專利名稱：利用固體吸附材料以提高的產(chǎn)率結晶蛋白質的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種以提高的產(chǎn)率結晶多肽或者蛋白質的簡單的、廉價的和十分有效的方法，特別是結晶從發(fā)酵肉湯獲得的酶。
現(xiàn)有技術對于工業(yè)目的，酶通常以液體或者無定形物提供。當尚未以液體提供時，它們通常以無定形物提供，因為通常認為結晶酶的已知方法太昂貴以致于不能用于工業(yè)規(guī)模。
有大量關于結晶酶的文獻。由于結晶酶的技術具有高度經(jīng)驗性，因此要使特定結晶方法的結果一般化是困難的。
迄今為止已知蛋白質結晶方法大多數(shù)的特征性特點是純化的和濃縮的初始溶液，十分長的結晶時間，以及化學藥品(如鹽)的高消費，對于參考文獻參見，例如，生物工程和生物技術48,1995,P.316-323。
已描述了利用聚乙二醇的工業(yè)酶結晶方法，對于參考文獻參見WO95/01989。
通過從溶液中浸提出鹽，隨后調節(jié)溶液的pH到酶的pI水平附近來結晶酶是可能的，這一點也已描述過，參考文獻可參見WO 94/22903。
人們已經(jīng)知道，固體吸附材料(如活性碳)在除色方面是有效的，但是以前沒有描述過這樣的吸附材料對于多肽/蛋白質結晶具有很大的作用。
發(fā)明簡述在本發(fā)明中，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在蛋白質結晶操作之前或尤其是同時進行碳處理時明顯地提高結晶產(chǎn)率和結晶純度。
因此，本發(fā)明提供一種以提高的產(chǎn)率結晶從包含一種以上蛋白質的蛋白質溶液中獲得的多肽或者蛋白質的方法，該方法包括(a)利用一種固體吸附材料處理蛋白質溶液；并且(b)在除去所說的固體吸附材料之后結晶所說的多肽或所說的蛋白質；或者(c)不除去所說的吸附材料就結晶所說的多肽或所說的蛋白質。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種以提高的產(chǎn)率從蛋白質溶液中，特別從發(fā)酵(培養(yǎng))肉湯中結晶蛋白質或多肽的方法。
除興趣多肽或者蛋白質之外，該發(fā)酵肉湯包含許多諸如底物化合物之類的其它化合物，例如碳水化合物和鹽類，細胞，以及其它代謝物如核酸和其它多肽和蛋白質。
優(yōu)選地，應用于本發(fā)明方法的發(fā)酵肉湯首先進行固體/液體分離，例如，絮凝、離心、過濾、微量過濾、超濾、沉淀、蒸發(fā)或者它們的組合。
由于本發(fā)明的方法對相對不純的溶液十分起作用，因此，在用固體吸附材料處理之前，利用層析方法純化從發(fā)酵肉湯獲得的蛋白質溶液通常是不必要的。
在更具體的實施方案中，本發(fā)明的方法包括用本身已知的方法濃縮包含蛋白質的溶液。這樣的方法包括通過超濾、滲濾、透析或者蒸發(fā)進行濃縮。
雖然對于進行用固體吸附材料處理來說，濃縮包含蛋白質的溶液是不重要的，但是它從處理和產(chǎn)率方面來說卻是方便的。由于實際原因，可以將包含蛋白質的溶液濃縮成蛋白質含量為0.1到25％(w/w)，優(yōu)選地為0.5-15％(w/w)，特別是1-10％(w/w)。
本發(fā)明方法可以運用于本領域中已知的任何結晶方法，例如，用于鹽結晶，用于利用如WO 95/01989所公開的聚合物的結晶，或者用于利用從該溶液中浸提出鹽的原理，隨后調節(jié)溶液的pH到酶的pI水平附近的結晶方法，參考文獻可參見WO 94/22903。最后提到的結晶方法用于本發(fā)明的實施例中。
在更優(yōu)選的實施方案中，將本發(fā)明的方法運用于酶的結晶，特別是選自下組的酶蛋白酶、多肽酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、木糖聚酶、異構酶和氧化還原酶。蛋白酶按照本發(fā)明結晶的合適的蛋白酶包括可以來自細胞(如微生物)的發(fā)酵產(chǎn)物的任何蛋白酶。優(yōu)選的是細菌或者真菌來源的。包括化學或者基因修飾突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選的是堿性微生物蛋白酶或者胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草菌素，尤其是那些從芽孢桿菌產(chǎn)生的枯草菌素，例如，枯草菌素Novo，枯草菌素Carlsberg，枯草菌素309，枯草菌素147和枯草菌素168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或者牛來源的)和在WO 89/06270中描述的鐮孢屬蛋白酶。
優(yōu)選的市售蛋白酶包括那些Novo Nordisk A/S(丹麥)以商品名Alcalase,Savinase,Primase,Durazym和Esperase出售的蛋白酶，那些Gist-Brocades以商品名Maxatase,Maxacal,Maxapem和Properase出售的蛋白酶，那些Genencor International以商品名Purafect和Purafect OXP出售的蛋白酶，以及那些Solvay Enzymes以商品名Opticlean和Optimase出售的蛋白酶。脂肪酶按照本發(fā)明結晶的合適的脂肪酶包括可以來自細胞(如微生物)的發(fā)酵產(chǎn)物的任何脂肪酶。優(yōu)選的是細菌或者真菌來源的。包括化學或者基因修飾突變體。
