專利名稱：曲霉屬膽色素原合酶和編碼該酶的核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及曲霉屬膽色素原合酶和包含編碼膽色素原合酶的核酸序列的分離核酸片段。本發(fā)明也涉及核酸構(gòu)建體、載體和包含該核酸序列的宿主細(xì)胞以及產(chǎn)生該膽色素原合酶的方法。
相關(guān)技術(shù)描述血紅素(一種原卟啉Ⅸ和鐵的螯合物)用作為血紅素蛋白的輔基。原卟啉Ⅸ由為四個甲基、兩個乙烯基和兩個丙酸基團(tuán)所取代的卟啉環(huán)組成，該卟啉環(huán)獲得一個鐵原子以形成血紅素。由甘氨酸和琥珀酰-CoA生物合成血紅素包括八個酶促步驟。該途徑中的第二種酶是膽色素原合酶(也稱為乙酰丙氨酸脫水酶)，該膽色素原合酶催化兩個5-乙酰丙氨酸分子的縮合而形成膽色素原。膽色素原合酶在粗糙脈孢菌和釀酒酵母的血紅素生物合成途徑中是限速酶。
從脫輔基蛋白質(zhì)到血紅素蛋白的轉(zhuǎn)化取決于血紅素生物合成途徑所提供的血紅素的可用性。脫輔基蛋白質(zhì)形式的血紅素蛋白與血紅素結(jié)合產(chǎn)生活性血紅素蛋白。活性血紅素蛋白獲得一種構(gòu)象，該構(gòu)象使血紅素蛋白比受蛋白水解作用的脫輔基蛋白質(zhì)更穩(wěn)定。如果微生物產(chǎn)生的血紅素量遠(yuǎn)小于產(chǎn)生的脫輔基蛋白質(zhì)量，那么脫輔基蛋白質(zhì)將積累并經(jīng)過蛋白水解降解降低活性血紅素蛋白的產(chǎn)率。
為了克服這一問題，Jensen顯示把血紅素或者含血紅素材料添加至發(fā)酵培養(yǎng)基，可導(dǎo)致米曲霉的過氧化物酶產(chǎn)率的大量增加(WO93/19195)。當(dāng)血紅素添加至發(fā)酵培養(yǎng)基時，可導(dǎo)致血紅素蛋白產(chǎn)率的很大提高，但大規(guī)模實行起來卻不合適，而且很昂貴、很困難。
得自釀酒酵母的膽色素原合酶基因的克隆與表達(dá)已經(jīng)公開(Labbe-Bois和Labbe,1990,In,Dailey,H.A.，編輯，血紅素和葉綠素的生物合成，McGraw-Hill,Inc.，紐約，258頁)。
本發(fā)明的目的是提供新的膽色素原合酶和編碼該酶的基因。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及得自曲霉屬的基本上純化的膽色素原合酶和包含編碼曲霉屬膽色素原合酶的核酸序列的分離核酸片段。本發(fā)明還提供了核酸構(gòu)建體、載體和包含本發(fā)明的核酸片段的重組宿主細(xì)胞以及產(chǎn)生膽色素原合酶的方法。
附圖簡要描述

圖1顯示質(zhì)粒pAJ005-1的限制性酶切圖。
圖2顯示米曲霉膽色素原合酶基因的核苷酸與推定的氨基酸序列(分別見SEQ ID NO:1和2)。有下劃線的是CAAT盒，方框里的是TATA盒。用點線標(biāo)明的是推定的內(nèi)含子，用虛線標(biāo)明的是推定的鋅指結(jié)構(gòu)域。文庫探針用黑色實線標(biāo)明，圈起來的是活性賴氨酸。
圖3顯示得自枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、人、豌豆、大鼠、菠菜、酵母和米曲霉的膽色素原合酶的推定氨基酸序列(分別見SEQ ID NO:22、20、18、21、19、23、17和2)的對比。
圖4顯示pAJ023的限制性酶切圖。
圖5顯示質(zhì)粒pJVi9的構(gòu)建。
圖6顯示質(zhì)粒pJeRS6的限制性酶切圖。
圖7顯示質(zhì)粒pJRoC50的限制性酶切圖。
發(fā)明的詳細(xì)描述如上所述，本發(fā)明涉及得自曲霉菌株的膽色素原合酶，例如得自包括但不限于以下曲霉的菌株的膽色素原合酶臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉和米曲霉。公眾很容易從一些培養(yǎng)物保藏中心獲取這些物種的菌株，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、聯(lián)邦德國微生物保藏中心(DSM)、荷蘭真菌菌種保藏中心(CBS)、國際微生物研究所(IMI)、農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心、北方地區(qū)研究中心(NRRL)以及日本大阪發(fā)酵研究所(IFO)。
在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及得自曲霉的膽色素原合酶。在一更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及得自米曲霉的膽色素原合酶。在一最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及得自米曲霉IFO 4177或者其突變體菌株的膽色素原合酶，例如具有SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列的膽色素原合酶。
本發(fā)明也涉及為在高度嚴(yán)格條件下(即在45℃條件下，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml的剪切和變性鮭精DNA以及50％甲酰胺中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交)能夠與探針雜交的核酸序列所編碼的膽色素原合酶，所說的探針在相同條件下與SEQ ID NO:1描述的核酸序列雜交。該基因或基于它的寡核苷酸可以在Southern雜交中用作為探針來分離任一曲霉屬物種的同源基因。特別是，這樣的探針可用于按照標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡過程與所感興趣物種的基因組或cDNA雜交，以便鑒定并分離其中相應(yīng)的膽色素原合酶基因。簡并的PCR引物(寡核苷酸)與基因組DNA或cDNA片段可一起用來擴(kuò)增膽色素原合酶特異性基因片段。
得自不同于那些本文具體舉例說明的來源的膽色素原合酶基因的鑒定和分離，可通過利用本例子所描述的方法，用公眾可獲得的曲霉菌株來完成。
對于本發(fā)明來說，術(shù)語“得自”意指膽色素原合酶由特定來源(例如曲霉菌株)或者由得自該來源的編碼膽色素原合酶的基因已插入其中的細(xì)胞產(chǎn)生。
本發(fā)明也包含膽色素原合酶變體，其與SEQ ID NO:2所描述的氨基酸序列有至少大約50％、優(yōu)選大約55％、更優(yōu)選大約60％、甚至更優(yōu)選大約65％，以及甚至優(yōu)選大約70％、更優(yōu)選大約75％、甚至更優(yōu)選大約80％、最優(yōu)選大約85％、甚至最優(yōu)選大約90％、最最優(yōu)選大約95％的同源性，并且其定性地保持這里所描述的膽色素原合酶活性。本發(fā)明也涉及膽色素原合酶變體，該變體的氨基酸序列與SEQ ID NO:2所描述的氨基酸序列有三個氨基酸(優(yōu)選地有兩個氨基酸、更優(yōu)選地有一個氨基酸)不同。每一種差異可能是氨基酸的插入或者缺失或者不同氨基酸對氨基酸殘基的取代。以上定義的分類范圍內(nèi)的有用變體包括，例如那些在其中已進(jìn)行了保守氨基酸取代的變體，該取代作用并不嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的活性。保守替換意味著相同種類的氨基酸可能被同類的另一氨基酸取代。例如非極性脂肪族殘基Ala、Val、Leu和Ile可能進(jìn)行相互取代，堿性殘基Lys和Arg，或者酸性殘基Asp和Glu也可能進(jìn)行相互取代。同樣地，Ser和Thr進(jìn)行相互地保守替換，Asn和Gln也一樣。
利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可確定本發(fā)明的膽色素原合酶的物理化學(xué)性質(zhì)，這些技術(shù)包括但不限于SDS-PAGE、等電聚焦以及交叉反應(yīng)免疫鑒定檢驗方法。本發(fā)明的膽色素原合酶可利用本領(lǐng)域已知的方法分析。
本發(fā)明的膽色素原合酶可由本領(lǐng)域已知的各種方法純化，這些方法包括但不限于層析法(例如離子交換法、親和法、疏水法、層析聚焦法以及大小排阻法)、電泳法(例如制備性等電點聚焦)、差別溶解法(例如硫酸銨沉淀)或者抽提法(參見，例如蛋白質(zhì)純化，編者J.-C.Janson和LarsRyden，VCH出版社，紐約，1989)。如本文所定義的，“基本上純化的”膽色素原合酶是指本質(zhì)上無其它非膽色素原合酶蛋白質(zhì)的膽色素原合酶，例如由SDS-PAGE所確定的純度為至少大約20％，優(yōu)選為大約40％，更優(yōu)選為大約60％，甚至更優(yōu)選為大約80％，最優(yōu)選為大約90％，甚至最優(yōu)選為至少大約95％。
本發(fā)明也涉及包含編碼本發(fā)明的膽色素原合酶的核酸序列的核酸片段和包含本發(fā)明核酸片段的核酸構(gòu)建體。
在一優(yōu)選的實施方案中，核酸序列編碼得自曲霉的膽色素原合酶。在一更優(yōu)選的實施方案中，核酸序列編碼得自米曲霉的膽色素原合酶。在最為優(yōu)選的實施方案中，核酸序列編碼得自米曲霉IFO4177的膽色素原合酶，例如SEQ ID NO:1所描述的核酸序列。本發(fā)明也涉及編碼膽色素原合酶的核酸序列，該膽色素原合酶具有SEQ ID NO:2所描述的氨基酸序列，這種序列以其遺傳密碼的簡并而區(qū)別于SEQ ID NO:1中描述的氨基酸序列。本發(fā)明的核酸序列既包含本文中所描述的基因組序列及對應(yīng)的cDNA與RNA序列，也包含本文所使用的術(shù)語“核酸序列”(其在本文中將理解為包含包括合成DNA在內(nèi)的所有這類變體)。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明核酸片段的核酸構(gòu)建體。一般將“核酸構(gòu)建體”理解為意指一個單鏈或者雙鏈的核酸分子，該核酸分子從天然存在的基因中分離或者經(jīng)修飾而含有核酸的片段，這種核酸片段以實際上并不存在的方式組合和并列。在一優(yōu)選的實施方案中，將該核酸構(gòu)建體與能夠指導(dǎo)膽色素原合酶在合適表達(dá)宿主中表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)可操作地連接。
本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組載體。在一較優(yōu)選的實施方案中，將核酸序列可操作地連接于啟動子序列上。在另一較優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的載體還包含轉(zhuǎn)錄終止信號和/或選擇性標(biāo)記。
本發(fā)明的重組載體有益于以活性形式表達(dá)曲霉屬膽色素原合酶基因。有用的載體包含一元件(使載體能夠穩(wěn)定整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組或者使載體能夠獨立于宿主細(xì)胞基因組在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制)以及優(yōu)選的是包含一或多個表型標(biāo)記(使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞易于選擇)。載體也可以包括控制序列(如啟動子)、核糖體結(jié)合位點、翻譯起始信號以及選擇性地包括可選擇性標(biāo)記或各種激活物或阻抑序列。為了使所表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠分泌，可將編碼信號序列的核酸插入該基因的編碼序列之前。對于控制序列指導(dǎo)下的表達(dá)，以一定方法使將要按照本發(fā)明使用的膽色素原合酶基因可操作地連接于控制序列上，通過這一方法可在與控制序列相容的條件下完成對編碼序列的表達(dá)。
