專利名稱：分離的二聚體成纖維細(xì)胞激活蛋白α及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與癌癥組織和反應(yīng)性腫瘤基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的某種分子。本發(fā)明更具體地涉及成纖維細(xì)胞激活蛋白α(下文稱之為“FAPα”)分子。先前已通過免疫化學(xué)方法鑒定出此分子的單體形式，但仍未分離或克隆出編碼該分子的核酸分子，也未鑒定出其二聚體形式，而這些正是本發(fā)明的特征。通過煮沸樣品的SDS-PAGE測定出單體蛋白質(zhì)的分子量約為88-95KDa，通過未煮沸樣品的SDS-PAGE測定出二聚體的分子量約為170KDa。FAPα的特征在于它與特征性膜結(jié)合酶共享很多特征和特性，這很強(qiáng)烈地暗示它也是膜結(jié)合酶。為本發(fā)明主要部分的核酸分子既可用于表達(dá)FAPα之細(xì)胞的探針，也可作為重組生產(chǎn)該蛋白質(zhì)的起始物質(zhì)。FAPα蛋白則可用于生產(chǎn)特異于該蛋白質(zhì)的單克隆抗體，因此是其自身有用的診斷試劑。它們也有另外的用途，包括如本文所述的與酶功能相關(guān)的用途。
背景和現(xiàn)有技術(shù)上皮癌癥的侵染性生長與支持基質(zhì)中特征性的細(xì)胞和分子變化相關(guān)。例如，上皮癌癥誘導(dǎo)腫瘤血管的形成，反應(yīng)性腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞的征集，淋巴和吞噬細(xì)胞的浸潤，肽介體和蛋白酶解酶的釋放，和經(jīng)改變的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生。例見Folkman,Adv.Cancer Res,43:175-203(1985)；Basset等，自然，348:699-704(1990)；Denekamp等，Cancer Metastasis Rev,9:267-282(1990)；Cullen等，癌癥研究，51:4978-4985(1991)；Dvorak等，癌癥細(xì)胞，3:77-85(1991)；Liotta等，癌癥研究，51:5054s-5059s(1991)；Garin-Chesa等，組織化學(xué)及細(xì)胞化學(xué)雜志，37:1767-1776(1989)。在幾種普通組織學(xué)類型的上皮癌癥中，基質(zhì)高度一致的分子特征可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAPα)，該蛋白是細(xì)胞表面的糖蛋白，最初通過單克隆抗體mAb F19發(fā)現(xiàn)該蛋白Mr觀測值為95,000，所述單充隆抗體是抗增殖培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的。例見Rettig等，癌癥研究，46:6406-6412(1986)；Rettig等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),85:3110-3114(1988)；Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)；Rettig等，癌癥研究，53:3327-3335(1993)。這四篇文獻(xiàn)的全文列入本文作為參考。
上述文獻(xiàn)提到的那些免疫組化研究已表明在某些正常的胎兒間充質(zhì)組織中瞬時(shí)表達(dá)了FAPα，但正常的成人組織一般是FAPα-。類似地，惡性的上皮，神經(jīng)和造血細(xì)胞一般是FAPα-。然而，大多數(shù)普通類型的上皮癌癥，包括＞90％的乳腺，肺，皮膚，胰腺和結(jié)腸癌含有豐富的FAPα+反應(yīng)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞。Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)。FAPα+腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞幾乎恒定地與腫瘤血管相伴隨，形成在腫瘤毛細(xì)血管內(nèi)皮和惡性上皮細(xì)胞簇的基本方位之間插入的不同的細(xì)胞分隔間。盡管在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥中都發(fā)現(xiàn)了FAPα+基質(zhì)成纖維細(xì)胞，但良性的和前惡性的上皮損害，如乳腺和結(jié)腸腺瘤的纖維腺瘤幾乎不含F(xiàn)APα+基質(zhì)細(xì)胞。與FAPα在上皮腫瘤的基質(zhì)特異性定位形成對照的是大部分骨和軟組織肉瘤的惡性細(xì)胞中表達(dá)了FAPα(Rettig等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:3110-3114(1988))。最終，在愈合傷口的肉芽組織中已檢測到FAPα+成纖維細(xì)胞(Garin-Chesa等，文獻(xiàn)同上)?；贔APα在正常組織中的限制性分布模式及其在多種上皮癌癥之支持基質(zhì)中的一致表達(dá)，已在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者體內(nèi)開始用131I-標(biāo)記的mAb F19進(jìn)行臨床試驗(yàn)(Welt等，Proc.Am.AssocCancer Res,33:319(1992)；Welt等，J.Clin.Oncol,12:1561-1571(1994))以研究用于上皮癌癥之免疫檢測和免疫治療的“腫瘤基質(zhì)靶向”概念。
列入本文參考文獻(xiàn)的Rettig等，Int.J.Cancer,58:385-392(1994)中討論了FAPα分子及其特征。Rettig等假定在大于400KDa的高分子量絡(luò)合物中發(fā)現(xiàn)了FAPα，但未討論二聚體分子的可能性，此文獻(xiàn)中也未詳細(xì)地說明此分子特異性的酶特性。
在胎兒發(fā)育，組織修復(fù)和致癌的過程中，在組織再建的時(shí)間和位點(diǎn)對FAPα+成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)與此分子在正常成纖維細(xì)胞生理學(xué)中的基本作用一致。因此，分離和克隆編碼此分子的核酸分子是有意義和有價(jià)值的。這是本發(fā)明的一方面，在下文的公開內(nèi)容中將結(jié)合本發(fā)明的其它特征詳細(xì)地描述此方面。本發(fā)明另外的方面包括二聚體的FAPα分子，和這些分子之特性的利用，下文中也會(huì)詳細(xì)地說明這些特征。
圖的簡述

圖1比較了推定的FAPα氨基酸序列和已知的CD26序列，序列的排列已最優(yōu)化。
圖2A-2H(含2A和2H)顯示了在多種組織中對FAPα和CD26的免疫組化檢測。在圖2A和2B中，研究了乳腺癌中的FAPα(圖2A)和CD26(圖2B)。在圖2C和2D中，研究了惡性纖維組織細(xì)胞瘤中的FAPα(圖2C)和CD26(圖2D)。在圖2E(FAPα)和2F(CD26)中檢測了皮膚瘢痕組織。在圖2G(FAPα)和2H(CD26)中研究了腎細(xì)胞癌。
圖3提供了顯示FAPα具有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)降解活性之實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的一些資料。當(dāng)進(jìn)行293-FAP明膠降解提取物的酶譜檢測時(shí)，使用未煮沸的樣品以保留酶活性，通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)的分子量約為170KD。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述實(shí)施例1以前已觀察到成纖維細(xì)胞系WI-38可與mAb F19反應(yīng)(Rettig等，癌癥研究，46:6406-6412(1986)；Rettig等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:3110-3114(1988)；Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)；Rettig等，癌癥研究，53:3327-3335(1993))。在以下的實(shí)驗(yàn)中利用了此特性。