有用脂肪酶的例子包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如，如EP258 068和EP 305 216中所描述的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如，如EP 238 023中所描述的，假絲酵母屬(Candida)脂肪酶，如Candidaantarctica脂肪酶，例如，如EP 214761所描述的Candida antarctica脂肪酶A或者B，諸如產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)和假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)脂肪酶之類的假單胞菌屬(Pseudomonas)脂肪酶，例如，如EP 218272中所描述的，蔥頭假單胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶，例如，如EP 331376中所描述的，Pseudomonas stutzeri脂肪酶，例如，如BP 1,372,034中所公開的，Pseudomonas fluorescens脂肪酶，芽孢桿菌屬(Bacillus)脂肪酶，例如，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)脂肪酶(Dartois等，(1993)，生物化學生物物理學報1131,253-260)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)脂肪酶(WO91/16422)。
此外，一些克隆脂肪酶可能是有用的，包括由Yamaguchi等描述的Penicillium camembertii脂肪酶(Yamaguchi等，(1991)，基因103,61-67),Geotricum candidum脂肪酶(Schimada,Y.等，(1989)，生物化學雜志106,383-388)，以及各種諸如Rhizopus delemar脂肪酶(Hass M.J等，(1991)，基因109,117-113)，雪白根霉(Rhizopus niveus)脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，生物科學，生物技術，生物化學56,716-719)和Rhizopus oryzae脂肪酶之類的根霉屬(Rhizopus)脂肪酶。
也可以將諸如角質酶之類的其它類型的脂解酶進行結晶，例如，如WO88/09367所描述的由門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)生成的角質酶，或者由Fusarium solani pisi生成的角質酶(例如WO 90/09446所描述的)。
尤其合適的脂肪酶是諸如M1 LipaseMT,Luma fastMT和LipomaxMT(Gist-Brocades),LipolaseMT和Lipolase UltraMT(NovoNordiskA/S)的脂肪酶，以及脂肪酶P＂Amano＂(Amano藥物有限公司)。淀粉酶按照本發(fā)明結晶的合適的淀粉酶(α或者β)包括可以是來自細胞(如微生物)的發(fā)酵產(chǎn)物的任何淀粉酶。優(yōu)選的是細菌或者真菌來源。包括化學或者基因修飾突變體。
淀粉酶包括例如，從芽孢桿菌屬(Bacillus)獲得的α-淀粉酶，特別是在英國專利說明書No.1,296,839中更詳細描述的一種地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的特定菌株。市售的淀粉酶是DuramylTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(由Novo Nordisk A/S提供的)以及RapidaseTM和Maxamyl PTM(由Gist-Brocades提供的)。
其它有用的酶是例如從芽孢桿菌屬，熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobactor或者Thermoanaerobacterium)獲得的CGT酶(環(huán)糊精葡聚糖轉移酶，EC 2.4.1.19)。纖維素酶在本文中，所說的術語＂纖維素酶＂是指催化纖維素降解成葡萄糖，纖維二糖，丙糖和其它纖維寡糖的酶。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，結晶的纖維素酶是內切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，優(yōu)選的是單組分(重組)內切葡聚糖酶。
優(yōu)選地，所說的纖維素酶是微生物纖維素酶，更優(yōu)選的是細菌或者真菌纖維素酶。
細菌纖維素酶的有用例子是來源于下組細菌或者可由下組細菌產(chǎn)生的纖維素酶，這組細菌選自假單胞菌屬(Pseudomonas)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，纖維單胞菌屬(Cellulomonas)，梭菌屬(Clostridium)，Microspora，棲熱袍菌屬(Thermotoga),Caldocellum以及放線菌屬(Actinomyces)如鏈霉菌屬(Streptomyces)，高溫單孢菌屬(Termomonospora)和熱酸菌屬(Acidothemus)，特別是解纖維假單胞菌(Pseudomonas cellulolyticus)，燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)，糞肥纖維單胞菌(Ceilulomonas fimi),Microspora bispora，褐色高溫單孢菌(Termomonospora fusca),Termomonospora cellulolyticum和解纖維熱酸菌(Acidothemus cellulolyticus)。
有用的結晶的纖維素酶是酸性纖維素酶，該酸性纖維素酶是來源于下組真菌或者可由下組真菌產(chǎn)生的，這些真菌選自由木霉屬(Trichoderma)，漆斑菌屬(Myrothecium)，曲霉屬(Aspergillus)，Phanaerochaete，脈孢菌屬(Neurospora),Neocallimastix和葡萄孢屬(Botrytis)組成的屬，特別是選自綠色木霉(Trichoderma viride),Trichoderma reesei,Trichoderma Iongibrachiatum,Myrotheciumverrucaria，黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae),Phanaerochaete chrysosporium，粗糙脈孢菌(Neurospora crassa),Neocallimastix partriciarum和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。
