大約2cm×2cm×260μm的器官組織切片作為在體外培養(yǎng)中的宿主組織，其中該宿主組織富含線粒體；在體外用病毒感染所述宿主組織；在一個體外動態(tài)器官培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)所述感染的宿主組織，該動態(tài)器官培養(yǎng)系統(tǒng)提供將所述感染的宿主組織周期性地浸入組織培養(yǎng)基中以及還提供氣體交換；允許所述感染的組織維持在所述動態(tài)器官培養(yǎng)中足夠的時間以產(chǎn)生病毒抗原；以及分離在體外產(chǎn)生的所述病毒抗原。
2．權(quán)利要求l的方法，其中該提供步驟用的宿主組織從肝、腎、胰腺或唾液腺的器官組織中分離。
3．權(quán)利要求1的方法，其中該提供步驟用的宿主組織從非人類動物即大鼠、小鼠、狗、雞或蛙中分離。
4．權(quán)利要求l的方法，其中該感染步驟用的人類病毒選自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和腦炎病毒。
5．權(quán)利要求1的方法，其中該允許步驟在所述宿主組織中的線粒體狀細(xì)胞器中在大約24至大約48小時內(nèi)產(chǎn)生病毒抗原。
6．權(quán)利要求1的方法，還包括將分離的病毒抗原導(dǎo)入動物以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的步驟。
7．按照權(quán)利要求1方法生產(chǎn)的并適于在疫苗中使用的病毒抗原。
8．按照權(quán)利要求1方法生產(chǎn)的病毒抗原用于制備疫苗的用途。
9．體外生產(chǎn)病毒抗原的方法，包括以下步驟提供得自非人類動物的大約2cm×2cm×260μm的器官組織切片作為在體外培養(yǎng)中的宿主組織，其中所述宿主組織富含線粒體；
在體外用包含重組病毒DNA和允許重組病毒DNA表達(dá)的DNA序列的一種DNA載體轉(zhuǎn)染所述宿主組織；在一個體外動態(tài)器官培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的宿主組織，該動態(tài)器官培養(yǎng)系統(tǒng)提供將所述感染的宿主組織周期性地浸入組織培養(yǎng)基中以及還提供氣體交換；允許所述感染的組織維持在所述動態(tài)器官培養(yǎng)中足夠的時間以產(chǎn)生病毒抗原；以及分離在體外產(chǎn)生的所述病毒抗原。
10．權(quán)利要求9的方法，其中該提供步驟用的宿主組織從肝、腎、胰腺或唾液腺的器官組織中分離。
11．權(quán)利要求9的方法，其中該提供步驟用的宿主組織從非人類動物即大鼠、小鼠、狗、雞或蛙中分離。
12．權(quán)利要求9的方法，其中該轉(zhuǎn)染步驟用的重組病毒DNA得自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或其重組體中的核酸。
13．權(quán)利要求9的方法，其中該轉(zhuǎn)染步驟用的重組病毒DNA得自乙型肝炎病毒中的核酸，并插入編碼非結(jié)構(gòu)病毒蛋白的人病毒DNA序列中。
14．權(quán)利要求9的方法，其中該允許步驟在所述宿主組織中的線粒體狀細(xì)胞器中在大約24至大約48小時內(nèi)產(chǎn)生病毒抗原。
15．權(quán)利要求9的方法，還包括用輔助病毒感染或轉(zhuǎn)染所述宿主組織的步驟。
16．按照權(quán)利要求9方法生產(chǎn)的并適于在疫苗中使用的病毒抗原。
17．按照權(quán)利要求9方法生產(chǎn)的病毒抗原用于制備疫苗的用途。
權(quán)利要求
1．在培養(yǎng)的動物組織中生產(chǎn)病毒抗原的方法，包含以下步驟提供來自動物的器官組織作為在體外培養(yǎng)中的宿主組織，其中所述宿主組織富含線粒體；用病毒體外感染所述宿主組織；體外培養(yǎng)所述感染的宿主組織，以用所述宿主組織中的線粒體翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)病毒蛋白；以及從所述感染的和培養(yǎng)的宿主組織中分離病毒蛋白。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主組織從選自肝、腎、胰腺和唾液腺的器官組織中分離。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述動物選自人、大鼠、小鼠、狗、雞和蛙。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒是選自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒。丙型肝炎病毒和腦炎病毒的一種人類病毒。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒抗原在所述宿主組織中的線粒體中生產(chǎn)。
6．權(quán)利要求1的方法，還包含將分離的病毒抗原導(dǎo)入動物以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
7．適于在按照權(quán)利要求1方法生產(chǎn)疫苗中使用的病毒抗原。
8．在培養(yǎng)的動物組織中生產(chǎn)蛋白的方法，包含以下步驟提供來自動物的器官組織作為在體外培養(yǎng)中的宿主組織，其中所述宿主組織富含線粒體；用含病毒DNA和重組DNA的一個DNA載體體外轉(zhuǎn)染所述宿主組織；體外培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的宿主組織，以用所述宿主組織中的線粒體翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)由所述轉(zhuǎn)染的DNA載體編碼的蛋白；以及從所述培養(yǎng)的和轉(zhuǎn)染的宿主組織中分離由所述轉(zhuǎn)染的DNA載體編碼的蛋白。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述宿主組織從選自肝、腎、胰腺和唾液腺的器官組織中分離。
10．權(quán)利要求1的方法，其中所述動物選自人、大鼠、小鼠、狗、雞和蛙。
11．權(quán)利要求8的方法，其中所述病毒DNA是人乙型肝炎病毒DNA。
12．權(quán)利要求8的方法，還包含用一種輔助病毒感染或轉(zhuǎn)染所述宿主組織的步驟。
13．權(quán)利要求8的方法，其中所述蛋白在所述宿主組織中的線粒體中生產(chǎn)。
14．適于在按照權(quán)利要求8的方法生產(chǎn)的疫苗中使用的蛋白。
15．權(quán)利要求14的方法，其中所述病毒DNA是人乙型肝炎病毒DNA。
16．權(quán)利要求14的蛋白，其中該DNA載體含有一重組DNA，后者插入非結(jié)構(gòu)病毒蛋白的人類病毒DNA序列中。
全文摘要
公開了一種通過用病毒包括人乙型肝炎病毒(HBV)在內(nèi)的一種病毒感染動物富含線粒體的器官組織并體外培養(yǎng)感染的組織,在體外生產(chǎn)病毒抗原的方法。公開了一種通過用重組HBV－基載體轉(zhuǎn)染線粒體豐富的動物組織并在一個動態(tài)組織培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的組織,在體外生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號C12N15/86GK1217632SQ97191905
公開日1999年5月26日 申請日期1997年1月21日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月29日
發(fā)明者柏繼興 申請人:柏繼興