使用熟知的技術(shù)和可商購的材料，由WI-38制備cDNA文庫。具體地說，使用Fast Track mRNA分離試劑盒和Librarian cDNA噬粒系統(tǒng)，在表達(dá)載體pCDNAI中構(gòu)建文庫。一旦制備好文庫，將載體電穿孔至細(xì)胞系大腸桿菌MC1061/P3中。pCDNAI表達(dá)載體含有抗生素抗性基因，因此通過抗生素抗性可選擇該大腸桿菌。然后將抗性菌落用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中。根據(jù)Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，第2版，1989)的描述，通過堿性裂解和在CsCl2上純化可得到菌落中的質(zhì)粒DNA。此技術(shù)一旦分離出質(zhì)粒DNA，將所述DNA用于轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，再用抗體包被的平皿檢測這些細(xì)胞。所用mAb包括Rettig等(1986，文獻(xiàn)同上，全文列入本文參考文獻(xiàn))所述的F19。由于COS-1細(xì)胞正常情況下是FAPα-，任何陽性的結(jié)果都表明編碼序列的存在。免疫選擇方案取自列入本文參考文獻(xiàn)的Aruffo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3365-3369(1987)。
根據(jù)Hirt，分子生物學(xué)雜志，26:365-369(1967)的教導(dǎo)回收陽性克隆的質(zhì)粒DNA，重新導(dǎo)入大腸桿菌MC1061/P3中，并在COS-1細(xì)胞中重新選擇。
將本文所提供的方案再進(jìn)行4輪，然后，使用Qiagen質(zhì)粒試劑盒純化50個(gè)分離的細(xì)菌菌落的質(zhì)粒DNA。通過EcoRⅠ限制性酶圖譜分析測定發(fā)現(xiàn)在所有菌落中，有27個(gè)克隆含有相同的2.8kb的插入片斷。通過在COS-1細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)和用mAbF19直接免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)其中幾個(gè)克隆含有FAPα特異性的cDNA。選擇這些克隆中的一個(gè)，即“pFAP.38”供進(jìn)一步的研究，此研究將在下文中詳細(xì)描述。
實(shí)施例2一旦已鑒定出pFAP.38，將它與編碼已知細(xì)胞表面標(biāo)記物CD26的載體(“pCD26”)以及對照載體pCDNAⅠ一起檢測。
在這些實(shí)驗(yàn)中，用pFAP.38,pCD26或pCDNAⅠ中的一個(gè)轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。48小時(shí)后，使用熟知的用于細(xì)胞表面抗原表達(dá)的MHA花結(jié)試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染子。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用了FAPα特異性的mAb F19以及CD26特異性的mAb EF-1。也使用了4個(gè)其它的FAPα特異性的mAb，即FB23,FB52,FB58和C48。還檢測了已知能與mAb F19(SW872脂肪肉瘤)或EF-1(SK-OV6卵巢癌)反應(yīng)的2個(gè)癌癥細(xì)胞系，結(jié)果列于下列表1。
表1．在人細(xì)胞和COS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染子中多種FAPα表位和CD26的細(xì)胞表面表達(dá)細(xì)胞表面抗原表達(dá)靶細(xì)胞F19 FB23 FB52 FB58 C48 EF-1人細(xì)胞SW872脂肪肉瘤＞95％＞95％＞95％＞95％ ＞95％ -SK-OV6卵巢癌 - - - --＞95％COS-1轉(zhuǎn)染子COS.pCDNAI對照 - - - ---COS.pFA P38 40％ 30％ 40％ 20％20％ -COS.pCD26- - - - - 40％實(shí)施例3然后進(jìn)行免疫沉淀研究以鑒定出通過抗體靶向的抗原。
用Trans35S-標(biāo)記(ICN)代謝標(biāo)記細(xì)胞，用裂解緩沖液(0.01MTris-HCl/0.15M NaCl/0.01M MgCl2/0.5％Nonidet P-40/抑蛋白酶肽(20ug/ml)/2mM苯甲基磺酰氟)提取，然后進(jìn)行免疫沉淀。所用方案都是熟知的，可參見Rettig等，癌癥研究，53:3327-3325(1993)；和Fellinger等，癌癥研究，51:336-340(1991)，所述文獻(xiàn)的全文已列入本文參考文獻(xiàn)。沉淀的mAb是陰性的對照小鼠Ig,mAbF19或EF-1。用模擬轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞進(jìn)行對照試驗(yàn)。免疫沉淀之后，在提取緩沖液中煮沸免疫沉淀物，并在還原條件下，通過NaDOdSO4/PAGE分離免疫沉淀物。在一些實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行另外的試驗(yàn)以測定免疫沉淀的物質(zhì)是否是糖基化的。在這些實(shí)驗(yàn)中，在免疫沉淀之前用ConA-SEPHAROSE分級(jí)分離細(xì)胞提取物。在免疫沉淀之后，但在NaDOdSO4/PAGE上分級(jí)分離之前，用N-聚糖酶消化這些沉淀物。
結(jié)果表明在COS-1細(xì)胞中，pFAP.38指導(dǎo)了88kd蛋白質(zhì)類(通過SDS-PAGE測定)的表達(dá)，它比SW872，或培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的95kd FAPα類略小。用N-聚糖酶消化產(chǎn)生了大小相當(dāng)?shù)碾?即74kd對75kd)，這表明COS-1細(xì)胞中FAPα蛋白質(zhì)的糖基化與人細(xì)胞系中有所不同。
實(shí)施例4然后使用得自FAPα+成纖維細(xì)胞系WI-38和GM05389和FAPα-卵巢癌細(xì)胞系SK-OV6的mRNA進(jìn)行典型的Northern印跡分析。使用Sambrook等，文獻(xiàn)同上的方法，檢測得自每種細(xì)胞系的5ug mRNA。所用探針是32P標(biāo)記的探針，并制備自pFAP.38的2.3kb ECOI片斷，CD26的2.4kb HindⅢ片斷和γ-肌動(dòng)蛋白cDNA的1.8kb BamHⅠ片斷。已從1％瓊脂糖凝膠中純化出這些片斷。
FAPα+成纖維細(xì)胞株的提取物顯示出2.8kb的FAP mRNA類，但SK-OV6的提取物沒有顯示出所述mRNA。在所有種類中都觀察到γ-肌動(dòng)蛋白的mRNA類。
實(shí)施例5對鑒定為編碼FAPα的cDNA進(jìn)行從測序開始的更加詳細(xì)的分析。使用Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467(1977)中所述的典型的Sanger方法學(xué)測定cDNA兩條鏈的序列。一旦操作完畢，由此推導(dǎo)出氨基酸序列，此資料示于SEQ ID NO:1。然后將此序列與已知的CD26氨基酸序列(Morimoto等，免疫學(xué)雜志，143:3430-3437(1989))相比較。圖1提供了使用最優(yōu)化序列排列的比較結(jié)果。星號(hào)表示比較中的任何缺口，而在CD26序列中用破折號(hào)表示相同的氨基酸。雙劃線表示疏水的推定的跨膜序列，而單劃線表示潛在的N-糖基化位點(diǎn)。
序列分析顯示出2812堿基對的插入片斷，其中2277個(gè)堿基對構(gòu)成了開放閱讀框。此ORF從核苷酸209位的起始密碼子ATG延伸至2486位的終止密碼子TAA。