攜帶本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的載體可以是便于經(jīng)受重組DNA過程的任何載體。對載體的選擇典型地取決于載體將要引入其中的宿主細(xì)胞。載體可以是能夠進(jìn)行自我復(fù)制的載體(即作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或者人工染色體?？蛇x擇地，載體可以是這樣一種載體，當(dāng)將它引入宿主細(xì)胞時，其被整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組并與其已整合進(jìn)入的染色體一道復(fù)制。載體系統(tǒng)可以是單個載體或質(zhì)粒，或者是兩個或多個載體或質(zhì)粒(共同包含將要整合進(jìn)入基因組的整個DNA)。
在載體中，DNA序列應(yīng)該可操作地連接于合適的啟動子序列上。啟動子可以是任何在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并且其可以得自編碼宿主細(xì)胞的同源或者異源蛋白質(zhì)的基因。用于指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的例子(尤其是在細(xì)菌宿主中)是大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因dagA啟動子、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)啟動子、枯草芽孢桿菌xylA和xtlB基因啟動子、原核β-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，美國國家科學(xué)院院報75:3727-3731)或者tac啟動子(DeBoer等，1983，美國國家科學(xué)院院報80:21-25)。另外一些啟動子描述在以下文獻(xiàn)中“來自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”，美國科學(xué)。1980,242:74-94；和Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約，1989。在酵母宿主中，有用啟動子是eno-l啟動子。對于在真菌宿主中的轉(zhuǎn)錄，有用啟動子的例子是得自編碼以下蛋白質(zhì)的基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或者泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或者構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。優(yōu)選的啟動子是TAKA淀粉酶、NA2-tpi以及glaA啟動子。
本發(fā)明的載體也可以包含合適的轉(zhuǎn)錄終止子和在真核細(xì)胞中與編碼本發(fā)明膽色素原合酶的DNA序列可操作地連接的聚腺苷酸化序列。終止子和聚腺苷酸化序列與啟動子具有相同的來源。載體還可包含能夠使載體在所討論的宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的DNA序列。這種序列的例子有質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1以及pIJ702的復(fù)制起點。
優(yōu)選的本發(fā)明載體含有一個或多個便于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是一種基因，其產(chǎn)物具有殺生物劑抗性或病毒抗性、對重金屬的抗性和從原養(yǎng)型變?yōu)闋I養(yǎng)缺陷型及其類似情況。選擇性標(biāo)記可選自但不限于由以下物質(zhì)組成的組中amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC、bar和hygB。優(yōu)選用于曲霉細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或者米曲霉的amdS和pyrG標(biāo)記以及吸水鏈霉菌的bar標(biāo)記。此外，可通過共轉(zhuǎn)化作用完成選擇，例如正如在WO91/17243中所描述的一樣(其中選擇性標(biāo)記包含在一單個載體中)。
本發(fā)明的優(yōu)選載體也包含信號肽編碼區(qū)，其編碼與血紅素生物合成酶的氨基末端連接的氨基酸序列，從而使膽色素原合酶得以定位于特定的細(xì)胞區(qū)室。信號肽編碼區(qū)可以天然地存在于編碼膽色素原合酶的第一核酸序列中或者得自外源。第一核酸序列的編碼序列的5’端可以固有地包含信號肽編碼區(qū)，其在翻譯讀框中自然地與編碼定位的膽色素原合酶的編碼區(qū)的片段連接。此外，編碼序列的5’端可包含編碼信號肽編碼區(qū)的核酸，該信號肽編碼區(qū)對于編碼定位的膽色素原合酶的編碼序列的部分來說是屬于外源的。信號肽編碼區(qū)可得自粗糙脈孢菌ATP酶基因(Viebrock等，1982,EMBO雜志1:565-571)或者釀酒酵母細(xì)胞色素C過氧化物酶基因(Kaput等，1982，生物化學(xué)雜志257:15054-15058)。然而，能夠使5-乙酰丙氨酸合酶定位于選擇的絲狀真菌宿主中的任何信號肽編碼區(qū)都可用于本發(fā)明。
為了避免破壞細(xì)胞來獲得所表達(dá)的膽色素原合酶的必要性，以及最大限度地減少細(xì)胞內(nèi)的所表達(dá)的膽色素原合酶的可能降解的量，優(yōu)選的是膽色素原合酶基因的表達(dá)產(chǎn)生細(xì)胞外分泌的產(chǎn)物。就這一目的而言，本發(fā)明的膽色素原合酶可因此包含使所表達(dá)的蛋白質(zhì)得以分泌到培養(yǎng)基中的前區(qū)。如果需要，這一前區(qū)可以天然存在于本發(fā)明的膽色素原合酶中或者為不同的前區(qū)或信號序列所取代(方便地由編碼各自前區(qū)的DNA序列的取代來完成)。例如，前區(qū)可得自葡糖淀粉酶或曲霉物種的淀粉酶基因、芽孢桿菌物種的淀粉酶基因、Rhizomucor miehei的脂肪酶或蛋白酶基因、釀酒酵母的α-因子基因或小牛前凝乳酶原基因。更優(yōu)選的是米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、芽孢桿菌NCIB 11837的產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶或者地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的前區(qū)。真菌宿主的有效信號序列是米曲霉TAKA淀粉酶信號、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶信號或者Rhizomucor miehei脂肪酶信號。
對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，用于連接本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、啟動子、終止子和其它元件的方法以及把這些元件插入包含必要復(fù)制信息的合適載體中的方法都是已知的(例如，參見Sambrook等，見上)。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或者表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，這些核酸構(gòu)建體或者表達(dá)載體有益地用于本發(fā)明膽色素原合酶的重組產(chǎn)生過程。細(xì)胞可經(jīng)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，該核酸構(gòu)建體方便地整合進(jìn)入宿主染色體中。一般視該整合作用為優(yōu)點，因為該序列更可能穩(wěn)定地存在于細(xì)胞中。例如通過同源或異源重組，按照常規(guī)方法可完成構(gòu)建體進(jìn)入宿主染色體的整合?；蛘呒?xì)胞可由如下描述的表達(dá)載體(與不同類型宿主細(xì)胞關(guān)連的)轉(zhuǎn)化。
宿主細(xì)胞和載體的選擇在很大程度上取決于膽色素原合酶和它的來源。宿主細(xì)胞可從原核細(xì)胞中選擇，如細(xì)菌細(xì)胞。合適的細(xì)菌例子是格蘭氏陽性細(xì)菌、諸如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿性芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌、鼠灰鏈霉菌或者格蘭氏陰性細(xì)菌(如大腸桿菌)。通過例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或者通過以本領(lǐng)域已知的方式利用感受態(tài)細(xì)胞，可以實現(xiàn)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化。
宿主細(xì)胞優(yōu)選如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞的真核細(xì)胞，或者優(yōu)選包括酵母和絲狀真菌的真菌細(xì)胞。例如，有用的哺乳動物細(xì)胞包括CHO或者COS細(xì)胞。酵母宿主細(xì)胞可選自酵母屬或裂殖酵母屬的物種，例如釀酒酵母。有用的絲狀真菌可選自曲霉屬的物種，例如米曲霉或黑曲霉。此外，鐮刀菌屬物種的菌株(如尖鐮孢或禾谷鐮孢)可以用作為宿主細(xì)胞。真菌細(xì)胞可由包括利用本領(lǐng)域已知方式的原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生在內(nèi)的方法來轉(zhuǎn)化。曲霉宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的合適方法已在EP 238 023中進(jìn)行了描述。鐮刀菌屬物種轉(zhuǎn)化的合適方法由Malardier等，1989，基因78:147-156描述或者描述在共同懸而未決的美國系列號08/269,449中。
