專利名稱：溶血磷脂酰膽堿的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域這項(xiàng)發(fā)明涉及磷脂水解領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及利用磷脂酶A2促進(jìn)磷脂酰膽堿的水解來生產(chǎn)溶血磷脂酰膽堿的改進(jìn)方法。這項(xiàng)發(fā)明還涉及制造包含溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的脂類基質(zhì)的方法。
本發(fā)明的技術(shù)背景早在二十世紀(jì)初人們就已經(jīng)知道磷脂酰膽堿可以借助酶催水解轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰膽堿。借助蛇毒提取物使卵磷脂(磷脂酰膽堿)降解的早期研究結(jié)果已經(jīng)證明蛇毒的溶血作用發(fā)生在細(xì)胞膜的卵磷脂部分。1935年，Hughes用實(shí)驗(yàn)證明卵磷脂轉(zhuǎn)化成溶血卵磷脂(溶血磷脂酰膽堿)的單分子膜水解與諸如pH值、溫度和卵磷脂分子的表面濃度等因素有關(guān)。在單分子層中卵磷脂分子填充物大大降低了水解速度。Hanahan證明在雞蛋卵磷脂與磷脂酶A2之間的醚溶性絡(luò)合物導(dǎo)致釋放不飽和脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿。采用95％的乙醇、氯仿或石油醚作溶劑時，不能察覺磷脂酶A2對磷脂酰膽堿的水解作用。在1963年的報(bào)告中，Dawson完成的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了磷脂酶A2將磷脂酰膽堿水解成溶血磷脂酰膽堿和脂肪酸分子。Dawson曾確定酶的活性與鈣離子存在與否有關(guān)，并且添加醚或丁醇將激發(fā)磷脂酶的活性。授權(quán)給Unilever Ltd.的英國專利第1,215,868號介紹了進(jìn)一步方案改進(jìn)，即在有脂肪(油)存在的條件下進(jìn)行有磷脂酶A2參與的磷脂的水解反應(yīng)。
現(xiàn)有技術(shù)中揭示的磷脂酰膽堿水解方法由于存在某些缺點(diǎn)受到損害，其中包括水解不完全和在水解反應(yīng)中產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物?，F(xiàn)有方法的缺點(diǎn)是嚴(yán)重的，因?yàn)榇嬖谖捶磻?yīng)的原始物質(zhì)或不需要的副產(chǎn)物表示在反應(yīng)的終產(chǎn)物中污染物的含量是不可接受的。為了獲得需要的產(chǎn)品(即溶血磷脂酰膽堿)必須從反應(yīng)產(chǎn)物中除掉這些不需要的成分，因此必須增補(bǔ)純化步驟。
采用上述的現(xiàn)有方法，溶血磷脂酰膽堿的最大得率近似為磷脂酰膽堿原始物質(zhì)的70％。Dawson的工作表明為了在磷脂酰膽堿水解中激發(fā)磷脂酶A2的活性，使最大得率達(dá)到大約60至70％，需要添加醚。采用包含8vol.％(體積百分比，下同)二乙基醚的水緩沖液作為反應(yīng)介質(zhì)將獲得溶血磷脂酰膽堿的最大得率，采用這種反應(yīng)介質(zhì)看到的是兩相體系。Dawson還發(fā)現(xiàn)為了提高溶血磷脂酰膽堿的得率可以在反應(yīng)介質(zhì)中用6vol.％的丁醇代替二乙基醚，而乙醇和甲基異丁基己烷對增強(qiáng)磷脂酰膽堿的水解是無效的。Dawson的結(jié)論是醚(或丁醇)對磷脂酰膽堿水解的促進(jìn)作用可能是由于密集地填充在脂界面的定向的磷脂酰膽堿分子的表面稀釋作用和從界面除去抑制性的脂肪酸的羰基的結(jié)果。添加脂肪酸抑制磷脂酰膽堿的酶解，這個證據(jù)支持Dawson的結(jié)論。添加脂肪酸使反應(yīng)受到抑制的原因它抑制從界面除去脂肪酸，或使鈣離子與脂肪酸形成螯合物，即除去了維持磷脂酶A2活性所需的鈣離子(Ca+2)。Dawson認(rèn)為除去鈣離子是更可信的解釋，因?yàn)檫M(jìn)一步添加醚將形成兩相并增加脂肪酸的溶解性，但不促進(jìn)磷脂酰膽堿的水解；反之鈣的濃度增加9倍將部分地減緩抑制作用。這還表明，眼鏡蛇毒經(jīng)純化得到的酶(磷脂酶A2)在水解中的活性取決于鈣離子的存在。在水解反應(yīng)中磷脂酶A2對鈣離子的需求以及鈣離子與磷脂酰膽堿水解釋放的脂肪酸的聯(lián)系在技術(shù)上是已知的(Novo Nordisk)。
本發(fā)明人以前發(fā)明過多種方法，這些方法適合制備脂類混合顆粒，這些顆粒在傳送藥物和提供易于吸收的卡路里方面是有用的(參閱美國專利第4,874,795號和第5,314,921號)。這些方法涉及使溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸按指定的摩爾比混合。盡管這些早期的方法容易完成，但是它們都采用價格昂貴的經(jīng)離析獲得的高純度的溶血磷脂酰膽堿，因此增加了脂類混合顆粒終產(chǎn)品的成本。
由于現(xiàn)有技術(shù)有上述的缺點(diǎn)，所以需要提出更有效地將磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰膽堿的方法。該方法將更有效地利用磷脂酰膽堿，并且使反應(yīng)終產(chǎn)物中不需要的副產(chǎn)物(如甘油磷酰膽堿)和污染物(如未水解的磷脂酰膽堿)更少。采用新方法將獲得純度更高的終產(chǎn)物，從而由于對終產(chǎn)物的純化要求降低導(dǎo)致大幅度地降低成本和節(jié)約工時。此外，還需要簡化的方法，該方法將適合生產(chǎn)包含溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的脂類混合顆粒。用磷脂酰膽堿作原始物質(zhì)將減少使用純化的溶血磷脂酰膽堿的需求，因此將降低制造脂類混合顆粒終產(chǎn)品的總成本。
