專利名稱：制備提純的核酸的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提純的核酸的制備及其應(yīng)用，尤其在基因治療中的應(yīng)用。
可復(fù)制核酸通常通過(guò)在革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌中擴(kuò)增可復(fù)制質(zhì)粒DNA進(jìn)行生產(chǎn)。生物量(die Biomasse)經(jīng)裂解后(通常利用溶菌酶或超聲波進(jìn)行堿性裂解)，將其離心并且用酚將上清液振搖出來(lái)。隨后進(jìn)行氯化銫梯度超速離心(Birnboim&Doly,Nucleic Acid Res.7(1979)1513-1523,Garger et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.117(1983)835-842)。然而，此制備物含有內(nèi)毒素，酚，氯化銫和/或作為染料的溴化乙錠。
在the QIAGENPlasmid Handbook(Qiagen Inc.,Chatsworth,USA)和EP-B 0268上描述了另一種的方法。按照此方法，經(jīng)傳統(tǒng)的裂解后獲得的細(xì)胞裂解液在QIAGEN-TIP上進(jìn)行層析，此QIAGEN-TIP含有QIAGEN樹(shù)脂(一種以硅為基礎(chǔ)的支持物)。此方法的不利因素是DNA結(jié)合蛋白質(zhì)無(wú)法完全從DNA中分離出來(lái)，因而提純的質(zhì)粒部分含有相當(dāng)數(shù)量的蛋白質(zhì)，尤其是內(nèi)毒素(來(lái)自革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的膜)。
在另一種方法中，大腸桿菌生物量經(jīng)堿性裂解后，離心上清液按照Birnboim&Doly在高鹽條件下經(jīng)過(guò)陰離子交換柱進(jìn)行層析(例如來(lái)自Pharmacia的Mono-Q,Source-Q，來(lái)自BioRad的Macroprep-Q，來(lái)自Perseptive Biosystems的Poros-Q或來(lái)自Biosepra的HyperD-Q,cf.Chandra et.al.,Analyt.Biochem.203(1992)169-172；Dion et al.,J.Chrom.535(1990)127-147)。同樣在這種情況下提純的質(zhì)粒部分含有相當(dāng)數(shù)量的蛋白質(zhì)尤其是內(nèi)毒素。
在另一種方法中，經(jīng)過(guò)堿性裂解和隨后的酚/氯仿抽提后，可以通過(guò)凝膠過(guò)濾進(jìn)行層析(McClung&Gonzales,Analyt.Biochem.177(1989)378-382；Raymond et al.,Analyt.Biochem.173(1988)125-133)。盡管經(jīng)過(guò)這樣的提純，質(zhì)粒制備物仍含有雜質(zhì)尤其是酚。
WO 95/21177上描述了一種分離和提純用于基因治療的核酸的方法，其中提純基本上是通過(guò)離心，過(guò)濾，親和層析或無(wú)機(jī)層析材料層析及隨后的離子交換劑層析實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)核酸用含有10％TritonX100和40mmol/1 MOPS緩沖液(3-morpholino-1-propanesulfonate緩沖液)的內(nèi)毒素去除緩沖液處理后，根據(jù)WO 95/21177可以使內(nèi)毒素得到額外的去除。這種方法的不利因素是用此方法提純的核酸含有Triton和MOPS緩沖液等雜質(zhì)。雖然通過(guò)此方法可去除的內(nèi)毒素至含量為ca.100EU/mg DNA(Qiagen News 1/96,3-5)，但是通過(guò)此方法不能將內(nèi)毒素進(jìn)一步去除。