在一特別優(yōu)選的實施方案中，膽色素原合酶基因的表達(dá)在真菌宿主細(xì)胞(如曲霉)中完成。將膽色素原合酶基因連接到優(yōu)選包含米曲霉TAKA淀粉酶啟動子或者黑曲霉中性淀粉酶NA2啟動子和amdS或pyrG作為選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒中。此外，選擇性標(biāo)記可以在一單個質(zhì)粒上并用于共轉(zhuǎn)化中。按照Yelton等，1984，美國國家科學(xué)院院報81:1470-1474中所描述的方法，質(zhì)粒用來轉(zhuǎn)化如米曲霉或者黑曲霉的曲霉屬物種宿主細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的膽色素原合酶的方法，該方法包括(a)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)曲霉菌株以產(chǎn)生膽色素原合酶，以及(b)回收膽色素原合酶。
本發(fā)明也涉及重組產(chǎn)生本發(fā)明的膽色素原合酶的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含在有助于酶生成的條件下編碼膽色素原合酶的核酸序列，以及(b)回收膽色素原合酶。如果表達(dá)系統(tǒng)分泌膽色素原合酶進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收該酶。如果沒有分泌重組膽色素原合酶，則從細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中回收膽色素原合酶。
可利用本領(lǐng)域已知的任何培養(yǎng)細(xì)胞方法實現(xiàn)對本發(fā)明膽色素原合酶的表達(dá)或者分離。例如，可將培養(yǎng)過程理解為包含搖瓶培養(yǎng)、在實驗室或者工業(yè)發(fā)酵罐中在合適培養(yǎng)基中和在一定條件(使該膽色素原合酶得以表達(dá)和分離)下完成的小或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)的、成批的、分批補(bǔ)料的或固態(tài)的發(fā)酵)。利用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基(包含碳和氮源及無機(jī)鹽)中進(jìn)行培養(yǎng)(參見，例如Bennett,J.W.和LaSure,L.編輯，真菌中的多基因操縱，科學(xué)院出版社，加拿大，1991)。合適的培養(yǎng)基可由商家提供或者按照公開的組成(例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。
由包括但不限于離心、過濾、噴霧干燥、蒸發(fā)或者沉淀的常規(guī)方法，可從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收用上述方法產(chǎn)生的膽色素原合酶。然后由例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和性層析或者類似方法的各種層析方法可以進(jìn)一步純化所回收的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及利用膽色素原合酶的方法。
通過在宿主細(xì)胞中超表達(dá)編碼膽色素原合酶的核酸序列，本發(fā)明的膽色素原合酶可用來增加由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的血紅素蛋白的產(chǎn)率，其中的膽色素原合酶在宿主細(xì)胞中血紅素產(chǎn)生過程中是一限速步驟。該方法包括(a)引入到宿主細(xì)胞中，該宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生血紅素蛋白、一或多個編碼膽色素原合酶的核酸序列拷貝，其中的核酸序列可操作地連接到能夠指導(dǎo)膽色素原合酶表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)上；
(b)在適合于產(chǎn)生血紅素蛋白和膽色素原合酶的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞；以及(c)從上述細(xì)胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收血紅素蛋白。
下列例子進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些例子并不構(gòu)成限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1米曲霉菌株A1560基因組DNA提取在32℃和250rpm條件下使米曲霉菌株A1560(IFO 4177)在25ml的0.5％酵母提取液-2％葡萄糖(YEG)培養(yǎng)基中生長24小時。然后由通過Miracloth(Calbiochem,La Jolla，加拿大)的過濾收集菌絲體，并用25ml的10mM Tris-1mM EDTA(TE)緩沖液洗滌一次。從菌絲體中排出過量緩沖液，隨后將菌絲體凍結(jié)于液氮中。在電動咖啡研磨機(jī)上將凍結(jié)的菌絲體研磨成精細(xì)粉末，并將粉末加入在一次性塑料離心管中的20ml TE緩沖液和5ml的20％w/v十二烷基硫酸鈉(SDS)中。和緩地倒轉(zhuǎn)混合物幾次以確?；旌暇鶆颍孟嗤w積的苯酚氯仿異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)混合液提取兩次。加入乙酸鈉(3M溶液)至終濃度為0.3M，其后加入2.5倍體積的用冰預(yù)冷的乙醇來沉淀核酸。然后通過在15,000xg下離心該管30分鐘使核酸成粒狀沉淀。在重懸浮于0.5ml的TE緩沖液中之前，使粒狀沉淀風(fēng)干30分鐘。加入無DNA酶的核糖核酸酶A至濃度為100μg/ml并在37℃條件下溫育混合物30分鐘。然后加入濃度為200μg/ml的蛋白酶K并在37℃條件下再溫育混合物一小時。最后，在如前述的用乙酸鈉和乙醇沉淀DNA之前，用苯酚氯仿異戊醇(25∶24∶1 v/v/v)提取混合物兩次。使DNA粒狀沉淀在真空下干燥、重懸浮于TE緩沖液中、并在4℃條件下保存直到進(jìn)一步利用。實施例2通過PCR的基因組hemB探針的產(chǎn)生基于側(cè)接米曲霉126bp hemB片段的氨基酸序列(Jesper Vind,1994，博士論文，丹麥，哥本哈根，哥本哈根大學(xué))以及酵母和人hemB克隆的同源區(qū)(Myers等，1987，生物化學(xué)雜志262:16822-16829；Wetmur等，1986，美國國家科學(xué)院院報83:7703-7707)，設(shè)計簡并PCR引物。寡核苷酸引物利用應(yīng)用生物系統(tǒng)394型DNA/RNA合成儀合成。將有義5′-GT(AGCT)GC(AGCT)CC(AGCT)(AT)(CG)(AGCT)GA(CT)ATGATGGA-3′(SEQ ID NO:3)和反義5′-GC(AG)TC(AGCT)CG/T(AG)AA(AGCT)CC(AG)TA-3′(SEQ ID NO:4)引物用于利用pJVi60(Vind,1994，見上)作為模板來PCR擴(kuò)增hemB片段。PCR反應(yīng)物(50μl)由10 mM Tris-HCl pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01％w/v明膠，各200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP,500ng的pJVi60以及50pmol的上述各PCR引物組成。上述反應(yīng)物在95℃下溫育3分鐘并冷卻至80℃。然后加入5個單位的Taq聚合酶。在設(shè)定為35個循環(huán)的Perkin-Elmer 9600熱循環(huán)儀中溫育該反應(yīng)物，其中每一循環(huán)為95℃下30秒、45℃下1分鐘及72℃下1分鐘。在最后一循環(huán)后接著在72℃條件下溫育反應(yīng)物5分鐘。預(yù)計的126bphemB PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)入pCRⅡ載體，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pAJ005-1(圖1)。實施例3米曲霉菌株A1560 DNA文庫和膽色素原合酶(hemB)克隆的鑒定利用作為宿主(用于平板培養(yǎng)和純化重組噬菌體)的大腸桿菌Y1090ZL細(xì)胞和用于切除個體pZL1-hemA克隆的大腸桿菌DH10Bzip，按照廠商的指導(dǎo)利用噬菌體克隆載體λZipLox(生命技術(shù)，Gaithersburg,MD)來構(gòu)建米曲霉菌株A1560基因組DNA文庫。用Tsp509I部分地消化以如實施例1中描述的方法制備的全部細(xì)胞DNA，并用50mM Tris-50mM硼酸鹽-1mM乙二胺四乙酸二鈉(TBE)緩沖液在1％瓊脂糖凝膠上對其進(jìn)行大小分級分離。切除在4-7kb大小范圍內(nèi)遷移的DNA片段，并利用Prep-a-Gene試劑(BioRad實驗室，Hercules,加拿大)將其從凝膠上洗脫。將洗脫的DNA片段與EcoRⅠ切割的并脫磷酸的λZipLox載體臂連接，利用商業(yè)包裝提取物(Stratagene,La Jolla,加拿大)把連接混合物包裝起來。在大腸桿菌Y1090ZL細(xì)胞中平板培養(yǎng)和擴(kuò)增包裝的DNA文庫。未擴(kuò)增的基因組文庫包含1×106pfu/ml。
將得自大約8×104噬斑的噬菌體DNA轉(zhuǎn)移以復(fù)制環(huán)狀Nytran Plus膜(Schleicher & Schuell,Keene,NH)，并用32P標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行探測，該PCR產(chǎn)物按照Mertz和Rashtchian(1994，分析生物化學(xué)221:160-165)的方法通過擴(kuò)增pAJ005-1的hemB片段(參見例2)而得到。擴(kuò)增反應(yīng)物(50μl)包含下列組分10mM Tris-HCl pH8.3,50mMKCl,1.5mM MgCl2,0.01％(w/v)明膠，各0.04mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP,5μl的32P-dCTP(3000Ci/mmole,3.3μM；Amersham,Arlington Heigths,IL)以及各50pmole的有義引物5’-GTGGCTCCGAGTGATAT-3’(SEQ ID NO:5)和反義引物5’-GCATCGCGAAAAGGACCG-3’(SEQ ID NO:6)。將反應(yīng)物加熱到95℃并保持3分鐘，隨后加入5個單位的Taq聚合酶。然后在設(shè)定為30個循環(huán)的Perkin-Elmer熱循環(huán)儀中溫育該反應(yīng)物，其中每一循環(huán)為95℃下1分鐘，55℃下1分鐘以及72℃下1分鐘。使反應(yīng)溶液通過葡聚糖凝膠G50柱(Pharmacia,Alameda，加拿大)以除去未摻入的核苷酸，隨后使其變性并將其加入到雜交緩沖液中。在雜交緩沖液中加入變性探針(106cpm/ml)，并用預(yù)雜交膜溫育一夜。在5×SSC,50mM磷酸鈉pH7,5×Denhardt溶液，0.1％(w/v)SDS,5mM EDTA pH8,10μg/mL變性鮭精DNA以及50％甲酰胺中，在42℃條件下進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。在42℃的0.1×SSC,0.1％SDS溶液中將膜洗滌四次(共15分鐘)。第二次篩選給出陽性信號的主要噬斑，并按照廠商的指導(dǎo)對其進(jìn)行純化。按照廠商的指導(dǎo)(Bethesda研究實驗室，Inc.,Bethesda,MD)從作為pZL衍生物的λZipLox載體中切除產(chǎn)生陽性信號的10個基因組克隆，以及按照Hattori及Sakaki的方法(1986，分析生物化學(xué)152:232-237)測序。指定pZL衍生物為pAJ007-1直至pAJ007-10。大腸桿菌DH5αpAJ007-6克隆包含基于限制酶切圖的3.7kb的基因組片段，并且對它進(jìn)行了進(jìn)一步分析。實施例4膽色素原合酶(hemB)基因的表征按照實施例2所描述的方法對實施例2所描述的大腸桿菌DH5αpAJ007-6進(jìn)行了DNA測序。