本發(fā)明概述本發(fā)明的第一個目標(biāo)是提供一種比現(xiàn)有方法更有效的方法制造溶血磷脂酰膽堿。例如，采用現(xiàn)有方法制造溶血磷脂酰膽堿，磷脂酰膽堿原始物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率不超過60-70％。本發(fā)明在優(yōu)先的實(shí)施方案中提供一種方法，利用該方法磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰膽堿的效率可以接近100％。此外，按照本發(fā)明磷脂酰膽堿水解產(chǎn)生的不需要的副產(chǎn)物即使有也是少量的。借助磷脂酰膽堿以接近100％的效率轉(zhuǎn)化，本發(fā)明還提供一種降低了生產(chǎn)成本的溶血磷脂酰膽堿的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明涉及改進(jìn)磷脂酰膽堿的酶催水解。按照本發(fā)明某些制劑將與磷脂酰膽堿合并，借此提高磷脂酰膽堿酶催水解生成溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的效率，該效率將高于不添加這類制劑的磷脂酰膽堿的水解反應(yīng)的效率。因此，本發(fā)明提供了制造溶血磷脂酰膽堿的改進(jìn)方法。它還提供了制造包含溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的組合物的改進(jìn)方法。這些改進(jìn)方法涉及磷脂酰膽堿和制劑的水分散體的酶催水解，其中所述制劑將增強(qiáng)磷脂酰膽堿的水解。為了提供生物學(xué)優(yōu)選的溶血磷脂酰膽堿，磷脂酰膽堿的水解酶將優(yōu)選從磷脂酰膽堿的2-位摘除脂肪酸的酶(如磷脂酶A2)。
按照本發(fā)明的第一方面，提供了生產(chǎn)溶血磷脂酰膽堿的方法。制劑和磷脂酰膽堿與水合并，使制劑與磷脂酰膽堿的混合物在水中形成水分散體。優(yōu)先在有鈣離子存在的條件下，讓該混合物的水分散體與磷脂酶A2接觸，以形成反應(yīng)混合物。該制劑可以是單酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油。在某些實(shí)施方案中，混合物中的磷脂酰膽堿的含量低于混合物總量的大約40wt％(重量百分比，下同)，而且優(yōu)先是混合物總量的大約30wt％。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括回收在反應(yīng)混合物中形成的溶血磷脂酰膽堿?；厥杖苎字Ｄ憠A優(yōu)先包括使溶血磷脂酰膽堿與反應(yīng)混合物成分分離，這些成分選自包括脂肪酸、制劑、或脂肪酸和制劑的一組成分。在特別優(yōu)先的實(shí)施方案中，后繼的分離包括用丙酮萃取。因此，本發(fā)明包括使溶血磷脂酰膽堿與上述各種成分分離的方法，以致基本純凈的終產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化就可以使用。在上述的任何實(shí)施方案中，制劑優(yōu)先是單酸甘油酯，更優(yōu)先的是單酸甘油酯所包含的?；哂?至22個碳原子。
按照本發(fā)明的第二方面，在制造溶血磷脂酰膽堿的方法中，制劑、磷脂酰膽堿和有機(jī)溶劑與水合并，使制劑和磷脂酰膽堿混合物在水中形成包含有機(jī)溶劑的水分散體。優(yōu)先在有鈣離子存在的條件下，讓該混合物的水分散體與磷脂酶A2接觸，以形成反應(yīng)混合物。該制劑可以是單酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油。在優(yōu)先的實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑是叔丁醇。在補(bǔ)充實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑可以是二乙基醚、二乙基醚與乙醇的混合物(優(yōu)先的是乙醇大約占有機(jī)溶劑總量的4％)、叔丁醇與乙醇的混合物(優(yōu)先的是乙醇大約占有機(jī)溶劑總量的4％)、或者甲基異丁基酮。
按照本發(fā)明的第三方面，在制造溶血磷脂酰膽堿的方法中，制劑和磷脂酰膽堿與水合并，在水中形成水分散體。讓水分散體與磷脂酶A2接觸，以形成反應(yīng)混合物，在反應(yīng)混合物中制劑以能夠有效地增強(qiáng)磷脂酰膽堿向溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化的劑量存在，與沒有該制劑的反應(yīng)混合物相比有效的增強(qiáng)了磷脂酰膽堿向溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化。優(yōu)先的是該制劑的劑量使轉(zhuǎn)化效率增加到80％或更高，更優(yōu)先的是使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到90％或更高，更進(jìn)一步優(yōu)先的是達(dá)到95％或更高，最優(yōu)先的是達(dá)到99％或更高。該制劑優(yōu)先從包括單酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一組制劑中選定。
盡管實(shí)際上優(yōu)先的制劑(即單酸甘油酯)以任何劑量都能增強(qiáng)由磷脂酶A2催化的磷脂酰膽堿的水解，但是按照本發(fā)明的第四方面，在制造溶血磷脂酰膽堿的方法中磷脂酰膽堿與單酸甘油酯的摩爾比從大約1∶1至大約1∶5。優(yōu)先的是磷脂酰膽堿與單酸甘油酯的摩爾比大約為1∶3。按照本發(fā)明的這些實(shí)施方案，磷脂酰膽堿的水解效率接近100％。
實(shí)際上任何單酸甘油酯對于增強(qiáng)磷脂酶A2催化的磷脂酰膽堿水解都是有用的。但是，依據(jù)優(yōu)先的實(shí)施方案，在本發(fā)明中有用的單酸甘油酯可以包含一個?；?，該?；?至22個碳原子。優(yōu)先的是單酸甘油酯的?；哂?至4個不飽和鍵，即碳-碳雙鍵。因此，優(yōu)先的是混合物中的單酸甘油酯包括一個?；擋；菑陌ň哂幸粋€不飽和鍵的?；⒕哂袃蓚€不飽和鍵的?；?、具有三個不飽和鍵的?；途哂兴膫€不飽和鍵的酰基的一組?；羞x出的。最優(yōu)先的是在混合物中50％以上的單酸甘油酯包括從上述的那組具有一個、兩個、三個或四個不飽和鍵的酰基中選定的?；Ｒ虼?，按照本發(fā)明，為了使磷脂酰膽堿有效的水解，選定具體的單酸甘油酯時依據(jù)的是單酸甘油酯分子使磷脂酰膽堿分子分開進(jìn)行有效水解的能力，并且可以進(jìn)一步依據(jù)在反應(yīng)的終產(chǎn)品(如下述的脂類基體組合物)中可能需要的?；拈L度和不飽和度。
