專利名稱：通過改變海藻糖－6－磷酸的水平來調(diào)節(jié)代謝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
糖酵解是在文獻(xiàn)中用生化詳細(xì)描述的第一批代謝過程之一。盡管已知碳水化合物在生物體中的一般流動(dòng)，盡管糖酵解途徑中所有的酶都已得到闡明，但通過刺激糖酵解來決定代謝誘導(dǎo)的信號(hào)還未闡明。已提出了幾個(gè)尤其是依據(jù)酵母中的情況的假說，但沒有一個(gè)得到毫無疑問的證實(shí)。
對(duì)碳水化合物分配方向的影響不僅直接影響糖酵解和碳水化合物儲(chǔ)存的細(xì)胞過程，而且也被用于影響繼發(fā)性的或衍生的過程例如細(xì)胞分裂、生物量的產(chǎn)生和儲(chǔ)存化合物的積累，因而決定生長和生產(chǎn)能力。
尤其在植物中，碳水化合物的存在經(jīng)常直接影響一個(gè)組織的特性，碳水化合物分配的方向能產(chǎn)生重要的差別。
植物的生長、發(fā)育和產(chǎn)量取決于這種植物在光合作用過程中能從CO2固定衍化而來的能量。光合作用主要發(fā)生在葉內(nèi)，較次一些程度的光合作用發(fā)生在莖中，而其它植物組織如根、種子或塊莖對(duì)光同化作用基本上沒有貢獻(xiàn)。這些組織的生長和營養(yǎng)完全依靠光合作用活躍的組織。這就意味著有一個(gè)從光合作用衍化而來的產(chǎn)物(共同稱為光合產(chǎn)物)到植物光合作用不活躍部位的流動(dòng)。
光合作用活躍的部分命名為“源”，它們定義為光合產(chǎn)物的凈輸出者。光合作用不活躍的部分命名為“池”，它們被定義為光合產(chǎn)物的凈輸入者。
假定光合作用的效率和碳水化合物的分配在一個(gè)植物內(nèi)都是必需的。新生長的組織如新葉或其它部分如根和種子完全依賴于源內(nèi)的光合作用。影響碳水化合物分配的可能性會(huì)對(duì)一個(gè)植物的形態(tài)有很大影響，例如它的高度、結(jié)間距、葉的大小和形狀以及根系統(tǒng)的大小和結(jié)構(gòu)。
此外，光同化作用產(chǎn)物的分配對(duì)于植物生物量和產(chǎn)物的產(chǎn)量很重要。一個(gè)例子是上個(gè)世紀(jì)中小麥的培育。它的光合能力沒有顯著的的變化，但小麥產(chǎn)量卻大大增加，即收獲指數(shù)(可收獲生物量/總生物量的比率)增加。根本的原因是通過傳統(tǒng)育種改變了池對(duì)源的比率，使可收獲的池，即種子部分增加。然而調(diào)節(jié)光同化作用產(chǎn)物的分配以及相應(yīng)的源和池形成的機(jī)制還未知。此機(jī)制被認(rèn)為位于碳水化合物代謝途徑和其調(diào)節(jié)中的某一位置。在最近的研究中，明確了己糖激酶可以在代謝信號(hào)傳遞和代謝流動(dòng)的控制中起很重要的作用。已推定了許多調(diào)節(jié)己糖激酶活性的機(jī)制(Graham等人(1994)，植物細(xì)胞(The Plant Cell)6:761；Jang & Sheen(1994)，植物細(xì)胞6,1665；Rose等人，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)199,511-518,1991；Blazquez等人,(1993),FEBS 329,51；Koch,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant.Mol.Biol.(1996)47,509；Jang等人，(1997)，植物細(xì)胞9,5。這些己糖激酶調(diào)節(jié)理論中推定在酵母中的一個(gè)提到了海藻糖及其相關(guān)單糖(Thevelein和Hohmann(1995),TIBS 20,3)。然而，因?yàn)楹Ｔ逄堑暮铣杀徽J(rèn)為限定于某些種類，很難看出這是一個(gè)廣泛的機(jī)制。
因此，仍需要闡明引導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞、組織和器官的組成和/或發(fā)育改變的信號(hào)。
發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過導(dǎo)入海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)和/或海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)從而在海藻糖-6-磷酸(T-6-P)的代謝途徑上誘導(dǎo)一個(gè)改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)T-6-P可得量的改變，就有可能在體內(nèi)改變細(xì)胞、組織和器官的發(fā)育和/或組成。導(dǎo)入TPS從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)T-6-P濃度的增加，這引起糖酵解方向碳流的抑制、光合作用的促進(jìn)、生長的抑制、池相關(guān)活性的促進(jìn)和資源儲(chǔ)存的增加。導(dǎo)入TPP從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)T-6-P濃度的降低，這引起糖酵解方向碳流的促進(jìn)、生物量的增加和光合作用活性的降低。通過用一種能影響T-6-P水平的基因構(gòu)建體對(duì)生物進(jìn)行基因工程改造或外源性地(口服地、局部地、非腸道地等)補(bǔ)充能影響這些水平的化合物均可以影響T-6-P的水平?？捎糜诖税l(fā)明的基因構(gòu)建體是包含磷酸海藻糖合成酶(TPS)基因的構(gòu)建體，此酶能催化從葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖變成T-6-P的反應(yīng)。另一方面，一種編碼催化從T-6-P至海藻糖反應(yīng)的磷酸海藻糖磷酸酶(TPP)的構(gòu)建體，一旦表達(dá)，可降低T-6-P的產(chǎn)量。
另一方面，含有反義TPS或TPP的基因構(gòu)建體也能用于調(diào)節(jié)T-6-P的細(xì)胞內(nèi)可得量。
此外，最近已報(bào)道一種來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的細(xì)胞內(nèi)磷酸-α-(1,1)-葡糖苷酶(TreA)，其能將T-6-P水解成葡萄糖和葡萄糖6-磷酸(Schock等人，基因，170,77-88,1996)。對(duì)于大腸桿菌已描述了一個(gè)類似的酶(Rimmele和Boos(1996)，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bact.)176(18),5654-)。
為了過量表達(dá)，不得不使用異源或同源基因構(gòu)建體。一般認(rèn)為內(nèi)源性T-6-P形成和/或降解酶受變構(gòu)調(diào)節(jié)和受共價(jià)修飾的調(diào)節(jié)。通過使用異源基因可以避開這種調(diào)節(jié)。
另一方面，異源或同源基因的突變也可以用于消除調(diào)節(jié)。
本發(fā)明也提供了在植物中改變?cè)?池關(guān)系和資源分配的能力。植物的整個(gè)碳系統(tǒng)，包括源組織內(nèi)同化生產(chǎn)和源組織內(nèi)的使用都可以被改變，這可以導(dǎo)致收獲產(chǎn)品生物量的增加。通過此方法，可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)能力增加以及收獲指數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量的改善。源組織中的這些變化例如通過光合酶輸出的增加能導(dǎo)致池組織中的變化。反之，池組織中的改變也能導(dǎo)致源組織中的改變。
在一種細(xì)胞器、組織或一種生物的其它部位中的特異性表達(dá)使得上述提到的一般效應(yīng)定向于特定局部應(yīng)用。通過將編碼TPS、TPP的基因或TPS、TPP的反義基因置于特異性啟動(dòng)子的控制下，可以建立這種特異性表達(dá)。特異性表達(dá)使不同的組織中能同時(shí)表達(dá)TPS和TPP酶，因而局部地增加T-6-P的水平和降低T-6-P的水平。
通過使用特異性啟動(dòng)子也可能建立一個(gè)時(shí)間的差異。為了此目的可以使用在植物各個(gè)部位的組織發(fā)生的特定時(shí)期中有特異活性的啟動(dòng)子。這樣就有可能首先影響將要發(fā)育的器官的量，然后使這些器官充滿儲(chǔ)存物質(zhì)如淀粉、油或蛋白質(zhì)。
另一方面，可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也可以用于選擇性地開啟或關(guān)閉本發(fā)明基因的表達(dá)。通過例如病原體、應(yīng)激反應(yīng)、化學(xué)制劑、或光/黑暗刺激可以實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)。
定義-己糖激酶活性是在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的酶的活性，其催化己糖至己糖-6-磷酸的反應(yīng)。己糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖或任何其它C6糖。已知有許多同功酶都能在所述生化反應(yīng)中起作用。通過催化此反應(yīng)，己糖激酶在己糖(葡萄糖)信號(hào)傳遞中構(gòu)成一個(gè)關(guān)鍵酶。-己糖信號(hào)傳遞是調(diào)節(jié)機(jī)制，通過它使細(xì)胞感受到己糖(葡萄糖)的可得量。-糖酵解是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸并伴隨有ATP產(chǎn)生的反應(yīng)。-冷甜化是馬鈴薯塊莖收獲后在低溫儲(chǔ)存時(shí)可溶性糖的積累。-資源材料的儲(chǔ)存是這樣的過程，其中主要產(chǎn)物葡萄糖被代謝成適于在細(xì)胞中或在一特定組織中儲(chǔ)存的分子形式。這些形式可以不同。在植物界中，儲(chǔ)存大多以碳水化合物和多聚碳水化合物如淀粉、果聚糖和纖維素，或以更簡單的單-和二糖象果糖、蔗糖和麥芽糖的形式發(fā)生；以油的形式如花生(arachic)油或油酸(oleic)油和以蛋白質(zhì)的形式例如十字花素(cruciferin)、napin和油菜種子中的種子儲(chǔ)存蛋白。在動(dòng)物細(xì)胞中也形成多聚碳水化合物例如糖原，但也有大量富含能量的碳化合物轉(zhuǎn)化為脂肪和脂質(zhì)。-生物量是生物材料的總量。