克隆的米曲霉A1560 hemB基因的核苷酸序列顯示出如圖2(SEQ IDNO:1)所示的1308核苷酸的開放讀框，該開放讀框編碼如圖2(SEQ IDNO:2)所示的具有40kDa預(yù)計分子量的374氨基酸多肽。上述核苷酸序列包含一個由剪接位點共有序列側(cè)連的48bp推定內(nèi)含子，并包含由有關(guān)文獻(xiàn)(Unkles,1992，絲狀真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)，第2章，J.R.Kinghorn和G.Turner，編輯，Blackie Academic and ProfessionalPublications)所預(yù)計的內(nèi)部共有序列。3’剪接位點(TAG)定位于Met下游的254 bp處，5’剪接位點(GTCCGC)定位于3’剪接位點上游的46bp處，內(nèi)部共有序列(TCTAAC)定位于5’剪接位點下游的30bp處。5’非翻譯區(qū)在-377和-233位包含兩個CAAT基元，其可在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要的作用(Gurr等，1987，見上)。另外，在3’非翻譯區(qū)(-117、-208、-650)發(fā)現(xiàn)幾個推定的TATA樣盒。正如所料，hemB在N未端似乎并不包含前導(dǎo)序列，這是由于它在除植物以外的其它有機(jī)體中屬于胞質(zhì)所致(Bottemley和Muller-Eberhard,1988，血液學(xué)報告25:282-302)。
圖3中顯示的是米曲霉hemB基因(SEQ ID NO:2)與其它hemB基因的氨基酸序列對比。來自酵母(SEQ ID NO:17；Myers等，1987,見上)、人(SEQ ID NO:18；Wetmur等，1986，見上)、大鼠(SEQ IDNO:19；Bishop等，1989，核酸研究14:10115)和大腸桿菌(SEQ IDNO:20；Li等，2989，基因75:177-184)的推定hemB氨基酸序列分別有63％、55％、55％和40％完全等同于米曲霉hemB氨基酸序列。來自豌豆(SEQ ID NO:21；Bsese等，1991，生物化學(xué)的雜志266:17060-17066)、枯草芽孢桿菌(SEQ ID NO:22；Hansson等，1991，細(xì)菌學(xué)雜志173:2590-2599)和菠菜(SEQ ID NO:23；Scharmburg和Schneider-Poetsch,1991,EMBL數(shù)據(jù)文庫)的推定hemB氨基酸序列具有較小的相似度(分別為40％、39％和33％的等同性)。然而，由于豌豆和菠菜hemB氨基酸序列含有N端葉綠體信號序列，如果將它們作為成熟多肽進(jìn)行對比，那么它們與米曲霉hemB序列的相似性將明顯增加?；谶@些序列對比，米曲霉hemB的活性賴氨酸位點定位在299氨基酸處(Jaffe,1995，生物能和生物膜雜志27:169-179)，并且如Berg(1986，自然319:264-265)所預(yù)測的保守鋅指樣結(jié)構(gòu)域定位于氨基酸166-180處。有人認(rèn)為鋅指通過結(jié)合Zn2+而在活性部位阻止巰基的氧化(Jaffe,1995，見上)。有人提出在植物hemB中的對應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合Mg2+而非Zn2+(Bsese等，1991，見上)。令人感興趣的是，hemB指結(jié)構(gòu)域的第一個殘基是Thr(在位置166)，其對于植物金屬結(jié)合域中的這一位置來說是保守的。然而，hemB鋅指結(jié)構(gòu)域中的其余位置都是保守的。實施例5pAJ023的構(gòu)建通過PCR擴(kuò)增米曲霉hemB編碼區(qū)并將其亞克隆到米曲霉表達(dá)載體pBANE6中來構(gòu)建質(zhì)粒pAJ023(圖4)。設(shè)計擴(kuò)增產(chǎn)物以包含5’SwaⅠ和3’PacⅠ限制位點，從而有利于其克隆到pBANe6中。擴(kuò)增反應(yīng)物(50μl)包含下列組分10mM Tris-HCl pH8.3,50mM KCl,1.5mM,MgCl2,0.01％(w/v)明膠，各200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP,200ng的pAJ007-6 DNA以及如下所示的各50pmol的PCR引物PBG10(有義)5’-GCATATTTAAATGATGTCCTTTTCTAATCTCGT-3’(SEQ ID NO:7)PBGⅠ1A(反義)5’-ATATTAATTAATCCATCTAGCTAAATCATT-3’(SEQ ID NO:8)PBG10和PBG11A的劃線區(qū)分別包含克隆限制序列SwaⅠ與PacⅠ。在95℃下溫育反應(yīng)物3分鐘并冷卻至80℃。加入五個單位的PWO(BM)聚合酶。在設(shè)定為30個循環(huán)的Perkin-Elmer9600熱循環(huán)儀中溫育反應(yīng)物，其中每一循環(huán)為95℃下30秒、57℃下1分鐘以及72℃下1分鐘。在最后一循環(huán)后，接著在72℃下溫育反應(yīng)物5分鐘。凝膠純化最后的PCR產(chǎn)物，用SwaⅠ和PacⅠ消化其，并將其連接到用SwaⅠ和PacⅠ消化的載體pBANE6中以產(chǎn)生pAJ023。實施例6米曲霉菌株JRoC50.3.18A的構(gòu)建以如下方法構(gòu)建包含質(zhì)粒pJRoC50的米曲霉菌株JRoC50.3.18A。利用基于長根鬼傘過氧化物酶(Baunsgaard等，1993，歐洲生物化學(xué)雜志213:605-611)的氨基酸序列構(gòu)建的、如下所示(Saiki等，1988，科學(xué)239:487-491)的特異性寡核苷酸引物，由PCR制備灰蓋鬼傘IFO8371過氧化物酶cDNA片段1.5’-GCGCGAATTCGTNGGNATNGGNATNAA(CT)CA(CT)GG-3’(SEQ ID NO:9)2.3’-TACAGNTT(GA)AC(GA)GGNGGCCTAGGCG-5’(SEQ ID NO:10)3.5′-GCGAATTCACNCCNCA(GA)GTNTT(CT)GA(CT)AC-3’(SEQID NO:11)4.3′-GGNAA(GA)GGNCCNCT(CT)AA(GA)CCTAGGCG-5’(SEQ IDNO:12)5.5′-GCGCGAATTCTGGCA(GA)TCNAC-3′(SEQ ID NO:13)6.5′-GCGCGAATTCTGGCA(GA)AGNATG-3′(SEQ ID NO:14)7.3′-CGNTACCGNTT(CT)TACAGCCTAGG-5′(SEQ ID NO:15)利用Gene Amp Kit與儀器(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)，按照廠商的指導(dǎo)完成PCR，例外情況是在28℃下進(jìn)行反應(yīng)的前三個循環(huán)以便獲得與第一條鏈cDNA(由得自灰蓋鬼傘菌株IFO 8371的mRNA制備)的更好雜交，隨后在65℃下進(jìn)行的30個PCR循環(huán)。
引物的結(jié)合情況如下1和2、3和4、5和7、6和7、1和4以及3和7。用5’端EcoRⅠ位點和3’端BamHⅠ位點伸展PCR片段。在1％瓊脂糖-TBE凝膠上分析反應(yīng)物，在所有的反應(yīng)中均發(fā)現(xiàn)所需大小的DNA帶。為了檢驗對應(yīng)于過氧化物酶特異性序列的DNA帶，對凝膠進(jìn)行Southern印跡，并使之與包含如下序列(位于引物3和4之間)的寡核苷酸探針雜交5’-GT(CT)TC(GA)AT(GA)TAGAA(CT)TG-3’(SEQ ID NO:16)發(fā)現(xiàn)探針與大約130bp、420bp、540bp以及240bp的帶雜交，由此確認(rèn)觀察到的DNA帶對應(yīng)于過氧化物酶序列。
用EcoRⅠ和BamHⅠ消化得自各種PCR反應(yīng)的DNA，并將其克隆到質(zhì)粒pUC19(新英格蘭生物實驗室，Beverly,MA)中。利用上述的寡核苷酸探針(SEQ ID NO:16)通過雜交來鑒定包含正確PCR片段的菌落。通過限制性酶切圖和如Sanger等(1977，美國國家科學(xué)院院報74:5463-5467)所描述的部分DNA序列分析來分析得自陽性菌落的DNA。來自克隆體(通過利用引物1和4獲得的)之一的430bp片段用于篩選如下所述的灰蓋鬼傘cDNA文庫。
從勻化的灰蓋鬼傘菌株IFO 8371菌絲體中提取整個RNA，并按照Boel等(1984,EMBO雜志3:1097-1102)和Chirgwin等(1979，生物化學(xué)18:5294-5299)所描述的方法在過氧化物酶活性最大時收集該RNA。在Aviv和Leder(1972，美國國家科學(xué)院院報69:1408-1412)所描述的在低聚(dT)-纖維素上，通過兩個循環(huán)的親和層析獲得包含Poly(A)的RNA。按照廠商的指導(dǎo)利用cDNA合成試劑盒(Invitrogen,San Diego，加拿大)來合成cDNA。將來源于灰蓋鬼傘cDNA文庫的大約50,000個大腸桿菌重組體轉(zhuǎn)移到Whatman 540濾紙上。如Gerger等所描述的(1979，核酸研究7:2115-2135)一樣，裂解和固定上述菌落。在0.2×SSC-0.1％SDS中使濾膜與用32P-標(biāo)記的430bp過氧化物酶特異性探針雜交。在65℃下進(jìn)行濾膜的雜交和洗滌，其后用增感屏使之放射自顯影24小時。放射自顯影之后，在不斷升高的溫度下洗滌濾膜，而后用增感屏使之放射自顯影24小時。按照這一方法，可鑒定超過50個陽性菌落。利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Birnboim和Doly,1979，核酸研究7:1513-1523)把小量制備質(zhì)粒DNA與雜交菌落分離，并利用Sanger的雙脫氧方法(Sanger等，1977，美國國家科學(xué)院院報74:5463-5467)確定cDNA插入片段的DNA序列。選擇上述菌落之一，并指定該載體為pCiP。通過利用BamHⅠ/XhoⅠ的切割來從該載體上切除過氧化物酶cDNA片段，并由瓊脂糖凝膠電泳純化其，電洗脫之并準(zhǔn)備用于連接反應(yīng)。cDNA片段連接到BamHⅠ/XhoⅠ消化的pHD414上從而產(chǎn)生pJVi9，其中的cDNA處于米曲霉的TAKA啟動子和如圖5中所示的黑曲霉的AMGTM(NovoNordisk A/S,Bagsvard，丹麥)終止子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