然而，為了達(dá)到應(yīng)用于治療例如基因治療的目的，核酸制備物需要盡可能地去除所有雜質(zhì)(尤其是基本上不含內(nèi)毒素)。正象例如Cottenet al.在Gene Therapy 1(1994)239-246上描述的一樣，質(zhì)粒制備物中的內(nèi)毒素含量迄今為止仍然是一個(gè)沒(méi)有解決的問(wèn)題。只有通過(guò)本領(lǐng)域的情形例如按照WO 95/21177，如果核酸用非離子去垢劑例如Triton(來(lái)自WO 95/21177的內(nèi)毒素去除緩沖液)進(jìn)行處理，才能實(shí)現(xiàn)減低的內(nèi)毒素含量(ca.100EU/mg DNA)。然而，Triton具有生物作用例如引起肺部變化或減低血壓(Fiedler,“Lexikon der Hilfstoffe fur Pharmazieund Kosmetik und angrenzende Gebiete(Band 9,3rd edition,1989,EditioCantor,DE))。額外需要的MOPS緩沖液也具有一種對(duì)于治療應(yīng)用來(lái)說(shuō)會(huì)引起問(wèn)題的物質(zhì)。
本發(fā)明提供了一種高純度的核酸制備物，優(yōu)選地是質(zhì)粒DNA，其中內(nèi)毒素基本上被去除且優(yōu)選地不含溴化乙錠，酚，氯化銫，多粘菌素或非離子去垢劑，同時(shí)還提供了一種簡(jiǎn)單而有效的提純這種核酸尤其是去除內(nèi)毒素的方法。
本發(fā)明涉及一種可以在革蘭氏陰性細(xì)菌中復(fù)制的核酸，優(yōu)選地是一種質(zhì)粒DNA，具有含量少于1％的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地少于0.1％的蛋白質(zhì)，和含量少于1EU/mg DNA，優(yōu)選地0.01-0.1EU/mg DNA的內(nèi)毒素，此質(zhì)粒DNA優(yōu)選地不含溴化乙錠，酚和氯化銫，不含以辛酚基聚(乙二醇醚)n(octylphenolpoly(ethylene glycol ether)n)為基礎(chǔ)的去垢劑例如Triton去垢劑并且不含MOPS緩沖液物質(zhì)和RNAse。
擴(kuò)增被理解為在載體復(fù)制基礎(chǔ)上的核酸(尤其是DNA和質(zhì)粒DNA)拷貝數(shù)目的增加。在此過(guò)程中大量的拷貝從一個(gè)模板上被復(fù)制出來(lái)。代表著核酸或含有克隆的核酸的載體被復(fù)制。
質(zhì)粒DNA被理解為一種染色體外DNA雙鏈分子。DNA質(zhì)粒的大小通常為1至大于200kb并且在宿主細(xì)胞中存在1至幾百個(gè)拷貝。質(zhì)粒DNA通常在革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌中擴(kuò)增而且隨后被分離。質(zhì)粒常被用于構(gòu)建克隆載體，用來(lái)轉(zhuǎn)染原核和真核細(xì)胞。治療應(yīng)用在涉及體內(nèi)和體外基因治療時(shí)尤其重要。治療上使用的質(zhì)粒DNA優(yōu)選地具有5至20kb的長(zhǎng)度，尤其優(yōu)選地為5-10kb并且為雙股的。質(zhì)粒DNA可以是線性的或環(huán)狀閉合的。優(yōu)選地使用的DNA基本上是環(huán)狀閉合的。
隨后，本發(fā)明額外涉及一種藥物組合物，它含有治療有效量的本發(fā)明的核酸，優(yōu)選地為質(zhì)粒DNA，并且任選地含有附加的藥用助劑，填充劑或添加劑。
內(nèi)毒素是來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖。內(nèi)毒素在哺乳動(dòng)物中具有熱原效應(yīng)并能引起內(nèi)毒素休克。內(nèi)毒素的主要毒性成分是類脂A，多糖分子干擾水的溶解性，脂類分子具有毒性效果。內(nèi)毒素在哺乳動(dòng)物中的生物效果主要是致超敏作用以及伴隨著發(fā)燒的其它反應(yīng)。
質(zhì)粒DNA通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法在大腸桿菌，即一種革蘭氏陰性細(xì)菌中被擴(kuò)增。發(fā)酵后在此過(guò)程中獲得的生物量被溶解并且細(xì)胞被裂解。在此過(guò)程中內(nèi)毒素從細(xì)胞膜上被釋放出來(lái)。這意味著在革蘭氏陰性細(xì)菌尤其是大腸桿菌中核酸尤其是質(zhì)粒DNA擴(kuò)增后，如果打算在治療上使用此質(zhì)粒DNA必須去除內(nèi)毒素。