按照本發(fā)明的第五方面，提供了制造包含溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的脂類基體組合物的方法。讓磷脂酰膽堿和單酸甘油酯與磷脂酶A2接觸，并且借助諸如除水之類的方法回收最終的脂類絡(luò)合物。如果需要，可以將單酸甘油酯和/或脂肪酸添加到該脂類絡(luò)合物中，以獲得優(yōu)先選擇的摩爾比。在一個優(yōu)先的實(shí)施方案中，脂類絡(luò)合物中溶血磷脂酰膽堿與另兩種成分之和(即單酸甘油酯與脂肪酸之和)的摩爾比介于大約1∶4至1∶12之間。更優(yōu)先的是溶血磷脂酰膽堿與與另兩種成分之和(即單酸甘油酯與脂肪酸之和)的摩爾比介于大約1∶5至1∶6之間。在另一個優(yōu)先的實(shí)施方案中，脂類絡(luò)合物各種成分的摩爾比介于1∶4∶2至1∶2∶4之間(溶血磷脂酰膽堿∶單酸甘油酯∶脂肪酸)。最優(yōu)先的是脂類絡(luò)合物由溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸組成，這些成分的摩爾比為1∶4∶2、1∶3∶3或1∶3∶2(溶血磷脂酰膽堿∶單酸甘油酯∶脂肪酸)。在補(bǔ)充實(shí)施方案中，制造包含溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的脂類基體的方法可以包括使用來源于天然的甘油三酯的單酸甘油酯。
按照本發(fā)明的第六方面，在制造溶血磷脂酰膽堿的方法中制劑與磷脂酰膽堿合并，形成制劑與磷脂酰膽堿的混合物。其中制劑可以是單酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油。將該混合物與水合并，在水中形成該混合物的水分散體，該分散體優(yōu)先在有鈣離子存在的條件下與磷脂酶A2接觸，以形成反應(yīng)混合物。然后，回收溶血磷脂酰膽堿。
盡管不希望受任何發(fā)明理論的束縛，但是發(fā)明人認(rèn)為按照本發(fā)明的方法在磷脂酰膽堿/制劑/水向溶血磷脂酰膽堿/制劑/脂肪酸/水轉(zhuǎn)化的酶催水解期間，保持著Small介紹的磷脂酰膽堿/制劑/水的層狀結(jié)構(gòu)(J.Am.Oil Chemists’Soc.,45:108-109,1968)。借助提供一組保持該層狀結(jié)構(gòu)的反應(yīng)條件，使磷脂酰膽堿分子在反應(yīng)進(jìn)程中始終保持與磷脂酶A2接觸，從而使水解反應(yīng)效率得到提高。
本發(fā)明的這些方面和目標(biāo)以及其它方面和目標(biāo)將結(jié)合本發(fā)明的詳細(xì)說明進(jìn)一步詳細(xì)介紹。
附圖的簡要說明

圖1描述不添加甘油一油酸酯的磷脂酰膽堿水解混合物的組成隨時間的變化。
圖2描述以1∶3的摩爾比添加甘油一油酸酯的磷脂酰膽堿水解混合物的組成隨時間的變化。
本發(fā)明的詳細(xì)敘述本發(fā)明是一種制造溶血磷脂酰膽堿的改進(jìn)方法，該方法包括使磷脂酰膽堿和制劑與磷脂酶A2接觸。磷脂酶A2是優(yōu)先的，因?yàn)榻柚字Ｄ憠A在2-位水解生產(chǎn)的溶血磷脂酰膽堿是優(yōu)先生物學(xué)優(yōu)選的溶血磷脂酰膽堿(與借助磷脂酰膽堿在1-位水解生產(chǎn)的溶血磷脂酰膽堿恰好相反)。由此形成的溶血磷脂酰膽堿可以非必選地與添加的制劑和(或)由于磷脂酶A2對磷脂酰膽堿的作用釋放的脂肪酸分開。這種方法使磷脂酰膽堿只需一步就基本上完全水解，形成溶血磷脂酰膽堿。如果需要，制劑可以是單酸甘油酯，而且由此獲得的溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的脂類基體可以與磷脂酶A2、微量的未反應(yīng)的磷脂酰膽堿、水、有機(jī)溶劑、以及在反應(yīng)混合物中存在的任何雜質(zhì)分開。
本方法的起始物質(zhì)是磷脂酰膽堿，即一種包括親水的膽堿極性首基和與磷酸酯和丙三醇鏈接的組成兩個脂肪酸分子的疏水的非極性尾基的磷脂。磷脂酰膽堿可以有特殊脂肪酸基團(tuán)，也可以是有各種各樣的與首基鏈接的脂肪酸基團(tuán)的磷脂酰膽堿的混合物。例如，Phospholipon80(American Lecithin,Oxford,CT)就是有各種各樣脂肪酸?；c極性首基鏈接的磷脂酰膽堿分子的混合物。
就象在這里揭示的那樣，磷脂酰膽堿與制劑以及其它非必選的參與反應(yīng)的成分的混合物可以通過合并這些成分來制備。術(shù)語“混合物”僅僅表示這些成分彼此接觸。例如，混合物可以是磷脂酰膽堿和制劑的膠態(tài)混合物；在與水或其它含水溶劑合并時，可以說磷脂酰膽堿和制劑的混合物膠體被分散在水中?；旌衔镞€可以不作為微粒分散在水中，而是作為較大的膠態(tài)的或非膠態(tài)的絡(luò)合物分散在水中。盡管本發(fā)明不受分層結(jié)構(gòu)理論的限制，但是我們認(rèn)為磷脂酰膽堿和制劑形成雙層或多層結(jié)構(gòu)。因此，只要該混合物在磷脂酰膽堿向溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化中能增強(qiáng)磷脂酶A2的活性，本發(fā)明可以包括物理形態(tài)或結(jié)構(gòu)不同的混合物。
在本發(fā)明的方法中，將制劑和磷脂酰膽堿與水合并，以形成磷脂酰膽堿和制劑的混合物的水分散體，隨后讓該分散體在允許磷脂酰膽堿分子水解的條件下與磷脂酶A2接觸。我們認(rèn)為磷脂酰膽堿在水中或在任何實(shí)際的含水溶劑中將形成分散體。換言之，在這里使用的“水”是泛指與磷脂酰膽堿和制劑的混合物形成的分散體相容的水或其它含水緩沖液。如上所述，我們認(rèn)為這種分散體包含層狀結(jié)構(gòu)(雙層或多層)，而且磷脂酰膽堿的極性首基朝雙層或多層結(jié)構(gòu)的外側(cè)取向。我們進(jìn)一步認(rèn)為，磷脂酰膽堿在與本發(fā)明的制劑混合并加熱時仍將在水性溶劑中形成分散體并且保持類似的層狀結(jié)構(gòu)。我們認(rèn)為添加制劑可以達(dá)到幾個目的。第一，我們認(rèn)為制劑的分子將磷脂酰膽堿的分子分開，使磷脂酰膽堿更頻繁地被磷脂酶A2接觸，從而使磷脂酰膽堿完全轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰膽堿。第二，我們認(rèn)為添加制劑可以在水解反應(yīng)期間保持層狀結(jié)構(gòu)。第三，我們認(rèn)為添加制劑可以保持兩層磷脂酰膽堿的流動性，從而增強(qiáng)磷脂酶A2的酶催水解。因此，任何具有一種或多種上述特征的制劑都適合添加到磷脂酰膽堿中，以利于磷脂酶A2的酶催水解。優(yōu)先的是從包括單酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油的一組制劑中選定該制劑。最優(yōu)先選擇單酸甘油酯。