另一種有用的結晶的纖維素酶是中性或者堿性纖維素酶，優(yōu)選的是真菌的中性或者堿性纖維素酶，該纖維素酶來源于下組真菌或可由下組真菌產(chǎn)生曲霉屬(Aspergillus)，青霉屬(Penicillium)，毀絲霉屬(Myceliophthora)，腐質霉屬(Humicola)，耙菌屬(Irpex)，鐮孢屬(Fusarium),Stachybotrys，帚霉屬(Scopulariopsis)，毛殼屬(Chaetomium)，疣孢霉屬(Mycogone)，輪枝孢屬(Verticillium)，漆斑菌屬(Myrothecium),Papulospora，粘帚霉屬(Gliocladium)，頭孢霉屬(Cephalosporium)和頂孢霉屬(Acremonium)，特別是Humicola insolens，尖鐮孢(Fusarium oxysportum)，嗜熱毀絲霉(Myceliopthora thermophila)，微紫青霉(Penicillium janthinellum)和Cephalosporium sp，優(yōu)選的是Humicola insolens,DSM 1800，尖鐮孢，DSM 2672，嗜熱毀絲霉，CBS117.65，以及Cephalosporium sp.,RYM-202。
其它有用的結晶的纖維素酶的例子是纖維素酶的變體，其母本酶是真菌或者細菌來源的纖維素酶，例如可由真菌腐質霉屬(Humicola)，木霉屬(Trichoderma)或者鐮孢屬(Fusarium)的菌株產(chǎn)生的纖維素酶。氧化還原酶按照本發(fā)明結晶的氧化還原酶包括過氧化物酶和氧化酶(如漆酶)。過氧化物酶顯示過氧化物酶活性的酶可能是任何由酶分類號EC 1.11.1.7所包括的顯示過氧化物酶活性的過氧化物酶，或者由此所衍生的任何片段。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法所使用的過氧化物酶是可由微生物(如真菌或者細菌)產(chǎn)生的。一些優(yōu)選的真菌包括屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢菌綱(Hyphomvcetes)的菌株，例如，鐮孢屬(Fusarium)，腐質霉屬(Humicola)，木霉屬(Tricoderma)，漆斑菌屬(Myrothecium)，輪枝孢屬(Verticillum),Arthromyces，卡爾黑霉屬(Caldariomyces),Ulocladium,Embellisia，枝孢屬(Cladosporium)或者Dreschlera，特殊是尖鐮孢(Fusarium oxysporum)(DSM 2672),Humicola insolens,Trichoderma resii,Myrothecium verrucana(IFO6113)，黃萎輪枝孢(Verticillum alboatrum),大麗花輪枝孢(Verticillumdahlie),Arthromyces ramosus(FERM P-7754),Caldariomycesfumaso,Ulocladium chartarum,Embellisia alli或者Dreschlerahalode。
其它優(yōu)選的真菌包括屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)，擔子菌綱(Basidiomycetes)的菌株，例如鬼傘屬(Coprinus)，展齒革菌屬(Phanerochaete)，云芝屬(Coriolus)或者栓菌屬(Trametes)，特別是灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)f.microsporus(IFO 8371)，長根鬼傘(Coprinusmacrorhizus),Phanerochaete chrysosporium(例如NA-12)或者栓菌屬(以前稱為多孔菌屬(Polyporus))，例如雜色栓菌(Trametes versicolor)(例如PR428-A)。
進一步優(yōu)選的真菌包括屬于接合菌亞門(Zygomycotina),Mycoraceae綱的菌株，例如根霉屬(Rhizopus)或者毛霉屬(Mucor)，特別是凍土毛霉(Mucor hiemalis)。
一些優(yōu)選的細菌包括放線菌目(Actinomycetales)的菌株，例如，類球形鏈霉菌(Streptomyces spheroides)(ATTC 23965)，熱紫鏈霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)(IFO 12382)或者輪絲鏈輪絲菌輪絲亞種(Streptoverticillum verticillium ssp.verticillium)。
其它優(yōu)選的細菌包括短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)(ATCC12905)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides),Rhodomonas palustri，乳鏈球菌(Streptococcuslactis),Pseudomonas purrocinia(ATCC 15958)或者熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)。
進一步優(yōu)選的細菌包括屬于粘球菌屬(Myxococcus)(例如，變綠粘球菌(Myxococcus virescens))的菌株。