根據(jù)應(yīng)用，50μg至10mg的劑量或更多的可復(fù)制核酸尤其是質(zhì)粒DNA被用于或被計(jì)劃用于治療應(yīng)用中。劑量的大小根據(jù)疾病和給藥的方式。例如以氣霧劑的形式治療囊性纖維變性可使用400μg的劑量或更多。這同樣適用于包入脂類復(fù)合物(例如在脂質(zhì)體中)膠囊中的質(zhì)粒DNA。為了提供可在治療上使用的數(shù)量的可復(fù)制核酸，必須大規(guī)模地生產(chǎn)可復(fù)制核酸。因?yàn)榇税l(fā)酵制備物1-5kg的生物量比較有利，其中可分離到1-5g核酸。
本發(fā)明還涉及一種具有含量少于1EU/mg DNA優(yōu)選地0.01-0.1EU/mg DNA的內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)方法，其特點(diǎn)在于質(zhì)粒DNA在革蘭氏陰性細(xì)菌中復(fù)制，生物量被裂解后可溶性組分進(jìn)行羥基磷灰石層析，隨后所說(shuō)的質(zhì)粒DNA被分離出來(lái)。在羥基磷灰石層析之前，優(yōu)選地先進(jìn)行離子交換層析，這可以基本上去除RNA和外源蛋白質(zhì)?？扇芜x地去除進(jìn)一步的雜質(zhì)并且得到一定含量的核酸，此核酸含有少于1％的蛋白質(zhì)，優(yōu)選少于0.1％的蛋白質(zhì)，不含溴化乙錠，酚和氯化銫。這樣的制備物也優(yōu)選地不含以辛酚基聚(乙二醇醚)n為基礎(chǔ)的去垢劑和MOPS緩沖液物質(zhì)。
本發(fā)明中的方法幫助避免了或去除了質(zhì)粒DNA中含有的大量雜質(zhì)，如果此質(zhì)粒DNA是通過(guò)一種本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行生產(chǎn)的。畢竟本方法可以令人驚奇地用一種簡(jiǎn)單的方式強(qiáng)烈地降低內(nèi)毒素含量。
在本發(fā)明的方法中，內(nèi)毒素的顯著去除是通過(guò)用羥基磷灰石進(jìn)行層析取得的。這是最令人驚奇的，因?yàn)榱u基磷灰石層析在文獻(xiàn)中僅用于分離DNA和RNA(Johnson&Ilan,Analyt.Biochem.132(1983)20-25)。
羥基磷灰石層析的效果主要是基于鈣2+基團(tuán)與被提純的核酸中的負(fù)電荷之間的相互作用，較小程度上基于被提純的核酸與位于結(jié)晶羥基磷灰石表面上的PO43-基團(tuán)之間的相互作用(cfe.g.Protein PurificationMethods,Ed.by Elv.Harries and S.Angal,Oxford University Press 1989,238-244)。羥基磷灰石層析主要可被認(rèn)為是作為一個(gè)核酸的離子交換步驟，其中結(jié)合DNA不能通過(guò)簡(jiǎn)單的離子強(qiáng)度(例NaCl)的增加，而是通過(guò)增加濃度，優(yōu)選地為磷酸鹽，檸檬酸鹽，二價(jià)金屬離子和/或EDTA從羥基磷灰石基質(zhì)上洗脫。
在本發(fā)明的方法中，內(nèi)毒素和要提純的核酸首先主要通過(guò)在羥基磷灰石層析中的偶極-偶極相互作用被結(jié)合到羥基磷灰石上(如HA-陶瓷，BioGel HPHT,Bio-Gel HT/HTP from Biorad DE,HA-Ultrogelfrom IBF or HA spheroidal from BDH,Macrosorb C from SterlingOrganics)。平衡通常在磷酸緩沖液中于中性pH值下實(shí)現(xiàn)的。在隨后的柱子的清洗時(shí)，一種變性劑優(yōu)選地被加入。令人驚奇地是可以利用磷酸鹽，檸檬酸鹽或鈣離子將核酸從其與羥基磷灰石的結(jié)合上移去，而內(nèi)毒素仍然結(jié)合在上面。除了鈣離子，核酸從其與羥基磷灰石的結(jié)合上的移去可以用其它二價(jià)金屬離子例如Mg,Fe,Mn等來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些離子可在磷灰石中代替鈣離子。為了洗脫的目的，離子濃度優(yōu)選地為100mmod/l或更多。位于100和500mmol/l或200和500mmol/l之間的離子濃度是尤其優(yōu)選的。一種含有磷酸鹽離子(例如磷酸緩沖液)的溶液被尤其優(yōu)選地使用。洗脫前(沒(méi)有變性劑)，進(jìn)行清洗(用變性劑)是有益的。已經(jīng)證明例如使用一種硫酸鹽或磷酸鹽溶液(100-200mmol/l)是有利的，其中一種變性劑(例如尿素或鹽酸胍)已經(jīng)以DNA變性的濃度(例6mol/l尿素)被加入到此溶液中。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，羥基磷灰石層析后再附加進(jìn)行超濾。