單酸甘油酯是由與脂肪酸酰基鏈接的甘油首基組成的。在本發(fā)明中有用的單酸甘油酯的?；鶅?yōu)先包含8至22個碳原子。單酸甘油酯的?；梢允秋柡偷模部梢允遣伙柡偷?，優(yōu)先的是在碳鏈中有1至4個雙鍵。添加的單酸甘油酯可以是高純度的，也可以是原始形態(tài)的，這取決于用戶的要求和反應(yīng)混合物對雜質(zhì)的允許程度。在本發(fā)明中有用的單酸甘油酯可以是?；拇笮『惋柡蜖顟B(tài)各不相同的單酸甘油酯分子的混合物，也可以只有一種類型的?；绺视鸵挥退狨?、甘油一棕櫚酸酯。在本發(fā)明中有用的單酸甘油酯的實(shí)例包括DimodanTMLSK和DimodanTMOK(Danisco IngrdientsUSA,Inc.,New Century,KS)。
在本發(fā)明的方法中也可用甘油二酯增強(qiáng)受磷脂酶A2催化的磷脂酰膽堿水解。甘油二酯的分子由與兩個脂肪酸的?；噙B的甘油首基組成。與單酸甘油酯的?；嗤?，甘油二酯的?；奶兼渻?yōu)先具有8至22個碳原子和1至4個不飽和鍵。與單酸甘油酯一樣，在本發(fā)明中有用的甘油二酯的酰基特征、純度和混合物取決于各用戶的要求。只要能增強(qiáng)磷脂酰膽堿的水解，任何類型的甘油二酯或它們的組合都是可用于本發(fā)明的。
其它制劑，例如聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯或甘油，也可以借助使磷脂酰膽堿分子分開、保持分層結(jié)構(gòu)和流動性來增強(qiáng)磷脂酰膽堿的水解。這些化合物在美國專利第4,849,132號中已有描述。聚脂肪酸甘油酯由脂肪酸的單酯、二酯或聚酯與4至12個聚合的丙三醇分子組成。脫水山梨糖醇脂肪酸酯由脂肪酸的單酯、二酯或聚酯與山梨糖醇、脫水山梨糖醇和山梨糖醇酐組成。蔗糖脂肪酸酯的分子由脂肪酸的單酯、二酯或聚酯與蔗糖組成。與單酸甘油酯的?；嗤?，在聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯中脂肪酸中的?；兼渻?yōu)先具有8至22個碳原子和1至4個不飽和鍵。如上所述，在本發(fā)明中有用的制劑的?；卣?、純度和混合物取決于各用戶的要求。
任何能增強(qiáng)磷脂酰膽堿水解的單一制劑或不同制劑的混合物都被看作是對本發(fā)明有用的的制劑。上述的制劑可以通過各種商業(yè)渠道購買。
借助磷脂酶A2的作用磷脂酰膽堿被水解成溶血磷脂酰膽堿，其中酶的作用是割斷將脂肪酸基團(tuán)與磷脂酰膽堿的首基中丙三醇的2-位鏈接起來的酯鍵。通過各種渠道購買的磷脂酶A2可以提純后再用，也可以直接使用(例如LecitaseTM10L,Novo Nordisk,Denmark)。為了使磷脂酶A2獲得充足的活性，磷脂酶A2需要在反應(yīng)混合物中有Ca+2離子。盡管在市售的磷脂酶A2制劑中通常都有少量的Ca+2離子，使磷脂酶A2具有活性，但是優(yōu)先的是將Ca+2離子添加到反應(yīng)混合物中，以獲得充足的活性。應(yīng)當(dāng)注意，由于Ca+2離子與磷脂酰膽堿水解期間釋放的脂肪酸的酸基形成離子鍵，鈣離子會從反應(yīng)混合物中消失。所以，優(yōu)先的是將足夠的Ca+2離子添加到反應(yīng)混合物中，以保持磷脂酶A2有充足的活性。在本發(fā)明中，最優(yōu)先的是由用戶增補(bǔ)鈣離子的濃度，以保證鈣離子與磷脂酰膽堿的摩爾比至少達(dá)到1∶1。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員都可以認(rèn)識到的是，為了保持磷脂酶A2具有充足的活性可以用其它離子代替Ca+2離子。盡管不是所有的離子都能代替這個反應(yīng)中的Ca+2離子，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易通過試驗(yàn)確定適合保持磷脂酶A2活性的離子的具體類型和濃度。
如上所述，制造溶血磷脂酰膽堿的方法包括使磷脂酰膽堿和制劑的化合物的水分散體與磷脂酶A2接觸。我們認(rèn)為反應(yīng)混合物的含水性有利于磷脂酰膽堿分子中極性部分的取向，以致形成分層結(jié)構(gòu)。就借助磷脂酶A2使磷脂酰膽堿有效的轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰膽堿而言，我們認(rèn)為分層結(jié)構(gòu)是優(yōu)先的。所以，如果某種無水的混合物能使磷脂酰膽堿和制劑的分子在分層結(jié)構(gòu)中精確取向，如果磷脂酶A2的酶催水解特性可以保留下來，那么磷脂酰膽堿和制劑的無水混合物也能在本發(fā)明的方法中使用。
其它的反應(yīng)條件，如pH值、時間和溫度等都可以變化，以使磷脂酰膽堿的水解達(dá)到最佳狀態(tài)。例如，適合磷脂酶A2的最佳pH值為8-9，為了保持最大的酶活性就應(yīng)當(dāng)維持這個值。在反應(yīng)進(jìn)程中伴隨著磷脂酰膽堿水解將釋放出脂肪酸，反應(yīng)混合物的pH值會發(fā)生變化。這種變化要求補(bǔ)充堿來維持pH值在8至9的范圍內(nèi)。任何能夠?qū)H值提高到最佳范圍的堿在不妨礙磷脂酰膽堿水解的前提下都可以使用。本申請人為此目的已成功地使用過氫氧化鈉水溶液，但是其它的氫氧化鈉配方或其它的堿為了同樣的目的也可以使用。如果使用特殊的反應(yīng)條件致使pH值增高，則應(yīng)添加酸來維持最佳的pH值。