圖1質(zhì)粒pVDH275的圖解說明，其帶有兩側(cè)連接35S花椰菜花葉病病毒啟動(dòng)子(P35S)和終止子(T35S)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTⅡ)作為選擇性標(biāo)記；帶有一個(gè)含有豌豆質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(pPCpea)和胭脂堿合成酶終止子(Tnos)的表達(dá)盒；帶有右(RB)和左(LB)T-DNA邊緣序列和一個(gè)細(xì)菌卡那霉素抗性(kanR)標(biāo)記基因。圖2轉(zhuǎn)基因煙草植物的Northern雜交分析。組A表示在pMOG799轉(zhuǎn)基因煙草植物葉子中otsA mRNA的表達(dá)。對(duì)照組“C”含有來自未轉(zhuǎn)化的煙草植物(N.tabacum)的總RNA。圖3使用Wisconsin GCG序列分析包(Devereux等人(1984)Acomprehensive set of sequence analysis programs of the VAX.核酸研究(Nucl.Acids Res.),12,387)與TPSyeast序列比較植物來源的TPS編碼序列直列圖。分別編碼擬南芥屬(Arabidopsis)和水稻(Rice)TPS酶的TPSatal 3/56、142 TPSrice3(SEQ ID NO:53)和RiceTPS源自EST數(shù)據(jù)庫序列。分別編碼向日葵(Sunflower)和卷柏屬(Selaginella)TPS酶的TPSsun10,TPSse143,(SEQ ID NO:44)和TPSse18(SEQ ID NO:42)源自由PCR技術(shù)分離的序列(見實(shí)施例3)。圖4PCR擴(kuò)增的煙草TPS cDNA片段與編碼酵母TPS1基因的TPS的序列比較。方框表示所有四個(gè)所列序列之間的氨基酸相同。圖5PCR擴(kuò)增的煙草TPP cDNA片段與編碼酵母TPS2基因的TPP的序列比較。方框表示所有四個(gè)所列序列之間的氨基酸相同。圖6PCR擴(kuò)增的向日葵TPS/TPP兩分cDNA(SEQ ID NO:24)片段與編碼酵母TPS2基因的TPP的序列比較。方框表示兩個(gè)序列之間的氨基酸相同。圖7擬南芥屬TPS1和水稻EST克隆的片段與編碼酵母TPS1基因的TPS的序列比較。方框表示全部三個(gè)序列之間的氨基酸相同。圖8PCR擴(kuò)增的人TPS cDNA片段(SEQ ID NO:10)與編碼酵母TPS1基因TPS的序列比較。方框表示兩個(gè)序列之間的氨基酸相同。圖9在pMDG1027(35S反義海藻糖酶)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物塊莖中海藻糖的積累。圖10加和不加海藻糖-6-磷酸的野生型馬鈴薯(Solanum tuberosum cv.Kardal)塊莖抽提液的己糖激酶活性。圖11加和不加海藻糖-6-磷酸的野生型馬鈴薯塊莖抽提液的己糖激酶活性。果糖或葡萄糖用作檢測底物。圖12加和不加海藻糖-6-磷酸的野生型煙草葉(Nicotiana tabacum cv.SR1)抽提液的己糖激酶活性。果糖或葡萄糖用作檢測底物。圖13煙草己糖激酶活性測量的曲線圖。數(shù)據(jù)系列1煙草植物抽提液數(shù)據(jù)系列2煙草植物抽提液+1mM海藻糖-6-磷酸數(shù)據(jù)系列3來源于酵母的商業(yè)化己糖激酶抽提液(1/8單位)圖14加和不加海藻糖-6-磷酸的野生型水稻葉(Oryza sativa)抽提液的己糖激酶活性。使用不同量的抽提液重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。果糖或葡萄糖用作檢測底物。圖15加和不加海藻糖-6-磷酸的野生型玉米葉(Zea mais)抽提液的己糖激酶活性。果糖和葡萄糖用作檢測底物。圖16野生型(三角)、PC-TPS(四方形)和35S-TPP(叉)煙草葉的熒光特征。上兩組表明在標(biāo)明的光強(qiáng)度(PAR)下的電子傳遞效率(ETE)。測量經(jīng)過黑暗時(shí)期后(左上組)和經(jīng)過光照時(shí)期后(右上組)的植物。下端兩組表示由于同化產(chǎn)物積累(非光化學(xué)淬滅)造成的熒光下降。左和右組同前。圖17PC-TPS(饑餓)和35S-TPP(足養(yǎng))轉(zhuǎn)基因煙草植物的各個(gè)植物部位的相對(duì)池活性。表明的是不同植物部分經(jīng)過光(D)或光+黑暗(D+N)后以總碳含量的百分比表示的凈碳積累。圖18PC-TPS(饑餓)和35S-TPP(足養(yǎng))轉(zhuǎn)基因煙草植物的各個(gè)植物部分的碳的實(shí)際分布。表明的是不同植物部分經(jīng)過光(D)或光+黑暗(D+N)后以總?cè)辗e累的新碳百分比表示的凈碳積累。圖19與野生型植物相比在表達(dá)PC-TPS或PC-TPP的轉(zhuǎn)基因萵苣植物中減少或增加的抽苔。下面的圖表示葉的形態(tài)和顏色。圖20在轉(zhuǎn)基因萵苣(上方圖)和轉(zhuǎn)基因甜菜(下方圖)品系的抽提液中可溶糖的情況(圖20/1)。上圖中是與PC-TPS和PC-TPP轉(zhuǎn)基因品系相比較的對(duì)照GUS-轉(zhuǎn)基因品系。下圖中所有的轉(zhuǎn)基因都是PC-TPS。淀粉的情況在圖20/2中描述。圖21與野生型植物(對(duì)照)相比，表達(dá)PC-TPS(TPS)或PC-TPP(TPP)的轉(zhuǎn)基因甜菜品系的植物和葉的形態(tài)。TPS A-型的葉與野生型類似，而TPS D-型的葉明顯更小。與對(duì)照相比，TPP轉(zhuǎn)基因品系的葉子的綠色更淡，柄更大且尺寸增加。圖22轉(zhuǎn)基因甜菜品系(PC-TPS)的主根直徑。上方圖中A、B、C和D表示與對(duì)照(A)相比葉尺寸下降。下方圖中顯示了對(duì)照和PC-TPS品系286-2的各個(gè)克隆。圖23 pMOG799(35S TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的塊莖產(chǎn)量。圖24 pMOG1010(35S TPP)和pMOG1124(PC-TPP)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的塊莖產(chǎn)量。圖25 22株獨(dú)立的0生型馬鈴薯(S.tuberosum)克隆的塊莖產(chǎn)量。圖26 pMOG1093(PC-TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系與野生型相比的塊莖產(chǎn)量。B、C、D、E、F、G表示與野生型(B/C)相比下降的葉尺寸。圖27與野生型(圖27-2)相比，pMOG845(Pat-TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的塊莖產(chǎn)量。B、C表示葉尺寸。圖28 pMOG1129(845-11/21/28)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的塊莖產(chǎn)量。圖29 TPP(下方圖)和TPS(上方圖)轉(zhuǎn)基因煙草植物葉的橫切面。在TPS橫切面上可見增加的細(xì)胞層和增加的細(xì)胞大小。圖30 4℃儲(chǔ)存之前和儲(chǔ)存之后TPSEcoli轉(zhuǎn)基因品系塊莖的HPLC-PED分析，馬鈴薯C、F、B、G和H是未轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌废?。圖31 35S TPS轉(zhuǎn)基因煙草(上方葉)、野生型(中間葉)和35S TPP轉(zhuǎn)基因煙草(下方葉)葉的形態(tài)、顏色和大小。圖32 35S TPS(pMOG799)、35S TPP(pMOG1010)、野生型(WT)PC-TPS(pMOG1177)和PC-TPP(pMOG1124)轉(zhuǎn)基因煙草品系代謝情況。表示的是海藻糖、可溶性糖(圖32-1)、淀粉和葉綠素(圖32-2)的水平。圖33與野生型馬鈴薯品系相比pMOG1027(35S反義海藻糖酶(as-海藻糖酶))和pMOG1027(845-11/22/28)(35S反義海藻糖酶Pat TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系塊莖產(chǎn)量。圖34與野生型馬鈴薯品系相比pMOG1027(35S反義海藻糖酶)和pMOG1027(845-11/22/28)(35S反義海藻糖酶Pat TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的淀粉含量。在此描述的所有品系的順序與圖33相同。圖35與野生型馬鈴薯品系相比pMOG1028(Pat反義海藻糖酶)和pMOG1028(845-11/22/28)(Pat反義海藻糖酶Pat TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的產(chǎn)量。圖36與圖35中所描述的野生型馬鈴薯品系相比pMOG1092(PC反義海藻糖酶)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的產(chǎn)量。圖37與圖35中所描述的野生型馬鈴薯品系相比pMOG1130(PC反義海藻糖酶PC TPS)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品系的產(chǎn)量。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過T-6-P的水平在體內(nèi)改變代謝的研究結(jié)果。T-6-P細(xì)胞內(nèi)濃度的降低促進(jìn)糖酵解的活性。相反，T-6-P濃度的增加將抑制糖酵解的活性并促進(jìn)光合作用。
通過T-6-P水平變化而建立的這些改變最有可能是己糖激酶信號(hào)傳遞作用的結(jié)果，已知己糖激酶的活性受T-6-P調(diào)節(jié)。已證實(shí)在通過參與葡萄糖-6-磷酸反應(yīng)的己糖激酶的流量增加(即葡萄糖量的增加)可抑制植物中光合活性。此外，通過己糖激酶流量的增加不僅促進(jìn)糖酵解，而且也促進(jìn)細(xì)胞分裂活性。
海藻糖-6-磷酸調(diào)節(jié)碳代謝的理論在一個(gè)正常的植物細(xì)胞中，碳水化合物的形成發(fā)生在光合作用的過程中，其中CO2被固定且被還原為磷酸化的己糖，終產(chǎn)物為蔗糖。一般情況下，這些蔗糖被從細(xì)胞外運(yùn)至細(xì)胞或組織中，這些細(xì)胞或組織通過吸收這些蔗糖能將碳水化合物用作它們代謝的材料或能將碳水化合物儲(chǔ)存為如淀粉。在此方面，在植物中，能夠進(jìn)行光合作用因而能產(chǎn)生碳水化合物的細(xì)胞被命名為源，而消耗或儲(chǔ)存碳水化合物的細(xì)胞被稱為池。
在動(dòng)物和大多數(shù)微生物細(xì)胞中，無光合作用發(fā)生，碳水化合物不得不從外源獲取，通過從糖中直接吸收(如酵母和其它微生物)或者通過碳水化合物的消化(動(dòng)物)。碳水化合物的運(yùn)輸在這些生物體中經(jīng)常以葡萄糖的形式發(fā)生，其中葡萄糖經(jīng)過主動(dòng)運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜。
進(jìn)入細(xì)胞后，代謝途徑中第一個(gè)步驟之一是由己糖激酶催化將葡萄糖磷酸化為葡萄糖6-磷酸。已表明在植物中被己糖激酶(HXK)磷酸化的糖控制著參與光合作用的基因的表達(dá)(Jang & Sheen(1994)，植物細(xì)胞6，1665)。因此已提出HXK也許有雙重功能，可以做為碳水化合物介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵感受器和信號(hào)遞質(zhì)。認(rèn)為這種調(diào)節(jié)通常就起始產(chǎn)物即葡萄糖的可得量向細(xì)胞發(fā)出信號(hào)。通過導(dǎo)入影響T-6-P水平的TPS或TPP可以觀察到類似的效果。此外，已表明體外T-6-P的水平影響己糖激酶的活性。通過增加T-6-P的水平，細(xì)胞接收到存在碳水化合物輸入短缺的信號(hào)。相反，T-6-P水平的下降則產(chǎn)生存在充足葡萄糖的信號(hào)，因而導(dǎo)致光合作用的下調(diào)。它表明用于糖酵解的底物以及隨后用于細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂過程的能量供應(yīng)是充分可得的。認(rèn)為這個(gè)信號(hào)傳遞由通過己糖激酶的流量增加所起始(J.J.Van Oosten,在Rijks Universiteit Utrecht的公開演講，4月19日，1996)。
通過調(diào)節(jié)海藻糖-6-磷酸水平的調(diào)節(jié)植物中己糖激酶信號(hào)傳遞的理論暗示所有植物都需要存在著能產(chǎn)生和分解海藻糖-6-磷酸信號(hào)分子的酶系統(tǒng)。盡管海藻糖在真菌、細(xì)菌、酵母和藻類以及一些無脊椎動(dòng)物的多種種類中普遍存在，但推測只有非常有限范圍的維管植物被能合成此糖(Elbein(1974),Adv.Carboh.Chem.Biochem.30,227)。一個(gè)至今仍無法理解的現(xiàn)象是盡管明顯缺少海藻糖合成酶，但所有植物確實(shí)含有海藻糖酶，此酶能將海藻糖分解為兩個(gè)葡萄糖分子。
通過此處所述的用海藻糖酶抑制劑如有效霉素A或用反義海藻糖酶轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)可以獲得存在海藻糖代謝途徑的間接證據(jù)。
如果海藻糖中間產(chǎn)物T-6-P過度影響代謝活性，其產(chǎn)生將會(huì)受阻。優(yōu)選的，為了積累高水平的海藻糖而不影響通過海藻糖-6-磷酸作用的代謝產(chǎn)物的分配，需要過量表達(dá)一個(gè)兩分TPS/TPP酶。這個(gè)酶與在酵母中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)遺傳結(jié)構(gòu)相類似，當(dāng)與大腸桿菌OtsA和OstB基因相比較時(shí)，TPS2基因產(chǎn)物帶有一個(gè)TPS和TPP同源區(qū)域(Kaasen等人，(1994)，基因(Gene)145,9)。使用此酶時(shí)，海藻糖-6-磷酸不能被其它細(xì)胞組分所自由獲得。Zentella和Iturriaga(植物生理(Plant physiol.)(1996),111摘要88)給出了另一個(gè)兩分酶的例子，他們從卷柏(Selaginellalepidophylla)中分離出一個(gè)編碼一個(gè)推測的海藻糖-6-磷酸合成酶/磷酸酶的3.2kb的cDNA。也設(shè)想構(gòu)建一個(gè)截?cái)嗟腡PS-TPP基因產(chǎn)物，籍此只保留TPS的活性，其對(duì)于T-6-P的合成同大腸桿菌的OtsA基因一樣有效，當(dāng)在同源系統(tǒng)中應(yīng)用時(shí)也有同樣效果。
在分子水平上我們有資料表明除了卷柏屬之外海藻糖合成基因也存在于擬南芥屬、煙草、水稻和向日葵中。使用簡并性引物，依據(jù)TPSE.coli和TPSyeast之間的保守序列，我們能夠在向日葵和煙草中確定編碼推定的海藻糖-6-磷酸產(chǎn)生酶的基因。序列比較表明這些序列與來源于酵母和大腸桿菌的TPS基因，以及與來源于擬南芥屬和水稻(也見表6b，其含有已發(fā)現(xiàn)的同源EST編號(hào))的EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)序列有著顯著的同源性。
最近已闡明一個(gè)擬南芥屬基因(公開于GENEBANK Acc.No.YO8568,示于SEQ ID NO:39)，依據(jù)其同源性可以認(rèn)為是一個(gè)兩分酶。這些資料表明，與目前的認(rèn)識(shí)相反，大多數(shù)植物確實(shí)含有編碼磷酸海藻糖合成酶的基因，其使它們能合成T-6-P。通過在表達(dá)TPS的植物中海藻糖的積累所證實(shí)，植物也含有非特異性或特異性磷酸酶，其能使T-6-P去磷酸化成為海藻糖。海藻糖酶在所有植物中的存在也可實(shí)現(xiàn)海藻糖的轉(zhuǎn)換。
此外，我們也提供在人體組織中T-6-P參與調(diào)節(jié)碳水化合物途徑的資料。我們已闡明了一個(gè)人TPS基因(描述于SEQ ID NO:10)，其與酵母、大腸桿菌和植物的TPS基因都表現(xiàn)出同源性。此外，我們展示了己糖激酶活性在哺乳動(dòng)物(小鼠)組織中受到影響的資料。
通過TPP酶的表達(dá)(或TPS酶的抑制)降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸的濃度產(chǎn)生的“充足”信號(hào)則會(huì)給所有細(xì)胞系統(tǒng)一個(gè)增加糖酵解碳流量并抑制光合作用的信號(hào)。這在實(shí)驗(yàn)部分中有很好地展示，例如實(shí)例2中描述了TPP酶得到表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植物，其葉子大小增加，分枝增加，葉綠素的量減少。但是，因?yàn)椤俺渥恪钡男盘?hào)在缺乏葡萄糖充分供應(yīng)時(shí)產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物庫被迅速耗竭。
這樣，假設(shè)保持人為的“充足”信號(hào)，碳水化合物的減少最終將會(huì)限制細(xì)胞生長和分裂，即細(xì)胞將會(huì)用光所有儲(chǔ)存的碳水化合物，會(huì)處于“饑餓”狀態(tài)。這樣，帶有低儲(chǔ)存量碳水化合物的葉子將會(huì)形成。另一方面，表達(dá)一個(gè)帶有編碼增加細(xì)胞內(nèi)T-6-P量的TPS基因的構(gòu)建體的植物，其表現(xiàn)為葉子大小的減少，同時(shí)葉子呈深綠色，含有的葉綠素量增加。
在酵母中，葡萄糖誘導(dǎo)的信號(hào)傳遞的一個(gè)主要作用是將代謝從新生/呼吸方式轉(zhuǎn)換為發(fā)酵方式。幾個(gè)信號(hào)傳遞途徑參與此現(xiàn)象(Thevelein和Hohmann,(1995)TIBS 20,3)。除了己糖激酶信號(hào)傳遞的可能作用外，RAS-環(huán)狀單磷酸腺苷(cAMP)途徑也已表明可被葡萄糖活化。通過葡萄糖對(duì)RAS-cAMP途徑的活化需要葡萄糖磷酸化，但無進(jìn)一步葡萄糖代謝。到目前為止，已表明此途徑可以活化海藻糖酶和6-磷酸果糖-2-激酶(因而促進(jìn)糖酵解)，而通過cAMP-依賴性蛋白質(zhì)磷酸化，果糖-1,6-二磷酸酶被抑制(這樣防止葡萄糖異生)。此信號(hào)傳導(dǎo)路線和它所引起的代謝效應(yīng)能被設(shè)想為一個(gè)與己糖激酶信號(hào)傳遞途徑有平行作用的信號(hào)途徑，而且顯示它受海藻糖-6-磷酸水平的影響。
如在本發(fā)明中所述，表達(dá)反義海藻糖酶的轉(zhuǎn)基因植物顯示有類似現(xiàn)象，如深綠的葉子，產(chǎn)量升高，如表達(dá)TPS基因時(shí)所觀察到的。似乎是在雙重構(gòu)建體(double-construct)中反義海藻糖酶的表達(dá)增強(qiáng)了由TPS表達(dá)所引起的效應(yīng)。已表明海藻糖酶活性存在于如植物、昆蟲、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中，但是只在有限數(shù)目的物種中，海藻糖被積累。
雖然海藻糖酶存在于幾乎所有植物種類中，至今海藻糖酶的作用仍未知。據(jù)推測其參與植物病原體的相互作用和/或植物防御反應(yīng)。我們已經(jīng)分離了一個(gè)馬鈴薯海藻糖酶基因，表明在馬鈴薯葉和塊莖組織中海藻糖酶活性的抑制會(huì)導(dǎo)致塊莖產(chǎn)量的增加。反義海藻糖酶的果實(shí)特異性表達(dá)在西紅柿中與TPS表達(dá)一起顯著改變果實(shí)的發(fā)育。
依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在通過引入一個(gè)編碼磷酸海藻糖合成酶(TPS)的表達(dá)性基因構(gòu)建體而導(dǎo)入產(chǎn)生T-6-P的能力的細(xì)胞中造成T-6-P的積累。只要它能在所述細(xì)胞中生產(chǎn)能產(chǎn)生T-6-P的磷酸海藻糖合成酶，可以使用在細(xì)胞中DNA表達(dá)所必需的調(diào)控元件控制下的任何磷酸海藻糖合成酶基因，無論其是特異性還是組成性地。依據(jù)本發(fā)明的開放閱讀框架之一是如SEQ ID NO:2中所描述的編碼TPS酶的開放閱讀框架。另一些例子是描述于SEQ ID NO:10、18-23、41和45-53中的開放閱讀框架。如上面述及的序列所示，眾所周知多個(gè)DNA序列可以編碼相同的酶，此由密碼子的簡并性引起。如需要，編碼磷酸海藻糖合成酶活性的開放閱讀框架可以改造成所選擇宿主的適用密碼子，但不必須這樣做。
由例如SEQ ID NO:2中所描述的分離的核酸序列，通過PCR技術(shù)和/或通過用其它來源的DNA與來源于大腸桿菌基因的DNA或RNA片段雜交，可以用以鑒定其它生物體中的磷酸海藻糖合成酶基因，隨后分離并克隆它們。優(yōu)選地，通過在或多或少地嚴(yán)格條件下(受雜交混合物的溫度和離子強(qiáng)度等因素影響)雜交而克隆這些DNA序列。雜交條件是否嚴(yán)格也依賴于雜交的本身，即DNA∶DNA、DNA∶RNA、RNA∶RNA以及最短雜交片段的長度。那些本領(lǐng)域一般技術(shù)人員很容易就能建立一個(gè)足夠嚴(yán)格以避免非特異雜交并分離TPS基因的雜交方法。因?yàn)榭梢垣@得參與其它來源的海藻糖合成的基因，可以依據(jù)本發(fā)明用這些基因以類似的方法去獲取一個(gè)表達(dá)性磷酸海藻糖合成酶的基因。更詳細(xì)的內(nèi)容在實(shí)驗(yàn)部分給出。
用于分離磷酸海藻糖合成酶活性的來源包括微生物(如細(xì)菌、酵母、真菌)、植物、動(dòng)物等等。從其它來源分離的編碼磷酸海藻糖合成酶活性的DNA序列也可以類似地用于依據(jù)本發(fā)明的用于產(chǎn)生T-6-P的方法中。作為一實(shí)施例，來自酵母的用于產(chǎn)生T-6-P的基因已公開于WO93/17093中。
本發(fā)明也包括這樣的核酸序列，它是通過突變一個(gè)或多個(gè)密碼子來改變SEQ ID NO:1中所述核酸序列獲得的，突變?cè)斐伤幋a的蛋白質(zhì)中氨基酸改變，只要氨基酸序列的突變不完全消除磷酸海藻糖合成酶的活性。
依據(jù)發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，通過在細(xì)胞中DNA表達(dá)所必需的調(diào)控元件控制下的磷酸海藻糖磷酸酶編碼基因，海藻糖-6-磷酸在細(xì)胞中可被轉(zhuǎn)換為海藻糖。依據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的開放閱讀框架是SEQ ID NO:4中所描述的編碼一種TPP酶的開放閱讀框架。(Kaasen等人，(1994)基因，145,9)。眾所周知，多個(gè)DNA序列可以編碼相同的酶，此是由遺傳密碼子的簡并性造成的。如有需要，編碼磷酸海藻糖磷酸酶活性的開放閱讀框架可以改造成所選擇宿主使用的密碼子，但并不必須這樣做。
由SEQ ID NO:3中所描述的分離的核酸序列，通過PCR技術(shù)和/或通過用從大腸桿菌基因中獲取的DNA或RNA片段與其它來源的DNA雜交，可用以鑒定其它生物體中磷酸海藻糖磷酸酶基因，隨后分離并克隆它們。優(yōu)選地，通過在或多或少嚴(yán)格條件下(受雜交混合物的溫度和離子強(qiáng)度等因素影響)雜交而篩選這些DNA序列。條件是否嚴(yán)格也依賴于雜交的本身，即DNA∶DNA、DNA∶RNA、RNA∶RNA以及最短雜交片段的長度。那些本領(lǐng)域一般技術(shù)人員很容易就能建立一個(gè)足夠嚴(yán)格以避免非特異雜交并分離TPP基因的雜交方法。因?yàn)榭梢垣@得參與其它來源的海藻糖合成的基因，依據(jù)本發(fā)明，這些基因可以用于類似的方法中去獲取一個(gè)表達(dá)性磷酸海藻糖磷酸酶基因。更詳細(xì)的內(nèi)容在實(shí)驗(yàn)部分給出。
用于分離磷酸海藻糖磷酸酶活性的來源包括微生物(如細(xì)菌、酵母、真菌)、植物、動(dòng)物等等。來自其它來源的分離的編碼磷酸海藻糖磷酸酶活性的DNA序列也可以類似地使用。
只要氨基酸序列的突變不完全消除磷酸海藻糖磷酸酶的活性，本發(fā)明也包括這樣的改變過的核酸序列，它是通過突變一個(gè)或多個(gè)密碼子來改變SEQ ID NO:3中所描述的核酸序列獲得的，突變?cè)斐删幋a的蛋白質(zhì)中產(chǎn)生了氨基酸改變。
具有TPS或TPP活性的其它酶通過所謂兩分酶表示。設(shè)想特異性編碼兩種活性之一的序列部分能從編碼另一活性的兩分酶部分中分離出來。一種分離活性的方法是向編碼不選擇的活性的序列中插入一個(gè)突變，通過此突變表達(dá)的蛋白受損或缺少此活性，這樣只執(zhí)行另一個(gè)功能。這種方法能用于TPS和TPP活性的編碼序列。這樣，以此方法得到的編碼序列能用以形成可表達(dá)具有TPS或TPP活性的酶的新型嵌合開放閱讀框架。
依據(jù)發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，尤其是植物能被遺傳改變以在植物的特定部分產(chǎn)生和積累上述提到的酶。酶表達(dá)優(yōu)選的部位是葉子和植物的儲(chǔ)存部分。特別是馬鈴薯的塊莖被認(rèn)為是合適的植物部位。在微塊莖和馬鈴薯塊莖中實(shí)現(xiàn)選擇性表達(dá)TPS酶的優(yōu)選啟動(dòng)子獲自馬鈴薯patatin基因開放閱讀框架的上游區(qū)域。
用于特異性表達(dá)的另一個(gè)合適啟動(dòng)子是質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子，其特異于植物的光同化作用部分。此外，設(shè)想在植物部位的特異性表達(dá)可對(duì)植物生長和繁殖或該植物的經(jīng)濟(jì)用途產(chǎn)生有利的作用。在此方面有用的啟動(dòng)子是果實(shí)特異性的E8啟動(dòng)子(EP0409629)和2A11啟動(dòng)子(Van Haaren和Houck(1993)，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.),221,625)；種子特異性的十字花素啟動(dòng)子，napin啟動(dòng)子和ACP啟動(dòng)子；PAL-啟動(dòng)子；花特異性的查耳酮異構(gòu)酶啟動(dòng)子；葉特異性的SSU啟動(dòng)子和鐵氧化還原蛋白啟動(dòng)子；根特異性的TobRb7啟動(dòng)子，韌皮部特異性的RolC啟動(dòng)子和分生組織特異性的HMG2啟動(dòng)子(Enjuto等人(1995)，植物細(xì)胞7，517)和水稻PCNA啟動(dòng)子(Kosugi等人，(1995)，植物雜志(Plant J.)7,877)。
本發(fā)明中另一個(gè)選擇是使用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。已知可以被病原體、應(yīng)激反應(yīng)、化學(xué)制劑或光/黑暗刺激所誘導(dǎo)的啟動(dòng)子?？梢韵胂鬄榱苏T導(dǎo)特定的現(xiàn)象，例如發(fā)芽、抽苔、種子形成、儲(chǔ)存組織的填充，通過外界刺激誘導(dǎo)本發(fā)明基因的活性是有益的。這使得植物的正常發(fā)育和期望現(xiàn)象的誘導(dǎo)性的優(yōu)點(diǎn)均在控制之下。符合以此方式使用的啟動(dòng)子是在DE4446342(真菌和生長素誘導(dǎo)的PRP-1),WO96/28561(真菌誘導(dǎo)的PRP-1),EP 0 586 612(線蟲誘導(dǎo)的)EP 0 712 273(線蟲誘導(dǎo)的)、WO96/34949(真菌誘導(dǎo)的)，PCT/EP 96/02437(線蟲誘導(dǎo)的)、EP 0 330479(應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的)，US5,510,474(應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的)、WO96/12814(寒冷誘導(dǎo)的)、EP 0 494 724(四環(huán)素誘導(dǎo)的)、EP 0 619 844(乙烯誘導(dǎo)的)、EP 0 337 532(水楊酸所誘導(dǎo)的)、WO95/24491(維生素B1誘導(dǎo)的)和WO92/19724(光誘導(dǎo))中所描述的病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。其它化學(xué)制劑可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子在EP 0 674 608,EP 637 339,EP 455 667和US 5,364,780中描述。
依據(jù)發(fā)明的另一實(shí)施方案，用可以抑制內(nèi)源性表達(dá)TPS或TPP的功能的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。對(duì)不期望的內(nèi)源性酶活性的抑制可以由許多方法實(shí)現(xiàn)，這些方法的選擇對(duì)本發(fā)明并不關(guān)鍵。一種抑制基因表達(dá)的方法可以通過所謂“反義方法”來實(shí)現(xiàn)。在此表達(dá)一個(gè)DNA序列，它產(chǎn)生一種與編碼要被阻斷的酶活性的RNA至少部分互補(bǔ)的RNA。優(yōu)選使用同源反義基因，因?yàn)樗鼈儽犬愒椿蚋行?。阻斷不期望的酶活性合成的另一個(gè)可選擇的方法是向植物宿主基因組中導(dǎo)入在植物宿主中存在的一種內(nèi)源基因的附加拷貝。經(jīng)?？梢杂^察到這種基因的附加拷貝抑制了內(nèi)源基因這種效應(yīng)在文獻(xiàn)中稱為共同抑制效應(yīng)或共同抑制。增強(qiáng)底物可得量的步驟的細(xì)節(jié)在WO95/01446的實(shí)施例中提供，此處引入作為參考。
宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，只要其中通過T-6-P水平的改變可以實(shí)現(xiàn)己糖激酶信號(hào)傳遞的改變。這樣，相應(yīng)地，所有真核細(xì)胞都適用于本發(fā)明。從經(jīng)濟(jì)學(xué)的觀點(diǎn)來看，最適合于代謝化合物產(chǎn)生的細(xì)胞最適合本發(fā)明。這些生物體除了其它之外是植物、動(dòng)物、酵母、真菌。然而，也設(shè)想在特殊的動(dòng)物細(xì)胞(象胰腺的β細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)中表達(dá)。
優(yōu)選的植物宿主在種子植物門(Spermatophytae)中是被子植物綱(Angiospermae)，突出的是雙子葉植物綱((Dicotyledoneae)，包括除了其它之外的茄科(Solanaceae)作為一個(gè)代表性家族，和單子葉植物綱(Monocotyledoneae)，包括除了其它之外的禾本科(Gramineae)作為一個(gè)代表家族。在本發(fā)明范圍內(nèi)所定義的合適的宿主植物包括植物(以及該植物的各個(gè)部分和細(xì)胞)及其子代，其中通過例如用重組DNA技術(shù)在期望的植物或植物器官中引起或增加TPS或TPP的產(chǎn)量，而使其子代含有一個(gè)改變了的T-6-P水平。依據(jù)本發(fā)明的作物包括有花的象花椰菜(Brassicaoleracea)、朝鮮薊(Cynara scolymus)，切花象康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、玫瑰(Rose spp.)，菊屬(Chrysanthemum)、矮牽牛屬(Petunia)、六出花屬(Alstromeria)、扶郎花屬(Gerbera)、唐菖蒲屬(Gladiolus)、百合(Lilium spp.)、蛇麻草(Humulus luplus)、硬花球花柳(Broccoli)，盆載植物象杜鵑花屬(Rhododendron)、Azalia、大麗花屬(Dahlia)、秋海棠屬(Begonia)、倒掛金鐘屬(Fuchsia)、牛龍牛苗屬(Geranium)等；果實(shí)類例如蘋果(Malus，如domesticus)、香蕉(Musa，如Acuminata)、杏(Prunus armeniaca)、橄欖(Oliva sativa)、菠蘿(Ananascomosus)、椰子(Cocos nucifera)、芒果(Mangifera indica)、獼猴桃、油梨(Persea americana)、漿果(例如葡萄干、紅醋栗)、櫻桃(例如歐洲甜櫻桃(Prunus avium))，黃瓜(如Cucumis sativus)、葡萄(如Vitisvinifera)、檸檬(Citrus limon)、甜瓜(Cucumis melo)、芥末(Simapis alba和Brassica nigra)、堅(jiān)果(例如核桃(如Juglans regia)、落花生(如Arachis hypogeae))、桔子(如Citrus maxima)、桃子(如Prunuspersica)、梨(如Pyra communis)、胡椒(如Solaum capsicm)、李子(如Prunus domestica)、草莓(如麝香草莓Fragaria moschata)、西紅柿(如Lycopersicon esculentum)；葉例如苜蓿(Medicaqo sativa)、卷心菜(如甘藍(lán)Brassica oleracea)、菊苣(如Cichoreum endivia)、蔥(Allium porrum)、萵苣(lactuca sativa)、菠菜(Spinacia oleraceae)、煙草(Nicotiana tabacum)，草本類例如羊茅屬(Festuca)、早熟禾屬(Poa)、黑麥草屬(如黑麥草(Lolium perence)，多花黑麥草(Lolium multiflorm)和Arrenatherum spp.)、Amenity草，草皮草、海草、菊苣(Cichoriumintybus)、茶(Thea sinensis)、旱芹、縐葉歐芹(Petroselinum crispum)、chevil和其它草類；根例如竹芋(Maranta arundinacea)、甜菜根(Betavulgaris)、胡蘿卜(Daucus carota)，木薯(Manihot esculenta)、人參(Panaxginseng)、蕪菁(Brassica rapa)、蘿卜(Raphanus sativus)、番薯(Dioscoreaesculenta)、甘薯(Ipomoea batatas)、芋；種子例如菜豆(Phaseolusvulgaris)、豌豆(Pisum sativum)、大豆(Glycin max)、小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)，水稻(Oryzasativa)，矮菜豆和蠶豆(Vicia faba)、棉花(Gossypium spp.)、咖啡(Coffeaarabica和C.canephora)；塊莖例如擘藍(lán)(Brassica oleraceae)，馬鈴薯(Solanum tuberosum)；鱗莖植物例如洋蔥(Allium cepa)、亞實(shí)基隆蔥，郁金香(Tulipa spp.)，黃水仙(Narcissus spp.)、蒜(Allium sativum)；莖例如栓皮櫟，甘蔗(Saccharum spp.)，菠蘿劍麻(Sisal spp.)，亞麻(Linumvulgare)，黃麻；樹象橡膠樹，橡樹(Quercus spp.)，山毛櫸(Betula spp.)，赤楊(Alnus spp.)，水曲柳(Acer spp.)，榆樹(Ulmus spp.)，棕櫚，蕨類，ivies等等。
通過周知的載體系統(tǒng)例如pBluescript、pUC和病毒載體系統(tǒng)如RSV和SV40，利用本領(lǐng)域周知的轉(zhuǎn)化技術(shù)，可以完成酵母、真菌或動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
只要基因能在所述植物細(xì)胞中表達(dá)，將表達(dá)性磷酸海藻糖合成酶基因、表達(dá)性磷酸海藻糖磷酸酶基因或其它任何有義或反義基因?qū)胧荏w植物細(xì)胞的方法并不關(guān)鍵。
盡管發(fā)明的一些實(shí)施方案目前還不能實(shí)施，例如因?yàn)橐恍┲参锓N類還很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但本發(fā)明在這些植物種類中的實(shí)行只是時(shí)間的問題而不是原則問題，因?yàn)檫@種遺傳轉(zhuǎn)化的完成與本發(fā)明下面的實(shí)施方案不相關(guān)。
植物種類的轉(zhuǎn)化對(duì)大量的植物種類，包括雙子葉植物和單子葉植物是很常規(guī)的。依據(jù)此發(fā)明，原則上任何轉(zhuǎn)化方法都可以將嵌合DNA導(dǎo)入合適的祖細(xì)胞。合適的方法可以從用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇(Krens等人(1982)，自然296,72,Negrutiu等人(1987)，植物分子生物學(xué)8，363)，原生質(zhì)體的電穿孔(Shillito等人(1985)Bio/Technol.3,1099)，顯微注射進(jìn)植物組織(Crossway等人(1986),Mol.Gen.Genet.202),(DNA或RNA包被的)顆粒轟擊各種植物組織(Klein等人(1987)，自然327,70)，用(非整合)病毒感染，通過成年植物的浸潤或成熟花粉或孢子的轉(zhuǎn)化以在植物內(nèi)根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(EP 0 301 316)等等中選擇。依據(jù)發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法包括土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。尤其優(yōu)選的是公開于EP A120516和美國專利4,940,838中使用的稱為二元載體的技術(shù)。
盡管認(rèn)為進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化更難一些，單子葉植物易于轉(zhuǎn)化，有繁殖力的轉(zhuǎn)基因植物可以從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或胚胎或其它植物組織中再生。目前，用于單子葉植物轉(zhuǎn)化優(yōu)選的方法是胚胎、外植體或懸浮細(xì)胞的微粒轟擊和DNA直接吸收或(組織)電穿孔法(Shimamoto等人(1989)，自然338,274-276)。通過微粒轟擊將編碼phosphinothricin酰基轉(zhuǎn)移酶(能滅活除草劑phosphinothricin的一種酶)的吸水鏈霉菌(Streptomy ceshygroscopicus)bar基因?qū)胗衩讘腋∨囵B(yǎng)物的胚胎細(xì)胞來獲得轉(zhuǎn)基因玉米植物(Gordon-kamm(1990)植物細(xì)胞，2,603)。將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入其它單子葉作物例如小麥和大麥的糊粉原生質(zhì)體也已報(bào)道(Lee(1989)，植物分子生物學(xué)13,21)。通過選擇用于建立胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物的胚發(fā)生愈傷組織，小麥植株已從胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物中再生(Vasil(1990)Bio/Technol.8,429)。用于這些作物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的組合使本發(fā)明可應(yīng)用于單子葉植物。
