專利名稱：在發(fā)酵中增加細胞產(chǎn)量的營養(yǎng)培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及在發(fā)酵中使用的新的培養(yǎng)基，與已知培養(yǎng)基相比，它提供了增加的細胞產(chǎn)量。更特別地，與用已知培養(yǎng)基得到的產(chǎn)量相比，本發(fā)明引起真菌大鏈壺菌(Lagenidium giganteum)的產(chǎn)量至少2到3倍的增加。除了增加細胞的產(chǎn)量，在含卵磷脂的新培養(yǎng)基中生長的大鏈壺菌表現(xiàn)出提高了抵抗蚊的效力。
背景技術(shù)：
發(fā)酵是在專門容器中培養(yǎng)微生物或細胞的工序。細胞或微生物可以被純化并用于一系列的目的。舉例來說，在發(fā)酵罐中生長的真菌大鏈壺菌用來作為蚊的生物控制劑。
在發(fā)酵過程中微生物的最佳生長依賴于幾個因素，包括可用的營養(yǎng)物，氧氣濃度，pH，溫度，和混合度。在發(fā)酵過程中使用的培養(yǎng)基提供了細胞生長的必須營養(yǎng)。因此，從發(fā)酵中得到的產(chǎn)量部分地依賴于培養(yǎng)基的組成。
現(xiàn)在有幾種發(fā)表的通常用于大鏈壺菌發(fā)酵的營養(yǎng)培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基用去離子水加至終濃度為1L，并滅菌。一種配方包括2.0g Ardamine,2.0g葡萄糖，1ml玉米油，0.5g膽固醇和2mMCa2+(Kerwin,James L，和Washino,Robert k.(1986)“大鏈壺菌(卵菌綱壺菌目)有性和無性階段在地下和地上控制蚊蟲的應(yīng)用?！盝.Am.Mos.Control Assoc.2(2):182-189]。
另一種配方包括2.0g自溶酵母抽提物，1.0gProFlo,0.5g魚粉，2mM CaCl2·2H2O,1mM MgCl2·6H2O,0.05g膽固醇和2ml棉籽油〔Kerwin,James L.和Washino,Robert K.(1988)“大鏈壺菌(卵菌綱壺菌目)的田間評估和涉及一種新的真菌分離物的天然動物流行病的描述。”J.Med.Entomol.25(6):452-460]。而另一種發(fā)酵培養(yǎng)基包括1.25g葡萄糖，1.25g蛋白胨，1.25g自溶酵母提取物，2g玉米油，1g亞麻籽油，和0.075g CaCl2·2H2O(美國專利號4,687,744)。第四種公開的培養(yǎng)基包括1.25g酵母抽提物，1.2g葡萄糖，3.2g小麥胚粉末，大麻種子抽提物來提供每L 250mg可溶的蛋白，1.25細菌蛋白胨，3g葡萄糖和1.5g玉米油〔Lord,Jeffrey C.和Roberts,Donald W.(1986)“培養(yǎng)基品質(zhì)和宿主傳代對大鏈壺菌(卵菌綱壺菌目)的游動菌絲發(fā)生和感染性的影響”，無脊椎動物病理學(xué)雜志48:35-361〕。
當在發(fā)酵中使用時，上面引述的公開的培養(yǎng)基配方都產(chǎn)出大約相同數(shù)量的細胞并且以大約相同速率感染敏感的蚊蟲。因此為了提高生物控制劑如大鏈壺菌的產(chǎn)量和感染性，需要一種改進的發(fā)酵培養(yǎng)基。
發(fā)明概述在發(fā)酵時使用的培養(yǎng)基每升必須含有3.6g蛋白胨；3.0g自溶酵母抽提物；3.6g蛋白胨；1.5到3.0g自溶酵母抽提物；1.6g棉籽粉，如ProFlo(Traders Protein,Memphis,TN)；2.0到7.75g葡萄糖(右旋糖)；2.5g棕櫚油；0.2g膽固醇；0.6g CaCl2·2H2O,0.2gMgCl2·6H2O和可選擇地0.0到2.0g卵磷脂。此培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基相比，提供了更高的大鏈壺菌的產(chǎn)量，并且當培養(yǎng)基中包含了卵磷脂時，有機體的產(chǎn)量和感染性進一步增加。優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明涉及發(fā)酵用的改進的培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基增加的產(chǎn)量至少超過已知培養(yǎng)基大約2到3倍。本發(fā)明在大量生產(chǎn)大鏈壺菌(對蚊蟲的生物控制劑)中有用。
定義如在此使用的，術(shù)語“發(fā)酵”是指在專門容器中培養(yǎng)細胞或微生物的工序?！盃I養(yǎng)培養(yǎng)基”(“培養(yǎng)基”)是指支持有機體生長的固體或液體物質(zhì)。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，營養(yǎng)培養(yǎng)基按如下制備每升3.6g蛋白胨；每升1.5至3g自溶酵母抽提物；每升1.6g棉籽粉；
每升2.0至7.75g葡萄糖(右旋糖)；每升2.5g棕櫚油；每升0.2g膽固醇；每升0.6g CaCl2·2H2O；和每升0.2g MgCl2·6H2O。
加入去離子水至終體積為1升，并且調(diào)節(jié)pH到6.5。加熱這些成分直到溶解，然后培養(yǎng)基在121℃,15p.s.i.高壓消毒滅菌30分鐘。當用于大鏈壺菌的發(fā)酵時，此培養(yǎng)基增加的產(chǎn)量至少超過已知培養(yǎng)基2到3倍。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，營養(yǎng)培養(yǎng)基通過加入每升2.0g卵磷脂到上述配方中制備。