磷脂酶A2催化的磷脂酰膽堿水解將在許多種溫度下進(jìn)行，但優(yōu)先選擇在酶的活性最佳的溫度下進(jìn)行反應(yīng)(即70至80℃)。由于在這個溫度下磷脂酰膽堿/制劑的雙層結(jié)構(gòu)將既有流動性又有粘合力，有利于磷脂酶A2與磷脂酰膽堿分子接觸，所以這個溫度是優(yōu)先的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員用最少的實(shí)驗(yàn)就可以確定其它的最佳溫度，該溫度取決于在本發(fā)明的方法中使用的具體的反應(yīng)混合物。
只要磷脂酰膽堿水解的程度能達(dá)到要求，可以由方法的使用者適當(dāng)?shù)剡x擇反應(yīng)時間。優(yōu)先選擇反應(yīng)時間為1至5天，最優(yōu)先選擇反應(yīng)時間為2天。
如上所述，我們認(rèn)為在反應(yīng)混合物中保持分層結(jié)構(gòu)對磷脂酰膽堿的水解是最有效的。因此，優(yōu)先選擇反應(yīng)物中各種成分的量將以在反應(yīng)進(jìn)程中始終保持分層結(jié)構(gòu)為宜。在本發(fā)明的方法中使用的磷脂酰膽堿的劑量是按反應(yīng)混合物總量的重量百分比確定的。重量百分比的計(jì)算方法是用一種反應(yīng)物的重量除以全部反應(yīng)物的總重量。
優(yōu)先選擇在反應(yīng)混合物中磷脂酰膽堿的量不超過反應(yīng)混合物總量的大約40wt％。磷脂酰膽堿的含量超過大約40wt％的反應(yīng)混合物可能形成不分層的兩相體系，這種體系不利于磷脂酰膽堿的有效水解。最優(yōu)先選擇磷脂酰膽堿大約是反應(yīng)混合物總量的30wt％。
只要使磷脂酰膽堿的水解量超過只有磷脂酶A2參與時的水解量，只要足以增強(qiáng)磷脂酰膽堿水解，制劑可以按任何重量百分比添加到混合物中。最優(yōu)先選用的制劑是單酸甘油酯。實(shí)際上單酸甘油酯以任何劑量存在于反應(yīng)混合物中都將增強(qiáng)有磷脂酶A2參與的磷脂酰膽堿的水解。優(yōu)先選擇磷脂酰膽堿與單酸甘油酯的摩爾比在1∶0.1至1∶10之間。為了實(shí)現(xiàn)溶血磷脂酰膽堿的高得率，優(yōu)先選擇磷脂酰膽堿與單酸甘油酯的摩爾比在大約1∶1至1∶5之間。最優(yōu)先的是磷脂酰膽堿與單酸甘油酯的摩爾比大約為1∶3。
有磷脂酶A2參與的磷脂酰膽堿和制劑的水解反應(yīng)生成的理想的終產(chǎn)物是溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿與脂肪酸或制劑的組合物、或溶血磷脂酰膽堿與脂肪酸和制劑的組合物。具體地說，當(dāng)制劑是單酸甘油酯時，優(yōu)先的終產(chǎn)物是包括溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的脂類基體。在美國專利第4,874,795和5,314,921號中已經(jīng)揭示了這種脂類基體的效用。
在終產(chǎn)物是溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的脂類基體組合物時，脂類基體中溶血磷脂酰膽堿成分與另兩種成分(即單酸甘油酯和脂肪酸)之和的摩爾比大約為1∶3至1∶12。最優(yōu)先選用的溶血磷脂酰膽堿成分與另兩種成分(即單酸甘油酯和脂肪酸)之和的摩爾比介于1∶5至1∶6之間。脂類基體中各成分的摩爾比也優(yōu)先選定在某一范圍內(nèi)。因此，優(yōu)先的溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的摩爾比在1∶4∶2至1∶2∶4之間。最優(yōu)先的溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的摩爾比為1∶4∶2、1∶3∶3、或1∶3∶2。
為了獲得美國專利第4,874,795號定義的組合物，可以將補(bǔ)充的單酸甘油酯和脂肪酸添加到溶血磷脂酰膽堿/單酸甘油酯/脂肪酸的組合物中，然后熔融或混合。因此，為了獲得符合要求的產(chǎn)品而需要而改變單酸甘油酯和/或脂肪酸的摩爾比時，可以將單酸甘油酯和/或脂肪酸加到脂類基體中。
用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的脂類基體可用于輸送藥物。在這樣要求時，只要對藥物組合物的完整性不產(chǎn)生不利的影響，任何時候都可以將藥物組合物加到反應(yīng)混合物中，以使藥物包容在脂類基體中。優(yōu)先選擇在形成脂類基體之后添加需要的藥物組合物。
在這里揭示的方法還包括從反應(yīng)混合物中回收在反應(yīng)混合物中形成的溶血磷脂酰膽堿。在這里使用的術(shù)語“回收”的含義是從反應(yīng)混合物的一種或多種反應(yīng)混合物成分中回收溶血磷脂酰膽堿。溶血磷脂酰膽堿的實(shí)際形態(tài)可以變化，即回收的溶血磷脂酰膽堿可能是與反應(yīng)混合物中其它成分絡(luò)合的溶血磷脂酰膽堿。例如，回收溶血磷脂酰膽堿包括回收包含溶血磷脂酰膽堿、脂肪酸和制劑的脂類絡(luò)合物。回收溶血磷脂酰膽堿還包括回收包含溶血磷脂酰膽堿和制劑的脂類絡(luò)合物或包含溶血磷脂酰膽堿和脂肪酸的脂類絡(luò)合物。在回收時不必考慮溶血磷脂酰膽堿或包含溶血磷脂酰膽堿的脂類絡(luò)合物的純化問題。所以，溶血磷脂酰膽堿或包含溶血磷脂酰膽堿的脂類絡(luò)合物可以包含反應(yīng)混合物中存在的其它成分，如Ca+2離子或磷脂酶A2。但是，回收應(yīng)足以使溶血磷脂酰膽堿與其它物質(zhì)分離，以便成為有用的溶血磷脂酰膽堿提取物或包含溶血磷脂酰膽堿的脂類絡(luò)合物的提取物。如果需要，回收的溶血磷脂酰膽堿或包含溶血磷脂酰膽堿的脂類絡(luò)合物也可以被純化。