單子葉植物，包括商業(yè)上重要的作物例如水稻和玉米均能通過土壤桿菌菌株進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)移(Vide WO94/00977；EP 0 159 418 B1；Gould等人(1991)植物生理95,426-434)。
為了獲得能組成性表達(dá)多于一種嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物，也可采用許多其它方法，包括如下A．帶有與另一個(gè)選擇性標(biāo)記基因連接的一系列改變了的基因的DNA，如二元質(zhì)粒上的T-DNA的使用。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是嵌合基因是物理相連的，因而可以做為單個(gè)孟德爾位點(diǎn)轉(zhuǎn)移。B．各自已能表達(dá)一種或多種嵌合基因且優(yōu)選的與一種選擇性標(biāo)記基因連接的轉(zhuǎn)基因植物與來自含有連接到另一種選擇性標(biāo)記上的一種或多種嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物的花粉交叉授粉。通過這種雜交而得到的種子可以依據(jù)兩種選擇標(biāo)志的出現(xiàn)或依據(jù)嵌合基因自身的出現(xiàn)來選擇。從選擇的種子獲得的植物以后能用于進(jìn)一步雜交。原則上嵌合基因不在單一位點(diǎn)上，因此這些基因可以做為獨(dú)立的位點(diǎn)分離。C．許多復(fù)嵌合DNA分子的使用，例如質(zhì)粒，每一個(gè)含有一種或多種嵌合基因和一種選擇性標(biāo)記。如果共轉(zhuǎn)化的頻率很高，那么依據(jù)一種標(biāo)記進(jìn)行選擇就足夠了。在其它情況下，優(yōu)選依據(jù)多種標(biāo)記的選擇。D．用選擇性含有一種選擇性標(biāo)記基因的新的嵌合DNA去連續(xù)轉(zhuǎn)化已含有一種、兩種(等等)嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物。如方法B中，嵌合基因原則上不在單一位點(diǎn)上，因此嵌合基因可以做為獨(dú)立的位點(diǎn)分離。E．上述提及策略的聯(lián)合。
實(shí)際的策略也許取決于幾種考慮，如很容易決定的例如親本的目的(直接生長、用在繁殖計(jì)劃中、用于產(chǎn)生雜種)，但對(duì)所描述的發(fā)明它并不關(guān)鍵。
眾所周知，實(shí)際上所有的植物都可以從培養(yǎng)的細(xì)胞或組織中再生，但總的來說要首先提供轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體懸浮液或含有轉(zhuǎn)化外植體的培養(yǎng)皿。芽可以直接被誘導(dǎo)，也可以通過器官發(fā)生或胚胎發(fā)生以及隨后生根而間接地從愈傷組織中誘導(dǎo)。除了選擇性標(biāo)記，培養(yǎng)基中一般含有各種氨基酸和激素，例如生長素和細(xì)胞因子。向培養(yǎng)基中加入谷氨酸和脯氨酸也是有好處的，尤其對(duì)于玉米和首蓿這樣的物種。有效的再生取決于培養(yǎng)基、培養(yǎng)物的基因型和歷史。如果控制這三個(gè)變量，再生通常是可以重復(fù)的。在將轉(zhuǎn)化的基因序列穩(wěn)定整合入轉(zhuǎn)基因植物中后，由它們所賦予的特性可以通過性雜交傳給其它植物。根據(jù)要雜交的種類，可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)的繁殖技術(shù)。
用于控制植物表達(dá)性基因(包括標(biāo)記基因)表達(dá)的合適DNA序列，例如轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)域、增強(qiáng)子、非轉(zhuǎn)錄性引導(dǎo)子等等，可以源自能在植物細(xì)胞中表達(dá)的任何基因。也考慮使用含有多種啟動(dòng)子功能部分的雜合啟動(dòng)子或其合成的等效物。除了組成性啟動(dòng)子，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子或以它們的表達(dá)方式例如發(fā)育性地或細(xì)胞類型特異性的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子依據(jù)本發(fā)明都可以用于控制表達(dá)性基因的表達(dá)。
為了選擇或篩選細(xì)胞，依據(jù)發(fā)明優(yōu)選的包括一個(gè)標(biāo)記基因，此基因與待轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的植物表達(dá)性基因相連。在植物轉(zhuǎn)化中合適的標(biāo)記基因的選擇為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知；一般常規(guī)使用的標(biāo)記基因的實(shí)例為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予卡那霉素抗性(EP-B131623)，來自大鼠肝臟的谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對(duì)源自除草劑的谷胱苷肽的抗性(EP-A256223)，谷氨酰胺合成酶，其一旦過量表達(dá)則賦予對(duì)谷氨酰胺合成酶抑制劑phosphinothricin的抗性(WO87/05327)，來自綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因賦予了對(duì)選擇性試劑phosphinothricin的抗性(EP-A275957)，編碼5-烯醇式莽草酸3-磷酸酯合成酶(EPSPS)的基因賦予了對(duì)N-膦酰甲基甘氨酸的抗性，bar基因賦予了對(duì)雙丙氨酰膦的抗性(例如WO91/02071)等等。只要與所選擇的植物細(xì)胞聯(lián)合時(shí)標(biāo)記是有功能的(即有選擇性的)，標(biāo)記的具體選擇并不重要。
標(biāo)記基因和目的基因并不必相連，因?yàn)椴贿B接基因的共轉(zhuǎn)化(美國專利4,399,216)在植物轉(zhuǎn)化中也是有效方法。
轉(zhuǎn)化的優(yōu)選植物材料，尤其對(duì)雙子葉作物來說是葉盤，它能很容易被轉(zhuǎn)化并有很好的再生能力(Horsch等人(1985)，科學(xué)227,1229)。
可以設(shè)想以下列方式特異使用本發(fā)明從實(shí)施例中可以看出TPP表達(dá)的效果(其引起細(xì)胞內(nèi)T-6-P濃度的降低)是葉子尺寸的增加、導(dǎo)致葉子數(shù)目增加、分枝的增加、總的葉生物量增加、成熟葉變白、形成更小的花和絕育。這些效果在下列情況下尤其有用葉尺寸的增加(同時(shí)葉數(shù)目增加)對(duì)多葉蔬菜例如菠菜、萵苣、韭蔥、苜蓿、青貯飼料玉米；對(duì)于通過綠草和花園植物達(dá)到土地覆蓋和草的控制；對(duì)于葉子做為產(chǎn)品的作物例如煙草、茶、大麻和玫瑰(香水)；對(duì)于卷心菜類作物如花椰菜的matting up是有著經(jīng)濟(jì)上的重要性的。
這些葉子代謝活性被促進(jìn)的事實(shí)的另一個(gè)好處是它們將消耗掉所有細(xì)胞間的資源，這就意味著它們是低淀粉含量的。就目前低熱量食品的趨勢而言，對(duì)意味著消費(fèi)低淀粉含量的植物是有利的。淀粉含量的降低對(duì)葉的味道和質(zhì)地也有影響。通過TPP的表達(dá)而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)/碳水化合物平衡的升高對(duì)多葉作物例如青貯飼料玉米尤其重要。
伴隨有較大直徑的莖的趨勢的分枝增加在由莖負(fù)責(zé)產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)上有吸引力的產(chǎn)品的作物中是有利的。在此范圍內(nèi)的實(shí)例是用于增加木材產(chǎn)量的樹，木材也是紙生產(chǎn)的初始材料；如用于生產(chǎn)繩子和亞麻布的大麻、菠蘿劍麻、亞麻等作物；如竹子和甘蔗；橡膠樹的作物，栓皮櫟；防止作物或作物某一部分倒伏的，例如谷類、玉米、豆科植物和草莓。
第三個(gè)現(xiàn)象是葉的進(jìn)一步變白(由光合活性的降低所引起)。對(duì)于作物菊苣、蘆筍優(yōu)選顏色更少的葉子。對(duì)于切花，也期望花瓣變白，例如在六出花屬中。
一個(gè)總的效果是由于代謝活性的增加造成生物量的增加。這就意味著生物量含有代謝化合物例如蛋白質(zhì)和脂肪，相應(yīng)的，在成熟的葉子中蛋白質(zhì)/碳水化合物平衡增加，這對(duì)于如青貯飼料玉米和所有被青貯的飼料的作物是有利的?？梢栽诠麑?shí)、塊莖和其它可食的植物部分建立類似的蛋白質(zhì)/碳水化合物的平衡的增加。
在植物界以外，代謝的增加對(duì)在微生物或真核細(xì)胞培養(yǎng)物中蛋白質(zhì)的生產(chǎn)有益。內(nèi)源性蛋白和異源性蛋白的生產(chǎn)都可被加強(qiáng)，這就意味著在酵母或其它單細(xì)胞生物培養(yǎng)物中異源性蛋白的生產(chǎn)可以以這種方法得到增強(qiáng)。對(duì)酵母來說，這將產(chǎn)生一個(gè)更有效的發(fā)酵，其導(dǎo)致酒精產(chǎn)量的增加，所以對(duì)釀酒過程、酒精生產(chǎn)等等是有利的。
在動(dòng)物和人體中，可以設(shè)想通過在受影響的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)TPP或TPS可以克服由代謝缺損所引起的疾病。在人類細(xì)胞中，許多腫瘤細(xì)胞葡萄糖消耗的增加在很大程度上依賴于己糖激酶的過量表達(dá)(Remple等人(1996)FEBS Lett.385,223)。可以設(shè)想海藻糖-6-磷酸合成酶的表達(dá)可以影響葡萄糖進(jìn)入腫瘤細(xì)胞代謝的流量。已表明己糖激酶的活化可以被cAMP/PKA(蛋白激酶A途徑)強(qiáng)化。因此，這個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的滅活可以影響葡萄糖的吸收和瘤形成的增殖。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能合成海藻糖-6-磷酸和海藻糖以及降解海藻糖的酶活性已示于例如兔腎皮質(zhì)細(xì)胞中(Sacktor(1968)美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci)60,107)。已在胰腺β-細(xì)胞中胰島素分泌缺陷中發(fā)現(xiàn)另一實(shí)例，其中由己糖激酶催化的葡萄糖-6-磷酸的生產(chǎn)是主要反應(yīng)，其可將外源葡萄糖水平的增加和胰島素的分泌偶聯(lián)在一起(Efrat等人(1994),TIBS19,535)。由細(xì)胞內(nèi)T-6-P降低引起的己糖激酶活性的增加將在胰島素分泌缺陷的細(xì)胞中促進(jìn)胰島素的生產(chǎn)。
在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中蛋白質(zhì)/碳水化合物平衡的增加也是有利的。代謝特性的增加和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的增加在畜牧業(yè)中是很重要的，其中動(dòng)物能盡可能多的長肉。將TPP轉(zhuǎn)化到產(chǎn)肉動(dòng)物例如雞、牛、綿羊、火雞、山羊、魚、龍蝦、螃蟹、小蝦、蝸牛等中，會(huì)產(chǎn)生生長更快且具有含更高蛋白質(zhì)的肉的動(dòng)物。
同樣，這種代謝的增加意味著碳水化合物消耗率的增加，因而可以防止肥胖。
由細(xì)胞內(nèi)T-6-P濃度降低產(chǎn)生的更多的植物特異性效應(yīng)是花數(shù)目的增加(盡管它們似乎不導(dǎo)致種子的形成)。然而花數(shù)目的增加對(duì)切花植物和盆載花植物和適于園藝培養(yǎng)的所有植物都是有利的。
這種開花現(xiàn)象的另一效應(yīng)是絕育，因?yàn)橹参锊⒉划a(chǎn)生種子。絕育的植物在雜交育種中有利。
另一個(gè)經(jīng)濟(jì)上重要的方面是防止培養(yǎng)作物如萵苣、菊苣和欣賞及飼養(yǎng)型草的抽苔。這是一個(gè)有益的特性，因?yàn)樗棺魑锷L而不必將代謝作用花費(fèi)在開花和種子生產(chǎn)上。此外，在象萵苣、菊苣和草的作物中，商業(yè)性產(chǎn)品應(yīng)用是不抽苔的。
TPP在植物某一部分(池)中的特異性表達(dá)會(huì)產(chǎn)生其它有益的效應(yīng)。可以設(shè)想由一個(gè)在種子形成早期有活性的啟動(dòng)子引導(dǎo)的TPP的表達(dá)能使發(fā)育的種子生長增加。通過一個(gè)花特異性的啟動(dòng)子來表達(dá)TPP可以取得類似的效果。簡言之，如果通過合適的特異性啟動(dòng)子進(jìn)行TPP的表達(dá)，就有可能使植物某一部分過度生長。果實(shí)中的特異性表達(dá)能導(dǎo)致相對(duì)于果肉來說果皮生長的增加。這能改善果實(shí)的脫皮，其對(duì)自動(dòng)脫皮工業(yè)是有好處的。
在儲(chǔ)油種子發(fā)芽過程中TPP的表達(dá)防止油的降解。在發(fā)芽的過程中，乙醛酸循環(huán)是非?；钴S的。代謝途徑將乙酰輔酶A經(jīng)蘋果酸轉(zhuǎn)化為蔗糖，蔗糖可被運(yùn)輸并做為幼苗生長過程中的能量來源。此過程中的關(guān)鍵酶是蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶。兩個(gè)酶的表達(dá)被認(rèn)為由己糖激酶信號(hào)傳遞來調(diào)節(jié)。這種調(diào)節(jié)的一種指征是2-脫氧葡萄糖和甘露糖均被己糖激酶磷酸化并能在不被進(jìn)一步代謝的情況下傳導(dǎo)它們的信號(hào)，蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶表達(dá)的降低，種子中TPP的表達(dá)，降低了對(duì)己糖激酶的抑制，因而抑制蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂解酶以維持油儲(chǔ)存至種子中，防止發(fā)芽。
與TPP效果相反，由TPS的表達(dá)引起的T-6-P的增加導(dǎo)致象在實(shí)施例中所述的其它效應(yīng)。從此可知T-6-P量的增加引起矮化生長(尤其在TPS高表達(dá)時(shí))、更多的披針形葉的形成、由于葉綠素的增加而顏色加深以及淀粉含量的增加。如上所知，一個(gè)反義海藻糖酶構(gòu)建體的導(dǎo)入也會(huì)促成與TPS導(dǎo)入類似的效應(yīng)。因此，使用反義海藻糖酶也同樣可以實(shí)現(xiàn)由TPS所示的反應(yīng)。此外，使用TPS和反義海藻糖酶的雙重構(gòu)建體可加強(qiáng)單個(gè)構(gòu)建體的效果。
矮化是園藝植物中期望的現(xiàn)象，其中日本bonsai樹是一個(gè)經(jīng)典的實(shí)例。在如多子植物、玫瑰、孤挺花屬(Amaryllis)、Hortensia、樺樹和棕櫚的植物中創(chuàng)造微型花會(huì)創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)上的機(jī)會(huì)。除了植物界，矮化在動(dòng)物也是需要的。它也可以在培養(yǎng)的作物例如萵苣中誘導(dǎo)抽苔，因?yàn)檫@樣能迅速產(chǎn)生種子，所以是有益的。理想的，用于這些效果的TPS的表達(dá)在一種可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的控制下。頂端優(yōu)勢的丟失也引起多個(gè)芽的形成，這在例如苜蓿中有經(jīng)濟(jì)上的重要性。
生長的降低也是“蔬菜型快餐”工業(yè)所需，其中蔬菜被認(rèn)為以快餐的形式消費(fèi)。櫻桃番茄是一個(gè)在市場上成功的大小縮小了的蔬菜的實(shí)例?？梢韵胂笪⑿统叽绲钠渌卟巳缇硇木怼⒒ㄒ?、胡蘿卜、甜菜、甘薯和果實(shí)如蘋果、梨、桃子、甜瓜和幾種熱帶水果如芒果和香蕉是有市場的。
對(duì)于所有對(duì)生物體產(chǎn)生損害的細(xì)胞如病原體細(xì)胞和癌細(xì)胞都期望生長降低。在后一方面通過改變T-6-P的水平，能看到在調(diào)節(jié)生長方面的作用。T-6-P水平的增加能降低癌組織的生長和代謝。一種升高細(xì)胞內(nèi)T-6-P水平的方法是通過引入在內(nèi)源TPP基因中引起一種突變的特異性重組事件來敲除這些細(xì)胞中的TPP基因。這樣做的一種方法是通過一種癌細(xì)胞特異性內(nèi)源化抗體在內(nèi)源基因上導(dǎo)入一個(gè)能介導(dǎo)突變的DNA序列。另一種方法是用該DNA進(jìn)行定點(diǎn)微粒轟擊。第三種方法是可以使用一個(gè)癌細(xì)胞特異性病毒載體。
伴隨T-6-P濃度的升高可見綠色更深的現(xiàn)象，這對(duì)于盆載花植物以及一般地用于園藝的種類和用于欣賞的草都是一種需要的特性。
T-6-P水平的增加也引起儲(chǔ)存碳水化合物例如淀粉和蔗糖的增加。這將意味著儲(chǔ)存碳水化合物的組織將會(huì)儲(chǔ)存更多的物質(zhì)。這可以通過實(shí)施例來說明，其中所示在植物中儲(chǔ)存器官例如塊莖生物量增加和如在甜菜中形成變粗的根(蔗糖的儲(chǔ)存)。
可從中受益的作物是馬鈴薯、甜菜、胡蘿卜、菊苣和甘蔗。
在馬鈴薯中另一個(gè)經(jīng)濟(jì)上重要的效應(yīng)是用編碼TPS基因的DNA轉(zhuǎn)化后(造成T-6-P的增加)，即使在低溫(4℃)下收獲和儲(chǔ)存塊莖，也可以發(fā)現(xiàn)可溶性糖量降低。正常情況下為了防止早發(fā)芽，需要更冷的儲(chǔ)存條件，但這樣會(huì)造成馬鈴薯的過度甜化。還原糖量的減少對(duì)食品工業(yè)是很重要的，因?yàn)樵谶€原糖和氨基酸之間發(fā)生美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)會(huì)變黑，故甜化的馬鈴薯塊莖材料不適合于加工。
同樣用編碼TPS酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化甜菜，也可以獲得蔗糖酶活性的抑制。在甜菜抑制其蔗糖酶的活性在經(jīng)濟(jì)上是非常重要的。
同樣，在果實(shí)和種子中，可以改變儲(chǔ)存。這不僅能導(dǎo)致儲(chǔ)存量的增加，而且使儲(chǔ)存化合物的組成也發(fā)生變化。種子產(chǎn)量的提高對(duì)玉米、水稻、谷類、豌豆、油籽油菜、向日葵、大豆和豆科植物的作物極其重要。此外，對(duì)所儲(chǔ)存的碳水化合物的組成和量進(jìn)行改變對(duì)于所有帶果實(shí)的植物是重要的。尤其是對(duì)水果，儲(chǔ)存產(chǎn)物的組成在硬度上產(chǎn)生改變，這對(duì)于如西紅柿、香蕉、草莓、桃子、櫻桃和葡萄等軟水果尤其重要。
與TPP表達(dá)所看到的效應(yīng)相反，TPS的表達(dá)降低了葉中蛋白質(zhì)/碳水化合物的比率。這種效果在多葉作物例如飼料草和苜蓿中重要。此外，生物量降低的葉在amenity草中重要，但更重要的是它們有相對(duì)增加的能量含量。這個(gè)特性對(duì)如洋蔥、韭蔥和青貯玉米等作物是尤其有益的。
此外細(xì)胞內(nèi)T-6-P可得量的水平可影響種子的生存力。
TPP在一種植物的一部分表達(dá)與TPS在此植物另一部分的表達(dá)的聯(lián)合能協(xié)同增加上述描述的效果，也有可能通過使用特異性啟動(dòng)子在發(fā)育過程中連續(xù)表達(dá)基因。最后，通過將編碼序列置于可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的控制下，也有可能誘導(dǎo)所參與的基因中任意一個(gè)的表達(dá)。可以想象所描述的應(yīng)用方法的聯(lián)合對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步闡明。應(yīng)強(qiáng)調(diào)這些實(shí)施例表示本發(fā)明特殊的實(shí)施方案，但應(yīng)清楚的是本發(fā)明也覆蓋這些實(shí)施例中的變化以及使用其它植物或表達(dá)系統(tǒng)。
實(shí)施例DNA操作所有DNA操作(從大腸桿菌中分離DNA、限制性酶切、連接，轉(zhuǎn)化，等)均依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法(Sambrook等人。(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular cloning:a laboratory manual)，第二版Cold spring Harborlaboratory出版社，CSH，紐約)來進(jìn)行。菌種在所有實(shí)施例中大腸桿菌K-12菌種DH5α被用于克隆。用于植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的根癌土壤桿菌菌種是EHA105和MOG101(Hood等人(1993)Trans.Research2,208)。土壤桿菌菌種MOG101的構(gòu)建土壤桿菌菌種MOG101的構(gòu)建如WO96/21030中所述。大腸桿菌OtsA基因的克隆和pMOG799的構(gòu)建在大腸桿菌中磷酸海藻糖合成酶(TPS)由位于操縱子OtsBA中的OtsA基因所編碼。otsA基因的克隆和序列測定在WO95/01446的實(shí)施例Ⅰ中被詳述，此處引用作為參考。為了實(shí)現(xiàn)它在植物細(xì)胞中的表達(dá)，如在WO95/01446的實(shí)施例Ⅰ中更詳細(xì)說明，開放閱讀框架已與CaMV 35SRNA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件、ALMV引導(dǎo)子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及nos基因的轉(zhuǎn)錄終止子相連，得到pMOG799。含有pMOG799的大腸桿菌樣品已按照布達(dá)佩斯條約于1993年8月23日(星期一)保藏在真菌菌種保藏中心(CBS),Oosterstraat 1,P.O.Box 273,3740 AG Baarn，荷蘭國際保藏研究所的保藏號(hào)為CBS430.93。patatin啟動(dòng)子的分離/pMOG546的構(gòu)建利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將一個(gè)patatin啟動(dòng)子片段從馬鈴薯(Solanum.tuberosum)的染色體DNA中分離出來。合成一套與λpat21 patatin基因上游區(qū)域序列(Bevan等人(1986)核酸研究14,5564)互補(bǔ)的一套寡核苷酸，包括下列序列5′AAG CTT ATG TTG CCA TAT AGA GTA G 3′PatB32.2(SEQIDNO:5)5′GTA GTT GCC ATG GTG CAA ATG TTC 3′PatATG.2(SEQIDNO:6)以從馬鈴薯中分離的染色體DNA為模板，用這些引物進(jìn)行PCR以擴(kuò)增一個(gè)1123bp的DNA片段。擴(kuò)增的片段與λpat21 patatin序列有很高程度的類似性，并用EcoRⅠ接頭克隆進(jìn)pUC18載體，得到質(zhì)粒pMOG546。構(gòu)建pMOG845pMOG845的構(gòu)建在WO96/21030中描述。pVDH318，質(zhì)體藍(lán)素-TPS的構(gòu)建質(zhì)粒pMOG798(在WO95/01446中描述)用HindⅢ消化，且與寡核苷酸二聚體TCV11和TCV12連接(見pMOG845的構(gòu)建)。產(chǎn)生的載體用PstⅠ和HindⅢ酶切，再插入PotPiⅡ終止子產(chǎn)生pTCV118。質(zhì)粒pTCV118用SmaⅠ和HindⅢ酶切產(chǎn)生含有TPS編碼區(qū)域和PotPiⅡ終止子的DNA片段。加入BglⅡ接頭，將所得片段插入用BamHⅠ消化的植物二元表達(dá)載體pVDH275(圖.1)中，產(chǎn)生pVDH318。pVDH275是pMOG23(Sijmons等人。(1990),Bio/Technol.8.217)的衍生質(zhì)粒，其帶有在35S CaMV啟動(dòng)子控制下的NPTⅡ選擇標(biāo)記和含有豌豆質(zhì)體藍(lán)素(PC)啟動(dòng)子以及nos終止子序列的表述盒。存在于pVDH275中的質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子已由Pwee Gray(1993)植物雜志(Plant J.)3,437描述。使用PCR擴(kuò)增和含有合適克隆位點(diǎn)的引物將此啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入二元載體中。大腸桿菌otsB基的克隆和pMOG1010的構(gòu)建(35S CaMV TPP)合成一套與大腸桿菌TPP基因(SEQ ID NO:3)序列互補(bǔ)的寡核苷酸，TPPⅠ(5′CTCAGATCTGGCCACAAA 3′)(SEQ ID NO:56)和TPPⅡ(5′GTGCTCGTCTGCAGGTGC 3′)(SEQ ID NO:57)。使用pMOG748(WO95/01446)做為模板，將這些引物用于PCR擴(kuò)增375bp的DNA片段，此片段帶有大腸桿菌TPP基因編碼區(qū)域的3′部分，并在終止密碼子的下游10bp處導(dǎo)入一個(gè)PstⅠ位點(diǎn)。此PCR片段用BglⅡ和PstⅠ酶切并克隆進(jìn)pMOG445(EP0449376A2實(shí)施例7a)，并用BglⅡ和PstⅠ線性化。產(chǎn)生的載體用PstⅠ和HindⅢ酶切，插入一個(gè)PotPiⅡ終止子(見pMOG845的構(gòu)建)。前面描述的載體用BglⅡ和HindⅢ酶切，分離產(chǎn)生的1325bp片段，并和用SmaⅠ和BglⅡ酶切的5′TPPPCR片段一同克隆進(jìn)用SmaⅠ和HindⅢ線性化的pUC18中。產(chǎn)生的載體稱為pTCV124。此載體用EcoRⅠ和SmaⅠ線性化并用于插入35S CaMV啟動(dòng)子(一個(gè)從含有35S CaMV雙增強(qiáng)子啟動(dòng)子的pMOG18中分離的850bp EcoRⅠ-‘NcoⅠ’(NcoⅠ位點(diǎn)由綠豆核酸酶處理變成平端)片段)。此載體稱為pTCV127。從這個(gè)載體中分離一個(gè)含有完整35S TPP表達(dá)盒的2.8kb EcoRⅠ-HindⅢ片段，并克隆進(jìn)二元載體pMOG800，產(chǎn)生pMOG1010載體。pVDH321，質(zhì)體藍(lán)素(PC)TPP的構(gòu)建通過BamHⅠ消化、補(bǔ)平及隨后再連接，去除質(zhì)粒pTCV124的BamHⅠ位點(diǎn)。隨后再用HindⅢ和EcoRⅠ酶切產(chǎn)生一個(gè)包含TPP編碼區(qū)域和PotPiⅡ終止子的DNA片段。加入BamHⅠ接頭，將所得片段插入植物二元表達(dá)載體pVDH275中(用BamHⅠ消化)，產(chǎn)生pVDH321。Patatin TPP表達(dá)載體的構(gòu)建與Patatin TPS表達(dá)載體的構(gòu)建(見pMOG845的構(gòu)建)類似，構(gòu)建一個(gè)Patatin TPP表達(dá)載體以產(chǎn)生一個(gè)二元載體(pMOG1128)，其在轉(zhuǎn)化以后能以塊莖特異性的方式實(shí)現(xiàn)TPP的表達(dá)。其它表達(dá)載體的構(gòu)建與上述提及的載體的構(gòu)建類似，使用帶有NPTⅡ基因或潮霉素抗性基因做為選擇性標(biāo)記基因的二元載體，應(yīng)用聯(lián)合TPS、TPP或海藻糖酶的不同的啟動(dòng)子構(gòu)建基因構(gòu)建體。帶有HPT選擇標(biāo)記的二元載體pMOG22的說明見Goddijn等人(1993)植物雜志4,863。三親交配在與含質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌菌株HB101(Ditta等人(1980)美國國家科學(xué)院院報(bào)77,7347)的三親交配中二元載體被移至根癌土壤桿菌菌株MOG101或EHA105中并用于轉(zhuǎn)化。煙草(Nicotiana tabacum cv.SR1或cv.Samsun NN)的轉(zhuǎn)化通過植物組織與含有所述的目的二元載體的根癌土壤桿菌菌株MOG101共同培養(yǎng)轉(zhuǎn)化煙草。使用如由Horsch等人(1985)科學(xué)227，1229中描述的煙草葉盤共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因植物從生長在含有卡那霉素的培養(yǎng)基的苗中再生，生根并轉(zhuǎn)移到土壤中。馬鈴薯的轉(zhuǎn)化馬鈴薯(Solanum tuberosum cv.Kardal)用含有目的二元載體的土壤桿菌菌株EHA105轉(zhuǎn)化?；九囵B(yǎng)基是MS30R3培養(yǎng)基，其包括MS鹽(Murashige和Skoog(1962)植物生理14,473),R3維生素(Ooms等人(1987)Theor.Appl.Genet.73,744),30g/L蔗糖，0.5g/L MES，最終pH5.8(用KOH調(diào)節(jié))，需要時(shí)用8g/L Daichin瓊脂固化。馬鈴薯的塊莖削皮后并通過在96％乙醇中燃燒5秒鐘進(jìn)行表面消毒。在無菌水中熄滅火焰，切成約2mm厚的片。用一個(gè)鉆從脈管組織中切出園片，在含有帶二元載體的1-5×108細(xì)菌/ml的土壤桿菌EHA105的MS30R3培養(yǎng)基中孵育20分鐘。用MS30R3培養(yǎng)基沖洗塊莖園片并轉(zhuǎn)移到凝固的后培養(yǎng)(Postculthre)培養(yǎng)基(PM)中。PM包括補(bǔ)充有3.5mg/L玉米素核苷和0.03mg/L吲哚乙酸(IAA)的M30R3培養(yǎng)基。兩天后將園片轉(zhuǎn)移至含有200mg/L頭孢噻肟和100mg/L萬古霉素的新鮮PM培養(yǎng)基中。三天后，塊莖園片被轉(zhuǎn)移到苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SIM)中，其包括加有250mg/L羧芐青霉素和100mg/L卡那霉素的PM培養(yǎng)基。4-8周后，剪去從園片中生出的苗，置于生根培養(yǎng)基上(加有100mg/L頭孢噻肟，50mg/L萬古霉素和50mg/L卡那霉素的MS30R3培養(yǎng)基)。經(jīng)過分生組織切割無菌性地繁殖苗。萵苣的轉(zhuǎn)化依據(jù)Curtis等人(1994)J.Exp.Bot.45,1441進(jìn)行萵苣(Lattuac sativacv.Evola)的轉(zhuǎn)化。甜菜的轉(zhuǎn)化依據(jù)Fry等人(1991)ISPMB第三屆國際大會(huì)，Tucson USA文摘NO.384，或依據(jù)Krens等人(1996)植物科學(xué)(Plant Sci)116,97進(jìn)行甜菜(Beta vulagaris維持群)的轉(zhuǎn)化。番茄(Lycopersicon esculentum)的轉(zhuǎn)化依據(jù)Van Roekel等人(1993)Plant cell Rep.12,644進(jìn)行西紅柿的轉(zhuǎn)化。擬南芥(Arabidopsis)的轉(zhuǎn)化通過Clarke等人(1992)Plant.Mol.Biol.Rep.10,178描述的方法或通過Valvekens等人(1988)美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，85,5536描述的方法進(jìn)行擬南芥(Arabidopsis thaliana)的轉(zhuǎn)化。微塊莖的誘導(dǎo)帶有輔助性分生組織的體外馬鈴薯植物的莖片段被轉(zhuǎn)移到微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有補(bǔ)充R3維生素、0.5g/L MES(最終pH=5.8，用KOH調(diào)節(jié))和用8g/L Daichin瓊脂固化的、60g/L蔗糖和2.5mg/L激動(dòng)素的1X MS鹽。在24℃下黑暗中生長3至5周后，形成微塊莖。有效霉素A的分離已發(fā)現(xiàn)有效霉素A是各種來源的范圍從(IC50)10-6M至10-10M的海藻糖酶的高度特異抑制劑(Asano等人(1987)抗生素雜志(J.Antibiot.)40,526；Kameda等人(1987)抗生素雜志40,563)。除了海藻糖酶，它并不特異性抑制任何α-或β-糖基水解酶(glycohydrolase)活性。有效霉素A從Solacol,由Kendall等人(1990)植物化學(xué)(Phytochemistry)29,2525所描述的一種商業(yè)化農(nóng)用制劑(Takeda chem.Indust.,Tokyo)中分離。步驟包括將3％Solacol農(nóng)用制劑經(jīng)過離子交換層析(QAE-Sephadex A-25(Pharmacia)，床體積10ml，平衡緩沖液0.2mM Na-Pi,pH7)。將1mlSolacol上柱并用水洗脫為7個(gè)流份，實(shí)際上所有的有效霉素均從第4流份內(nèi)回收。依據(jù)100％的回收率，使用這個(gè)步驟，有效霉素A的濃度在MS培養(yǎng)基中被調(diào)至1.10-3M以用于海藻糖積累實(shí)驗(yàn)。此外，有效霉素A和B也可如Iwasa等人(1971)抗生素雜志24,119所述的直接從吸水鏈霉菌檸檬亞種(Strepotomyces hygroscopicus var.Limoneus)中純化，此處引入其內(nèi)容作為參考。碳水化合物分析通過帶有脈沖電化學(xué)探測的陰離子交換層析來定量測定碳水化合物。通過用80％乙醇抽提勻漿的冷凍材料制備抽提液。在室溫下抽提15分鐘后，蒸發(fā)可溶部分并溶于蒸餾水中。樣品(25μl)在配有4×250mmDionex 35391 Carbopac PA-1柱和4×50mm Dionex 43096 CarbopacPA-1預(yù)柱的Dionex DX-300液相層析儀上分析。用1ml/min的100mMNaOH及隨后的NaAC梯度洗脫。用脈沖電化學(xué)探測器(Dionex,PED)來檢測糖。商業(yè)可得的碳水化合物(Sigma)用作標(biāo)準(zhǔn)品。淀粉分析淀粉分析如在Aman等人(1994)碳水化合物方法(Methods inCarbohydrate Chemistry),Volume x(BeMiller等人編)，111-115頁所述進(jìn)行。表達(dá)分析導(dǎo)入各種植物種類中的基因的表達(dá)用Northern雜交分析來監(jiān)測。海藻糖-6-磷酸磷酸酶測定通過測定從[14C]海藻糖-6-磷酸而來的[14C]海藻糖的生成(Londesborough和Vuorio(1991)普通微生物學(xué)雜志(J.of Gen.Microbiol.)137,323)在37℃下測定TPP。粗抽提液在含5.5mMMgCl2,25mM Tris-HCl,pH7.4中制備。樣品在含有1mg/ml BSA的抽提緩沖液中稀釋至1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度。標(biāo)準(zhǔn)測定混合物(終體積50μl)含有27.5mM Tris-HCl,pH7.4,5.5mM MgCl2,1mg/ml BSA和0.55M T-6-P(特異性活性854cpm/nmol)。通過加入5μl酶起始反應(yīng)，1小時(shí)后通過在沸水中加熱5分鐘終止反應(yīng)。加入AG1-X8(甲酸鹽)陰離子交換樹脂(BioRad)，反應(yīng)混合物在室溫下平衡20分鐘后離心。通過液體閃爍計(jì)數(shù)儀測定樣品上清中(400μl)的放射性。用于己糖激酶測定的植物抽提液的制備在液氮中研磨冷凍植物材料且用含有完全蛋白酶抑制劑(BoehringerMannheim)的抽提緩沖液(EB:100mM HEPES pH7.0(KOH),1％(w/v)PVP,5mM MgCl2,1.5mM EDTA,0.1％v/v β-MeOH)勻漿30秒。離心后上清中的蛋白質(zhì)用80％硫酸銨沉淀，并溶于Tris-HCl pH7.4中，抽提液用100mM Tris-HCl pH7.4透析過夜。一部分樣品用于己糖激酶的測定。己糖激酶測定在含有0.1M Hepes-KOH pH7.0,4mM MgCl2,5mM ATP,0.2mMNADP+,10U/ml磷酸肌酸激酶(溶于50％甘油，0.1％BSA,50mMHepes pH7.0中),3.5mM磷酸肌酸、7U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和2mM葡萄糖的測定液中通過測定25℃下340nm OD值的上升而測定己糖激酶活性。當(dāng)用2mM果糖而不是用葡萄糖作為己糖激酶反應(yīng)的底物時(shí)，還包括3.8U/ml磷酸葡糖異構(gòu)酶。另外，使用由Gancedo等人(1977)生物化學(xué)(J.Biol.Chem.)252,4443所述的己糖激酶測定法。
實(shí)施例1
大腸桿菌otsA基因(TPS)在煙草和馬鈴薯中的表達(dá)產(chǎn)生了帶有由de35S CaMV啟動(dòng)子(pMOG799)或質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(pVDH318)啟動(dòng)的otsA基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物。
產(chǎn)生了帶有由馬鈴薯塊莖特異性Patatin啟動(dòng)子(pMOG845)啟動(dòng)的otsA基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物。
使用根癌土壤桿菌用二元載體pMOG799轉(zhuǎn)化煙草葉盤。在卡那霉素上選擇轉(zhuǎn)基因苗。一些土壤生長型植物的葉子在側(cè)向上并不完全展開，導(dǎo)致了一種披針形形態(tài)(圖.31)。此外，頂端優(yōu)勢的降低導(dǎo)致矮化生長及幾個(gè)腋生芽的形成。32株植物中的7株表現(xiàn)為嚴(yán)重的生長減退，在開花時(shí)植物長度達(dá)到4-30cm(表1)。表1．otsA轉(zhuǎn)基因煙草植物葉樣品中海藻糖的積累和在開花時(shí)植株的高度