從質(zhì)粒pJVi9上切除編碼灰蓋鬼傘過氧化物酶的cDNA作為BamHⅠ/XhoⅠ片段，并將其克隆到質(zhì)粒pJeRS6(圖6)中從而產(chǎn)生質(zhì)粒pJRoC50(圖7)，質(zhì)粒pJRoC50包含作為選擇性標(biāo)記的pyrG、TAKA啟動子及amdS終止子。
利用5μg的純化質(zhì)粒pJRoC50(如下所述)通過如下修改，制備米曲霉菌株HowB425轉(zhuǎn)化體。省略瓊脂覆蓋，并將原生質(zhì)體直接平板接種在基本培養(yǎng)基平板上。在每ml 2×107原生質(zhì)體的濃度下用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將100μ1原生質(zhì)體與5μgDNA在冰上放置30分鐘。加入1ml的SPTC(40％PEG4000,0.8M山梨醇，0.05M Tris pH8.0,0.05MCaCl2)，并在34℃下培養(yǎng)原生質(zhì)體20分鐘。將轉(zhuǎn)化物直接接種在包含基本培養(yǎng)基的平板上。每升基本培養(yǎng)基(pH6.5)由6g NaNO3、0.52g KCl、1.52g KH2PO4、1ml痕量金屬、1g葡萄糖、500mg MgSO4-7H2O、342.3g蔗糖以及20g純凈瓊脂組成。每升痕量金屬溶液(1000X)由22gZnSO4-7H2O、11g H3BO3、5g MnCl2-4H2O、5g FeSO4-7H2O、1.6g CoCl2-5H2O、1.6g(NH4)6Mo7O24以及50g Na4EDTA組成。在34℃下溫育平板5-7天。將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到相同培養(yǎng)基的平板上并在37℃下培養(yǎng)3-5天。
利用下列酶分析方法測定66個轉(zhuǎn)化體的過氧化物酶活性將180μl底物緩沖液{20ml 0.1M磷酸鉀-0.01 Tween-80 pH7.0,250μl 2,2’-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)(ABTS)溶液(22mg/ml)以及2μl的30％過氧化氫}加至20μl的以1∶900比例稀釋的培養(yǎng)物上清液中，隨后迅速利用Molecular Devices Thermomax Microplate Reader(Molecular Devices,Sunnyvale，加拿大)在25℃下測定其在405nm處的吸光度。在伴隨混合的2分鐘時間內(nèi)每10秒記錄一次測定結(jié)果，并用SOFT max程序(Molecular Devices,Sunnyvale，加拿大)計算Vmax值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(以已知量的灰蓋鬼傘過氧化物酶繪制的)作為標(biāo)準(zhǔn)來估算每ml中的過氧化物酶單位(POXU)。一個POXU的定義為30℃下每分鐘催化1.0μmole的0.88mM H2O2、1.67mM ABTS、0.1M磷酸鹽pH7.0轉(zhuǎn)化的酶量。在與上述相同的條件下利用相同的平板，通過劃線孢子和挑取分離的菌落來孢子純化表達(dá)最高水平的四個轉(zhuǎn)化體。
在搖瓶中進(jìn)行最終的評價，其中每一轉(zhuǎn)化體的大約5×106個孢子接種到25ml的MY25培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基包含1％酵母提取物、2.5％麥芽糖、0.2％尿素和1X MY鹽pH6.5。每升1X MY鹽由2g MgSO4-7H2O、2g K2PO4、10g KH2PO4、2g檸檬酸、0.5ml痕量金屬溶液、1ml 10％CaCl2-2H2O組成。每升痕量金屬溶液由13.9g FeSO4-7H2O、8.5g MnSO4-H2O、14.28g ZnSO4-7H2O、1.63g CuSO4、0.24gNiCl2-6H2O以及3.0g檸檬酸組成。加入氯高鐵血紅素(得自在50mMNaOH中制備的10mg/ml新鮮貯存物)至終濃度為0.01mg/ml。在34℃和200rpm條件下溫育搖瓶7-8天。指定最好的過氧化物酶產(chǎn)生者為JRoC50.3.18A。實施例7利用pAJ023的米曲霉JRoC50.3.18A的轉(zhuǎn)化為了確定米曲霉hemB基因的超表達(dá)是否增加過氧化物酶的產(chǎn)量，用pAJ023轉(zhuǎn)化米曲霉菌株JRoC50.3.18A。作為對照，pBANe6也用于轉(zhuǎn)化米曲霉JRoc50.3.18A。
在每ml 2×107原生質(zhì)體的濃度下用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在冰上將100μl原生質(zhì)體與10μg DNA、200μl60％PEG 4000-10mM HEPES-10mM CaCl2溶液一起溫育30分鐘。加入1ml的SPTC(40％PEG 4000、0.8M山梨醇、0.05M Tris pH8.0、0.05M CaCl2)，并在34℃下溫育原生質(zhì)體20分鐘。在接種到用于amdS轉(zhuǎn)化的COVE轉(zhuǎn)化平板(每升0.52g KCl、0.52g MgSO4-7H2O、1.52g KH2PO4、1ml如實施例6所描述的痕量金屬溶液、342.3g蔗糖、25g純凈瓊脂、10ml 1M乙酰胺以及10ml的3M CsCl)上之前，將0.25ml轉(zhuǎn)化物的等分試樣加至15ml COVE瓊脂覆蓋物(與COVE培養(yǎng)基+0.7％低熔點瓊脂相同)上。在室溫下溫育平板5-7天。將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到相同培養(yǎng)基的平板上，在37℃溫育3-5天。在相同條件下利用相同的平板通過劃線孢子和挑取分離的菌落來純化上述轉(zhuǎn)化體。實施例8hemB初級轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的過氧化物酶產(chǎn)量使總共20種米曲霉hemB轉(zhuǎn)化體和42種對照轉(zhuǎn)化體(有米曲霉表達(dá)載體而無米曲霉hemB的JRoC 50.3.18A的轉(zhuǎn)化體)在24個孔平板上生長，并如實施例6中所述的一樣分析其過氧化物酶產(chǎn)量。
過氧化物酶分析的結(jié)果顯示產(chǎn)生較高水平的過氧化物酶活性的轉(zhuǎn)化體相對于對照轉(zhuǎn)化體，在數(shù)量上無任何增加。
微生物保藏下列菌株按照布達(dá)佩斯條約保藏在美國農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)，北方研究實驗室，1815大學(xué)街，Peoria,Illinois61604，美國。菌株登記號 保藏日期大腸桿菌DH5α(pAJ007-6) NRRL B-215641996年4月22日在一定條件下存放菌株，該條件要確保在此專利申請的懸而未決期間對于由按照37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授權(quán)的專利與商標(biāo)委員所確定的人員來說可獲得培養(yǎng)物的使用權(quán)。保藏物表示每一種存放菌株的基本上純化的培養(yǎng)物。保藏物可按照提交主題申請或其子申請的國家的專利法要求而得到。然而，應(yīng)該理解保存物的可使用權(quán)并不包括許可侵犯政府授予的專利權(quán)而實施主題發(fā)明。
這里所描述的和所要求的本發(fā)明，并不限于這里所公開的具體實施方案范圍，由于這些實施方案旨在說明本發(fā)明的幾個方面。任何等同的實施方案都意欲包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。的確，除這里所描述和示例的修改方案之外，有關(guān)本發(fā)明的其他各種修改方案從以上描述看對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是很明顯的。這些修改方案也意欲包含在附屬的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
這里引用各種參考文獻(xiàn)，它們的公開內(nèi)容均與本文一并參考。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱Novo Nordisk生物技術(shù)公司(B)街道1445 Drew路(C)城市Davis，加利福尼亞(D)國家美利堅合眾國(E)郵編(ZIP):95616-4880(F)電話(916)757-8100(G)傳真(916)758-0317(ⅱ)發(fā)明名稱曲霉屬膽色素原合酶和編碼該酶的核酸(ⅲ)序列數(shù)23(ⅳ)通訊地址(A)收信人北美的Novo Nordisk,Inc.
(B)街道405 Lexington路(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家美國(F)郵編10174(ⅴ)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機(jī)可兼容的IBM(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ Windows 2.0版本(ⅶ)在先的申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?0/019,529(B)申請日10-JUN-1996(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息
(A)姓名Lambiris,Elias J.