回收步驟可以包括一個或多個處理步驟，借助這些處理步驟足以將溶血磷脂酰膽堿與反應(yīng)混合物中的一種或多種成份分開。因此，溶血磷脂酰膽堿可以與脂肪酸、制劑(如單酸甘油酯)、或脂肪酸和制劑分開。分離包括將需要的溶血磷脂酰膽堿或包含溶血磷脂酰膽堿的脂類絡(luò)合物從反應(yīng)混合物中分離出來，以及將不需要的成分從反應(yīng)混合物中分離出來。例如，反應(yīng)混合物可以利用丙酮萃取將溶血磷脂酰膽堿與反應(yīng)混合物的其它成分分開。在其他的實(shí)施方案中，在包括溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的脂類基體是符合需要的終產(chǎn)物時，可以將其他的反應(yīng)成分，如磷脂酶A2、水、有機(jī)溶劑和過剩的單酸甘油酯或脂肪酸等與脂類基體分開。此外，借助加熱或干燥可以將水與其他的反應(yīng)混合物成分分開。本文提出一些分離方法適合將選中的產(chǎn)物從磷脂酰膽堿的酶催水解產(chǎn)物中分離出來，還有一些其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以用于分離溶血磷脂酰膽堿和其它反應(yīng)成分，這些方法建立在溶解度、分子量、分子尺寸或其它性質(zhì)存在差異的基礎(chǔ)上。例如，可以借助氧化硅凝膠制備色譜將溶血磷脂酰膽堿與其它成分分開。優(yōu)先借助丙酮萃取從反應(yīng)混合物中將溶血磷脂酰膽堿分離出來。這種方法靠的是磷脂類不溶于丙酮，溶血磷脂酰膽堿作為固體沉淀下來，很容易從其它反應(yīng)成分中回收。其它方法將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
無論溶血磷脂酰膽堿的組合物只包含溶血磷脂酰膽堿，還是與單酸甘油酯和(或)脂肪酸結(jié)合，包含溶血磷脂酰膽堿的組合物在化妝品和皮膚科制劑中作為乳化劑、抗氧劑和表面活性劑都是有用的。
如上所述，本發(fā)明的方法還包括從反應(yīng)混合物中除去水和/或其它溶劑，以便回收需要的終產(chǎn)物。因此，制造上述任何產(chǎn)品的方法都可以將除去水和溶劑作為分離方法的一部分。
只要符合需要的水解反應(yīng)終產(chǎn)物不會受到不利的影響，在技術(shù)上已知的任何除去水、含水溶劑、或含水溶劑和有機(jī)溶劑的混合物的方法都可以被使用。優(yōu)先采用那些在工業(yè)化生產(chǎn)溶血磷脂酰膽堿或脂類基體組合物時可以使用的方法。例如，可以借助加熱法、冷凍干燥法、或噴霧干燥法從符合需要的終產(chǎn)物中除去溶劑。為了除去全部或部分的水或溶劑，可以根據(jù)用戶的要求決定這類方法的持續(xù)時間以及除水或溶劑的程度。優(yōu)先選擇反應(yīng)產(chǎn)物通過加熱除水，借此獲得糊狀的溶血磷脂酰膽堿或脂類基體。
本發(fā)明的最佳實(shí)施例實(shí)施例1磷脂酶A2是由眼鏡蛇(Naja naja siamenesis)和響尾蛇(Crotalus atrox)制備的。包含各種酶的貯備液是用pH值為7.4的包含0.74mM Ca+2離子的10mM硼酸鹽緩沖液制備的，其中酶的濃度均為2mg/ml。用己烷和乙醇的混合物(己烷與乙醇的比例為95/5)制備脂類混合物，該混合物包含大豆卵磷脂(Phospholipon,Nattermann Phospholipid GMBH,lot#60020；250μg/ml)、含棕櫚酰基和同位素的磷脂酰膽堿(每分鐘大約衰變800000次，其質(zhì)量可以忽略)(1-palmitoyl-2-(I-[14C-oleoyl])-phosphatidylcholine)和甘油一油酸酯[MO](4.54mg/ml)。在6個樣品中磷脂酰膽堿[PC]與MO的摩爾比分別為1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、和1∶5。在每個1ml的“管狀瓶(ReactiVial)”(Pierce,Rockford,IL)中放一個樣品并在氮?dú)鈿夥罩懈稍?。添加硼酸鹽/Ca+2離子緩沖液(0.01M、pH7.4)，然后使樣品形成渦旋并用配備了盤形喇叭的W-375型聲處理器(Branson sonifier)進(jìn)行聲處理，樣品溫度47℃、持續(xù)時間10分鐘，功率6至7級。在總體積為0.2ml的緩沖液中反應(yīng)混合物包含250μgPC和各種磷脂酶A2制劑，每種制劑4μg。樣品中甘油一油酸酯的量用上述的摩爾比表示。在搖動浴器中使樣品在30℃下培養(yǎng)，并抽取等分試樣以供分析。
在第5小時抽取的10μl等分試樣經(jīng)過放射性分析后，發(fā)現(xiàn)除1∶0和1∶1的樣品之外在所有的樣品中脂類物質(zhì)都不呈均勻分布，即我們沒有獲得有代表性的樣品。樣品的目測結(jié)果也是明顯的，在摩爾比為1∶≥2的樣品中脂類物質(zhì)呈聚集狀態(tài)并且附著在瓶壁上。所有的管狀瓶都再次用盤形喇叭聲處理器進(jìn)行聲處理并且在第24小時進(jìn)行檢驗(yàn)。除1∶2的樣品之外，摩爾比為1∶≥3的樣品外觀都沒有變化，而且它們的放射性表明這些樣品仍然沒有均勻分散。大約在向管狀瓶中添加酶之后的第24小時，給每個樣品添加100μl緩沖液，再將每個樣品溫度升到50℃，用功率設(shè)在2至3級的W-225型聲處理器進(jìn)行聲處理，其中微型振動棒直接放在樣品中，處理時間30秒。盡管后來在1∶4和1∶5的樣品中觀察到絮凝現(xiàn)象并且放射性很低，但是這樣處理能使每個樣品中的脂類物質(zhì)分散。緊接聲處理，立即將另一份酶溶液的等分試樣添加到每個樣品中，并且重新開始在30℃下培養(yǎng)。用于分析的等分試樣的抽取量增加到20μl。在添加酶240小時以后，按與在中間時間點(diǎn)抽取等分試樣進(jìn)行分析相同的方式提取所有的樣品進(jìn)行分析。
將抽取的分析試樣加到0.6ml 2∶1的氯仿與甲醇混合物和0.3ml的2mM的EGTA水溶液(pH5.25)中。為了在薄層色譜分析中用于每個樣品的載體包含各種脂類物質(zhì)而且每種脂類物質(zhì)的量均為25μg，有機(jī)溶劑包含PC、溶血磷脂酰膽堿、油酸[OA]和MO，它們的濃度均為0.0417mg/ml。在室溫下使樣品形成渦旋，然后用Sorvall SS-34型離心機(jī)以3000xg對樣品進(jìn)行離心處理，處理時間10分鐘，使有機(jī)相與水相分離。用注射器將下層的有機(jī)相從管狀瓶中取出，放到小試管中，在氮?dú)鈿夥罩懈稍?水相干燥后，用閃爍計(jì)數(shù)器檢測放射性，結(jié)果不再是800,000dpm，而是＜1200dpm)。將樣品再次用60μl 2∶1的氯仿和甲醇混合物溶解后，在氮?dú)鈿夥罩屑皹悠啡芤旱卧趲?9條刻槽的20×20 WhatmanLK5D硅膠薄層色譜板上的交錯道上。用60∶40∶1的己烷、二乙基醚和乙酸混合液展開。溶劑在空氣中蒸發(fā)后，色譜板上的痕跡距底部7cm。用60∶40∶1的氯仿、甲醇和氨水混合液二次展開，使PC離開原點(diǎn)、并且使MO與PC分開。