ND=未測定對(duì)照植物在開花時(shí)長度達(dá)到60-70cm。帶有矮化生長表型的轉(zhuǎn)基因品系產(chǎn)生較少的種子。Northern雜交分析證實(shí)有矮化生長表型的植物表達(dá)了來源于大腸桿菌的otsA基因(圖2)。在對(duì)照植物中檢測不到轉(zhuǎn)錄物。通過對(duì)來自32株轉(zhuǎn)基因的溫室生長煙草植物的葉材料的碳水化合物分析證明了所導(dǎo)入基因的功能性，揭示在長度減少的植物中存在每克鮮重(Fresh weight)中范圍從0.02至0.12mg的海藻糖(表1)，表明TPS催化的反應(yīng)產(chǎn)物被植物磷酸酶去磷酸化。通過用豬海藻糖酶處理粗抽提液獲得在煙草中海藻糖積累的進(jìn)一步證據(jù)。延長煙草葉抽提液與海藻糖酶的孵育導(dǎo)致海藻糖的完全降解(數(shù)據(jù)未顯示)。在對(duì)照植物或沒有異常表型的轉(zhuǎn)基因煙草植物中沒有檢測到海藻糖。表1a初始PC-TPS煙草轉(zhuǎn)化物

pVDH318轉(zhuǎn)基因煙草植物發(fā)育成矮化生長，并長出比對(duì)照葉子綠色更深且稍厚的小葉子，一種類似于pMOG799轉(zhuǎn)基因植物的表型(表1a)。進(jìn)一步分析這些葉子表明與對(duì)照相比每個(gè)葉面積的鮮重和干重量(表1a和2)增加。深綠色葉子表明在轉(zhuǎn)基因葉子中存在更多的葉綠素(表1b)。pMOG799(35STPS)和pMOG1177(PCTPS)轉(zhuǎn)基因的植物在可溶性碳水化合物、葉綠素、海藻糖和淀粉方面進(jìn)行分析(圖.32)。pMOG1177在功能上與pVDH318相同。
表1b.PC-TPS轉(zhuǎn)基因煙草(N.tabacum)葉(To)中葉綠素的含量