(B)登記號33,728(C)證書號4809.204-WO(ⅸ)電訊信息(A)電話212-867-0123(B)傳真212-878-9655(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1807對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CTGGACCAAT GGTAACCCTC CGTAATTGCC TTACAGATTT AGCCCAGGGG GGTTATGGTA 60TCCTTGGGTA TTGAGGCCTG GAAATTTTTT TAGCCACCAG TTTACAGCCA GTTTCCGTTT 120GTAAATATTT CACATCCCCC GACCCTGTCC CAATACAATA ATTTTTTCGC TATATATAAC 180GCCCCTAGCG TTGTTTTATG ATCCTTAAAT CCTTACTTGT ACCTGAAAAT TGCAACAAAT 240GTACTGACCT GGATCGCTGG CCATTTATAT CATTGCCCTG CGAAGTCGTA TTCTGCCAGT 300GGCACAGGCG CTATTCTCTT TTCTTCCCTC CACCGCGTTT CTATCTTCCA TAGCACCCCA 360CTTGCTTGCC GCTCCTGTCA TTATGTCCTT TTCTAATCTC GTCTCTGACC TCGCCTTCAG 420AGATTCTCAT GATGACCGAA GTTCTCAGAT ATCTCAGGTA CAATCGCAAG CCACTGCACG 480ATCGTATACA AGCACAGCTG CCACAAGCGT CAGCATATCT GGCGACATCT CAAGCCAGCT 540TCATTCCGGT TACAGCCATC CACTGAGCCG ATCATGGCAG GCTGAAAGAC AGTTGACTAA 600AGTCCGCATT TTCTTTTGTA TTTACTGAGC TGCTCTAACC CCGAGATAGG AAATGCTTAT 660TTATCCTCTC TTCATCACCG ATAATCCCGA TGAGGAGACT CCTATCCCGT CTCTCCCTGG 720ACAGTATCGT CGAGGATTAA ACCGTCTAGT TCCTTTCATC AAACCACTTG CCCACAAGGG 780GCTACGCTCA GTCATCCTGT TTGGCGTCCC ACTACACCCC TCTGCGAAGG ATGCACTAGG 840TACCGCTGCA GACGATCCAT CTGGACCGGT AATTCAAGCT ATTCGCTTGC TTAGGTCGCG 900GTTTCCTCAA CTTTATATCG TGACAGATGT GTGCCTTTGC GAGTATACTT CGCATGGCCA 960CTGTGGGATA CTGCGAGAAG ATGGGACTCT TGATAATACA CAGTCTGTGG ATCGGATTTC 1020GGATGTTGCT CTGGCTTATG CTGCCGCCGG AGCCCATTGT GTCGCTCCGT CTGATATGAA 1080TGATGGGCGA GTGCGTGCTA TAAAACTGAA GCTTATTGAA GCCGGGATGG CCCACCGTGT 1140CCTACTGATG TCCTACAGCG CCAAATTTAG CGGTTGTTTG TACGGCCCTT TCCGTGATGC 1200AGCGGGGTCC TGCCCATCAT TCGGGGATCG CAGATGCTAC CAGTTACCAC CCGGAGGCCG 1260TGGACTTGCT CGGCGCGCTA TACAGAGAGA TATAGGCGAA GGGGCAGACA TCATAATGGT 1320AAAGCCGGCG AGCAGCTACC TGGACATTAT CAGAGACGCA AAAGAAATTG CCAAAGACAT 1380TCCCATTGCT GCTTACCAGG TCAGCGGTGA GTATGCTATG ATACATGCTG GTGCCAAGGC 1440GGGCGTATTT GACTTGAAAT CCATGGCCTT TGAAAGTACT GAAGGGATTA TAAGGGCTGG 1500TGCTGGGATT ATAGTAAGCT ATTTCGTGCC TGATTTTCTA GATTGGCTTT CGAAATGATT 1560TAGCTAGATG GAGCGTGATG AAAGCATCCA CCAGATAAAT AGCAGTGACG ATCGCGTTTG 1620AATCATACCT ATTGGAGTAG AAGTCTCGGT ATCTCGTTGG GGATTCTCTA GGTTGCTTAT 1680TTAACGTAAT GCCACGCCAT GTGTTATATA TTGCCTAAAT ACTTTTATAA AAGATACACC 1740AAGCTGATGG TGCCAAGTGA CCACTTCTAA TAAATACAAT TATACCAATT CCTCCGAAAT 1800ATGCGGG 1807(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度375個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Ser Phe Ser Asn Leu Val Ser Asp Leu Ala Phe Arg Asp Ser His1 5 10 15Asp Asp Arg Ser Ser Gln Ile Ser Gln Val Gln Ser Gln Ala Thr Ala20 25 30Arg Ser Tyr Thr Ser Thr Ala Ala Thr Ser Val Ser Ile Ser Gly Asp35 40 45Ile Ser Ser Gln Leu His Ser Gly Tyr Ser His Pro Leu Ser Arg Ser50 55 60Trp Gln Ala Glu Arg Gln Leu Thr Lys Glu Met Leu Ile Tyr Pro Leu65 70 75 80Phe Ile Thr Asp Asn Pro Asp Glu Glu Thr Pro Ile Pro Ser Leu Pro85 90 95Gly Gln Tyr Arg Arg GLy Leu Asn Arg Lau Val Pro Phe Ile Lys Pro100 105 110Leu Ala His Lys Gly Leu Arg Ser Val Ile Leu Phe Gly Val Pro Leu115 120 125His Pro Ser Ala Lys Asp Ala Leu Gly Thr Ala Ala Asp Asp Pro Ser130 135 140Gly Pro Val Ile Gln Ala Ile Arg Leu Leu Arg Ser Arg Phe Pro Gln145 150 155 160Leu Tyr Ile Val Thr Asp Val Cys Leu Cys Glu Tyr Thr Ser His Gly165 170 175His Cys Gly Ile Leu Arg Glu Asp Gly Thr Leu Asp Asn Thr Gln Ser180 185 190Val Asp Arg Ile Ser Asp Val Ala Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Ala195 200 205His Cys Val Ala Pro Ser Asp Met Asn Asp Gly Arg Val Arg Ala Ile210 215 220Lys Leu Lys Leu Ile Glu Ala Gly Met Ala His Arg Val Leu Leu Met225 230 235 240Ser Tyr Ser Ala Lys Phe Ser Gly Cys Leu Tyr Gly Pro Phe Arg Asp245 250 255Ala Ala Gly Ser Cys Pro Ser Phe Gly Asp Arg Arg Cys Tyr Gln Leu260 265 270Pro Pro Gly Gly Arg Gly Leu Ala Arg Arg Ala Ile Gln Arg Asp Ile275 280 285Gly Glu Gly Ala Asp Ile Ile Met Val Lys Pro Ala Ser Ser Tyr Leu290 295 300Asp Ile Ile Arg Asp Ala Lys Glu Ile Ala Lys Asp Ile Pro Ile Ala305 310 315 320Ala Tyr Gln Val Ser Gly Glu Tyr Ala Met Ile His Ala Gly Ala Lys325 330 335Ala Gly Val Phe Asp Leu Lys Ser Met Ala Phe Glu Ser Thr Glu Gly340 345 350Ile Ile Arg Ala Gly Ala Gly Ile Ile Val Ser Tyr Phe Val Pro Asp355 360 365Phe Leu Asp Trp Leu Ser Lys370 375(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GTNGCNCCNW SNGAYATGAT GGA 23(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GCRTCNCGTR AANCCRTA 18(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GTGGCTCCGA GTGATAT 17(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度18對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GCATCGCGAA AAGGACCG 18(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GCATATTTAA ATGATGTCCT TTTCTAATCT CGT 33(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:ATATTAATTA ATCCATCTAG CTAAATCATT 30(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:GCGCGAATTC GTNGGNATNG GNATNAAYCA YGG33(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:GCGGATCCGG NGGRCARTTN GACAT 25(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:GCGAATTCAC NCCNCARGTN TTYGAYAC 28(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:GCGGATCCRA AYTCNCCNGG RAANGG26(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21對堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:GCGCGAATTC TGGCARTCNA C 21(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:GCGCGAATTC TGGCARAGNA TG 22(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:GGATCCGACA TYTTNGCCAT NGC23(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17對堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:GTYTCRATRT AGAAYTG 17(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度342個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:Met His Thr Ala Glu Phe Leu Glu Thr Glu Pro Thr Glu Ile Ser Ser1 5 10 15Val Leu Ala Gly Gly Tyr ASh His Pro Leu Leu Arg Gln Trp Gln Ser20 25 30Glu Arg Gln Leu Thr Lys Asn Met Leu Ile Phe Pro Leu Phe Ile Ser35 40 45Asp Asn Pro Asp Asp Phe Thr Glu