帶放射性標(biāo)記的產(chǎn)物油酸位于7cm的上沿。該色譜板干燥后，用Berthode線性分析儀的放射性探頭測定每條道上的放射性分布。這個單元給出一個視在效率，近似為7-9％。在模擬實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)的樣品等分采樣后立即將酶加到提取的混合物中。帶放射性標(biāo)記的PC沒有發(fā)生水解，表明在樣品檢驗(yàn)的過程中提取介質(zhì)中的條件妨礙磷脂酶表達(dá)活性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1并且繪制成圖1和圖2。結(jié)果與磷脂酰膽堿的最大轉(zhuǎn)化率是一致的，即不添加單酸甘油酯(PC∶MO=1∶0)將有大約70％的磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰膽堿，這是測量帶放射性標(biāo)記的磷脂酰膽堿水解生成的帶放射性標(biāo)記油酸獲得的結(jié)果。以任何摩爾比添加單酸甘油酯都將增加生成的溶血磷脂酰膽堿的量，這也是測量帶放射性標(biāo)記油酸獲得的結(jié)果。應(yīng)當(dāng)注意，在反應(yīng)混合物中添加單酸甘油酯減少了副產(chǎn)物的累積，實(shí)際上以各種摩爾比(PC∶MO)，在第96小時之前(包括第96小時)沒有副產(chǎn)物生成。即使反應(yīng)時間更長，生成的副產(chǎn)物也減少了。我們認(rèn)為副產(chǎn)物是甘油磷脂酰膽堿。在有單酸甘油酯存在的條件下將增加溶血磷脂酰膽堿的形成，利用具有帶14C標(biāo)記的膽堿基的磷脂酰膽堿證實(shí)這一命題的研究工作現(xiàn)在已經(jīng)完成。
表1添加甘油一油酸酯對磷脂酰膽堿的磷脂酶A2酶催水解的影響
PC
表1(續(xù)表
OA
副產(chǎn)物
*在等分試樣中沒有足夠的放射性供定量分析使用；ND表示未測定。
實(shí)施例2將卵磷脂(Phospholipon80，分子量785,American Lecithin,含大約80％磷脂酰膽堿)和單酸甘油酯(DimodanTMLSK和DimodanTMOK,分子量356,Danisco Ingrdients)合并，其中磷脂酰膽堿與單酸甘油酯的摩爾比為1∶1至1∶5。優(yōu)先的摩爾比為1∶3(磷脂酰膽堿∶單酸甘油酯)。將這些成分混合到一起并加熱到70至80℃，以獲得均勻的熔體，即沒有任何可見的折射度差異。然后添加足夠的水，使磷脂酰膽堿在反應(yīng)物總量中占30wt％。將這些反應(yīng)物加熱到70至80℃的反應(yīng)溫度進(jìn)行混合，以達(dá)到均勻一致。用氫氧化鈉水溶液將pH值調(diào)至8-9，并保持這個pH值。按每公斤Phospholipon80添加大約2ml的比例添加LecitaseTM10L，一種磷脂酶A2的酶制劑(Novo Nordisk,Denmark)。沒有必要進(jìn)一步添加鈣離子，因?yàn)樵诿钢苿┲杏锈}離子。保持溫度、攪拌和pH值等反應(yīng)條件2天，直至磷脂酰膽堿完全水解為止。在完全水解后，加熱除去水，以得到糊狀物。
非必選地將附加的單酸甘油酯和脂肪酸加到由溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸組成的脂類基體中，并按上述方法熔融混合，以得到在美國專利第4,874,975號中定義的組合物。
為了獲得高純度的溶血磷脂酰膽堿，用丙酮沉淀反應(yīng)的終產(chǎn)物，其中丙酮將從上述的包含溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的水解產(chǎn)物中將單酸甘油酯和脂肪酸兩種成分萃取出來。在添加丙酮時，溶血磷脂酰膽堿將從溶液中沉淀出來，并且可以用標(biāo)準(zhǔn)方法回收。
已經(jīng)使用的術(shù)語和表達(dá)僅僅是說明性的用語，而不是限制性的，在使用這些術(shù)語和表達(dá)時無意排斥全部或部分特征相同的術(shù)語和表達(dá)，應(yīng)當(dāng)明了的是在本發(fā)明的范圍內(nèi)可能有各種各樣的改進(jìn)方案。
權(quán)利要求
1．一種制備溶血磷脂酰膽堿的方法，該方法包括將一種制劑與磷脂酰膽堿與水合并，在水中形成制劑與磷脂酰膽堿的水分散液；以及讓該混合物的水分散體與磷脂酶A2接觸，形成反應(yīng)混合物，其中所述制劑是從包括單酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一組制劑中選出的。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法進(jìn)一步包括從反應(yīng)混合物中回收溶血磷脂酰膽堿。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中回收步驟包括使溶血磷脂酰膽堿與反應(yīng)混合物成分分離，這些成分是在包括脂肪酸、制劑、或脂肪酸和制劑的一組成分中選定的。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中對溶血磷脂酰膽堿與脂肪酸和制劑的分離包括用丙酮萃取。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述制劑是單酸甘油酯。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，該方法進(jìn)一步包括從反應(yīng)混合物中回收溶血磷脂酰膽堿。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中回收步驟包括使溶血磷脂酰膽堿與反應(yīng)混合物成分分離，這些成分是從包括脂肪酸、單酸甘油酯、或脂肪酸和單酸甘油酯的一組成分中選定的。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中對溶血磷脂酰膽堿與脂肪酸和單酸甘油酯的分離包括丙酮萃取。
9．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中單酸甘油酯具有含8至22個碳原子的?；?。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中制劑與磷脂酰膽堿混合物的水分散體在有鈣離子存在的條件下與磷脂酶A2接觸。