特別地，重組產(chǎn)生的過氧化物酶是優(yōu)選的，例如，從Coprinus sp.所產(chǎn)生的過氧化物酶，特別是按照WO 92/16634的長根鬼傘(Coprinusmacrorhizus)或者灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)，或者其變體，例如如WO93/24618和WO 95/10602所描述的變體。漆酶和漆酶相關的酶在本發(fā)明的上下文中，漆酶和漆酶相關的酶包括由酶分類號EC1.10.3.2所包括的任何漆酶，由酶分類號EC 1.10.3.1所包括的任何chatechol氧化酶，由酶分類號EC 1.3.3.5所包括的任何膽紅素氧化酶或者由酶分類號EC 1.14.18.1所包括的任何一元酚單加氧酶。
微生物漆酶可能來源于細菌或者真菌(包括絲狀真菌和酵母)，并且合適的例子包括可由曲霉屬，脈孢菌屬(Neurospora)(例如Neurosporacrassa)，柄孢殼屬(Podospora)，葡萄孢屬(Botrytis)，金錢菌屬(Collybia)，層孔菌屬(Fomes)，香菇屬(Lentinus)，側耳屬(Pleurotus)，栓菌屬(Trametes)(例如Trametes villosa和雜色栓菌(Trametes versicolor))，絲核菌屬(Rhizoctonia)(例如立枯絲核菌(Rhizoctonia solani))，鬼傘屬(Coprinus)(例如褶紋鬼傘(Coprinus plicatilis)和灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)),Psattyrella，毀絲霉屬(Myceliophthora)(例如Myceliophthorathermophila)，Schytalidium，多孔菌屬(Polyporus)(例如Polyporuspinsitus)，射脈菌屬(Phlebia)(例如Phlebia radita(WO 92/01046))，或者云芝屬(Coriolus)(例如毛云芝(Coriolus hirsutus)(JP 2-238885))的菌株產(chǎn)生的漆酶，特別是由栓菌屬(Trametes)，毀絲霉屬(Myceliophthora),Schytalidium或者多孔菌屬(Polyporus)可獲得的漆酶。以吸附材料處理我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，在結晶過程之前或同時添加低濃度的吸附材料，可以明顯地提高晶體產(chǎn)率，并且同時提高所形成的晶體的純度以及給出所包括的實施例的指出的更容易獲得的形態(tài)。
按照本發(fā)明，可以利用任何本領域所熟知的固體吸附材料；尤其有用的吸附材料是碳材料，特別是活性碳材料。碳材料可以是粉、顆粒、小球形式或者是任何本領域所熟知的其它形式。
有用的活性碳類型可以是由Elf Atochem North America提供的Acticarbon 4S#2228，由American Norit公司提供的Darco碳KB-B，或者由匹茲堡活性碳提供的Calgon顆粒碳。
按照本發(fā)明可以利用的其它固體吸附材料包括硅藻土(Kieselguhr)、漂白土、皂土和各種疏水或者離子交換樹脂。
在某些情況下，添加不止一種的吸附材料可能是有益的。
在本發(fā)明的特定實施方案中固體吸附材料是以0.05-5％(w/w)的濃度，優(yōu)選的是以0.1-2％(w/w)的濃度添加至蛋白質溶液中。
固體吸附材料可以以一步添加，或者可以以不止一步添加；通常當固體吸附材料以一步添加時，將令人滿意地完成該過程。
通常將固體吸附材料的處理持續(xù)達40小時，特別是1/2-20小時，優(yōu)選的是1-10小時，更優(yōu)選的是1-5小時，在結晶之前除去該固體吸附材料，或者如果當結晶時固體吸附材料在溶液中，那么只要結晶持續(xù)它將在溶液中結晶的時間可能不同，將取決于所選擇的結晶方法。
在某些情況下，結晶開始之后首先添加吸附材料可能是有益的。
所選擇的固體吸附處理的時間將取決于許多因素如產(chǎn)物穩(wěn)定性，微生物水平以及工藝設備的容量，但是通常情況下對于短時間處理來說，沒有必要添加任何穩(wěn)定劑或者抑制劑至蛋白質溶液中。
用固體吸附材料處理的蛋白質溶液的溫度優(yōu)選的是從5℃到50℃，特別是從10℃到40℃。
用固體吸附材料處理的蛋白質溶液的pH優(yōu)選的是從3-10。
代替以粉、顆粒或者小球的形式添加固體吸附材料至蛋白質溶液中，在某些情況下，讓蛋白質溶液通過用吸附材料填充的層析柱或者讓蛋白質溶液通過，例如碳濾器可能是有益的。例如，在鹽結晶過程中，情況可能就是這樣，其中首先添加一些鹽，接著讓蛋白質溶液通過碳柱或者碳濾器，然后添加余下的鹽，成核開始，這可能是有益的。結晶通過利用本發(fā)明的方法我們已經(jīng)證明(參見實施例2)提高結晶產(chǎn)率，改善晶體純度，減少晶體形成的結晶時間，以及改變所形成的晶體的形態(tài)。
實施例2也顯示如果在結晶期間將碳留在濃縮液中，固體吸附材料的作用是最大的。在濃縮液中留下碳也是為了減少操作時間的優(yōu)選生產(chǎn)方式。結晶后的回收本發(fā)明的方法導致以更純的形式和更高的產(chǎn)率結晶多肽或蛋白質，特別是酶。
如果當結晶時，固體吸附材料留在溶液中，那么為了除去如吸附材料一樣的不溶物質，通常在收獲后將晶體重新溶解，然后將它作為固液分離方法(如過濾)的實驗材料。
如果需要很高純度的結晶產(chǎn)物，可以重復本發(fā)明的方法，即將本發(fā)明的方法的結晶終產(chǎn)物進行重新溶解，并且經(jīng)一次或多次附加的固體吸附材料處理和/或結晶。
終產(chǎn)物可以是一種結晶產(chǎn)物或者為了產(chǎn)生如高純度的液體多肽或蛋白質產(chǎn)物，可以將晶體重新溶解。
下列實施例將進一步說明本發(fā)明，該實施例不以任何方式限制如所要求的本發(fā)明的范圍。實施例1通過提高脂肪酶的結晶效能的碳同時吸附雜質的作用如下表1所顯示的，將100kg包含在米曲霉中表達的Humicolalanuginosa脂肪酶的培養(yǎng)肉湯(如EP 305216所描述的)進行預處理。