注生長過程中光照條件會(huì)顯著影響葉綠素的確切水平。葉綠素的計(jì)算含量只可在一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)收獲和分析的植物之間進(jìn)行比較。
表2．質(zhì)體藍(lán)素TPS E.coli轉(zhuǎn)基因葉材料的鮮重和干重PC-TPS轉(zhuǎn)基因煙草N.Tabacum cv.Samsun NN


長出的葉長度和寬度之比的計(jì)算清楚地表明PC-TPS轉(zhuǎn)基因植物的葉更具披針形(表3)。
用帶有二元載體pMOG845的根癌土壤桿菌EHA105轉(zhuǎn)化馬鈴薯塊莖園片(Solanum tuberosum cv.Kardal)。以類似于空載體對(duì)照的轉(zhuǎn)化頻率獲得轉(zhuǎn)基因植物。所有獲得的植物在形態(tài)上與野生型植物沒有區(qū)別，表明組織特異性啟動(dòng)子的使用防止了在組成性啟動(dòng)子啟動(dòng)TPS基因的植物中所觀察到的表型。在加有10-3M有效霉素A的微塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因和野生型植物的莖部分以誘導(dǎo)微塊莖。作為對(duì)照，在不加有效霉素A的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)微塊莖。在加有效霉素A的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的微塊莖顯示比在未加有效霉素A的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的微塊基中海藻糖水平升高(表4)。在野生型植物中少量海藻糖的存在表明存在一個(gè)有功能的海藻糖生物合成途徑。表3 pVDH318轉(zhuǎn)基因煙草植物(cv.samsum NN)<

>*典型的TPS表型 對(duì)照的l/w比例平均為1.50
表4．海藻糖(％鮮重

施例2大腸桿菌otsB基因(TPP)在煙草中的表達(dá)產(chǎn)生了帶有由35S CaMV啟動(dòng)子(pMOG1010)和質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子(pVDH321)雙重加強(qiáng)啟動(dòng)的otsB基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物。
用pMOG1010轉(zhuǎn)化的煙草(cv.Samsun NN)表明在溫室中非常大的葉子的發(fā)育過程，(葉面積平均增加高達(dá)約140％)，當(dāng)其完全長成時(shí)會(huì)開始生成萎黃病(圖.31)。此外，與對(duì)照相比生成了更粗的莖，在一些情況下導(dǎo)致莖的脹破。在一些情況下從植物的基部生成多個(gè)莖(分枝)(表5)。長成大葉的植物的葉樣品與對(duì)照植物相比表明，海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性增加了5-6倍，這證明了所導(dǎo)入基因的功能。異常大葉子的干和鮮重/cm2與對(duì)照葉相類似，表明葉子大小的增加是由于干物質(zhì)的增加而不是水含量的增大?；ㄐ蛞彩躎PP表達(dá)的影響。有矮化表型的植物可能是由于TPP基因在所有植物部分的組成性表達(dá)引起。其長出許多并未完全成熟并掉落或壞死的小花?；ǖ陌l(fā)育和種子形成在不太矮化的植物中似乎所受的影響也較少。表5

表6初始PC-TPP煙草轉(zhuǎn)化物

wt=野生型用pVDH321轉(zhuǎn)化的煙草植物(cv.Samsun NN)揭示了在溫室中與pMOG1010轉(zhuǎn)基因植物相類似的一種發(fā)育模式(表6)。
pMOG1010(35S-TPP)和pMOG1124(PC-TPP)轉(zhuǎn)基因植物在碳水化合物、葉綠素、海藻糖和淀粉方面經(jīng)過分析。(圖.32)。葉綠素?cái)?shù)據(jù)也見表6a。
表6a.PC-TPP轉(zhuǎn)基因煙草葉(To)(N.tabacum)的葉綠素含量

注生長過程中的光照條件會(huì)顯著影響葉綠素的確切水平。葉綠素的計(jì)算含量只可在一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)收獲和分析的植物之間進(jìn)行比較。
實(shí)施例3編碼來源于卷柏(Selaginella lepidophylla)和向日葵(Helianthus annuus)的海藻糖-6-磷酸合成酶的基因片段的分離來自大腸桿菌和釀酒酵母的TPS蛋白質(zhì)序列的比較表明存在幾個(gè)保守區(qū)域。這些區(qū)域被用于設(shè)計(jì)簡并性引物，這些引物在使用大腸桿菌和酵母的基因組DNA做為模板的PCR擴(kuò)增中進(jìn)行測試。使用了一個(gè)帶有退火和延伸步驟之間的溫度循環(huán)以促進(jìn)簡并性引物的退火的PCR程序。
使用引物組TPSdeg 1/5和TPSdeg 2/5并以卷柏的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
所使用的簡并性引物(IUB密碼)TPSdeg1:GAY ITI ATI TGG RTI CAY GAY TAY CA (SEQ IDNO:7)TPSdeg2:TIG GIT KIT TYY TIC AYA YIC CIT TYC C(SEQ IDNO:8)TPSdeg5:GYI ACI ARR TTC ATI CCR TCI C(SEQ IDNO:9)克隆了預(yù)期大小的PCR片段并測序。因?yàn)榉蛛x了許多同源序列，用Southern雜交分析確定哪一個(gè)克隆可與卷柏屬基因組DNA雜交。分離到兩個(gè)克隆，其中克隆8的序列在SEQ ID NO:42(PCR引物組合1/5)中給出，克隆43的序列在SEQ ID NO:44(PCR引物組合2/5)中給出，它們?cè)诎被崴缴巷@示出與大腸桿菌和酵母來源的TPS基因有高百分比的相同區(qū)域。
使用PCR組合TPSdeg 2/5在以向日葵基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增中從向日葵中分離了一個(gè)TPS基因。序列分析和Southern雜交證實(shí)與來源于大腸桿菌、酵母和卷柏屬的TPS基因有同源性。用各種生物體中來源的EST序列(表達(dá)的序列標(biāo)鑒)與這些序列比較，見表6b和SEQ IDNOS 45-53和41，表明在水稻和擬南芥屬中存在高度同源基因，這支持了我們的發(fā)明即大多數(shù)植物均含有TPS同源基因(圖.3)。Table 6b

<p>實(shí)施例4從煙草(Nicotiana tabacum)中分離植物TPS和TPP基因使用PCR在來源于煙草葉總RNA制備物的cDNA上分離出植物編碼TPS和TPP的cDNA片段。表7中“嵌套式”一欄表示是否需要用引物組3和4進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增以獲取相應(yīng)的DNA片段。引物均包括在序列表中(表7)。用提及的引物組獲得的DNA片段的亞克隆和隨后的序列分析表明其與已知的TPS基因基本同源(圖.4&amp;5)。
表7植物來源的TPS和TPP cDNA的擴(kuò)增


實(shí)施例5來自向日葵(Helianthus annuus)和煙草(Nicotiana tabacum)的一種兩分TPS/TPP基因的分離使用來自向日葵的TPS基因片段的序列信息，利用RACE-PCR技術(shù)獲得一全長向日葵TPS克隆。全長克隆的序列分析以及TPS和TPP編碼序列與來自酵母的TPS2的序列比較(圖.6)表明分離的克隆編碼一種TPS/TPP兩分酶(SEQ ID NO 24,26和28)。分離的兩分克隆(pMOG1192)依布達(dá)佩斯條約的規(guī)定已于1997年4月21日以保藏號(hào)CBS692.97保藏于菌種保藏中心局(Central Bureau for Strain collections)中。隨后我們考察了是否其它植物種類也含有TPS/TPP兩分克隆。從煙草中擴(kuò)增出來一種TPS/TPP cDNA。用引物TPS deg1/TRE-TPP-16 PCR以及用引物TPS deg2/TRE-TPP-15(SEQ ID NO:33)嵌套式PCR(nestedPCR)后檢測到一個(gè)預(yù)期大小的DNA產(chǎn)物(即1.5kb)。用TPS deg1/TRE-TPP-6(SEQ ID NO:34)PCR以及用引物TPS deg2/TRE-TPP-15嵌套式PCR后出現(xiàn)相同的帶。后一片段在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中可與向日葵兩分cDNA雜交。此外使用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)檢索，確認(rèn)了一種擬南芥(Arabidopsis)兩分克隆(SEQ ID NO:39)。
實(shí)施例6植物來源的TPS基因在植物中的表達(dá)通過分離TPS基因相應(yīng)的全長cDNA克隆并隨后在植物中35SCaMV動(dòng)子控制下表達(dá)這些克隆，獲得來源于向日葵和卷柏(Selaginellalepidophylla)TPS基因功能的進(jìn)一步證據(jù)。通過卷柏屬酶的表達(dá)產(chǎn)生的海藻糖的積累已被Zentella和Iturriaga(1996)(植物生理111，文摘88)所報(bào)道。
實(shí)施例7來自單子葉植物種類的編碼TPS和TPP的基因在Genebank序列中的計(jì)算機(jī)檢索表明存在幾個(gè)與來自酵母的TPS1和TPS2同源的水稻EST序列(圖.7)，它們已包括在序列表中(SEQ IDNO:41,51,52和53)。
實(shí)施例8人TPS基因的分離從人cDNA中分離TPS基因。使用簡并性TPS引物deg2和deg5在人cDNA上進(jìn)行PCR反應(yīng)。這產(chǎn)生了預(yù)期的0.6kb的TPS片段。序列分析(SEQ ID NO 10)和與TPSyeast的序列比較表明分離的序列編碼一個(gè)同源的TPS蛋白(圖.8)實(shí)施例9通過反義抑制以抑制內(nèi)源性TPS的表達(dá)通過在需要抑制的細(xì)胞或組織中在啟動(dòng)反義TPS基因的啟動(dòng)子控制下，同源TPS基因的反義表達(dá)可以抑制內(nèi)源性TPS基因的表達(dá)。盡管在一反義表達(dá)載體中并不需要表達(dá)完整的編碼區(qū)域，此方法中，優(yōu)選使用與所要抑制的TPS基因完全相同的序列。這種編碼區(qū)域的片段已證明在基因表達(dá)的反義抑制中是有功能的。此外，與內(nèi)源基因有足夠的同源性的異源基因可以用于反義的方法。
只要保證所抑制的導(dǎo)入基因的編碼區(qū)域以反方向?qū)胍部墒褂门cpMOG845和pMOG1010類似的二元載體。適于在靶組織中啟動(dòng)基因表達(dá)的所有合適的啟動(dòng)子也適合于基因的反義表達(dá)。
實(shí)施例10通過反義抑制以抑制內(nèi)源性TPP的表達(dá)與可用于在細(xì)胞和組織中啟動(dòng)TPS反義表達(dá)的載體的構(gòu)建相類似(實(shí)施例9)，構(gòu)建了啟動(dòng)TPP基因反義表達(dá)的載體。
實(shí)施例11在有效霉素A上生長的野生型煙草和馬鈴薯植物中海藻糖的積累通過在有10-3M海藻糖酶抑制劑有效霉素A中培養(yǎng)野生型植物獲得了在煙草中存在海藻糖生物合成途徑的證據(jù)。經(jīng)過處理的植物積累非常少量的海藻糖，最多達(dá)0.0021％(鮮重)。在培養(yǎng)于未加抑制劑的任何對(duì)照植物中從未檢測到海藻糖的積累。用培養(yǎng)于有效霉素A中的野生型微塊莖也可獲得類似數(shù)據(jù)。17個(gè)品系中有10個(gè)積累平均0.001％海藻糖(鮮重)(表4)。在未加有效霉素A的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的微塊莖中未觀察到海藻糖。
實(shí)施例12在反義海藻糖酶轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中海藻糖的積累用一個(gè)35S CaMV反義海藻糖酶構(gòu)建體(SEQ ID NO:54和55,pMOG1027；描述于WO96/21030中)轉(zhuǎn)化野生型馬鈴薯植物獲得存在內(nèi)源性海藻糖生物合成基因的進(jìn)一步證據(jù)。一個(gè)pMOG1027轉(zhuǎn)基因馬鈴薯苗在鮮重基礎(chǔ)上表現(xiàn)出海藻糖積累達(dá)0.008％。通過用海藻糖酶特異性降解積累的海藻糖證實(shí)了所觀察到的海藻糖峰是相同的。一些pMOG1027轉(zhuǎn)基因品系的莖顯示積累了少量海藻糖(圖.9)。
實(shí)施例13通過海藻糖-6-磷酸抑制植物己糖激酶的活性為了證明海藻糖-6-磷酸對(duì)己糖激酶活性的調(diào)節(jié)作用，制備植物抽提液并在缺少和存在海藻糖-6-磷酸的情況下檢測己糖激酶活性?！び霉?圖.10，圖.11)和葡萄糖(圖.11)作為底物檢測馬鈴薯塊莖抽提液。依據(jù)Gancedo等人(1997)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)252,4443使用1mM T-6-P和果糖作為底物進(jìn)行馬鈴薯塊莖檢測。依據(jù)在實(shí)驗(yàn)部分描述的方法對(duì)煙草，水稻和玉米進(jìn)行下列檢測。·使用果糖(圖.12)和葡萄糖(圖.12和圖.13)作為底物檢測煙草葉抽提液?！な褂霉呛推咸烟?圖.14)作為底物檢測水稻葉抽提液?！な褂霉呛推咸烟?圖.15)作為底物檢測玉米葉抽提液。
實(shí)施例14
通過海藻糖-6-磷酸在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制己糖激酶的活性為了證明在動(dòng)物細(xì)胞中己糖激酶活性的調(diào)節(jié)，從小鼠雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中制備總細(xì)胞抽提液。在如Gancedo等人所述的條件(見上)下使用葡萄糖或果糖作為底物進(jìn)行己糖激酶檢測。通過將細(xì)胞沉淀先后置于20％蔗糖和蒸餾水中將小鼠雜交瘤細(xì)胞滲透壓休克。此粗蛋白抽提液被用于己糖激酶測定(50μl抽提液相應(yīng)于約200μg蛋白質(zhì))中。
表8．通過T-6-P抑制動(dòng)物己糖激酶的活性

獲得的資料清楚地表明在小鼠細(xì)胞抽提液中的己糖激酶活性被海藻糖-6-磷酸抑制。觀察到此效果的T-6-P濃度范圍與在粗植物抽提液中觀察到的類似。使用葡萄糖或果糖為酶的底物，在用海藻糖-6-磷酸對(duì)己糖激酶活性抑制的效率上沒有可觀察到的差別。
實(shí)施例15表達(dá)TPS和TPP煙草植物的光合作用和呼吸作用使用35S-TPP(1010-5),PC-TPS(1318-10和1318-37)轉(zhuǎn)基因煙草植物和野生型煙草(Samsum NN)植物，確定在葉子中這些基因的表達(dá)對(duì)光合作用和呼吸作用的效果。
在氣體交換實(shí)驗(yàn)裝置上進(jìn)行測量。使用遠(yuǎn)紅外氣體分析設(shè)備依據(jù)進(jìn)氣和出氣之間濃度上的差別計(jì)算氣體交換速度。測定了來源于相同葉子的光合作用和呼吸作用。每一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中使用最年輕的，完全成熟的葉(上葉)和其下3-4層葉子的一個(gè)葉(下葉)。
在350vpm和950vpm的CO2濃度下四個(gè)樣品中以0-975μmol.m-2.S-1(200Watt m-2)的光合活性光強(qiáng)度(PAR)的函數(shù)測量光合作用。
使用兩個(gè)不同的時(shí)間尺度來測量呼吸作用。光合作用后短暫的黑暗時(shí)期內(nèi)進(jìn)行的測量在表9中記作RD。這些數(shù)值反應(yīng)了瞬時(shí)活性，因?yàn)楹粑饔没旧显诤诎禃r(shí)期發(fā)生變化。由此，整個(gè)夜間的數(shù)值也被總結(jié)在表10(只在350vpm CO2下測量)中。表9 光合作用和呼吸作用的速率，STD為標(biāo)差差