推導(dǎo)的多肽長為760個(gè)氨基酸，分子量為87,832。與之形成對照的是據(jù)報(bào)道經(jīng)N-聚糖酶消化的，免疫純化的FAPα在NaDOdSO4/PAGE上的Mr估計(jì)值為75,000(Rettig等，癌癥研究，53:3327-3335(1993))。進(jìn)行GenBank數(shù)據(jù)庫檢索，所發(fā)現(xiàn)的最密切相關(guān)的基因是那些編碼二肽基肽酶Ⅳ同系物(DPPIV；EC3.4.14.5)的基因，所述同系物與人的DPPIV(也已知為T-細(xì)胞激活抗原CD26)顯示出61％的核苷酸序列同一性，和48％的氨基酸序列同一性。
第二套相關(guān)基因是DPPX的人，大鼠和牛同系物的基因，所述基因是在腦和其它正常組織中廣泛表達(dá)的未知功能的基因。推定的人的DPPX基因產(chǎn)物顯示出與FAPα和CD26有30％的氨基酸序列同一性。FAPα分子顯示出Ⅱ型膜內(nèi)在蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征，包括大的COOH-末端胞外域，疏水的跨膜區(qū)段，和短的胞質(zhì)尾。推定的胞外域含有5個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，11個(gè)半胱氨酸殘基(其中8個(gè)在FAPα和CD26之間是保守的)，和對應(yīng)于絲氨酸蛋白酶，如DPPIV特征性的高度保守的催化域的3個(gè)區(qū)段。這些保守的序列示于下列表2。通過Morimoto等，文獻(xiàn)同上；Wada等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:197-201(1992)；Yokotani等，人類分子遺傳學(xué)，2:1037-1039(1993)的描述與DPPIV和DPPX進(jìn)行比較。
實(shí)施例6進(jìn)行另一套實(shí)驗(yàn)以測定非人類中是否存在FAPα相關(guān)序列。為此，使用限制性酶消化人，小鼠和中國倉鼠的基因組DNA，并使用前述的經(jīng)32P標(biāo)記的2.3kb片段，經(jīng)Southern印跡檢測所述DNA。使用嚴(yán)緊的洗滌條件(0.1×SSC,0.1％NaDOdSO4,68℃)進(jìn)行雜交，用小鼠和倉鼠DNA都易于觀察到交叉雜交，這表明高度保守的FAPα同系物的存在。在使用前述的CD26cDNA片段的對照實(shí)驗(yàn)中，未觀察到交叉雜交的跡象。
實(shí)施例7CD26分子與先前所述的FAPβ共享很多生化和血清學(xué)特性，F(xiàn)APβ是FAPα相關(guān)分子，其分子量為105kd，是在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和黑素細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的(Rettig等，癌癥研究，53:3327-3335(1993))。進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以測定FAPβ是否是CD26基因產(chǎn)物。為此，使用與前述的用pFAP.38或pCD26轉(zhuǎn)染所用方法相同的方法，但使用了兩個(gè)載體。上述文獻(xiàn)中提供的結(jié)果表明對每個(gè)載體而言，共轉(zhuǎn)染的效率約為40％，因此約有10-20％的細(xì)胞應(yīng)能被共轉(zhuǎn)染。
共轉(zhuǎn)染之后，如前述用Trans35S標(biāo)記COS-1細(xì)胞，然后也如前述進(jìn)行裂解。
在Con A SEPHAROSE上分離所得的細(xì)胞提取物，回收與Con A結(jié)合之組分中的抗原(FAPα和/或CD26)。用0.25M α-D-甘露吡喃糖苷(mannopyranoside)洗脫被結(jié)合的組分。然后如前述進(jìn)行免疫沉淀，也如上述文獻(xiàn)中所討論的在NaDOdSO4/PAGE上分離沉淀物。
那些僅用pFAP.38轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生了FAPα，而不是FAPβ(由mAb F19的免疫沉淀物測定)，它們也未產(chǎn)生CD26抗原(用EF-1檢測)。那些僅用pCD26轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生了CD26而不是FAPα。共轉(zhuǎn)染子產(chǎn)生了CD26和FAPα/FAPβ異聚體，這在mAbF19的沉淀物中可檢測到，此結(jié)果提供了FAPβ是CD26基因產(chǎn)物的直接證據(jù)。
實(shí)施例8以前已觀察到一些培養(yǎng)的人細(xì)胞類型共表達(dá)了FAPα和CD26，并顯示出FAPα/CD26異聚體的形成。然而，由以前的免疫組化研究測定出FAPα和CD26的體內(nèi)分布模式似乎是非重疊的(見Rettig等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:3110-3114(1988)；Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)；Rettig等，癌癥研究，53:3327-3335(1993)；Stein等，于Knapp等人編輯的“白細(xì)胞定型Ⅳ-白細(xì)胞分化抗原”，p412-415；Mobious等，實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)雜志，74:431-437(1988))。鑒于FAPα/CD26共結(jié)合的潛在意義，通過同時(shí)免疫組化染色已知含有FAPα+成纖維細(xì)胞或FAPα+惡性細(xì)胞的正常組織和損害組織以重新檢查組織的分布。
為了檢測樣品，將樣品包埋于OCT化合物中，在預(yù)冷于液氮的異戊烷中冷凍，并儲(chǔ)存于-70℃下待用。切下5微米厚的切片，封固于經(jīng)聚-L-賴氨酸包被的玻片上，風(fēng)干，并在冷丙酮中固定(4℃,10分鐘)。然后使用如Garin-Chesa等，組織化學(xué)及細(xì)胞化學(xué)雜志，37:1767-1776(1989)；Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)；Rettig等，癌癥研究，53:3327-3335(1993)；Garin-Chesa等，Am.J.Pathol,142:557-567中所述的熟知的親和素-生物素免疫-過氧化物酶法，用mAb(10-20ug/ml)檢測切片。
結(jié)果示于圖2，乳腺，結(jié)腸，胰腺和肺癌顯示出FAPα的強(qiáng)表達(dá)，而未發(fā)現(xiàn)CD26(見圖2A和2B)。檢測了5個(gè)FAPα+肉瘤，包括惡性纖維組織細(xì)胞瘤(圖2C和2D)，未發(fā)現(xiàn)CD26的表達(dá)。愈合中的真皮傷口的反應(yīng)性成纖維細(xì)胞的檢查(圖2E和2F)顯示出FAPα和CD26都有充分的表達(dá)。被檢測的3個(gè)腎癌(圖2G和2H)顯示出惡性上皮中CD26的表達(dá)。惡性上皮細(xì)胞中缺乏FAPα,FAPα在這些癌癥的基質(zhì)中顯示出低表達(dá)。
實(shí)施例9制備被編碼FAPα之cDNA轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
人胚胎腎細(xì)胞系293是眾所周知的，并可廣泛地得自例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心。
于37℃,95％空氣，5％CO2的氛圍中，在溫箱中維持293樣品。在Dulbecco氏修飾的極限必需培養(yǎng)基與Ham氏F12培養(yǎng)基的50∶50混合物中培養(yǎng)細(xì)胞，所述混合物中添加了10％胎牛血清，青霉素和鏈霉素。按照Ustar等，歐洲分子生物學(xué)雜志，1991，和/或Park等，生物化學(xué)雜志，169:25646-25654(1994)(皆列入本文參考文獻(xiàn))所述的方法，將FAPα之cDNA(即SEQ ID NO:1)轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。上述文獻(xiàn)中提供了cDNA載體的細(xì)節(jié)(pFAP.38)。選擇對抗生素(200ug/ml遺傳霉素)具有抗性的轉(zhuǎn)染子，然后在含有遺傳霉素的選擇性培養(yǎng)基中維持轉(zhuǎn)染子。