表1脂肪酶肉湯的預處理。
通過濾鼓過濾除去生產(chǎn)菌株，將獲得的濾液利用Seitz K900濾板進行連續(xù)過濾。利用Seitz EK1濾板通過過濾減少微生物總數(shù)。將形成的濾液在Dow DDS(20kD)膜上進行濃縮。將UF-濃縮液進一步滲濾成傳導率為0.8mS。
以(OD440nm/g活性脂肪酶)之比來說明形成的濃縮液的純度。

表2產(chǎn)生的濃縮液的純度(結晶開始前)。
將濃縮液經(jīng)不同量的Acticarbon 4S#2228進行處理，利用20％w/w甲酸溶液調節(jié)pH=4.3，并且保持24小時的結晶時間。
通過離心獲得晶體懸濁液，利用去離子水洗滌晶體，并且利用甲酸調節(jié)到pH=4.3。將晶體塊溶解并且配制成4倍(重量)的50％MPG+0.3％w/w CaCl2x2H2O溶液，然后利用Seitz EK1濾板過濾除去碳。利用三丁酸甘油酯測定分析形成的配制的產(chǎn)物的OD440nm和脂肪酶活性。
三丁酸甘油酯測定以所說的酶催化三丁酸甘油酯的水解為基礎，同時將堿消耗作為時間的函數(shù)。將一個脂肪酶單位(LU)定義為在標準條件(即30.0℃；pH7.0；用阿拉伯樹膠作為乳化劑并且以三丁酸甘油酯作為底物)每分鐘釋放1μmole可滴定的丁酸所需的酶量。
下表3顯示終產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度。