以下的實施例僅僅用來作為說明的目的，不能用來在任何方面限制本發(fā)明。實施例1大鏈壺菌在不同培養(yǎng)基中搖瓶生長率的比較在并列的搖瓶實驗中在新營養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長率與兩種其它培養(yǎng)基的比較。
培養(yǎng)基#11.25g葡萄糖(右旋糖)1.25g蛋白胨1.25g自溶酵母抽提物2.0g玉米油1.0g棕櫚油0.03g膽固醇0.4g CaCl2·2H2O0.2g MgCl2·6H2O培養(yǎng)基#21.2g蛋白胨1.2g自溶酵母抽提物
3.0g葡萄糖(右旋糖)0.5g膽固醇新營養(yǎng)培養(yǎng)基3.6g蛋白胨3.0g自溶酵母抽提物1.6g Proflo棉籽抽提物2.0g葡萄糖(右旋糖)2.5g棕櫚油0.2g膽固醇0.6g CaCl2·2H2O0.2g MgCl2·6H2O當制備每一種培養(yǎng)基時，所有的成分混合并加入去離子水至終濃度為1L。調(diào)節(jié)pH值到6.5。內(nèi)容物在微波爐中加熱直到溶解，在121℃，15psi滅菌30分鐘。對于每一種培養(yǎng)基，9個250ml培養(yǎng)瓶中每個加入50ml培養(yǎng)基。從培養(yǎng)皿中取出的一盤大鏈壺菌(加利福尼亞菌株)用來接種每一個培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)瓶在軌道溫度控制搖床中于120rpm,29℃震蕩培養(yǎng)7天。通過在18℃,5200rpm離心真菌團20分鐘收獲細胞。離心的細胞團稱重并且細胞計數(shù)通過血細胞計數(shù)器進行。記錄平均細胞數(shù)，結(jié)果總結(jié)于表1中。
表1<
培養(yǎng)基#1和#2在每一個實驗中產(chǎn)生的每ml培養(yǎng)基中的細胞量大約相同。與或者培養(yǎng)基#1或者培養(yǎng)基#2相比較，新營養(yǎng)培養(yǎng)基始終連貫地增加每ml中的細胞量。當生長在新營養(yǎng)培養(yǎng)基中時，大鏈壺菌的平均產(chǎn)量增加大約3.5倍。實施例2新培養(yǎng)基加入卵磷脂后搖瓶培養(yǎng)比較實施例1中的新培養(yǎng)基配方的建立提高了超過已知培養(yǎng)基的細胞產(chǎn)量，在基礎(chǔ)的新培養(yǎng)基上變化葡萄糖和酵母抽提物的量和加入1.0g或2.0g卵磷脂的影響得到檢測。所有培養(yǎng)基用很大的磁轉(zhuǎn)子在70％轉(zhuǎn)速下混勻10-15秒，以確保所有組分溶解。用EmReagents color phast將所有培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到6.5，并如實施例1中滅菌。對每一種培養(yǎng)基，三個250ml培養(yǎng)瓶裝入50ml培養(yǎng)基，如實施例1中描述的接種，培養(yǎng)并收獲。結(jié)果總結(jié)于表2和表3中。
表2
如表2中所示的，對于沒有卵磷脂的培養(yǎng)基，每ml中平均細胞產(chǎn)量為3.6×105，對于有卵磷脂的培養(yǎng)基，每ml中細胞產(chǎn)量增加到4.63×105。實施例3生長在不同培養(yǎng)基中的大鏈壺菌的感染性大鏈壺菌在實施例2中描述的新培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)基中不包括卵磷脂，包括重量比為0.1000％的卵磷脂或重量比為0.2000％的卵磷脂。培養(yǎng)條件如實施例1中所述。細胞濃度得到計算，并且它們殺死蚊蟲的能力在濃度為5,000；2,500；1,250和675細胞/ml時測量?？偨Y(jié)在表3中的結(jié)果是重復(fù)實驗的平均值。
表3
這些結(jié)果說明生長在新培養(yǎng)基中的大鏈壺菌比生長在不加卵磷脂的培養(yǎng)基中的細胞殺死了更多的蚊子。
權(quán)利要求
1．一種用于發(fā)酵的培養(yǎng)基，必須含有以下成分(a)每升3.6g蛋白胨；(b)每升1.5至3g自溶酵母抽提物；(c)每升1.6g棉籽粉；(d)每升2.0至7.75g葡萄糖(右旋糖)；(e)每升2.5g棕櫚油；(f)每升0.2g膽固醇；(g)每升0.6g CaCl2·2H2O；和(h)每升0.2g MgCl2·6H2O。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，進一步包含每升多達2.0g卵磷脂。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)大鏈壺菌。
4．根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)大鏈壺菌。
全文摘要
提供了一種發(fā)酵中使用的營養(yǎng)培養(yǎng)基來提高細胞或有機體的產(chǎn)量。提供的配方與已知培養(yǎng)基相比使真菌大鏈壺菌(Lagenidium giganteum)的產(chǎn)量增加了2到3倍。
文檔編號C12N1/14GK1222190SQ97193075
公開日1999年7月7日 申請日期1997年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月17日
發(fā)明者S·D·海因斯, D·D·尤因, P·G·馬倫 申請人:阿格拉奎斯特公司