挑選抗性細(xì)胞的各個(gè)集落，在6孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)至鋪滿，并在免疫熒光測定(IFA)中檢測各個(gè)集落的FAPα表達(dá)，所述IFA使用前述的FAPα特異性的單克隆抗體F19。
擴(kuò)展表達(dá)FAPα的那些集落，并通過前述的間接IFA和細(xì)胞熒光測定分析監(jiān)測所述集落。
對于下文中被稱為細(xì)胞系293-FAP的轉(zhuǎn)染子而言，IFA呈陽性，但對于親代細(xì)胞系293而言，IFA呈陰性。
實(shí)施例10為了進(jìn)一步地證實(shí)實(shí)際上正在產(chǎn)生的重組FAPα，進(jìn)行了一系列的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)都遵照Park等，文獻(xiàn)同上和Rettig等，癌癥研究，53:3327-3335(1993)(都已列入本文參考文獻(xiàn))中所述的方法。實(shí)質(zhì)上，以上述文獻(xiàn)中所述的方式將35[S]甲硫氨酸標(biāo)記的細(xì)胞提取物與單克隆抗體F19相連，然后在提取緩沖液中煮沸沉淀物，使用小鼠IgG1作為陰性對照在SDS-PAGE凝膠上電泳。檢測了細(xì)胞系293-FAP和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系293。結(jié)果清楚地表明重組的FAPα是由被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系293-FAP產(chǎn)生的，這是通過免疫沉淀分析測定的，所述分析使用了FAPα特異性單克隆抗體F19。
實(shí)施例11產(chǎn)生重組FAPα的能力使得可進(jìn)一步地研究分子的特性。具體地說，假使在前述實(shí)施例中已列出了結(jié)構(gòu)特征，可設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以測定FAPα是否具有酶活性，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以檢測FAPα是否具有降解胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的活性。
使用提取緩沖液(0.15M NaCl,0.05M Tris-HCl,pH7.4,10mMMgCl2,1％Triton X-114)制備293-FAP的提取物，通過離心(4,000×g,10分鐘，4℃)澄清提取物，在37℃下進(jìn)行相分配達(dá)10-20分鐘，然后再次離心(4000×g,20分鐘，20-25℃)。用緩沖液(0.15M NaCl,0.05MTris-HCl,pH7.4,5mM CaCl2,5mM MgCl2,0.75％ Empigen BB)稀釋去污劑相，按照Rettig等，文獻(xiàn)同上的教導(dǎo)，在伴刀豆球蛋白A-Sepharose上分離此相。在洗脫緩沖液中(0.15M NaCl,0.05M Tris-HCl,pH7.4,5mMCaCl2,5mM MgCl2,0.1％ Triton X-100)，用0.25M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷洗脫任何被伴刀豆球蛋白A結(jié)合的組分，將此組分與酶譜樣品緩沖液(0.25M Tris-HCl,pH6.8,8％SDS,40％甘油，0.01％溴酚藍(lán))以3∶1的比率混合，并用于進(jìn)一步的分析。
將樣品的等分試樣上樣于含有0.1％的明膠或酪蛋白的聚丙烯酰胺凝膠中，然后在Biorad Mini-Protein Ⅱ系統(tǒng)中，以20mA的恒定電流進(jìn)行電泳1.5-2小時(shí)，直至樣品正前方的溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的末端。取出凝膠，于20-25℃，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上，2.5％的Triton X-100水溶液中保溫1小時(shí)，傾析TritonX-100溶液，并用酶緩沖液(0.05M Tris-HCl,pH7.5,0.2M NaCl,5mMCaCl2,5mM MgCl2,0.02％Brij35)代替之。然后在37℃或41℃下保溫凝膠，接著在室溫下染色或脫染色。在30％甲醇和10％乙酸的水溶液中，用0.5％的考馬斯亮藍(lán)G-250分別染色凝膠15,30和60分鐘。隨后，在30％CH3OH和5％甘油的水溶液中將凝膠保溫15分鐘，再在玻璃紙層中干燥。
根據(jù)Kleiner等，Anal.Biochem,218:325-329(1994)(全文列入本文參考文獻(xiàn))的教導(dǎo)評(píng)價(jià)明膠酶的活性，這是用于測定是否存在能消化明膠的蛋白酶的常規(guī)試驗(yàn)，在用于分子量測定的逐漸還原的條件下，在相同凝膠中電泳經(jīng)標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)。
使用熟知的膜覆蓋試驗(yàn)檢測確定氨基酸序列基元的蛋白酶解活性，見Smith等，組織化學(xué)雜志，24(9):637-647(1992)(列入本文參考文獻(xiàn))。底物是Ala-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素，Gly-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素和Lys-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素。
這些實(shí)驗(yàn)的部分結(jié)果示于圖3，此圖顯示出細(xì)胞提取物中明膠降解活性的酶譜檢測，見Kleiner等，文獻(xiàn)同上。觀察到經(jīng)SDS-PAGE檢測大約為170KDa的蛋白質(zhì)類具有明膠降解活性。因此將在293-FAP細(xì)胞系，而不是在未轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的此類蛋白質(zhì)鑒定為FAPα，分子量與二聚體，即二聚體的FAPα分子的一致。
當(dāng)酪蛋白為底物時(shí)，未觀察到本文所述的底物為明膠的蛋白酶解活性。
實(shí)施例12進(jìn)行另外的研究以進(jìn)一步鑒定170KD的FAPα二聚體。具體地說，重復(fù)實(shí)施例11中所述的實(shí)驗(yàn)，不同之處在于進(jìn)行SDS-PAGE之前，在提取物中加入5％2-巰基乙醇或5um碘乙酰胺，或在用于明膠酶譜分析的保溫緩沖液中加入乙二胺N,N,N’,N’-四乙酸(10mM)，這些處理都不能消除酶活性。與之形成對照的是在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳之前在100℃中加熱5分鐘會(huì)消除明膠降解活性。
使用如Smith等，組織化學(xué)雜志，24(9):637-647(1992)(列入本文參考文獻(xiàn))中所述的膜覆蓋試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，揭示了FAPα二聚體可裂解所有被檢測的Ala-Pro,Gly-Pro和Lys-Pro二肽。
在另外的實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)生了融合蛋白，該蛋白含有FAPα和鼠CD8蛋白的胞外域。此嵌合蛋白是在昆蟲細(xì)胞的桿狀病毒系統(tǒng)中產(chǎn)生的。使用上述文獻(xiàn)中討論的模式，嵌合蛋白表現(xiàn)出與FAPα相同的酶解活性。