為了生產(chǎn)出本發(fā)明中的核酸，代表著或含有該核酸的質(zhì)粒通常在革蘭氏陰性細(xì)菌培養(yǎng)中進(jìn)行擴(kuò)增。這樣的方法是為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的并且被描述在例如J.Sambrook等所著的(1989),MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring HarborLaboratory Press和F.M.Ausubel等所著的eds.(1991),Current Protocolsin Molecular Biology,Wiley Interscience,New York。為此目的，含有質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物首先被傳代培養(yǎng)，隨后培養(yǎng)在一種任選地加入了選擇劑的合適的培養(yǎng)基中。
生物量同樣也采用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行裂解(Mechanical or enzymatic lysis,see e.g.Birnboim and Doly,NucleicAcids Research 7 (1979)1513-1423)并且不加入RNAse。如果蛋白質(zhì)通過(guò)陰離子交換柱層析進(jìn)行分離，則可以省略用酚將蛋白質(zhì)振搖分離這一步驟。經(jīng)過(guò)裂解和不溶組分的分離之后，優(yōu)選地通過(guò)離心和經(jīng)過(guò)濾器(5μm孔)過(guò)濾，細(xì)胞上清液優(yōu)選地首先在陰離子交換柱上進(jìn)行層析以去除蛋白質(zhì)。適合的陰離子交換柱是以瓊脂糖例如Q-Sepharose為基礎(chǔ)的陰離子交換柱。其它的陰離子交換柱是以下列物質(zhì)為基礎(chǔ)聚異丁烯酸(Polymethacrylat)(Macroprep/Bio-Rad,Germany)，聚苯乙烯/二乙烯苯(Polystyrol/Divinylbenzol)(Poros/Perseptive,HyperD/Biosepra,Source/Pharmacia)或者在其表面上結(jié)合有例如二乙氨乙基(DEAE)或二甲氨基乙基(DMAE)的硅膠。
為了達(dá)到最優(yōu)的提純效果，核酸通過(guò)一個(gè)高鹽梯度例如NaCl梯度(優(yōu)選地0.65mol/l-0.85mol/l)在TE緩沖液中進(jìn)行洗脫。這樣能夠令人驚奇地幫助將大量的雜質(zhì)(RNA，蛋白質(zhì))僅用一步進(jìn)行分離。
同樣優(yōu)選的是進(jìn)行附加的異丙醇/乙醇沉淀，優(yōu)選地在羥基磷灰石層析之后，以減少細(xì)菌負(fù)荷(die Keimbelastung)和脫鹽。隨后本發(fā)明中的核酸可以在無(wú)菌條件下進(jìn)行裝瓶。
下列的實(shí)例更加詳細(xì)地描述了本發(fā)明。實(shí)例1核酸從大腸桿菌生物量中的分離。
含有質(zhì)粒DNA的大腸桿菌生物量通過(guò)堿性裂解方法被裂解，釋放出來(lái)的質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)Q-Sepharose和HA-Ceramic進(jìn)行層析。洗出物通過(guò)異丙醇/乙醇沉淀進(jìn)行脫鹽并濃縮，質(zhì)粒DNA沉淀物被重新懸浮在TE緩沖液中。
再懸浮緩沖液50mmol/l Tris/HCl,10mmol/l EDTA-Na2,pH8.0±0.2乙酸鉀緩沖液3mol/l乙酸鉀緩沖液pH 5.5將來(lái)自發(fā)酵罐的60g生物量(濕重，大腸桿菌)裝入到脫熱原的離心杯中。加入750ml的再懸浮緩沖液并且在5±4℃下慢慢攪拌(ca.35rpm)至少24小時(shí)直到生物量被完全懸浮。在此過(guò)程中懸浮液的溫度慢慢增加至25℃。
750ml 0.2mol/l NaOH/l％DSD邊以ca 80rpm攪拌邊被加入到懸浮液中，并在25℃培養(yǎng)5分鐘。邊攪拌邊加入750ml乙酸鉀緩沖液(見(jiàn)上面)。生物量的溫度盡可能快地降低到4℃。