表3經(jīng)增加量的碳處理的并且在pH=4.3和28℃下結晶的UF-濃縮液，該UF-濃縮液顯示出產(chǎn)率、純度和形態(tài)。
我們發(fā)現(xiàn)在結晶期間通過利用碳同時提高了產(chǎn)率和純度，這表明除去了抑制脂肪酶的結晶的雜質。
在配制的產(chǎn)物中，通過顏色的減弱(mOD440nm/g活性脂肪酶)看出其純度的提高。我們也發(fā)現(xiàn)在形態(tài)方面朝著棒狀變化(從菱形)。
換句話說，本實施例顯示通過利用本發(fā)明的方法我們可以充分地提高產(chǎn)率并且同時獲得更高的純度以及形成的酶晶體是相同的棒狀形狀。實施例2通過碳處理預吸附或同時吸附雜質對脂肪酶結晶的作用如實施例1所描述的方法獲得UF-濃縮液。將UF-濃縮液滲濾成傳導率為1.0mS。
如下表4所顯示的以(mOD440nm/g活性脂肪酶)之比說明形成的濃縮液的純度。

表4生產(chǎn)的濃縮液的純度(在結晶開始之前)。
將濃縮液集分成三個組分A、B和C，并且如下表5所顯示的進行處理

表5在結晶開始之前經(jīng)不同處理的三個組分。
然后將三個組分調節(jié)到pH=4.3，加熱到28℃，保持24小時的結晶時間。通過離心獲得晶體懸濁液，用去離子水洗滌晶體，利用甲酸調節(jié)到pH=4.3。將晶體塊溶解并且配制成4倍(重量)的50％MPG+0.3％w/wCaCl2x2H2O溶液，然后利用Seitz EK1濾板過濾除去碳。利用三丁酸甘油酯測定分析形成的配制的產(chǎn)物的OD440nm和脂肪酶活性。
下表6顯示終產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度

>表6當在結晶期間在濃縮液中留下碳時，在產(chǎn)率和純度方面結晶的組分A、B和C顯示更好的作用。
當比較組分A與組分B或組分C時，我們看到，在結晶前進行碳處理增加產(chǎn)率和純度，并且如果在結晶期間將碳留在濃縮液中其效果最大。在濃縮液中留下碳也是為了減少操作時間的優(yōu)選生產(chǎn)方式。
從表6也看出，我們通過利用碳處理可以控制從晶形混合物向一種相同的晶形變化的形態(tài)，因此利用本發(fā)明的方法提高了產(chǎn)率，同時又控制了形態(tài)。實施例3中試規(guī)模評估通過碳處理提高脂肪酶結晶效能同時吸附雜質的作用如實施例1所描述的在中試規(guī)模中以一種類似的方法獲得UF-濃縮液。將UF-濃縮液滲濾成傳導率為1.0mS。
利用增加量的碳(Darco碳KB-B型)(直到如下表7所顯示的用于中試規(guī)模試驗的量)實施實驗室檢驗

表7在結晶期間結合實驗室和中試規(guī)模碳處理的試驗。
表7表明兩種產(chǎn)率和純度的實驗室實驗和中試規(guī)模結果之間的驚人地非常一致。因此，對工業(yè)化方法生產(chǎn)來說，直接提高實驗室結果是可能的。再者，在實驗室實驗中看出在碳處理和對照之間有顯著的差異。實施例4通過碳處理提高脂肪酶結晶效能，利用顆粒碳同時吸附雜質的作用如實施例1所描述的方法獲得UF-濃縮液。將UF-濃縮液滲濾成傳導率為1.0mS。
如下表8所顯示的以(mOD440nm/g活性脂肪酶)之比說明形成的濃縮液的純度。