表10．在12小時(shí)黑暗時(shí)期內(nèi)的呼吸作用(mmol CO2)STD是標(biāo)準(zhǔn)差

與上葉中的呼吸作用相比較，在下葉中TPS轉(zhuǎn)基因植物的呼吸作用顯著高于野生型和TPP植物(表10)，表明代謝活性更高。對(duì)于TPS轉(zhuǎn)基因植物在葉衰老過程中呼吸作用的下降明顯較少。
同樣，在TPS轉(zhuǎn)基因植物、TPP轉(zhuǎn)基因植物和野生對(duì)照植物之間光合特征顯著不同。AMAX值(在光飽和時(shí)光合作用最大值)、光合作用的效率(EFF)和光合作用測量后在短暫黑暗時(shí)期內(nèi)呼吸作用速率(RD)示于表9。平均來說，TPS上葉比TPP和野生型的上葉AMAX值高35％。下葉則顯示光合作用增加的速率更高(88％)。
為了排除光吸收的不同所引起的不同的光合速率，用SPAD-502(Minolta)測量吸收值。在吸收上未測出顯著差異(表11)。
表11．轉(zhuǎn)基因品系的光吸收值

實(shí)施例16表達(dá)TPS和TPP煙草植物的葉綠素?zé)晒馐褂?5S-TPP(1010-5)、PC-TPS(1318-10和1318-37)轉(zhuǎn)基因煙草植物和野生型煙草(Samsum NN)植物，確定表達(dá)這些基因?qū)θ~材料的葉綠素?zé)晒馑a(chǎn)生的效果。測量了熒光的兩個(gè)特征1)ETE(電子傳遞效率)，做為對(duì)電子傳遞速度和還原力產(chǎn)生的測量，及2)非光化學(xué)淬滅，一種對(duì)由同化產(chǎn)物積累所引起的能量分配的測量。
植物生長在加有100μmol.m-2.S-1(04:00-20:00小時(shí))光的溫室中。白天/夜晚T=21℃/18℃；R.H.±75％。在測量前的夜時(shí)期(持續(xù)16小時(shí))，將每個(gè)基因型的兩株植物轉(zhuǎn)移到黑暗中，兩株轉(zhuǎn)移到光照(±430μmol.m-2.S-1,20℃,R.H.70％)中。測量最年輕的完全成熟的葉子。PSⅡ(光系統(tǒng)Ⅱ)的光化學(xué)效率和“非光化學(xué)淬滅”參數(shù)被定為光強(qiáng)度增加的函數(shù)。在每一個(gè)光強(qiáng)度，采用300秒穩(wěn)定時(shí)間。用3次閃光/分的頻率，在350ppm CO2和20％O2的條件下分別對(duì)5,38,236,422和784μmol m-2.S-1PAR進(jìn)行測量。使用相同的植物逆轉(zhuǎn)從黑暗至光的預(yù)處理重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，反之亦然。熒光特征描述于圖.16。
在TPP和野生型植物之間電子傳遞效率(ETE)的降低相差不大。TPS植物明顯對(duì)光強(qiáng)度增加的反應(yīng)較小。這種差異在光預(yù)處理下最清楚。這些觀察與“非光化學(xué)”淬滅數(shù)據(jù)一致。與TPP和野生型植物相比，TPS植物明顯對(duì)由光提供的附加的同化產(chǎn)物補(bǔ)給反應(yīng)較小。在TPS植物中，對(duì)光合作用積累性同化產(chǎn)物的負(fù)調(diào)節(jié)顯著降低。
實(shí)施例17在表達(dá)TPS和TPP煙草植物中同化產(chǎn)物的輸出和分配使用35S-TPP(1010-5)和PC-TPS(1318-37)轉(zhuǎn)基因煙草植物，1)由完全長成的葉中碳同化產(chǎn)物的輸出(表明“相對(duì)源活性”，Koch(1996)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant.mol.Biol.47,509)和2)確定在光照和黑暗時(shí)期在池中光同化產(chǎn)物的凈積累(“相對(duì)池活性”)。
植物的發(fā)育階段花芽剛剛可見。使用的標(biāo)記技術(shù)穩(wěn)定態(tài)高豐度13C-標(biāo)記的光合產(chǎn)物(De Visser等人(1997)Plant Cell Environ 20,37)。對(duì)于兩個(gè)基因型的8株植物，使用完全長成的葉子進(jìn)行標(biāo)記，在光照時(shí)期(10小時(shí))用原子百分比5.1的13CO2標(biāo)記，當(dāng)合適時(shí)隨后接著一個(gè)黑暗時(shí)期(14小時(shí))。標(biāo)記之后植物被分成1)苗尖，2)新的正生長的葉，3)新的完全長成的葉(在被標(biāo)記葉的上方)，4)新莖(在被標(biāo)記葉的上方)，5)標(biāo)記的葉，6)標(biāo)記葉的柄和基底，7)正在老化的葉，8)低于標(biāo)記葉的其它葉和最老的葉，9)低于標(biāo)記葉的莖，10)根尖。確定了數(shù)目，鮮重和干重以及13C占C的百分比(13C原子百分比)。除了如生物量、干物質(zhì)和葉數(shù)目的一般參數(shù)，還計(jì)算了1)被標(biāo)記葉輸出的碳；2)在植物各個(gè)部分輸入碳的相對(duì)量；3)在植物各個(gè)部分輸入碳的絕對(duì)量，4)在光照時(shí)期和一個(gè)完全光照和黑暗時(shí)期輸入C的相對(duì)分布。
與TPS轉(zhuǎn)基因植物相比，TPP轉(zhuǎn)基因植物土壤以上部分的生物量大27％(P＜0.001)；TPP轉(zhuǎn)基因植物的根系統(tǒng)也發(fā)育得更好。與TPS植物相比，TPP植物的干物質(zhì)分布有明顯改變，葉和莖所占生物量分別為+39％和+10％。TPS植物有大量的葉子，但每個(gè)葉的葉面積較小。每個(gè)TPS植物總?cè)~面積與野生型(0.4m2植物-1)類似-完全發(fā)育葉的相對(duì)源活性使用植物(無被標(biāo)記葉)中“新碳”量作為尺度，通過夜間“新碳”的百分比相對(duì)下降(對(duì)TPP為39％和對(duì)TPS為56％)和通過在植物中總的固定量確定被標(biāo)記葉光合產(chǎn)物的凈輸出率。光照時(shí)期以后，相比于TPS葉的51％的輸出，TPP葉輸出為37％(表11)。在隨后的黑暗時(shí)期內(nèi)，此比例分別增加為52％(TPP)和81％(TPS)。兩種方法都支持這種結(jié)論相比于TPP轉(zhuǎn)基因植物，TPS轉(zhuǎn)基因植物的光合產(chǎn)物輸出率顯著提高。-在植物各個(gè)部分中“新碳”的絕對(duì)量與TPP轉(zhuǎn)基因植物相比，TPS轉(zhuǎn)基因植物的輸出明顯高。新生長的TPS葉的碳輸入強(qiáng)于新生長的TPP葉。-在植物各個(gè)部分中“新碳”的相對(duì)增加池強(qiáng)度“新碳”在相關(guān)植物部分的相對(duì)組成描述于圖.17中。此比例是池強(qiáng)度的一個(gè)標(biāo)尺。在TPS轉(zhuǎn)基因植物中池強(qiáng)度顯著較高，尤其在苗尖、被標(biāo)記葉以上和以下的莖中以及被標(biāo)記葉的柄中。表11.一個(gè)完全長成的被標(biāo)記葉的源活性碳積累和輸出。在光照時(shí)期(天)經(jīng)穩(wěn)定態(tài)13C標(biāo)記后在標(biāo)記葉和整個(gè)植物(土壤以上)中碳同化產(chǎn)物的凈日積累量和輸出量。N=4:LSD值表示對(duì)于P＜0.05時(shí)最小的顯著性差異

-在植物各個(gè)部分之間“新碳”在植物內(nèi)的相對(duì)分布相對(duì)池強(qiáng)度在植物器官之間固定碳的分布(圖.18)證實(shí)了上述的結(jié)論。TPS轉(zhuǎn)基因植物顯示出對(duì)苗尖、新的正生長的葉子(白天)和最老的葉子(無腋生分生組織)以及新莖和老莖均有相對(duì)大的同化產(chǎn)物的輸出。
實(shí)施例18萵苣PC-TPS和PCTPP轉(zhuǎn)基因萵苣植物的特性在萵苣轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用的構(gòu)建體PC-TPS和PC-TPP。通過將外植體培養(yǎng)在60g/L蔗糖中在再生過程中挽救PC-TPS轉(zhuǎn)基因植物。TPS和TPP轉(zhuǎn)基因植物的表型均與野生型對(duì)照有明顯區(qū)別的；與野生型植物相比，TPS轉(zhuǎn)基因植物有厚、深綠色的葉子，TPP轉(zhuǎn)基因植物帶有較光滑葉邊緣的淡綠色葉子。
葉子的形態(tài)，最顯著的是葉子邊緣，明顯地受TPS和TPP的表達(dá)的影響。PC-TPS轉(zhuǎn)基因的葉子比有著較光滑和圓形的PC-TPP轉(zhuǎn)基因的葉子有更多的“缺刻”(圖.19)。分析了轉(zhuǎn)基因萵苣品系的葉提取物中的糖和淀粉(圖.20)實(shí)施例19甜菜
PC-TPS和PC-TPP轉(zhuǎn)基因甜菜植物的特性在甜菜轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中所用構(gòu)建體是PC-TPS和PC-TPP。用TPS和TPP構(gòu)建體獲得的轉(zhuǎn)化效率和對(duì)照類似。TPS和TPP轉(zhuǎn)基因植物的表型和野生型對(duì)照均有明顯區(qū)別；與野生型植物相比較，TPS轉(zhuǎn)基因植物有厚、深綠色的葉子，TPP轉(zhuǎn)基因植物則帶有稍細(xì)長柄的淡綠色葉子(圖.21)。在溫室中生長約8周以后測定所有植物的主根直徑。具有與對(duì)照植物類似葉尺寸的一些PC-TPS轉(zhuǎn)基因品系主根直徑明顯更大(圖.22)。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，PC-TPP轉(zhuǎn)基因品系形成一個(gè)較小的主根。分析了轉(zhuǎn)基因甜菜品系的葉抽提液中的糖和淀粉(圖.20)。
實(shí)施例20擬南芥屬PC-TPS和PC-TPP轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬的特性用于擬南芥屬轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的構(gòu)建體PC-TPS和PC-TPP。TPS和TPP轉(zhuǎn)基因植物的表型均與野生型對(duì)照有明顯區(qū)別的；與野生型植物相比，TPS轉(zhuǎn)基因植物有厚、深綠色的葉子，TPP轉(zhuǎn)基因植物有更大的變白的葉子。具有高水平TPP表達(dá)的植物不結(jié)種。
實(shí)施例21馬鈴薯TPS和TPP結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯(Solanum tuberosum)的特性構(gòu)建體35S-TPS pMOG799pMOG799轉(zhuǎn)基因植物生長在溫室中，測定塊莖產(chǎn)量(圖.23)。與野生型對(duì)照相比，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物的葉子較小。與對(duì)照品系相比，具有較小葉子的植物產(chǎn)生較小的塊莖量(圖.25)。
構(gòu)建體35S-TPP pMOG1010和PC-TPP pMOG1124pMOG1010和pMOG1124轉(zhuǎn)基因植物生長于溫室中，測定塊莖的產(chǎn)量。塊莖量(圖.24)與野生型對(duì)照品系類似或更少(圖.25)。
構(gòu)建體PC-TPS pMOG1093pMOG1093轉(zhuǎn)基因植物生長于溫室中，測定塊莖的產(chǎn)量。與對(duì)照植物相比，許多轉(zhuǎn)基因品系的葉大小與野生型(B-C)類似，葉子顏色上略微顯淺綠色且產(chǎn)生更多的塊莖(圖.26)。比對(duì)照植物葉子小的植物(D-G)產(chǎn)生較少的塊莖量。
構(gòu)建體Pat-TPP pMOG1128在Pat-TPP轉(zhuǎn)基因植物的外植體上體外誘導(dǎo)微塊莖。形成的微塊莖的平均鮮重生物量基本上低于對(duì)照品系。
構(gòu)建體Pat-TPS pMOG845pMOG845轉(zhuǎn)基因植物生長在溫室中，測定了塊莖產(chǎn)量。與對(duì)照品系相比，三個(gè)Pat-TPS品系產(chǎn)生更多的塊莖量(圖.27)。
構(gòu)建體PC TPS Pat TPS；pMOG1129(845-11/22/28)用帶有PC TPS構(gòu)建體和一個(gè)潮霉素抗性標(biāo)記基因的pMOG1129構(gòu)建體再轉(zhuǎn)化Pat-TPS品系(卡那霉素抗性)產(chǎn)生同時(shí)表達(dá)PC TPS和Pat-TPS的植物，即產(chǎn)生基因型pMOG1129(845-11)、pMOG1129(845-22)和pMOG1129(845-28)。所產(chǎn)的塊莖量在幾乎不產(chǎn)生至與對(duì)照植物類似或高于對(duì)照植物的量之間變化(圖.28)。
實(shí)施例22煙草TPS和TPP構(gòu)建體轉(zhuǎn)化煙草(N.tabacum)植物的特性根系統(tǒng)35S TPP(pMOG1010或35S TPS(pMOG799)轉(zhuǎn)基因煙草植物生長在溫室中。在即將開花前測定根大小。與pMOG799轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因野生型煙草植物相比，pMOG1010轉(zhuǎn)基因品系的根大小明顯較小/較大。TPS和/或TPP表達(dá)對(duì)開花的影響。
35S-TPS,PC-TPS、35S-TPP或PC-TPP轉(zhuǎn)基因煙草植物培養(yǎng)在溫室中。與野生型植物相比，TPS基因表達(dá)水平高的植物的生長速率較低。在這些植物中較低的葉的開花和老化被延遲，導(dǎo)致正常的正在老化葉的常綠表型。TPP基因表達(dá)水平高的植物不產(chǎn)生任何花或產(chǎn)生異常的未完全發(fā)育的花芽，以至于絕育。TPS和/或TPP的表達(dá)對(duì)種子形成的影響35S-TPS、PC-TPS、35S-TPP或PC-TPP轉(zhuǎn)基因煙草植物培養(yǎng)在溫室中。TPP基因高水平表達(dá)的植物花的發(fā)育較差或不發(fā)育，并無種子形成。TPS和/或TPP的表達(dá)對(duì)種子萌發(fā)的影響35S TPP(pMOG1010)或PC TPP轉(zhuǎn)基因煙草植物生長于溫室中。有著低表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因的某些轉(zhuǎn)基因品系可以開花并結(jié)種。S1種子一旦萌發(fā)，與來源于野生型植物的S1種子相比，可觀察到萌發(fā)頻率的顯著降低(或不萌發(fā))(表12)。
表12 35S-TPP轉(zhuǎn)基因植物種子的萌發(fā)

TPS和/或TPP的表達(dá)對(duì)種子產(chǎn)量的影響測定了pMOG1010-5轉(zhuǎn)基因植物S1代的種子產(chǎn)量。平均來說，與野生型植物7.8g種子/每株植物(n=8)相比，pMOG1010-5產(chǎn)生4.9g種子/每株植物(n=8)。對(duì)pMOG1010-5品系“1000?！敝亓渴?.06g而野生型煙草(Samsun NN)是0.08g。這些數(shù)據(jù)可以通過從源葉子中碳水化合物輸出降低，導(dǎo)致種子“池”組織發(fā)育較差加以解釋。TPS和TPP的表達(dá)對(duì)葉形態(tài)的影響固定溫定內(nèi)生長的PC-TPS轉(zhuǎn)基因、PC-TPP轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢煵萑~的片段，包埋于塑料中，制備包埋塊(coupe)以用光學(xué)顯微鏡研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)。PC-TPP轉(zhuǎn)基因植物橫切面的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)與在對(duì)照植物中所觀察到的類似。PC-TPS轉(zhuǎn)基因植物的橫切面與野生型和TPP轉(zhuǎn)基因植物中有3層海綿質(zhì)細(xì)胞相比表明，其海綿質(zhì)細(xì)胞層由7層細(xì)胞組成(圖.29)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與我們的觀察是一致的，即與TPP轉(zhuǎn)基因植物和對(duì)照植物相比，TPS轉(zhuǎn)基因品系形成更厚和更硬的葉子。
實(shí)施例23通過磷酸海藻糖合成酶的表達(dá)抑制冷甜化產(chǎn)生了帶有馬鈴薯塊莖特異性Patatin啟動(dòng)子控制下的TPS基因(pMOG845；實(shí)施例1)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物(Solanum tuberosum cv.Kardal)。轉(zhuǎn)基因植物和野生型對(duì)照植物生長于溫室中并且收獲塊莖。在收獲后直接進(jìn)行塊莖材料樣品的糖分析和4℃下儲(chǔ)存6個(gè)月后取塊莖材料的樣品進(jìn)行糖分析。來自HPLC-PED分析的數(shù)據(jù)描述于圖.30。
清楚表明的是在收獲后TPSE.coli轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物累積于決莖中的總糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)量較低。在4℃下儲(chǔ)存6個(gè)月后，與野生型對(duì)照品系相比，在轉(zhuǎn)基因品系中可溶糖的增加明顯較少。
實(shí)施例24在干旱逆境下35S TPS 35S TPP(pMOG851)轉(zhuǎn)基因煙草植物特性的改善產(chǎn)生帶有在35S CaMV啟動(dòng)子控制下來自大腸桿菌的TPS和TPP基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物。使用Northern雜交和酶活性測定在獲得的品系中證實(shí)了TPS和TPP基因的表達(dá)。用pMOG851-2轉(zhuǎn)化的植物顯示積累了0.008mg海藻糖g-1鮮重，pMOG851-5積累了0.09mg海藻糖·g-1鮮重。在干旱逆境下這兩個(gè)基因的表達(dá)對(duì)植物形態(tài)和生長特性有顯著作用。當(dāng)在由限制水供應(yīng)而施加的干旱逆境下生長時(shí)，所檢測的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草品系，pMOG851-2和pMOG851-5產(chǎn)生比野生型煙草高28％(P＜0.01)和39％(P＜0.001)的總干重量。這些干重的增加主要是由于葉生產(chǎn)的增長對(duì)pMOG851-5轉(zhuǎn)基因植物，葉干重增加達(dá)85％。在水供應(yīng)良好的條件下沒有觀察到顯著差異。干旱逆境實(shí)驗(yàn)從初始轉(zhuǎn)化物pMOG851-2和pMOG851-5自體受精獲得的F1種子(Goddijn等人(1997)植物生理113,181)用于此研究。種子在20％家用漂白劑中消毒10分鐘，在無菌水中沖洗5遍，播種在含有10g.L-1蔗糖和100mg.L-1卡那霉素的半強(qiáng)度Murashige和Skoog培養(yǎng)基中。野生型SR1種子播種在無卡那霉素的盤中。兩星期后，各個(gè)品系的幼苗轉(zhuǎn)到土壤(沙質(zhì)壤土)中，在22℃，約100μE.m-2光強(qiáng)度、14h·d-1條件下生長于生長小室中。所有植物都在3.8升盆內(nèi)相等量的土壤中生長。植物每天用半強(qiáng)度Hoagland營養(yǎng)液澆水。pMOG851-2和pMOG851-5的幼苗比野生型幼苗生長稍慢。因?yàn)槲覀冋J(rèn)為在相同發(fā)育階段開始實(shí)驗(yàn)最為重要，當(dāng)幼苗在相同高度(10cm)、相同發(fā)育階段(4葉)和相同干重(從每個(gè)品系的另兩株植物測量)時(shí)，我們開始對(duì)每個(gè)品系進(jìn)行干旱逆境處理。這就意味著對(duì)pMOG851-2的處理比野生型晚兩天，對(duì)pMOG851-5的處理比野生型晚7天。每個(gè)品系中，6株植物承受干旱逆境，4株保持良好的供水條件作為對(duì)照。通過將野生型煙草植物保持在萎蔫點(diǎn)附近對(duì)野生型煙草植物進(jìn)行干旱處理當(dāng)下半部分的葉子萎蔫時(shí)，向植物施營養(yǎng)液使植物暫時(shí)重新獲得生機(jī)。實(shí)際上，這就意味著每3天供應(yīng)50ml營養(yǎng)液；對(duì)照植物每天澆水以保持其田間持水量。pMOG851-2和pMOG851-5植物以與野生型完全相同的方式澆水，即，它們象野生型一樣在相同時(shí)間間隔后補(bǔ)充相同量的營養(yǎng)液。在整個(gè)研究過程中，定期測量莖高度。所有植物在同一天(野生型植物處理開始后32天)收獲，因?yàn)樵谳^晚階段收獲轉(zhuǎn)基因植物會(huì)使品系的比較更為復(fù)雜。收獲時(shí)用Delta-T Devices葉面積儀(Santa Clara,CA)測量總的葉面積。此外，測定了葉、莖和根的干重和鮮重。以基本上相同的方式進(jìn)行第二個(gè)實(shí)驗(yàn)以分析植物的滲透勢。在干旱逆境中35天后，在光照時(shí)期開始時(shí)從最年輕的成熟的葉子中取樣(n=3)。離脫葉的空氣干燥從供水良好的、4周齡pMOG851-2,pMOG851-5和野生型植物中測量自空氣干燥的離脫葉的水分丟失。每個(gè)品系中使用5株植物，從每株植物中分離2個(gè)最新成熟的葉子，在25％的相對(duì)濕度中空氣干燥。每個(gè)葉子的鮮重測量32小時(shí)。為了測量滲透勢和測定可溶性糖的含量，在實(shí)驗(yàn)時(shí)從類似的供水良好的葉中取樣。滲透勢測量用于滲透勢分析的葉樣品立即儲(chǔ)存在帶帽的1ml注射器中并在干冰上冷凍。在即將分之前將葉子汁被擠入一個(gè)小瓶內(nèi)、混合并用以浸潤一個(gè)紙片。在Wescor C52小室內(nèi)用Wescor HR-33T露點(diǎn)微伏計(jì)測定滲透勢。葉綠素?zé)晒庠诟珊堤幚?0天后，使用脈沖調(diào)節(jié)(PAM)熒光計(jì)(Walz,Effeltrich,德國)測量野生型、pMOG851-2和pMOg851-5植物的葉綠素?zé)晒?。在測量之前，植物在黑暗中保存兩小時(shí)，隨后為一小時(shí)光照期。隨后，最年輕的成熟的葉子適應(yīng)黑暗20分鐘。在每一個(gè)測量開始時(shí)，打開一個(gè)小的(調(diào)節(jié)為1.6kHz的0.05μmol m-2S-1)測量光束，并測量最小熒光水平(F0)。通過持續(xù)使用4000μmol m-2S-1800ms的飽和光脈沖測定最大熒光水平(Fm)。又經(jīng)過20秒后，當(dāng)信號(hào)衰減至接近F0時(shí)，以2秒的黑暗間隔30秒內(nèi)重復(fù)給予有光化性的光(波長800ms,4000μmol m-2S-1)的簡短飽和脈沖。從熒光/時(shí)間曲線依據(jù)Bolhar-Nordenkampf和Oquist(1993)的方法確定光化學(xué)(qQ)和非光化學(xué)(qE)淬滅組分。在測定時(shí)，所研究的葉子無可見的萎蔫。使用程序Number Cruncher統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)(Dr.J.L.Hintze,865 East 400 North,Kaysville,UT 84037，美國)通過變量的單邊(che-way)分析獲得統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
干旱逆境處理的植物的葉綠素?zé)晒夥治霰砻髟趐MOG851-5中有較高的光化學(xué)淬滅(qQ)和一個(gè)較高的可變熒光對(duì)最大熒光(Fv/Fm)的比率，表明是一個(gè)更為有效的的光合工作機(jī)制(表13)。表13.野生型(wt)和積累海藻糖的(pMOG851-2,pMOG851-5)轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。從分析每個(gè)品系在供水良好條件下(對(duì)照)或干旱條件下生長的植株之間的差異以及在供水良好或干旱條件下生長的轉(zhuǎn)基因品系和野生型的每一個(gè)之間的差異，通過ANOVA檢測分析可以得到P(概率)值。Fm最大熒光；Fv可變熒光(Fm-F0)；qQ光化學(xué)淬滅；qE非光化學(xué)淬滅。Fm,Fv以任意單位(表mm)表示。