Ile Asp Ser Leu Pro Asn Ile Asn50 55 60Arg Ile Gly Val Asn Arg Leu Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Leu Val Ala65 70 75 80Lys Gly Leu Arg Ser Val Ile Leu Phe Gly Val Pro Leu Ile Pro Gly85 90 95Thr Lys Asp Pro Val 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Val Met Ser Asp Thr Cys Phe Cys Glu Tyr Thr Ser His Gly His115 120 125Cys Gly Val Leu Cys Glu His Gly Val Asp Asn Asp Ala Thr Leu Glu130 135 140Asn Leu Gly Lys Gln Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Phe145 150 155 160Ile Ala Pro Ser Ala Ala Met Asp Gly Gln Val Gln Ala Ile Arg Gln165 170 175Ala Leu Asp Ala Ala Gly Phe Lys Asp Thr Ala Ile Met Ser Tyr Ser180 185 190Thr Lys Phe Ala Ser Ser Phe Tyr Gly Pro Phe Arg Glu Ala Ala Gly195 200 205Ser Ala Leu Lys Gly Asp Arg Lys Ser Tyr Gln Met Asn Pro Met Asn210 215 220Arg Ala Glu Gly Ile Ala Glu Tyr Leu Leu Asp Glu Ala Gln Gly Ala225 230 235 240Asp Cys Leu Met Val Lys Pro Ala Gly Ala Tyr Leu Asp Ile Val Arg245 250 255Glu Leu Arg Glu Arg Thr Glu Leu Pro Ile Gly Ala Tyr Gln Val Ser260 265 270Gly Glu Tyr Ala Met Ile Lys Phe Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Asp275 280 285Glu Glu Lys Val Val Leu Glu Ser Leu Gly Ser Ile Lys Arg Ala Gly290 295 300Ala Asp Leu Ile Phe Ser Tyr Phe Ala Leu Asp Leu Ala Glu Lys Lys305 310 315 320Ile Leu Arg(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度398個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:His Thr Phe Val Asp Leu Lys Ser Pro Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Leu1 5 10 15Ser Phe Ser Ser Ser Lys Arg Arg Gln Pro Pro Ser Leu Phe Thr Val20 25 30Arg Ala Ser Asp Ser Asp Phe Glu Ala Ala Val Val Ala Gly Lys Val35 40 45Pro Glu Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Pro Ala Ser Pro Ala Gly Thr50 55 60Pro Val Val Pro Ser Leu Pro Ile Gln Arg Arg Pro Arg Arg Asn Arg65 70 75 80Arg Ser Pro Ala Leu Arg Ser Ala Phe Gln Glu Thr Thr Leu Ser Pro85 90 95Ala Asn Phe Val Tyr Pro Leu Phe Ile His Glu Gly Glu Glu Asp Thr100 105 110Pro Ile Gly Ala Met Pro Gly Cys Tyr Arg Leu Gly Trp Arg His Gly115 120 125Leu Leu Glu Glu Val Ala Lys Ala Arg Asp Val Gly Val Asn Ser Val130 135 140Val Leu Phe Pro Lys Ile Pro Asp Ala Leu Lys Thr Pro Thr Gly Asp145 150 155 160Glu Ala Tyr Asn Glu Asp Gly Leu Val Pro Arg Ser Ile Arg Leu Leu165 170 175Lys Asp Lys Tyr Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Thr Asp Val Ala Leu Asp180 185 190Pro Tyr Ser Ser Asp Gly His Asp Gly Ile Val Arg Glu Asp Gly Val195 200 205Ile Met Asn Asp Glu Thr Val His Gln Leu Cys Lys Gln Ala Val Ala210 215 220Gln Ala Arg Ala Gly Ala Asp Val Val Ser Pro Ser Asp Met Met Asp225 230 235 240Gly Arg Val Gly Ala Met Arg Val Ala Leu Asp Ala Glu Gly Phe Gln245 250 255His Val Ser Ile Met Ser Tyr Thr Ala Lys Tyr Ala Ser Ser Phe Tyr260 265 270Gly Pro Phe Arg Glu Ala Leu Asp Ser Asn Pro Arg Phe Gly Asp Lys275 280 285Lys Thr Tyr Gln Met Asn Pro Ala Asn Tyr Arg Glu Ala Leu Thr Glu290 295 300Met Arg Glu Asp Glu Ser Glu Gly Ala Asp Ile Leu Leu Val Lys Pro305 310 315 320Gly Leu Pro Tyr Leu Asp Ile Ile Arg Leu Leu Arg Asp Asn Ser Pro325 330 335Leu Pro Ile Ala Ala Tyr Gln Val Ser Gly Glu Tyr Ser Met Ile Lys340 345 350Ala Gly Gly Ala Leu Lys Met Ile Asp Glu Glu Lys Val Met Met Glu355 360 365Ser Leu Leu Cys Leu Arg Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ile Leu Thr Tyr370 375 380Phe Ala Leu Gln Ala Ala Arg Thr Leu Cys Gly Glu Lys Arg385 390 395(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度323個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Met Ser Gln Ser Phe Asn Arg His Arg Arg Leu Arg Thr Ser Lys Ala1 5 10 15Met Arg Glu Met Val Lys Glu Thr Arg Leu His Pro Ser Asp Phe Ile20 25 30Tyr Pro Ile Phe Val Val Glu Gly Leu Glu Gly Lys Lys Ala Val Pro35 40 45Ser Met Pro Asp Val His His Val Ser Leu Asp Leu Leu Lys Asp Glu50 55 60Val Ala Glu Leu Val Lys Leu Gly Ile Gln Ser Val Ile Val Phe Gly65 70 75 80Ile Pro Glu Glu Lys Asp Asp Cys Gly Thr Gln Ala Tyr His Asp His85 90 95Gly Ile Val Gln Lys Ala Ile Thr Glu Ile Lys Glu His Phe Pro Glu100 105 110Met Val Val Val Ala Asp Thr Cys Leu Cys Glu Tyr Thr Asp His Gly115 120 125His Cys Gly Leu Val Lys Asp Gly Val Ile Leu Asn Asp Glu Ser Leu130 135 140Glu Leu Leu Ala Gln Thr Ala Val Ser Gln Ala Lys Ala Giy Ala Asp145 150 155 160Ile Ile Ala Pro Ser Asn Met Met Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Arg165 170 175Glu Ala Leu Asp Lys Glu Gly Phe Val Asn Ile Pro Ile Met Ser Tyr180 185 190Ala Val Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Tyr Gly Pro Phe Arg Asp Ala Ala195 200 205Asn Ser Thr Pro Gln Phe Gly Asp Arg Lys Thr Tyr Gln Met Asp Pro210 215 220Ala Asn Arg Met Glu Ala Leu Arg Glu Ala Gln Ser Asp Val Glu Glu225 230 235 240Gly Ala Asp Phe Leu Ile Val Lys Pro Ser Leu Ser Tyr Met Asp Ile245 250 255Met Arg Asp Val Lys Asn Glu Phe Thr Leu Pro Leu Val Ala Tyr Val260 265 270Ser Gly Glu Tyr Ser Met Val Lys Ala Ala Ala Gln Asn Gly Trp Ile275 280 285Lys Glu Lys Glu Ile Val Leu Glu Ile Leu Thr Ser Met Lys Arg Ala290 295 300Gly Ala Asp Leu Ile Ile Thr Tyr His Ala Lys Asp Ala Ala Lys Trp305 310 315 320Leu Ala Glu(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征