實(shí)施例13使用Ala-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素(Ala-Pro-AFC)作為底物進(jìn)行兩個(gè)定量測定FAPα酶活性的試驗(yàn)。在第一個(gè)試驗(yàn)形式中，將表達(dá)FAPα之細(xì)胞的膜提取物與5-10倍體積的反應(yīng)緩沖液(100mM NaCl,100mM Tris,pH7.8)混合，并將混合物加入等體積的含0.5mM Ala-Pro-AFC的反應(yīng)緩沖液中，然后在37℃下保溫1小時(shí)。在使用395nm激發(fā)/530nm發(fā)射濾光片套的熒光計(jì)中測量游離AFC的釋放。在此試驗(yàn)形式中分析的膜提取物得自293-FAPα細(xì)胞(被上述文獻(xiàn)中所述載體FAP.38穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞)或HT1080-FAPα細(xì)胞(被載體FAP.38穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HT1080細(xì)胞)。用制備自各個(gè)親代293或HT1080細(xì)胞系的膜提取物進(jìn)行評(píng)價(jià)FAPα特異性活性的陰性對照實(shí)驗(yàn)。在第二個(gè)試驗(yàn)中，通過特異于FAPα的抗體從293-FAPα或HT1080-FAPα的膜提取物中分離FAPα。在4℃下，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的1ug/ml F19單克隆抗體將96孔ELISA培養(yǎng)板包被過夜。在下文討論的CD8-FAPα的情況下，在4℃下用上述的F19抗體或1ug/ml大鼠抗-小鼠CD8將培養(yǎng)板包被過夜，然后用洗滌緩沖液(PBS,0.1％吐溫20)洗滌孔，在室溫下用封閉緩沖液(PBS中的5％牛血清白蛋白)將多余的結(jié)合位點(diǎn)封閉1小時(shí)，除去封閉緩沖液；加入293-FAPα表達(dá)細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞的膜提取物，并在室溫下保溫1小時(shí)。除去未結(jié)合的物質(zhì)，用洗滌緩沖液洗滌孔，在37℃下，使用100ulAla-Pro-AFC(于反應(yīng)緩沖液中的0.5mM Ala-Pro-AFC)檢測FAPα活性1小時(shí)，如上所述檢測游離AFC的釋放，mAb F19與FAPα的結(jié)合未可測地影響其酶解活性。
實(shí)施例14使用上述文獻(xiàn)中所述的用于FAPα酶活性的試驗(yàn)，已鑒定出FAPα酶活性的抑制劑。此抑制劑是(S)-纈氨酰吡咯烷-2(R)-硼酸(Snow等，J.Am.ChemSoc.(1994),116:10860-10869)，本文稱之為ValboroPro。ValboroPro抑制FAPα對Ala-Pro-AFC的裂解，其IC50為0.11uM。ValboroPro也抑制濃度為100uM的FAPα的明膠裂解活性。在試驗(yàn)中用不相關(guān)的絲氨酸蛋白酶，即胰蛋白酶闡明了ValboroPro對FAPα的特異性。當(dāng)用芐酯基-L-valinyl-glycinyl-L-arginyl-4-苯基重氮酸乙酸鹽(carbobenzoxyl-L-valinyl-glycinyl-L-arginyl-4-nitranilide acetate)作為底物檢測時(shí)，未觀察到ValboroPro(達(dá)100uM)對牛胰蛋白酶的抑制。
實(shí)施例15FAPα酶活性的特異性結(jié)構(gòu)需求的鑒定促進(jìn)了可結(jié)合和/或抑制FAPα的分子的發(fā)展。為了檢測FAPα多肽推測的氨基酸序列第624位的絲氨酸殘基對于其酶功能是否是至關(guān)重要的，可使用標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈反應(yīng)方法進(jìn)行根據(jù)Zoller等，DNA,3:479-488(1984)的定點(diǎn)誘變。用GCG取代FAPαcDNA中編碼第624位絲氨酸的TCC密碼子，在此位置產(chǎn)生了丙氨酸。如前文所述，將改變的DNA重新導(dǎo)入FAP.38載體中，并轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中。選擇遺傳霉素抗性集落，并通過間接IFA檢測FAPα的表達(dá)，所述IFA使用mAb F19以及上述文獻(xiàn)所列的Rettig等，癌癥雜志，58:385-392(1994)中所述的其它FAPα特異性抗體。與野生型FAPα轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，未觀察到抗FAPα抗體與突變體FAPα表達(dá)細(xì)胞之結(jié)合中的差異。通過用幾個(gè)克隆的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA的擴(kuò)增和限制性酶消化進(jìn)一步證實(shí)突變的存在。為了評(píng)價(jià)突變體FAPα的酶活性，進(jìn)行了下列的試驗(yàn)。由3個(gè)獨(dú)立的陽性克隆制備膜提取物，在明膠裂解和Ala-Pro-AFC捕獲試驗(yàn)中檢測等量的FAPα蛋白(在使用兩個(gè)抗FAPα抗體的雙測定ELISA試驗(yàn)中測定，所述抗體可識(shí)別不同的FAPα表位)。與野生型FAPα相比，分離的突變體FAPα的明膠裂解活性和捕獲試驗(yàn)中的活性降低至不可檢測的水平，這進(jìn)一步證實(shí)了催化三聯(lián)體中規(guī)范絲氨酸對兩種觀察到的酶解活性的作用。
實(shí)施例16產(chǎn)生融合蛋白以得到分泌的，水溶性的FAPα酶。在此融合蛋白中，使用標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈反應(yīng)方法，將由鼠CD8前189個(gè)氨基酸組成的CD8胞外域與Lane等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，177:1209(1993)中所述的FAPα胞外域(氨基酸27-760)相連，并插入可商購的pVL1393載體中。用此載體轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞并擴(kuò)增所得的重組桿狀病毒皆按上文所述進(jìn)行(桿狀病毒表達(dá)載體，OReilly,Miller和Luckow，牛津大學(xué)出版社，1994)。在兩步純化法中，從被CD8-FAPα桿狀病毒感染4天的High FiveTM細(xì)胞的用盡培養(yǎng)基中分離CD8-FAP融合蛋白。通過超速離心除去細(xì)胞和病毒，使上清液穿過含有肝素-Sepharose(Pharmacia)的柱中，并用10mM磷酸鹽，pH7中的0.6,1.0和2.0M NaCl逐步洗脫。收集1.0和2.0M洗脫液中的活性組分，并使用YM-10濾器和26/60 Superdex-200凝膠過濾柱濃縮之。在高分子量的峰中觀察到活性，當(dāng)進(jìn)行N-末端氣相測序時(shí)，進(jìn)一步證實(shí)了該活性為CD8-FAPα。在明膠裂解試驗(yàn)中，當(dāng)檢測純化的CD8-FAPα?xí)r，檢測到大于200KD的活性，這與融合蛋白較高的推測分子量一致。
實(shí)施例17
在非人類中存在結(jié)構(gòu)和功能同系物已被證實(shí)，例如，已克隆和鑒定了小鼠FAPα的cDNA。同源小鼠FAPα cDNA序列(EMBL登記號(hào)Y10007)的推測氨基酸序列的檢查揭示了FAPα交叉種類的高度保守性。兩種蛋白質(zhì)89％相同，人FAPα和小鼠FAPα之間的催化三聯(lián)體是保守的。高度保守性和相似的組織表達(dá)表明非人源的FAPα可能是人FAPα的功能等同物。此結(jié)論被下列發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)，即在設(shè)計(jì)上與CD8-人FAPα類似的CD8-鼠FAPα融合蛋白也闡明了使用Ala-Pro-AFC作為底物的預(yù)期二肽基肽酶酶解活性。
上述實(shí)施例描述了編碼成纖維細(xì)胞激活蛋白α(“FAPα”)的分離的核酸分子，以及此分子的二聚體形式，及其用途。此序列在COS-1細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在煮沸樣品的SDS-PAGE上顯示出分子量約為88kd。SEQ ID NO:1提供的一種形式分子的推定氨基酸序列產(chǎn)生了約88kd的分子量。
應(yīng)注意分子量有明顯的差異，因?yàn)镃OS-1分離物是糖基化的，而由推定氨基酸序列得到的分子量不能說明糖基化。然而，已知膜蛋白在凝膠系統(tǒng)中表現(xiàn)出異常的遷移，這可以解釋本文觀察到的差異。