碳水化合物分析在收獲時(shí)，pMOG851-5植物含有0.2mg·g-1干重海藻糖，而在pMOG851-2和野生型中不管在逆境或非逆境條件下，海藻糖水平均低于檢測限度。pMOG851-5植物的海藻糖含量與在逆境和非逆境中的植物類似(分別為0.19和0.20mg.g-1干重)。在供水良好的條件下，pMOG851-5植物中葡萄糖和果糖水平比野生型中高兩倍。逆境處理的pMOG851-5植物的葉子所含的四種非結(jié)構(gòu)碳水化合物淀粉、蔗糖、葡萄糖和果糖的各自水平比逆境處理的野生型植物葉高約3倍。在pMOG851-2葉子中，碳水化合物的水平象葉綠素?zé)晒庵狄粯雍鸵吧偷娜~子中的無顯著差異。與非逆境處理的植物相比，所有逆境處理的品系的植物含有水平增高的葡萄糖和果糖。干旱逆境處理的植物和對(duì)照植物的滲透勢在第二個(gè)類似的溫室條件下的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出與上述相同的表型，pMOG851-5植物在干旱逆境下再次比pMOG851-2和野生型植物在生長上下降較少。干旱處理的pMOG851-5植物的葉的滲透勢(-1.77±0.39Mpa)顯著(P=0.017)低于野生型葉(-1.00±0.88Mpa)；pMOG851-2表現(xiàn)為中間值(-1.12±0.05Mpa)。類似的，在供水良好的條件下pMOG851-5植物的滲透勢(-0.79±0.05Mpa)顯著(P=0.038)低于野生型葉的滲透勢(-0.62±0.03Mpa),pMOG851-2為中間值(0.70±0.01Mpa)。離脫葉的空氣干燥分離pMOG851-2、pMOG851-5和野生型植物的葉，它們鮮重的測量在空氣干燥下持續(xù)32小時(shí)。pMOG851-2和pMOG851-5植物的葉子失水顯著(P＜0.05)少于野生型的葉子經(jīng)過32小時(shí)后，pMOG851-5和pMOG851-2的葉子分別剩下鮮重的44％和41％，而野生型為30％。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了測定滲透勢以及進(jìn)行海藻糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的分析，從類似的、供水良好的葉子中取樣。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的滲透勢低于野生型(P＜0.05),pMOG851-5的水勢能最低(-0.63±0.03Mpa)，野生型最高(-0.51±0.02Mpa),pMOG851-2居中(-0.57±0.04Mpa)。在pMOG851-5植物葉子中所檢測的全部糖水平顯著高于野生型葉子中的，導(dǎo)致四種糖的聯(lián)合水平高出3倍(P=0.002)。pMOG851-2植物含有高出2倍的四種糖的聯(lián)合水平(P=0.09)。在pMOG851-5植物中海藻糖的水平為0.24±0.02mg·g-2DW，在pMOG851-2和野生型中低于檢測水平。
實(shí)施例25在干旱逆境下TPS和TPP轉(zhuǎn)基因萵苣品系的特性初始TPS和TPP轉(zhuǎn)化物和野生型對(duì)照植物經(jīng)受干旱逆境。TPP轉(zhuǎn)基因品系首先達(dá)到萎蔫點(diǎn)，然后是對(duì)照植物，接下來是TPS轉(zhuǎn)基因植物，這表明，如在其它植物種類中所觀察到的，在干旱應(yīng)激中TPS轉(zhuǎn)基因品系比TPP和野生型植物有明顯優(yōu)勢。
實(shí)施例26PGPS或PC-TPP轉(zhuǎn)基因萵苣植物的抽苔受到影響在PC-TPP轉(zhuǎn)基因萵苣植物中的抽苔減少(表14)。與野生型萵苣植物相比，PC-TPS轉(zhuǎn)基因品系顯示抽苔增加。
表14．萵苣植物的抽苔