生物量在4℃以26000×g離心30分鐘。含有質(zhì)粒DNA的上清液被傾析并經(jīng)過(guò)5μm濾器進(jìn)行過(guò)濾。Q-Sepharose ff層析TE緩沖液10mmol/l Tris-HCl,1mmol/l EDTA pH 8.0±0.2平衡/清洗緩沖液=梯度緩沖液A10mmol/l Tris-HCl,1mmol/lEDTA,0.65mol/l NaCl pH 8.0±0.2梯度緩沖液B10mmol/l Tris-HCl,1mmol/l EDTA,0.85mol/lNaCl pH 8.0±0.2傾析的離心上清液通過(guò)加入大約350ml TE緩沖液/L離心上清液被調(diào)至49-50mS/cm導(dǎo)電性并冷卻至5℃±4℃。全部的層析都在此溫度下進(jìn)行。離心上清液被以5-8柱體積(CV)/h加入平衡的柱子中。隨后用ca.8CV 10mmol/l Tris-HCl,1mmol/l EDTA,0.65mol/lNaCl pH 8.0±0.2以5-8 CV/h的流速清洗柱子。洗脫柱子被施以一個(gè)梯度(5CV緩沖液A,5CV緩沖液B)并且洗出物以5-8 CV/h的流速被分級(jí)分離。在254nm下進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)在一個(gè)不同的容器中從正在增加的側(cè)峰上收集主峰，從而將前峰物質(zhì)(雜質(zhì))與主峰(質(zhì)粒DNA)分離。洗出物的內(nèi)毒素含量在1200至12000EU/mg質(zhì)粒DNA之間。羥基磷灰石(HA Ceramic)層析層析在5±4℃下進(jìn)行。平衡緩沖液0.1mol/l磷酸鉀，6mol/l尿素，pH 7.0±0.2清洗緩沖液10.15mol/l磷酸鉀，6mol/l尿素，pH 7.0±0.2清洗緩沖液20.02mol/l磷酸鉀緩沖液，pH 7.0±0.2洗脫緩沖液0.5mol/l磷酸鉀，pH 7.0±0.2檢測(cè)在254nm下用紫外檢測(cè)器/標(biāo)繪器裝置進(jìn)行。一種用校正分光光度計(jì)測(cè)量過(guò)的1％產(chǎn)物溶液(質(zhì)粒DNA)被用作校正溶液。
Q-Sepharose池被調(diào)至最終的濃度1.1mmol/l氯化鈣并以5-8CV/h的流速加入到平衡的柱子中。
隨后以5-8 CV/h的流速用下列溶液連續(xù)地清洗柱子。1.0.1mol/l磷酸鉀，6mol/l尿素，pH 7.0±0.2，直到在檢測(cè)器上不再能檢測(cè)到光吸收。2.2-4 SV,0.15mol/l磷酸鉀，6mol/l尿素，pH 7.0±0.2。3.5 SV,0.02mol/l磷酸鉀，pH 7.0±0.2。
在清洗步驟之后，用0.5mol/l磷酸鉀緩沖液pH 7.0±0.1以5-6SV/h的流速進(jìn)行洗脫。
收集吸收峰，加熱至25℃并且加入其體積10％的4mol/l KCl溶液。隨后加入0.7部分體積(相對(duì)于洗出物的體積)的異丙醇，此溶液被混合并在25℃溫育5-10分鐘。以≥20,000×g的轉(zhuǎn)速將其離心30分鐘，質(zhì)粒DNA存在于沉淀物中。
將沉淀物中加入20ml 70％乙醇并再次以≥20,000×g轉(zhuǎn)速在4℃將其離心10-15分鐘。
含有質(zhì)粒DNA的沉淀物被重新懸浮在TE緩沖液中(10mmol/lTris-HCl,1mmol/l EDTA pH 8.0±0.2)并被調(diào)至1mg/ml的質(zhì)粒濃度。內(nèi)毒素含量典型地少于0.06 EU/mg DNA和在0.01至0.06EU/mg DNA之間。
通過(guò)在被檢查的溶液中加入鱟變形細(xì)胞溶胞產(chǎn)物溶液(LAL溶液)來(lái)測(cè)定內(nèi)毒素含量。內(nèi)毒素在此混合物中引起凝膠的形成。
在陰性對(duì)照制備物中不應(yīng)該有凝膠出現(xiàn)，而在陽(yáng)性對(duì)照制備物以及在補(bǔ)加有兩個(gè)λ對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的樣品溶液中則必須有凝膠形成。