本發(fā)明的另一部分是嵌合和融合蛋白，所述蛋白含有FAPα部分，該部分含有分子的催化域，所述蛋白另外還含有非FAPα組分。FAPα催化域本身也是本發(fā)明的一部分。
應(yīng)理解如上所述，F(xiàn)APα可以是糖基化的，根據(jù)表達(dá)此分子的細(xì)胞類型，糖基化的類型和量有所改變，本文所述的實(shí)驗(yàn)顯示出這一點(diǎn)。經(jīng)未煮沸樣品的SDS-PAGE測定出本文首次描述的二聚體形式的分子具有的分子量約為170KDa，這也是正確的。
本發(fā)明也包含用于產(chǎn)生FAPα分子的表達(dá)載體的生產(chǎn)。在這些載體最寬的范圍內(nèi)，它們含有與啟動(dòng)子有效相連的完整的FAPα編碼序列或其部分。另外的元件可以是表達(dá)載體的一部分，如與FAPα蛋白或蛋白質(zhì)部分融合的蛋白質(zhì)域(“融合蛋白”)的基因，所述基因可賦予抗生素抗性，以及可擴(kuò)增的基因等等。
編碼序列和載體也可用于制備細(xì)胞系，其中使用編碼序列或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化受體宿主，所用細(xì)胞的類型可以是原核生物，如大腸桿菌，或真核生物，如酵母，CHO,COS或其它細(xì)胞類型。
如SEQ ID NO:1所示核酸分子的鑒定也使得技術(shù)人員可鑒定和分離那些在嚴(yán)緊條件下能與之雜交的核酸分子。本文所用的“嚴(yán)緊條件”指的是上文所述的那些參數(shù)，籍此也鑒定出鼠和倉鼠的序列。熟練的技術(shù)人員可以認(rèn)為這些條件提供了使用與前述不同的參數(shù)可得到的嚴(yán)緊度。這些不同之處包含在術(shù)語“嚴(yán)緊條件”中。
核酸分子與互補(bǔ)分子雜交的能力也使得技術(shù)人員可通過使用核酸雜交試驗(yàn)鑒定出表達(dá)FAPα的細(xì)胞。人們可使用本發(fā)明中所述的序列與互補(bǔ)序列雜交，從而鑒定它們。通過此方法，可靶向mRNA，如表達(dá)FAPα分子的任何細(xì)胞中存在的mRNA。
當(dāng)然，應(yīng)懂得本發(fā)明的核酸分子也可用于生產(chǎn)單體和二聚體形式的重組FAPα。實(shí)施例清楚地說明宿主細(xì)胞可裝配二聚體形式。重組蛋白質(zhì)可用作例如免疫原的來源以產(chǎn)生與已知的mAb F19類似，并具有相同用途的抗體。類似地，可將重組蛋白質(zhì)，和/或表達(dá)其表面分子的細(xì)胞用于測定拮抗劑，激動(dòng)劑或能與具有FAPα活性之分子相互作用的其它分子的試驗(yàn)中。這種物質(zhì)可以是，但不必局限于底物，抑制分子，抗體等等。具有FAPα活性的分子可以是例如單體或二聚體形式的FAPα，含有催化域的衍生物等等。具有FAPα活性的分子可以是純的，或者是細(xì)胞提取物的形式，如已接受了FAPα活性基因的被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染之細(xì)胞的提取物。原核生物和真核生物都可以使用。根據(jù)所觀察到的與膜結(jié)合酶的結(jié)構(gòu)相似性應(yīng)考慮到本發(fā)明的最后一個(gè)特征。此類分子的某些相關(guān)特性無需在此詳細(xì)描述，這足以說明與FAPα相關(guān)的這些特性的抑制或加強(qiáng)是本發(fā)明的特征，例如，通過使用重組細(xì)胞或重組FAPα本身可鑒定FAPα分子的底物，可對底物進(jìn)行修飾以改善其效果，減輕其效果，或用可測的信號(hào)簡單地標(biāo)記它們以使它們可用于例如鑒定表達(dá)FAPα的細(xì)胞。對底物和FAPα，以及FAPα和任何諸如此類的分子之間的相互作用的研究可被用于開發(fā)和/或鑒定FAPα分子的激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明另外的特征是經(jīng)SDS-PAGE測定出其分子量約為170KDa的分離的二聚體FAPα分子，其作為酶裂解劑的用途和本文所述的其它用途。FAPα的酶活性形式也可以作為重組的融合蛋白產(chǎn)生，如含有FAPα催化域和具有適當(dāng)生化特性的其它蛋白質(zhì)域的可溶性融合蛋白，所述蛋白質(zhì)域包括分泌信號(hào)，蛋白酶裂解位點(diǎn)，純化標(biāo)記物和技術(shù)人員已知的其它元件，例子是上文所述的CD8肽序列。如本文所述，F(xiàn)APα具有特殊特性這一事實(shí)使得可以在表達(dá)分子的細(xì)胞上鑒定分子。換句話說，由于FAPα分子與腫瘤和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)，通過施用足夠的治療劑以減輕癌癥負(fù)荷，用治療劑靶向FAPα可以用作治療癌癥或癌癥前期疾病的方法。
顯示FAPα蛋白酶解特性的實(shí)驗(yàn)成為本發(fā)明的另一方面。眾所周知，降解胞外基質(zhì)或“ECM”蛋白質(zhì)的蛋白酶對于腫瘤生長的某些方面具有重要的作用，所述作用包括它們對腫瘤細(xì)胞侵害，腫瘤血管形成(即新血管生成)和腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。同蛋白酶的底物相比，膠原具有特殊的意義，因?yàn)槟z原是ECM重要的一部分。FAPα消化ECM的事實(shí)暗示了分子抑制劑的治療作用。本文所用的“抑制劑”是指干擾FAPα酶功能的分子，從這種抑制劑中特別排除的是單克隆抗體F19。已知此mAb可結(jié)合但不抑制FAPα的酶功能，因此它不是抑制劑。有關(guān)既結(jié)合也抑制酶的單克隆抗體領(lǐng)域的技術(shù)是很成熟的。這種抑制劑的另外的例子包括例如底物衍生物，如經(jīng)修飾的膠原分子，該分子干擾FAPα分子的活性位點(diǎn)，其它適當(dāng)?shù)囊种苿τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，本文無需羅列。另外，在酶篩選試驗(yàn)中可使用前述的重組FAPα蛋白和被FAPα轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系以從任何化合物庫中鑒定抑制劑，所述試驗(yàn)中使用了前述的底物或其它適當(dāng)?shù)牡孜?。因此，與FAPα活性分子相互作用之底物的鑒定使得可以治療受試者表現(xiàn)出異常FAPα活性的疾病。具體地說，給受試者施用足以使FAPα活性正?；倪m當(dāng)量底物，所述底物可以是抑制劑(如膠原衍生物，S-纈氨酰-吡咯烷-2(R)-硼酸)，激動(dòng)劑或拮抗劑。
本發(fā)明的其它方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，本文無需羅列。
本文使用的術(shù)語和措辭是為了描述而不是限制的目的，在使用這種術(shù)語和措辭時(shí)并不排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，應(yīng)理解多種修飾也可以在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人Zimmermann,Rainer；Park,John E.；Rettig,Wolfgang；Old,Lloyd J.(ⅱ)發(fā)明題目分離的二聚體成纖維細(xì)胞激活蛋白α及其用途(ⅲ)序列數(shù)2(ⅳ)通訊地址(A)收件人Felfe & Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家美國(F)郵政編碼10022(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤，3.5英寸，2.0MB內(nèi)存(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordperfect(ⅵ)目前的申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(hào)(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/619,280(B)申請日1996年3月18日(C)分類號(hào)435(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/230,491(B)申請日1994年4月20日(ⅷ)代理人/代理資料(A)姓名Hanson,Norman D.