表8生產(chǎn)的濃縮液的純度(在結晶開始之前)。
如下表9所顯示的利用增加量的粒狀形式的碳(Calgon型)實施實驗室檢驗。

表9經(jīng)增加量的碳處理的并且在pH=4.3和28℃下結晶的UF-濃縮液，該UF-濃縮液顯示產(chǎn)率和純度。
從表9看出，在結晶期間利用這種粒狀形式，其產(chǎn)率明顯地提高了，并且純度也稍有提高。實施例5通過碳處理提高蛋白酶的結晶效能同時吸附雜質的作用。
如下列表10所描述的，將100kg包含遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)蛋白酶的培養(yǎng)肉湯(例如，如US 3,723,250所描述的方法發(fā)酵)進行預處理。

表10蛋白酶肉湯的預處理和絮凝。
通過濾鼓過濾除去生產(chǎn)菌株，將獲得的濾液利用Seitz K900濾板進行連續(xù)過濾。利用Seitz EK1濾板通過過濾減少微生物總數(shù)。將形成的濾液在Asahi(6kD)膜上進行濃縮。
如下表11所顯示的，以顏色來說明純度(OD440nm/g活性蛋白酶)。

表11結晶前的UP-濃縮液的純度。
將UF-濃縮液經(jīng)不同量的FGV120碳進行處理，并且利用7％KAc進行結晶，利用20％(w/w)磷酸溶液調節(jié)到pH=4.9。在5小時之后，利用從10℃開始并且到28℃結束的溫度梯度進行結晶。將24小時用作結晶時間。
通過離心獲得最終晶體，利用5.5％的CaCl2(pH=4.9)溶液進行洗滌。將晶體塊溶于10倍(重量)的100％MPG溶液，并且利用動力學二甲基酪蛋白測定分析形成的產(chǎn)物的OD440nm和蛋白酶活性。
動力學二甲基酪蛋白測定以通過蛋白酶消化二甲基酪蛋白溶液為基礎。在這一過程中所形成的伯氨基基團與三硝基苯磺酸反應形成有色復合物。為了可以計算每個時間單位吸光度的變化，原位進行反應。相對于酶標準品確定其活性，并且以相同單位作為標準。
下表12顯示形成的產(chǎn)率和純度。

表12在結晶期間經(jīng)增加量的碳處理的蛋白酶濃縮液。
從表12可以看出，增加碳劑量提高其產(chǎn)率。在配制的產(chǎn)物中以OD440nm/g活性蛋白酶表示的純度稍有提高。晶體的形態(tài)由于其大小的平均增加小而稍有改變。實施例6
通過碳處理提高EG1 Humicola纖維素酶的結晶效能同時吸附雜質的作用。
如下列表13所顯示的，將100kg包含在米曲霉中表達的EG1Humicola insolens纖維素酶的培養(yǎng)肉湯進行預處理。

表13米曲霉肉湯的預處理。
通過濾鼓過濾除去生產(chǎn)菌株，將獲得的濾液利用Seitz EK1濾板進行連續(xù)微生物過濾。將形成的濾液在Dow DDS(20kD)膜上濃縮成干物質含量為22％。將UF-濃縮液利用3體積的自來水進一步滲濾，此后在30℃,pH=5.5下利用3％的Picatif FGV120碳進行碳處理2小時。利用SeitzK900濾板和Seitz EK1濾板通過過濾除去碳。形成的濃縮液具有1.06mS的傳導率。
以(OD440nm/g活性纖維素酶)之比說明形成的濃縮液的純度。

表14濃縮液的純度(結晶開始前)。
將濃縮液經(jīng)不同量的Picatif FGV 120碳進行處理，并且利用20％(ww)的甲酸溶液調節(jié)到pH=5.4，并且在28℃下保持24小時(結晶時間)。
通過離心獲得結晶懸濁液。將晶體塊在8倍(重量)的水和0.1％氯化鈉中溶解并且配制，利用0.45μ過濾器過濾除去碳。分析形成的配制的產(chǎn)物的OD440nm和纖維素酶活性。以S-CEVU(穩(wěn)定的纖維素酶粘度單位)測量纖維素酶活性，并且利用羧甲基纖維素(CMC)作為底物確定纖維素酶活性。內纖維素酶分解CMC。通過振動粘度計確定粘度的最終減少。在pH=7.5,40℃下，在0.1M磷酸緩沖液中進行反應30分鐘。
表15顯示終產(chǎn)物的產(chǎn)量與純度。