活性物質(zhì)溶液的第一個(gè)稀釋步驟，這些標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于此并且其中沒(méi)有凝膠形成發(fā)生，按下列公式被用來(lái)計(jì)算活性物質(zhì)溶液中的內(nèi)毒素含量E=V×λ(EE/ml)E內(nèi)毒素含量V稀釋因子λ溶胞產(chǎn)物敏感性(EE/ml)實(shí)例2按照本領(lǐng)域情況下的質(zhì)粒制備物質(zhì)粒制備物用類似于Birnboim等，Nucl.Acids Res.7(1979)1513-1523和Meth.Enzymol.100(1983)243-255中的方法進(jìn)行制備。因此細(xì)菌細(xì)胞在RNase存在時(shí)在NaOH/SDS中進(jìn)行裂解。將其離心而含有質(zhì)粒DNA的上清液進(jìn)一步進(jìn)行處理。上清液被裝入前平衡的Qiagen柱子中。
細(xì)菌物質(zhì)被重新懸浮在4ml緩沖液中(100μg/ml RNaseA,50mmol/l Tris-HCl,10mmol/l EDTA,pH 8.0)。加入4ml裂解緩沖液(200mmol/vl NaOH,1％SDS)并將其在室溫下培養(yǎng)5分鐘。隨后加入4ml中和緩沖液(3mol/l乙酸鉀，pH 5.5)并將其在4℃下培養(yǎng)15分鐘。在同樣的溫度下以30,000×g將其離心30分鐘并將上清液進(jìn)一步處理。將Qiagen柱子用4ml平衡緩沖液(750mmol/l NaCl,50mmol/l MOPS,15％乙醇，pH 7.0,0.15％TritonX 100)進(jìn)行平衡并且將上清液加入到柱子中。用1 mol/l NaCl,50mmol/l MOPS,15％乙醇，pH 7.0將其進(jìn)行清洗并且用5ml洗脫緩沖液(1.25mol/l NaCl,50mmol/l Tris-HCl,15％乙醇，pH 8.5)進(jìn)行洗脫。
將洗出物用異丙醇(0.7體積)進(jìn)行沉淀并且在4℃以15,000×g離心30分鐘。將DNA沉淀物在70％乙醇中清洗并再次離心。隨后將沉淀物重新溶解在10mmol/l Tris-HCl,1mmol/l EDTA,pH 8.0中。
這樣一種質(zhì)粒制備物的內(nèi)毒素含量典型地為300-3000 EU/mg。利用根據(jù)WO 95/21177和Qiagen news 1/96,p.3-5中的內(nèi)毒素去除緩沖液，內(nèi)毒素含量可以被進(jìn)一步減低到ca.100 EU/mg。
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1．具有含量少于0.1％的蛋白質(zhì)以及具有含量少于1EU/mgDNA的內(nèi)毒素的核酸制備物。
2．具有含量為0.01至0.1EU/mg DNA的內(nèi)毒素的權(quán)利要求1的核酸制備物。
3．權(quán)利要求1或2的核酸制備物，不含溴化乙錠，酚，氯化銫，MOPS緩沖液物質(zhì)和以辛酚基聚(乙二醇醚)n為基礎(chǔ)的去垢劑。
4．權(quán)利要求1至3之任一的核酸制備物，其特征在于，核酸可以在革蘭氏陰性細(xì)菌中進(jìn)行復(fù)制。
5．權(quán)利要求1至4之任一的核酸制備物，其特征在于，核酸是質(zhì)粒DNA。
6．權(quán)利要求5中的質(zhì)粒DNA，其特征在于，質(zhì)粒DNA能夠復(fù)制。
7．含有治療有效量的可復(fù)制的核酸和任選地含有藥用助劑，填充劑或添加劑的藥物組合物，所述核酸具有含量少于0.1％的蛋白質(zhì)以及具有含量少于1EU/mg DNA的內(nèi)毒素。
8．權(quán)利要求7中的藥物組合物，其特征是具有含量為0.01至0.1EU/mg DNA的內(nèi)毒素。
9．生產(chǎn)一種具有含量低于1EU/mg內(nèi)毒素的核酸的方法，其特征在于核酸在革蘭氏陰性細(xì)菌中進(jìn)行復(fù)制，生物量被裂解后其可溶性組分進(jìn)行羥基磷灰石層析，將所說(shuō)的核酸分離出來(lái)。
10．具有含量少于0.1％的蛋白質(zhì)以及具有含量少于1EU/mg內(nèi)毒素的可復(fù)制核酸在用于體外和/或體內(nèi)基因治療的藥劑的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
特別適用于基因治療的藥劑的具有含量少于1%,優(yōu)選0.1%的蛋白質(zhì)、不含溴化乙錠,酚,氯化銫,MOPS緩沖液物質(zhì)和以辛酚基聚(乙二醇醚)
文檔編號(hào)C12N15/10GK1210541SQ97192102
公開(kāi)日1999年3月10日 申請(qǐng)日期1997年1月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月6日
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