(A)長度424個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型無(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:Met Met Ala Ser Thr Phe Asn Ile Pro Cys Asn Ala Gly Thr Ile Lys1 5 10 15Asn Phe Asn Asn Ser Gln Arg Asn Leu Gly Phe Ser Ser Asn Leu Gly20 25 30Ile Asn Phe Ala Lys Thr Arg Phe Ser Asn Cys Gly Asp Ser Gly Arg35 40 45Ile Pro Ser Gln Leu Val Val Arg Ala Ser Glu Arg Arg Asp Asn Leu50 55 60Thr Gln Gln Lys Thr Gly Leu Ser Ile Glu Glu Cys Glu Ala Ala Val65 70 75 80Val Ala Gly Asn Ala Pro Ser Ala Pro Pro Val Pro Pro Thr Pro Lys85 90 95Ala Pro Ser Gly Thr Pro Ser Val Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Arg100 105 110Pro Arg Arg Ash Arg Thr Ser Pro Val Phe Arg Ala Ala Phe Gln Glu115 120 125Thr Thr Leu Ser Pro Ala Asn Val Val Tyr Pro Leu Phe Ile His Glu130 135 140Gly Glu Glu Asp Thr Pro Ile Gly Ala Met Pro Gly Cys Tyr Arg Leu145 150 155 160Gly Trp Arg His Gly Leu Val Glu Glu Val Ala Lys Ala Arg Asp Val165 170 175Val Val Asn Ser Ile Val Val Phe Pro Lys Pro Asp Ala Leu Lys Ser180 185 190Pro Thr Gly Asp Glu Ala Tyr Asn Glu Asn Gly Leu Val Pro Arg Thr195 200 205Ile Arg Met Leu Lys Asp Lys Phe Pro Asp Leu Ile Ile Tyr Thr Asp210 215 220Val Ala Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Asp Gly His Asp Gly Ile Val Thr225 230 235 240Gln His Gly Val Ile Met Asn Asp Glu Thr Val His Gln Leu Cys Lys245 250 255Gln Ala Val Ala Gln Ala Arg Ala Gly Ala Asp Val Val Ser Pro Ser260 265 270Asp Met Met Asp Gly Arg Val Gly Ala Ile Arg Ala Ala Leu Asp Ala275 280 285Glu Gly Tyr Ser Asn Val Ser Ile Met Ser Tyr Thr Ala Lys Tyr Ala290 295 300Ser Ser Phe Tyr Pro Arg Phe Gly Asp Lys Lys Thr Tyr Gln Met Asn305 310 315 320Pro Ala Asn Tyr Arg Glu Ala Leu Ile Glu Thr Gln Glu Asp Glu Ser325 330 335Glu Gly Ala Asp Ile Leu Leu Val Lys Pro Gly Leu Pro Tyr Leu Asp340 345 350Ile Ile Arg Leu Leu Arg Asp Asn Ser Asp Leu Pro Ile Ala Ala Tyr355 360 365Gln Val Ser Gly Glu Tyr Ser Met Ile Lys Ala Gly Gly Val Leu Lys370 375 380Met Ile Asp Glu Glu Lys Val Met Leu Glu Ser Leu Leu Cys Leu Arg385 390 395 400Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ile Leu Thr Tyr Phe Ala Leu Gln Ala Ala405 410 415Arg Cys Leu Cys Gly Glu Lys Arg420
權(quán)利要求
1．一種基本上純化的膽色素原合酶，該酶(a)得自一種曲霉菌株；(b)具有一個氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO:2所描述的氨基酸序列有至少50％同源性；或者(c)為一個核酸序列所編碼，該核酸序列能夠在高度嚴(yán)格條件下與一種探針進(jìn)行雜交，該探針在所說的條件下與SEQ ID NO:1所描述的核酸序列雜交。
2．按照權(quán)利要求1的膽色素原合酶，該膽色素原合酶得自一種米曲霉菌株。
3．按照權(quán)利要求2的膽色素原合酶，該膽色素原合酶得自米曲霉IFO4177或其突變體菌株。
4．按照權(quán)利要求1的膽色素原合酶，該膽色素原合酶具有與SEQ IDNO:2所描述的氨基酸序列有至少50％、優(yōu)選為至少60％、更優(yōu)選為至少70％、更優(yōu)選為至少80％、以及最優(yōu)選為至少90％的同源性的一個氨基酸序列。
5．按照權(quán)利要求4的膽色素原合酶，該酶具有SEQ ID NO:2所描述的氨基酸序列。
6．按照權(quán)利要求1的膽色素原合酶，該酶為一個核酸序列所編碼，該核酸序列能夠在高度嚴(yán)格條件下與一種探針進(jìn)行雜交，該探針在所說的條件下與SEQ ID NO:1所描述的核酸序列雜交。
7．一種分離的核酸片段，該核酸片段包含編碼權(quán)利要求1的膽色素原合酶的核酸序列。
8．按照權(quán)利要求7的核酸片段，其中的核酸序列編碼得自米曲霉的膽色素原合酶。
9．按照權(quán)利要求8的核酸片段，其中的核酸序列編碼得自米曲霉IFO4177的膽色素原合酶。
10．按照權(quán)利要求9的核酸片段，其中的核酸序列描述在SEQ IDNO:1中。
11．按照權(quán)利要求7的核酸片段，該核酸片段包含編碼膽色素原合酶的核酸序列，該膽色素原合酶具有與SEQ ID NO:2所描述的氨基酸序列有至少50％、優(yōu)選為至少60％、更優(yōu)選為至少70％、更優(yōu)選為至少80％、以及最優(yōu)選為至少90％的同源性的一個氨基酸序列。
12．按照權(quán)利要求7的核酸片段，該核酸片段能夠在高度嚴(yán)格條件下與一種探針進(jìn)行雜交，該探針在所說的條件下與SEQ ID NO:1所描述的核酸序列雜交。
13．一種包含權(quán)利要求7的核酸片段的核酸構(gòu)建體，該核酸片段可操作地連接到能夠指導(dǎo)上述膽色素原合酶在合適的表達(dá)宿主中表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)上。
14．一種包含權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體的重組載體。
15．按照權(quán)利要求14的載體，其中的核酸序列可操作地連接到一個啟動子序列上。
16．按照權(quán)利要求15的載體，該載體還包含一個轉(zhuǎn)錄終止信號。
17．按照權(quán)利要求15的載體，該載體還包含一個選擇性標(biāo)記。
18．一種包含權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
19．按照權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中的核酸構(gòu)建體包含在一個載體上。
20．按照權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
21．按照權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中的宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
22．按照權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中的真菌細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。
23．按照權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，其中的絲狀真菌細(xì)胞是頂孢霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、毀絲霉屬、毛霉屬、脈孢菌屬、青霉菌屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或者木霉屬物種的細(xì)胞。
24．按照權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中的真菌細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
25．按照權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，其中的酵母細(xì)胞是酵母屬或者裂殖酵母屬的菌株。
26．按照權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中的核酸構(gòu)建體被整合到宿主細(xì)胞基因組中。
27．一種產(chǎn)生權(quán)利要求1的膽色素原合酶的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)曲霉屬菌株以產(chǎn)生膽色素原合酶；以及(b)回收膽色素原合酶。
28．一種產(chǎn)生權(quán)利要求1的膽色素原合酶的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含在有助于膽色素原合酶表達(dá)的條件下編碼膽色素原合酶的核酸序列；以及(b)回收膽色素原合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及曲霉屬膽色素原合酶和包含核酸序列的分離核酸片段,所說的核酸序列編碼該膽色素原合酶,也編碼核酸構(gòu)建體、載體和包含該核酸序列的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明也涉及到產(chǎn)生膽色素原合酶的方法。
文檔編號C12N9/10GK1221455SQ97195374
公開日1999年6月30日 申請日期1997年6月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月10日
發(fā)明者A·瓊斯, J·R·查瑞 申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術(shù)有限公司