表15經(jīng)增加量的碳處理的以及在pH=5.4和28℃下結晶的濃縮液顯示的產(chǎn)率和純度。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，在結晶期間利用碳將提高產(chǎn)率，即使將濃縮液在結晶之前已經(jīng)進行碳處理。換句話說，實際上我們可以通過在結晶期間利用碳提高產(chǎn)率而不降低純度。實施例7通過硅藻土處理提高脂肪酶的結晶效能同時吸附雜質的作用。
如下列表16所顯示的，將50kg包含以在米曲霉中表達的Humicolalanuginosa脂肪酶變體設計的蛋白質的培養(yǎng)肉湯進行預處理。

表16．米曲霉肉湯的預處理。
在pH=10.0(以13％的NaOH調節(jié))通過濾鼓過濾除去生產(chǎn)菌株，將獲得的濾液利用Seitz K25過濾板進行連續(xù)過濾。將形成的濾液在DowDDS(20kD)膜上進行濃縮。利用2體積的自來水將UF-濃縮液進一步滲濾成傳導率為2.5mS/cm。
將濃縮液用各種量的Hyflo Supercell硅藻土進行處理，并且在5℃利用10％(w/w)磷酸溶液調節(jié)到pH=4.7。每30分鐘溫度提高3℃，直到28℃為止，并且在這一溫度下保持總共22小時的結晶時間。
下列表17中顯示其產(chǎn)率和晶體形態(tài)。<

表17．用增加量的硅藻土對UF-濃縮液進行處理，并且在pH=4.7用增加溫度進行結晶所顯示的產(chǎn)率和形態(tài)。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，在結晶時利用硅藻土提高產(chǎn)率。我們也發(fā)現(xiàn)在形態(tài)方面從棒狀朝著星形變化。換句話說，當在結晶期間利用硅藻土時，我們可以提高產(chǎn)率以及獲得更大的晶形。
權利要求
1．一種以提高的產(chǎn)率結晶從包含一種以上蛋白質的蛋白質溶液中獲得的多肽或者蛋白質的方法，該方法包括(a)利用一種固體吸附材料處理蛋白質溶液；并且(b)在除去所說的固體吸附材料之后結晶所說的多肽或所說的蛋白質；或者(c)不除去所說的吸附材料就結晶所說的多肽或所說的蛋白質。
2．按照權利要求1的方法，其中所說的蛋白質溶液由發(fā)酵肉湯獲得。
3．按照權利要求2的方法，其中在用固體吸附材料處理之前，通過離心、過濾、微量過濾、超濾、沉淀、蒸發(fā)或者它們的組合來純化所說的發(fā)酵肉湯。
4．按照權利要求2-3之任一的方法，其中在用固體吸附材料處理之前，添加一種或多種絮凝劑至所說的發(fā)酵肉湯中。
5．按照權利要求1-4之任一的方法，其中將所說的蛋白質溶液濃縮成蛋白質含量從0.1到25％(w/w)，優(yōu)選的是0.5-15％(w/w)，特別是1-10％(w/w)。
6．按照權利要求1的方法，其中將所說的固體吸附材料以0.05-5％(w/w)的濃度添加，優(yōu)選的是以0.1-2％(w/w)的濃度添加。
7．按照權利要求1的方法，其中所說的固體吸附材料是一種活性碳材料。
8．按照權利要求1的方法，其中所說的蛋白質是酶。
9．按照權利要求8的方法，其中所說的酶是蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶或者氧化還原酶。
10．按照權利要求1的方法，其中所說的蛋白質溶液pH在3和10之間。
11．按照權利要求1(c)的方法，其中將收獲后的晶體重新溶解，并且經(jīng)固體/液體分離技術處理，除去所說的固體吸附材料。
12．按照權利要求1的方法，其中將所說的固體吸附材料放置在層析柱或過濾器中。
13．一種可由按照權利要求1的方法獲得的蛋白質產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以提高的產(chǎn)率結晶從包含一種以上蛋白質的蛋白質溶液中獲得的多肽或者蛋白質的方法,該方法包括:(a)利用一種固體吸附材料處理蛋白質溶液;并且(b)在除去所說的固體吸附材料之后結晶所說的多肽或所說的蛋白質;或者(c)不除去所說的吸附材料就結晶所說的多肽或所說的蛋白質。
文檔編號C12N9/20GK1213376SQ97192948
公開日1999年4月7日 申請日期1997年3月3日 優(yōu)先權日1996年3月14日
發(fā)明者S·尼爾森, N·M·麥德森, C·辛普森 申請人:諾沃挪第克公司