11．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在混合物中磷脂酰膽堿的含量低于大約40wt％。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在混合物中磷脂酰膽堿的含量大約是30wt％。
13．一種制備溶血磷脂酰膽堿的方法，該方法包括將制劑、磷脂酰膽堿和有機(jī)溶劑與水合并，形成含有機(jī)溶劑的制劑與磷脂酰膽堿的混合物在水中的水分散體，其中所述溶劑是從包括乙醚、叔丁基醇、乙醚和乙醇的混合物、叔丁基醇和乙醇的混合物和甲基異丁基酮的一組溶劑中選定的；以及讓該混合物的水分散體與磷脂酶A2接觸，形成反應(yīng)混合物，其中所述制劑是從包括單酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一組制劑中選出的。
14．一種制備溶血磷脂酰膽堿的方法，該方法包括將磷脂酰膽堿和單酸甘油酯與水合并，使磷脂酰膽堿和單酸甘油酯的混合物在水中形成水分散體，其中磷脂酰膽堿和單酸甘油酯的比例從大約1∶1至大約1∶5；以及讓該混合物的水分散體與磷脂酶A2接觸，形成反應(yīng)混合物。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中磷脂酰膽堿和單酸甘油酯的比例大約是1∶3。
16．一種制備包含溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的組合物的方法，該方法包括使磷脂酰膽堿和單酸甘油酯的水合混合物與磷脂酶A2接觸；以及回收包含溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的脂類絡(luò)合物。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中回收脂類絡(luò)合物的步驟包括除去水。
18．根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中溶血磷脂酰膽堿在回收的脂類絡(luò)合物的組合物中與單酸甘油酯和脂肪酸之和的摩爾比介于1∶3至1∶12之間。
19．根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中溶血磷脂酰膽堿在回收的脂類絡(luò)合物的組合物中與單酸甘油酯和脂肪酸之和的摩爾比介于1∶5至1∶6之間。
20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在回收的脂類絡(luò)合物的組合物中溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的摩爾比介于1∶4∶2至1∶2∶4之間。
21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中在回收的脂類絡(luò)合物的組合物中溶血磷脂酰膽堿、單酸甘油酯和脂肪酸的摩爾比從包括1∶4∶2、1∶3∶3和1∶3∶2的一組比值中選定。
22．根據(jù)權(quán)利要求16或20所述的方法，其中單酸甘油酯來源于天然的甘油三酯。
23．一種制備溶血磷脂酰膽堿的方法，該方法包括將制劑和磷脂酰膽堿與水合并，使制劑與磷脂酰膽堿的混合物在水中形成分散液；以及讓該混合物的水分散體與磷脂酶A2接觸，形成反應(yīng)混合物，在反應(yīng)混合物中制劑以有效地增強(qiáng)磷脂酰膽堿向溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化的劑量存在，與沒有該制劑的反應(yīng)混合物相比磷脂酰膽堿的轉(zhuǎn)化效率明顯增加。
24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述制劑是從包括單酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一組制劑中選出的。
25．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述制劑以使磷脂酰膽堿向溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化的效率增加到80％或更高的有效劑量存在。
26．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述制劑以使磷脂酰膽堿向溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化的效率增加到90％或更高的有效劑量存在。
27．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述制劑以使磷脂酰膽堿向溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化的效率增加到95％或更高的有效的劑量存在。
28．根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述制劑以使磷脂酰膽堿向溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化的效率增加到99％或更高的有效的劑量存在。
29．一種制備溶血磷脂酰膽堿的方法，該方法包括將制劑和磷脂酰膽堿合并，形成制劑與磷脂酰膽堿的混合物，其中該制劑是從包括單酸甘油酯、甘油二酯、聚脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯和甘油的一組制劑中選定的；將該混合物與水合并，在水中形成該混合物的水分散體；以及讓該混合物的水分散體與磷脂酶A2接觸，形成反應(yīng)混合物。
全文摘要
這項(xiàng)發(fā)明提供制造溶血磷脂酰膽堿的方法,該方法包括利用磷脂酶A
文檔編號C12P9/00GK1210560SQ97192023
公開日1999年3月10日 申請日期1997年1月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月2日
發(fā)明者大衛(wèi)·W·耶塞亞 申請人:生物分子制品有限公司