(B)登記號(hào)30,946(C)資料/文檔號(hào)LUD 5330.1-PCT(ⅸ)通訊資料(A)電話(212)688-9200(B)傳真(212)838-3884(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度2815個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AAGAACGCCC CCAAAATCTG TTTCTAATTT TACAGAAATC TTTTGAAACT TGGCACGGTA 60TTCAAAAGTC CGTGGAAAGA AAAAAACCTT GTCCTGGCTT CAGCTTCCAA CTACAAAGAC 120AGACTTGGTC CTTTTCAACG GTTTTCACAG ATCCAGTGAC CCACGCTCTG AAGACAGAAT 180TAGCTAACTT TCAAAAACAT CTGGAAAAAT GAAGACTTGG GTAAAAATCG TATTTGGAGT 240TGCCACCTCT GCTGTGCTTG CCTTATTGGT GATGTGCATT GTCTTACGCC CTTCAAGAGT 300TCATAACTCT GAAGAAAATA CAATGAGAGC ACTCACACTG AAGGATATTT TAAATGGAAC 360ATTTTCTTAT AAAACATTTT TTCCAAACTG GATTTCAGGA CAAGAATATC TTCATCAATC 420TGCAGATAAC AATATAGTAC TTTATAATAT TGAAACAGGA CAATCATATA CCATTTTGAG 480TAATAGAACC ATGAAAAGTG TGAATGCTTC AAATTACGGC TTATCACCTG ATCGGCAATT 540TGTATATCTA GAAAGTGATT ATTCAAAGCT TTGGAGATAC TCTTACACAG CAACATATTA 600CATCTATGAC CTTAGCAATG GAGAATTTGT AAGAGGAAAT GAGCTTCCTC GTCCAATTCA 660GTATTTATGC TGGTCGCCTG TTGGGAGTAA ATTAGCATAT GTCTATCAAA ACAATATCTA 720TTTGAAACAA AGACCAGGAG ATCCACCTTT TCAAATAACA TTTAATGGAA GAGAAAATAA 780AATATTTAAT GGAATCCCAG ACTGGGTTTA TGAAGAGGAA ATGCTTCCTA CAAAATATGC 840TCTCTGGTGG TCTCCTAATG GAAAATTTTT GGCATATGCG GAATTTAATG ATAAGGATAT 900ACCAGTTATT GCCTATTCCT ATTATGGCGA TGAACAATAT CCTAGAACAA TAAATATTCC 960ATACCCAAAG GCTGGAGCTA AGAATCCCGT TGTTCGGATA TTTATTATCG ATACCACTTA 1020CCCTGCGTAT GTAGGTCCCC AGGAAGTGCC TGTTCCAGCA ATGATAGCCT CAAGTGATTA 1080TTATTTCAGT TGGCTCACGT GGGTTACTGA TGAACGAGTA TGTTTGCAGT GGCTAAAAAG 1140AGTCCAGAAT GTTTCGGTCC TGTCTATATG TGACTTCAGG GAAGACTGGC AGACATGGGA 1200TTGTCCAAAG ACCCAGGAGC ATATAGAAGA AAGCAGAACT GGATGGGCTG GTGGATTCTT 1260TGTTTCAAGA CCAGTTTTCA GCTATGATGC CATTTCGTAC TACAAAATAT TTAGTGACAA 1320GGATGGCTAC AAACATATTC ACTATATCAA AGACACTGTG GAAAATGCTA TTCAAATTAC 1380AAGTGGCAAG TGGGAGGCCA TAAATATATT CAGAGTAACA CAGGATTCAC TGTTTTATTC 1440TAGCAATGAA TTTGAAGAAT ACCCTGGAAG AAGAAACATC TACAGAATTA GCATTGGAAG 1500CTATCCTCCA AGCAAGAAGT GTGTTACTTG CCATCTAAGG AAAGAAAGGT GCCAATATTA 1560CACAGCAAGT TTCAGCGACT ACGCCAAGTA CTATGCACTT GTCTGCTACG GCCCAGGCAT 1620CCCCATTTCC ACCCTTCATG ATGGACGCAC TGATCAAGAA ATTAAAATCC TGGAAGAAAA 1680CAAGGAATTG GAAAATGCTT TGAAAAATAT CCAGCTGCCT AAAGAGGAAA TTAAGAAACT 1740TGAAGTAGAT GAAATTACTT TATGGTACAA GATGATTCTT CCTCCTCAAT TTGACAGATC 1800AAAGAAGTAT CCCTTGCTAA TTCAAGTGTA TGGTGGTCCC TGCAGTCAGA GTGTAAGGTC 1860TGTATTTGCT GTTAATTGGA TATCTTATCT TGCAAGTAAG GAAGGGATGG TCATTGCCTT 1920GGTGGATGGT CGAGGAACAG CTTTCCAAGG TGACAAACTC CTCTATGCAG TGTATCGAAA 1980GCTGGGTGTT TATGAAGTTG AAGACCAGAT TACAGCTGTC AGAAAATTCA TAGAAATGGG 2040TTTCATTGAT GAAAAAAGAA TAGCCATATG GGGCTGGTCC TATGGAGGAT ACGTTTCATC 2100ACTGGCCCTT GCATCTGGAA CTGGTCTTTT CAAATGTGGT ATAGCAGTGG CTCCAGTCTC 2160CAGCTGGGAA TATTACGCGT CTGTCTACAC AGAGAGATTC ATGGGTCTCC CAACAAAGGA 2220TGATAATCTT GAGCACTATA AGAATTCAAC TGTGATGGCA AGAGCAGAAT ATTTCAGAAA 2280TGTAGACTAT CTTCTCATCC ACGGAACAGC AGATGATAAT GTGCACTTTC AAAACTCAGC 2340ACAGATTGCT AAAGCTCTGG TTAATGCACA AGTGGATTTC CAGGCAATGT GGTACTCTGA 2400CCAGAACCAC GGCTTATCCG GCCTGTCCAC GAACCACTTA TACACCCACA TGACCCACTT 2460CCTAAAGCAG TGTTTCTCTT TGTCAGACTA AAAACGATGC AGATGCAAGC CTGTATCAGA 2520ATCTGAAAAC CTTATATAAA CCCCTCAGAC AGTTTGCTTA TTTTATTTTT TATGTTGTAA 2580AATGCTAGTA TAAACAAACA AATTAATGTT GTTCTAAAGG CTGTTAAAAA AAAGATGAGG 2640ACTCAGAAGT TCAAGCTAAA TATTGTTTAC ATTTTCTGGT ACTCTGTGAA AGAAGAGAAA 2700AGGGAGTCAT GCATTTTGCT TTGGACACAG TGTTTTATCA CCTGTTCATT TGAAGAAAAA 2760TAATAAAGTC AGAAGTTCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGCGGCCG CTCGA 2815(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度760個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:2:Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val5 10 15Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His20 25 30Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu35 40 45Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly
50 55 60Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn65 70 75 80Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys85 90 95Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val100 105 110Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala115 120 125Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn130 135 140Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser145 150 155 160Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro165 170 175Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile180 185 190Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Pro Thr195 200 205Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala210 215 220Glu Phe Asn Asp Lys Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly225 230 235 240Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly245 250 255Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro260 265 270Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser275 280 285Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val290 295 300Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile305 310 315 320Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln325 330 335Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val340 345 350Ser Arg Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe355 360 365Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val370 375 380Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile385 390 395 400Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu405 410 415Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr420 425 430Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys435 440 445Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu450 455 460Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg465 470 475 480Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn485 490 495Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu500 505 510Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe515 520 525Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro530 535 540Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr545 550 555 560Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly565 570 575Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu580 585 590Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile595 600 605Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile lrp Gly Trp Ser610 615 620Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu625 630 635 640Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp660 665 670Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr675 680 685Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn690 695 700Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala705 710 715 720Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu725 730 735Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu740 745 750Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp755 760
權(quán)利要求
1．分離的，二聚體FAPα分子，經(jīng)SDS-PAGE測定出其分子量約為170千道爾頓，其中所述二聚體FAPα分子能降解胞外基質(zhì)蛋白。
2．權(quán)利要求1的二聚體FAPα分子，其中所述二聚體FAPα分子的各個(gè)單體由SEQ ID NO:2的氨基酸序列組成。
3．權(quán)利要求1的二聚體FAPα分子，所述分子是重組產(chǎn)生的。
4．權(quán)利要求3的二聚體FAPα分子，所述分子是由真核細(xì)胞產(chǎn)生的。
5．分離的蛋白質(zhì)，由(ⅰ)FAPα催化域，和(ⅱ)至少一部分非FAPα蛋白組成。
6．從分子中裂解式Xaa-Pro的末端二肽的方法，所述方法包括將所述分子與第二分子接觸，所述第二分子具有FAPα酶解活性。
7．權(quán)利要求6的方法，其中所述第二分子是分離的二聚體FAPα。
8．權(quán)利要求6的方法，其中所述第二分子含有FAPα催化域。
9．鑒定與具有FAPα活性之分子相互作用的物質(zhì)的方法，所述方法包括將所述分子與需檢測的樣品混合，并將與所述分子的任何相互作用測定為與具有FAPα活性之分子相互作用的分子的指示。
10．權(quán)利要求9的方法，其中所述的FAPα分子是二聚體。
11．權(quán)利要求9的方法，其中所述分子含有FAPα催化域。
12．權(quán)利要求9的方法，其中所述物質(zhì)是FAPα活性的拮抗劑。
13．權(quán)利要求9的方法，其中所述物質(zhì)是FAPα活性的激動(dòng)劑。
14．權(quán)利要求9的方法，其中所述物質(zhì)是FAPα活性的抑制劑。
15．權(quán)利要求9的方法，包括將所述物質(zhì)與具有FAPα活性之細(xì)胞提取物混合。
16．權(quán)利要求15的方法，其中所述的細(xì)胞提取物是已被編碼具有FAPα活性之分子的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞是原核生物的細(xì)胞。
18．權(quán)利要求16的方法，其中所述細(xì)胞是真核生物的細(xì)胞。
19．治療處于FAPα活性異常之病理狀態(tài)的受試者的方法，所述方法包括給需要治療的受試者施用其量足以使所述受試者體內(nèi)的FAPα活性水平正?；奈镔|(zhì)，所述物質(zhì)可與具有FAPα活性之分子相互作用。
20．權(quán)利要求19的方法，包括施用FAPα活性的抑制劑。
21．權(quán)利要求20的方法，其中所述的抑制劑是膠原衍生物。
22．權(quán)利要求20的方法，其中所述抑制劑是(S)-纈氨酰吡咯烷-2(R)-硼酸。
23．權(quán)利要求19的方法，其中所述物質(zhì)是FAPα活性的激動(dòng)劑。
24．權(quán)利要求19的方法，其中所述物質(zhì)是FAPα活性的拮抗劑。
25．鑒定物質(zhì)是否與具有FAPα活性的分子相互作用的方法，所述方法包括將所述物質(zhì)與所述分子和Ala-Pro-AFC混合，測定所述分子與Ala-Pro-AFC的相互作用，并將所述相互作用與缺乏所述物質(zhì)時(shí)所述分子與Ala-Pro-AFC的相互作用相比較，其中它們之間的差異表示所述物質(zhì)與所述分子相互作用。
26．含有足以維持FAPα活性的FAPα分子的一部分和非FAPα氨基酸序列的融合蛋白，其中所述融合蛋白是水溶性的。
27．權(quán)利要求26的融合蛋白，其中所述的非FAPα氨基酸序列是在CD8蛋白中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。
28．權(quán)利要求27的融合蛋白，其中所述的CD8蛋白是鼠源蛋白質(zhì)。
29．權(quán)利要求27的融合蛋白，其中所述的CD8蛋白是人源蛋白質(zhì)。
30．權(quán)利要求27的融合蛋白，含有與FAPα的氨基酸27-760相連的鼠CD8氨基酸1-189。
全文摘要
本發(fā)明涉及已知為成纖維細(xì)胞激活蛋白α,或“FAPα”的蛋白質(zhì)的二聚體形式,及其用途。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1214052SQ97193176
公開日1999年4月14日 申請日期1997年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月18日
發(fā)明者雷納·齊默爾曼, 約翰·E·帕克, 沃爾夫?qū)だ滋└? 勞埃德·J·奧爾德 申請人:路德維格癌癥研究院, 貝林格爾·英格海姆國際有限公司