實(shí)施例27TPS和TPP轉(zhuǎn)基因西紅柿植物的特性在西紅柿轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中使用的構(gòu)建體35S TPP、PC-TPS,PC-TPS反義海藻糖酶、PC-TPP、E8-TPS、E8-TPP、E8TPS、E8反義海藻糖酶。由質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的TPP轉(zhuǎn)基因植物具有在其它植物中所觀察到的類似表型葉子變白，花形成減少或無花形成，導(dǎo)致小的果實(shí)或無果實(shí)。少數(shù)35S-TPP轉(zhuǎn)基因品系產(chǎn)生極大的果實(shí)。這些果實(shí)呈現(xiàn)出果皮的增生。由質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的TPS轉(zhuǎn)基因植物并不形成小披針形葉子。一些嚴(yán)重矮化的植物確實(shí)形成小而深綠葉子。與對(duì)照植物相比，PC-TPS或PC反義海藻糖酶轉(zhuǎn)基因植物確實(shí)形成較小和較深綠色的葉子。
與其它作物中所觀察到的相類似，35S或PC啟動(dòng)的TPS和TPP轉(zhuǎn)基因植物的顏色和葉緣有明顯區(qū)別。
帶有在果實(shí)特異的E8啟動(dòng)子控制下的TPS和TPP基因的植物與野生型果實(shí)相比并未表現(xiàn)出表型上的差異。E8 TPS E8反義海藻糖酶轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生具有黃皮和不完全成熟的異常果實(shí)。
實(shí)施例28反義海藻糖酶和/或TPS轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物的表現(xiàn)構(gòu)建體35S反義海藻糖酶(pMOG1027)和35S反義海藻糖酶Pat TPS(pMOG1027(845-11/22/28)。
用帶有35S反義海藻糖酶構(gòu)建體和一個(gè)潮霉素抗性標(biāo)記基因的構(gòu)建體pMOG1027再轉(zhuǎn)化Pat-TPS品系(卡那霉素抗性)，產(chǎn)生了同時(shí)表達(dá)35S反義海藻糖酶和Pat-TPS的植物，即基因型pMOG1027(845-11)、pMOG1027(845-22)和pMOG1027(845-28)。在體外誘導(dǎo)微塊莖，并測定微塊莖的鮮重。對(duì)帶有pMOG1027(pMOG845-11/22/28)的轉(zhuǎn)基因品系平均鮮重產(chǎn)量增加。獲自pMOG1027轉(zhuǎn)基因品系的微塊莖的鮮重生物量僅比野生型對(duì)照植物稍高。產(chǎn)生的植物生長于溫室中，測定塊莖產(chǎn)量(圖.33)。與對(duì)照品系相比，35S反義海藻糖酶或35S反義海藻糖酶和Pat-TPS聯(lián)合的轉(zhuǎn)基因品系產(chǎn)生的塊莖明顯更多。淀粉測定表明在由較高產(chǎn)量的品系所產(chǎn)生的塊莖中淀粉含量并無差別(圖34)。許多1027(845-11/22/28)品系在土壤以上的葉的腋生芽之外產(chǎn)生塊莖，表明所使用的構(gòu)建體對(duì)植物發(fā)育有顯著影響。35S反義海藻糖酶轉(zhuǎn)基因植物只是不在土壤以上形成塊莖。構(gòu)建體Pat反義海藻糖酶(pMOG1028)和Pat反義海藻糖酶Pat TPS(pMOG1028(845-11/22/28))用帶有Pat反義海藻糖酶構(gòu)建體和潮霉素標(biāo)記基因的構(gòu)建體pMOG1028再轉(zhuǎn)化Pat-TPS品系(卡那霉素抗性)，產(chǎn)生了同時(shí)表達(dá)反義海藻糖酶和Pat-TPS的植物，即基因型pMOG1028(845-11)、pMOG1028(845-22)和pMOG1028(845-28)。植物生長于溫室中，測定塊莖產(chǎn)量(圖.25)。與對(duì)照品系相比，許多pMOG1028轉(zhuǎn)基因品系產(chǎn)生的塊莖明顯更多。同時(shí)具有Pat-TPS和Pat反義海藻糖酶的單個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的塊莖產(chǎn)量從幾乎不產(chǎn)生到類似或高于對(duì)照品系的塊莖產(chǎn)量之間變化(圖.35)。構(gòu)建體PC反義海藻糖酶(pMOG1092)pMOG1092轉(zhuǎn)基因植物生長于溫室中，測定了塊莖產(chǎn)量。與對(duì)照相比，一些品系形成深綠色的葉子。與非轉(zhuǎn)基因植物相比塊莖產(chǎn)量顯著增加(圖.36)。構(gòu)建體PC反義海藻糖酶PC-TPS(pMOG1130)pMOG1130轉(zhuǎn)基因植物生長于溫室中，測定塊莖產(chǎn)量。幾個(gè)轉(zhuǎn)基因品系具有小而深綠色的葉子且為嚴(yán)重矮化生長，表明植物用TPS轉(zhuǎn)化時(shí)觀察到的表型的效果比反義海藻糖酶基因同時(shí)表達(dá)時(shí)更為嚴(yán)重(見實(shí)施例21)。與對(duì)照植物相比，所產(chǎn)的塊莖量在幾乎沒有至明顯更高的產(chǎn)量之間變化(圖.37)。
實(shí)施例29在煙草(N.tabacum)中馬鈴薯海藻糖酶cDNA的過量表達(dá)構(gòu)建體de35S CaMV海藻糖酶(pMOG1078)初始pMOG1078轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)化物具有與野生型煙草不同的表型，一些轉(zhuǎn)基因植物有深綠色的葉和更厚的葉(葉的形狀不是披針形)，表明了海藻糖酶基因的表達(dá)對(duì)植物代謝的影響。初始轉(zhuǎn)化物自交的種子被播種并在卡那霉素上選擇。在S1代中表型以孟德爾方式分離。
保藏下列保藏按布達(dá)佩斯條約進(jìn)行。克隆于1997年4月21號(hào)保藏在真菌菌種保藏中心(CBS)，Oosterstraat 1,P.O.Box 273,3740 AG Baarn,荷蘭，獲得下列保藏號(hào)大腸桿菌DH5alpha/pMOG1192CBS 692.97DH5alpha/pMOG1240CBS 693.97DH5alpha/pMOG1241CBS 694.97DH5alpha/pMOG1242CBS 695.97
DH5alpha/pMOG1243CBS 696.97DH5alpha/pMOG1244CBS 697.97DH5alpha/pMOG1245CBS 698.97保藏的克隆pMOG1192帶有插入多拷貝載體pGEM-T(Promega)中的向日葵(Helianthus annusis)TPS/TPP兩分cDNA。pMOG1240帶有插入pCRscript(Stratagene)中的煙草TPS“825”bp cDNA片段。pMOG1241帶有插入pGEM-T(Promega)中的煙草TPS“840”bp的cDNA片段。pMOG1242帶有插入pGEM-T(Promega)中的煙草TPS“630”bp的cDNA片段。pMOG1243帶有插入pGEM-T(Promega)中的煙草TPP“543”bp的cDNA片段。pMOG1244帶有插入pUC18質(zhì)粒中的煙草TPP“723”bp的cDNA片段。pMOG1245帶有插入pGEM-T(Promega)中的煙草TPP“447”bp的片段。相關(guān)pMOG###和pVDH###克隆的清單1．二元載體pMOG23 帶有NPTⅡ選擇標(biāo)記的二元載體(約10Kb)pMOG22 pMOG23的衍生物，NPTⅡ基因已被賦予潮霉素抗性的HPT-基因取代pVDH275 從pMOG23衍生而來的二元載體，帶有一個(gè)質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子-nos終止子的表達(dá)盒。pMOG402 pMOG23的衍生物，已恢復(fù)在NPTⅡ基因中的一個(gè)點(diǎn)突變，在多位點(diǎn)接頭中無KpnⅠ限制性位點(diǎn)存在。pMOG800 pMOG402的衍生物，在多位點(diǎn)接頭中帶有恢復(fù)的KpnⅠ位點(diǎn)。2．TPS/TPP表達(dá)構(gòu)建體pMOG799 35S-TPS-3′nos1pMOG810 同上，帶有潮霉素標(biāo)記pMOG845 Pat-TPS-3′PotpiⅡpMOG925 同上，帶有潮霉素標(biāo)記pMOG851 35S-TPS-3′nos 35S-TPP(atg)2pMOG1010 de 35S CaMV amv引導(dǎo)子TPP(gtg)PotPiⅡpMOG1142 同上，帶有潮霉素標(biāo)記pMOG1093 質(zhì)體藍(lán)素-TPS-3′nospMOG1129 同上，帶有潮霉素標(biāo)記pMOG1177 質(zhì)體藍(lán)素-TPS-3′PotPiⅡ 3′nospVDH318 與pMOG1177相同功能上與pMOG1093相同pMOG1124 質(zhì)體藍(lán)素-TPP(gtg)3′PotPiⅡ3′nospVDH321 與pMOG1124相同pMOG1128 Patatin TPP(gtg)3′PotPiⅡpMOG1140 E8-TPS-3′nospMOG1141 E8-TPP(gtg)-3′PotPiⅡ3．海藻糖酶構(gòu)建體pMOG1028 Patatin反義海藻糖酶3′PotPiⅡ，潮霉素抗性標(biāo)記pMOG1078 de35S CaMV amv引導(dǎo)子海藻糖酶3′nospMOG1090 de35S caMV amv引導(dǎo)子反義海藻糖酶3′nospMOG1027 同上，帶有潮霉素標(biāo)記pMOG1092 質(zhì)體藍(lán)素-反義海藻糖酶-3′nospMOG1130 質(zhì)體藍(lán)素-反義海藻糖酶-3′nos質(zhì)體藍(lán)素-TPS-3′nospMOG1153 E8-TPS-3′nos E8-反義海藻糖酶-3′PotPiⅡ1．除非另外注明，所有構(gòu)建體均帶有NPTⅡ選擇性標(biāo)記2．使用了兩種類型的TPP構(gòu)建體，如在Goddijn等人(1997)植物生理113,181中所述。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名MOGEN International nv(B)街道Einsteinweg 97(C)城市Leiden(E)國家荷蘭(F)郵政編碼(ZIP):2333CB(G)電話(0)71-5258282(H)電傳(0)71-5221471(ⅱ)發(fā)明名稱通過改變海藻糖-6-磷酸的水平來調(diào)節(jié)代謝(ⅲ)序列數(shù)目57(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀信息(A)介質(zhì)類質(zhì)軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0,Version#1.25(EPO)(ⅵ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朎P96.201.225.8(B)遞交日1996年5月3日(ⅵ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朎P96.202.128.3(B)遞交日1996年7月26日(ⅵ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朎P96.202.395.8(B)遞交日1996年8月29日(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1450個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)非(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置21..1450(ⅹⅰ)SE Q ID NO:1的序列描述ATAAAACTCT CCCCGGGACC ATG ACT ATG AGT CGT TTA GTC GTA GTA TCT 50Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser1 5 10AAC CGG ATT GCA CCA CCA GAC GAG CAC GCC GCC AGT GCC GGT GGC CTT 98Asn Arg Ile Ala Pro Pro Asp Glu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu15 20 25GCC GTT GGC ATA CTG GGG GCA CTG AAA GCC GCA GGC GGA CTG TGG TTT146Ala Val Gly Ile Leu Gly Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe30 35 40GGC TGG AGT GGT GAA ACA GGG AAT GAG GAT CAG CCG CTA AAA AAG GTG194Gly Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asn Glu Asp Gln Pro Leu Lys Lys Val45 50 55AAA AAA GGT AAC ATT ACG TGG GCC TCT TTT AAC CTC AGC GAA CAG GAC242Lys Lys Gly Asn Ile Thr Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp60 65 70CTT GAC GAA TAC TAC AAC CAA TTC TCC AAT GCC GTT CTC TGG CCC GCT290Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn Gln Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala75 80 85 90TTT CAT TAT CGG CTC GAT CTG GTG CAA TTT CAG CGT CCT GCC TGG GAC338Phe His Tyr Arg Leu Asp Leu Val Gln Phe Gln Arg Pro Ala Trp Asp95 100 105GGC TAT CTA CGC GTA AAT GCG TTG CTG GCA GAT AAA TTA CTG CCG CTG386Gly Tyr Leu Arg Val Asn Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu110 115 120TTG CAA GAC GAT GAC ATT ATC TGG ATC CAC GAT TAT CAC CTG TTG CCA 434Leu Gln Asp Asp Asp Ile Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro125 130 135TTT GCG CAT GAA TTA CGC AAA CGG GGA GTG AAT AAT CGC ATT GGT TTC 482Phe Ala His Glu Leu Arg Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe140 145 150TTT CTG CAT ATT CCT TTC CCG ACA CCG GAA ATC TTC AAC GCG CTG CCG 530Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro155 160 165 170ACA TAT GAC ACC TTG CTT GAA CAG CTT TGT GAT TAT GAT TTG CTG GGT 578Thr Tyr Asp Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly175 180 185TTC CAG ACA GAA AAC GAT CGT CTG GCG TTC CTG GAT TGT CTT TCT AAC 626Phe Gln Thr Glu Asn Asp Arg Leu Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn190 195 200CTG ACC CGC GTC ACG ACA CGT AGC GCA AAA AGC CAT ACA GCC TGG GGC 674Leu Thr Arg Val Thr Thr Arg Ser Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly205 210 215AAA GCA TTT CGA ACA GAA GTC TAC CCG ATC GGC ATT GAA CCG AAA GAA 722Lys Ala Phe Arg Thr Glu Val Tyr Pro Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu220 225 230ATA GCC AAA CAG GCT GCC GGG CCA CTG CCG CCA AAA CTG GCG CAA CTT 770Ile Ala Lys Gln Ala Ala Gly Pro Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu235 240 245 250AAA GCG GAA CTG AAA AAC GTA CAA AAT ATC TTT TCT GTC GAA CGG CTG 818Lys Ala Glu Leu Lys Asn Val Gln Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu255 260 265GAT TAT TCC AAA GGT TTG CCA GAG CGT TTT CTC GCC TAT GAA GCG TTG 866Asp Tyr Ser Lys Gly Leu Pro Glu Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu270 275 280CTG GAA AAA TAT CCG CAG CAT CAT GGT AAA ATT CGT TAT ACC CAG ATT 914Leu Glu Lys Tyr Pro Gln His His Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gln Ile285 290 295GCA CCA ACG TCG CGT GGT GAT GTG CAA GCC TAT CAG GAT ATT CGT CAT 962Ala Pro Thr Ser Arg Gly Asp Val Gln Ala Tyr Gln Asp Ile Arg His300 305 310CAG CTC GAA AAT GAA GCT GGA CGA ATT AAT GGT AAA TAC GGG CAA TTA1010Gln Leu Glu Asn Glu Ala Gly Arg Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gln Leu315 320 325 330GGC TGG ACG CCG CTT TAT TAT TTG AAT CAG CAT TTT GAC CGT AAA TTA1058Gly Trp Thr Pro Leu Tyr Tyr Leu Asn Gln His Phe Asp Arg Lys Leu335 340 345CTG ATG AAA ATA TTC CGC TAC TCT GAC GTG GGC TTA GTG ACG CCA CTG1106Leu Met Lys Ile Phe Arg Tyr Ser Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu350 355 360CGT GAC GGG ATG AAC CTG GTA GCA AAA GAG TAT GTT GCT GCT CAG GAC1154Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gln Asp365 370 375CCA GCC AAT CCG GGC GTT CTT GTT CTT TCG CAA TTT GCG GGA GCG GCA1202Pro Ala Asn Pro Gly Val Leu Val Leu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ala380 385 390AAC GAG TTA ACG TCG GCG TTA ATT GTT AAC CCC TAC GAT CGT GAC GAA1250Asn Glu Leu Thr Ser Ala Leu Ile Val Asn Pro Tyr Asp Arg Asp Glu395 400 405 410GTT GCA GCT GCG CTG GAT CGT GCA TTG ACT ATG TCG CTG GCG GAA CGT1298Val Ala Ala Ala Leu Asp Arg Ala Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg415 420 425ATT TCC CGT CAT GCA GAA ATG CTG GAC GTT ATC GTG AAA AAC GAT ATT1346Ile Ser Arg His Ala Glu Met Leu Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile430 435 440AAC CAC TGG CAG GAG TGC TTC ATT AGC GAC CTA AAG CAG ATA GTT CCG1394Asn His Trp Gln Glu Cys Phe Ile Ser Asp Leu Lys Gln Ile Val Pro445 450 455CGA AGC GCG GAA AGC CAG CAG CGC GAT AAA GTT GCT ACC TTT CCA AAG1442Arg Ser Ala Glu Ser Gln Gln Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys460 465 470CTC TGC AG 1450Leu Cys475(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度476個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:2的序列描述Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn Arg Ile Ala Pro Pro1 5 10 15Asp Glu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala Val Gly Ile Leu Gly20 25 30Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly Trp Ser Gly Glu Thr35 40 45Gly Asn Glu Asp Gln Pro Leu Lys Lys Val Lys Lys Gly Asn Ile Thr50 55 60Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn65 70 75 80Gln Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala Phe His Tyr Arg Leu Asp85 90 95Leu Val Gln Phe Gln Arg Pro Ala Trp Asp Gly Tyr Leu Arg Val Asn100 105 110Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu Leu Gln Asp Asp Asp Ile115 120 125Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro Phe Ala His Glu Leu Arg130 135 140Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe145 150 155 160Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Leu Leu165 170 175Glu Gln Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Gln Thr Glu Asn Asp180 185 190Arg Leu Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn Leu Thr Arg Val Thr Thr195 200 205Arg Ser Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly Lys Ala Phe Arg Thr Glu210 215 220Val Tyr Pro Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile Ala Lys Gln Ala Ala225 230 235 240Gly Pro Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu Lys Ala Glu Leu Lys Asn245 250 255Val Gln Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp Tyr Ser Lys Gly Leu260 265 270Pro Glu Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Gln275 280 285His His Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gln Ile Ala Pro Thr Ser Arg Gly290 295 300Asp Val Gln Ala Tyr Gln Asp Ile Arg His Gln Leu Glu Asn Glu Ala305 310 315 320Gly Arg Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gln Leu Gly Trp Thr Pro Leu Tyr325 330 335Tyr Leu Asn Gln His Phe Asp Arg Lys Leu Leu Met Lys Ile Phe Arg340 345 350Tyr Ser Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu355 360 365Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gln Asp Pro Ala Asn Pro Gly Val370 375 380Leu Val Leu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ala Asn Glu Leu Thr Ser Ala385 390 395 400Leu Ile Val Asn Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val Ala Ala Ala Leu Asp405 410 415Arg Ala Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile Ser Arg His Ala Glu420 425 430Met Leu Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn His Trp Gln Glu Cys435 440 445Phe Ile Ser Asp Leu Lys Gln Ile Val Pro Arg Ser Ala Glu Ser Gln450 455 460Gln Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu Cys465 470 475(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度835個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)非(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置18..818(ⅹⅰ)SE Q ID NO:3的序列描述ATAAAACTCT CCCCGGG ATG ACA GAA CCG TTA ACC GAA ACC CCT GAA CTA50Met Thr Glu Pro Leu Thr Glu Thr Pro Glu Leu1 5 10TCC GCG AAA TAT GCC TGG TTT TTT GAT CTT GAT GGA ACG CTG GCG GAA 98Ser Ala Lys Tyr Ala Trp Phe Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Ala Glu15 20 25ATC AAA CCG CAT CCC GAT CAG GTC GTC GTG CCT GAC AAT ATT CTG CAA 146Ile Lys Pro His Pro Asp Gln Val Val Val Pro Asp Asn Ile Leu Gln30 35 40GGA CTA CAG CTA CTG GCA ACC GCA AGT GAT GGT GCA TTG GCA TTG ATA 194Gly Leu Gln Leu Leu Ala Thr Ala Ser Asp Gly Ala Leu Ala Leu Ile45 50 55TCA GGG CGC TCA ATG GTG GAG CTT GAC GCA CTG GCA AAA CCT TAT CGC 242Ser Gly Arg Ser Met Val Glu Leu Asp Ala Leu Ala Lys Pro Tyr Arg60 65 70 75TTC CCG TTA GCG GGC GTG CAT GGG GCG GAG CGC CGT GAC ATC AAT GGT 290Phe Pro Leu Ala Gly Val His Gly Ala Glu Arg Arg Asp Ile Asn Gly80 85 90AAA ACA CAT ATC GTT CAT CTG CCG GAT GCG ATT GCG CGT GAT ATT AGC 338Lys Thr His Ile Val His Leu Pro Asp Ala Ile Ala Arg Asp Ile Ser95 100 105GTG CAA CTG CAT ACA GTC ATC GCT CAG TAT CCC GGC GCG GAG CTG GAG 386Val Gln Leu His Thr Val Ile Ala Gln Tyr Pro Gly Ala Glu Leu Glu110 115 120GCG AAA GGG ATG GCT TTT GCG CTG CAT TAT CGT CAG GCT CCG CAG CAT 434Ala Lys Gly Met Ala Phe Ala Leu His Tyr Arg Gln Ala Pro Gln His125 130 135GAA GAC GCA TTA ATG ACA TTA GCG CAA CGT ATT ACT CAG ATC TGG CCA 482Glu Asp Ala Leu Met Thr Leu Ala Gln Arg Ile Thr Gln Ile Trp Pro140 145 150 155CAA ATG GCG TTA CAG CAG GGA AAG TGT GTT GTC GAG ATC AAA CCG AGA 530Gln Met Ala Leu Gln Gln Gly Lys Cys Val Val Glu Ile Lys Pro Arg160 165 170GGT ACC AGT AAA GGT GAG GCA ATT GCA GCT TTT ATG CAG GAA GCT CCC 578Gly Thr Ser Lys Gly Glu Ala Ile Ala Ala Phe Met Gln Glu Ala Pro175 180 185TTT ATC GGG CGA ACG CCC GTA TTT CTG GGC GAT GAT TTA ACC GAT GAA 626Phe Ile Gly Arg Thr Pro Val Phe Leu Gly Asp Asp Leu Thr Asp Glu190 195 200TCT GGC TTC GCA GTC GTT AAC CGA CTG GGC GGA ATG TCA GTA AAA ATT 674Ser Gly Phe Ala Val Val Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Val Lys Ile205 210 215GGC ACA GGT GCA ACT CAG GCA TCA TGG CGA CTG GCG GGT GTG CCG GAT 722Gly Thr Gly Ala Thr Gln Ala Ser Trp Arg Leu Ala Gly Val Pro Asp220 225 230 235GTC TGG AGC TGG CTT GAA ATG ATA ACC ACC GCA TTA CAA CAA AAA AGA 770Val Trp Ser Trp Leu Glu Met Ile Thr Thr Ala Leu Gln Gln Lys Arg240 245 250GAA AAT AAC AGG AGT GAT GAC TAT GAG TCG TTT AGT CGT AGT ATC TAA 818Glu Asn Asn Arg Ser Asp Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Arg Ser Ile *255 260 265CCGGATTGCA CCTGCAG855270(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度272個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:4的序列描述Met Thr Glu Pro Leu Thr Glu Thr Pro Glu Leu Ser Ala Lys Tyr Ala1 5 10 15Trp Phe Phe Asp Leu Asp Gly Thr Leu Ala Glu Ile Lys Pro His Pro20 25 30Asp Gln Val Val Val Pro Asp Asn Ile Leu Gln Gly Leu Gln Leu Leu35 40 45Ala Thr Ala Ser Asp Gly Ala Leu Ala Leu Ile Ser Gly Arg Ser Met50 55 60Val Glu Leu Asp Ala Leu Ala Lys Pro Tyr Arg Phe Pro Leu Ala Gly65 70 75 80Val His Gly Ala Glu Arg Arg Asp Ile Asn Gly Lys Thr His Ile Val85 90 95His Leu Pro Asp Ala Ile Ala Arg Asp Ile Ser Val Gln Leu His Thr100 105 110Val Ile Ala Gln Tyr Pro Gly Ala Glu Leu Glu Ala Lys Gly Met Ala115 120 125Phe Ala Leu His Tyr Arg Gln Ala Pro Gln His Glu Asp Ala Leu Met130 135 140Thr Leu Ala Gln Arg Ile Thr Gln Ile Trp Pro Gln Met Ala Leu Gln145 150 155 160Gln Gly Lys Cys Val Val Glu Ile Lys Pro Arg Gly Thr Ser Lys Gly165 170 175Glu Ala Ile Ala Ala Phe Met Gln Glu Ala Pro Phe Ile Gly Arg Thr180 185 190Pro Val Phe Leu Gly Asp Asp Leu Thr Asp Glu Ser Gly Phe Ala Val195 200 205Val Asn Arg Leu Gly Gly Met Ser Val Lys Ile Gly Thr Gly Ala Thr210 215 220Gln Ala Ser Trp Arg Leu Ala Gly Val Pro Asp Val Trp Ser Trp Leu225 230 235 240Glu Met Ile Thr Thr Ala Leu Gln Gln Lys Arg Glu Asn Asn Arg Ser245 250 255Asp Asp Tyr Glu Ser Phe Ser Arg Ser Ile *260 265(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅹⅰ)SE Q ID NO:5的序列描述AAGCTTATGT TGCCATATAG AGTAGAT 27(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅹⅰ)SE Q ID NO:6的序列描述GTAGTTGCCA TGGTGCAAAT GTTCATATG 29(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅹⅰ)SE Q ID NO:7的序列描述GAYITIATIT GGRTICAYGA YTAYCA 26(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅹⅰ)SE Q ID NO:8的序列描述TIGGITKITT YYTICAYAYI CCITTYCC28(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅹⅰ)SE Q ID NO:9的序列描述GYIACIARRT TCATICCRTC IC 22(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度743個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物人(Homo sapiens)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..743(D)其它信息部分(ⅹⅰ)SE Q ID NO:10的序列描述GAC GTG ATG TGG ATG CAC GAC TAC CAT TTG ATG GTG TTG CCT ACG TTC 48Asp Val Met Trp Met His Asp Tyr His Leu Met Val Leu Pro Thr Phe1 5 10 15TTG AGG AGG CGG TTC AAT CGT TTG AGA ATG GGG TTT TTC CTT CAC AGT 96Leu Arg Arg Arg Phe Asn Arg Leu Arg Met Gly Phe Phe Leu His Ser20 25 30CCA TTT CCC TCA TCT GAG ATT TAC AGG ACA CTT CCT GTT AGA GAG GAA144Pro Phe Pro Ser Ser Glu Ile Tyr Arg Thr Leu Pro Val Arg Glu Glu35 40 45ATA CTC AAG GCT TTG CTC TGT GCT GAC ATT GTT GGA TTC CAC ACT TTT192Ile Leu Lys Ala Leu Leu Cys Ala Asp Ile Val Gly Phe His Thr Phe50 55 60GAC TAC GCG AGA CAC TTC CTC TCT TGT TGC AGT CGG ATG TTG GGT TTA240Asp Tyr Ala Arg His Phe Leu Ser Cys Cys Ser Arg Met Leu Gly Leu65 70 75 80GAG TAT CAG TCT AAA AGA GGT TAT ATA GGG TTA GAA TAC TAT GGA CGG288Glu Tyr Gln Ser Lys Arg Gly Tyr Ile Gly Leu Glu Tyr Tyr Gly Arg85 90 95ACA GTA GGC ATC AAG ATT ATG CCC GTC GGG ATA CAT ATG GGT CAT ATT336Thr Val Gly Ile Lys Ile Met Pro Val Gly Ile His Met Gly His Ile100 105 110GAG TCC ATG AAG AAA CTT GCA GCG AAA GAG TTG ATG CTT AAG GCG CTA 384Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Ala Lys Glu Leu Met Leu Lys Ala Leu115 120 125AAG CAG CAA TTT GAA GGG AAA ACT GTG TTG CTT GGT GCC GAT GAC CTG 432Lys Gln Gln Phe Glu Gly Lys Thr Val Leu Leu Gly Ala Asp Asp Leu130 135 140GAT ATT TTC AAA GGT ATA AAC TTA AAG CTT CTA GCT ATG GAA CAG ATG 480Asp Ile Phe Lys Gly Ile Asn Leu Lys Leu Leu Ala Met Glu Gln Met145 150 155 160CTC AAA CAG CAC CCC AAG TGG CAA GGG CAG GCT GTG TTG GTC CAG ATT 528Leu Lys Gln His Pro Lys Trp Gln Gly Gln Ala Val Leu Val Gln Ile165 170 175GCA AAT CCT ACG AGG GGT AAA GGA GTA GAT TTT GAG GAA ATA CAG GCT 576Ala Asn Pro Thr Arg Gly Lys Gly Val Asp Phe Glu Glu Ile Gln Ala180 185 190GAG ATA TCG GAA AGC TGT AAG AGA ATC AAT AAG CAA TTC GGC AAG CCT 624Glu Ile Ser Glu Ser Cys Lys Arg Ile Asn Lys Gln Phe Gly Lys Pro195 200 205GGA TAT GAG CCT ATA GTT TAT ATT GAT AGG CCC GTG TCA AGC AGT GAA 672Gly Tyr Glu Pro Ile Val Tyr Ile Asp ArG Pro Val Ser Ser Ser Glu210 215 220CGC ATG GCA TAT TAC AGT ATT GCA GAA TGT GTT GTT GTC ACG GCT GTG 720Arg Met Ala Tyr Tyr Ser Ile Ala Glu Cys Val Val Val Thr Ala Val225 230 235 240AGC GAC GGC ATG AAC TTC GTC TC 743Ser Asp Gly Met Asn Phe Val245(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度247個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:11的序列描述Asp Val Met Trp Met His Asp Tyr His Leu Met Val Leu Pro Thr Phe1 5 10 15Leu Arg Arg Arg Phe Asn Arg Leu Arg Met Gly Phe Phe Leu His Ser20 25 30Pro Phe Pro Ser Ser Glu Ile Tyr Arg Thr Leu Pro Val Arg Glu Glu35 40 45Ile Leu Lys Ala Leu Leu Cys Ala Asp Ile Val Gly Phe His Thr Phe50 55 60Asp Tyr Ala Arg His Phe Leu Ser Cys Cys Ser Arg Met Leu Gly Leu65 70 75 80Glu Tyr Gln Ser Lys Arg Gly Tyr Ile Gly Leu Glu Tyr Tyr Gly Arg85 90 95Thr Val Gly Ile Lys Ile Met Pro Val Gly Ile His Met Gly His Ile100 105 110Glu Ser Met Lys Lys Leu Ala Ala Lys Glu Leu Met Leu Lys Ala Leu115 120 125Lys Gln Gln Phe Glu Gly Lys Thr Val Leu Leu Gly Ala Asp Asp Leu130 135 140Asp Ile Phe Lys Gly Ile Asn Leu Lys Leu Leu Ala Met Glu Gln Met145 150 155 160Leu Lys Gln His Pro Lys Trp Gln Gly Gln Ala Val Leu Val Gln Ile165 170 175Ala Asn Pro Thr Arg Gly Lys Gly Val Asp Phe Glu Glu Ile Gln Ala180 185 190Glu Ile Ser Glu Ser Cys Lys Arg Ile Asn Lys Gln Phe Gly Lys Pro195 200 205Gly Tyr Glu Pro Ile Val Tyr Ile Asp Arg Pro Val Ser Ser Ser Glu210 215 220Arg Met Ala Tyr Tyr Ser Ile Ala Glu Cys Val Val Val Thr Ala Val225 230 235 240Ser Asp Gly Met Asn Phe Val245(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度395個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物煙草(Nicotiana tabacum)(B)種類Samsun NN(F)組織類型葉(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..395(D)其它信息部分(ⅹⅰ) SE Q ID NO:12的序列描述GCG AAA CCG GTG ATG AAA CTT TAC AGG GAA GCA ACT GAC GGA TCA TAT 48Ala Lys Pro Val Met Lys Leu Tyr Arg Glu Ala Thr Asp Gly Ser Tyr1 5 10 15ATA GAA ACT AAA GAG AGT GCA TTA GTG TGG CAC CAT CAT GAT GCA GAC 96Ile Glu Thr Lys Glu Ser Ala Leu Val Trp His His His Asp Ala Asp20 25 30CCT GAC TTT GGC TCC TGC CAG GCA AAG GAA TTG TTG GAT CAT TTG GAA 144Pro Asp Phe Gly Ser Cys Gln Ala Lys Glu Leu Leu Asp His Leu Glu35 40 45AGC GTA CTT GCA AAT GAA CCT GCA GTT GTT AAG AGG GGC CAA CAT ATT 192Ser Val Leu Ala Asn Glu Pro Ala Val Val Lys Arg Gly Gln His Ile50 55 60GTT GAA GTC AAG CCA CAA GGT GTG ACC AAA GGA TTA GTT TCA GAG AAG 240Val Glu Val Lys Pro Gln Gly Val Thr Lys Gly Leu Val Ser Glu Lys65 70 75 80GTT CTC TCG ATG ATG GTT GAT AGT GGG AAA CCG CCC GAT TTT GTT ATG 288Val Leu Ser Met Met Val Asp Ser Gly Lys Pro Pro Asp Phe Val 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Glu Thr Ser Met Val Trp Ser Tyr Glu Asp Ala Asp50 55 60Pro Asp Phe Gly Ser Cys Gln Ala Lys Glu Leu Leu Asp His Leu Glu65 70 75 80Ser Val Leu Ala Asn Glu Pro Val Thr Val Arg Ser Gly Gln Asn Ile85 90 95Val Glu Val Lys Pro Gln Gly Val Ser Lys Gly Leu Val Ala Lys Arg100 105 110Leu Leu Ser Ala Met Gln Glu Lys Gly Met Ser Pro Asp Phe Val Leu115 120 125Cys Ile Gly Asp Asp Arg Ser Asp Glu Asp Met Phe Glu Val Ile Met130 135 140Ser Ser Met Ser Gly Pro Ser Met Ala Pro Thr Ala Glu Val Phe Ala145 150 155 160Cys Thr Val(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度361個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物煙草(nicotiana tabacum)(B)種類Samsun NN(F)組織類型葉(ⅹⅰ)SE Q ID NO:16的序列描述TTTGATTATG ATGGGACGCT GCTGTCGGAG GAGAGTGTGG ACAAAACCCC GAGTGAAGAT60GACATCTCAA TTCTGAATGG TTTATGCAGT GATCCAAAGA ACGTAGTCTT TATCGTGAGT 120GGCAGAGGAA AGGATACACT TAGCAAGTGG TTCTCTCCGT GTCCGAGACT CGGCCTATCA 180GCAGAACATG GATATTTCAC TAGGTGGAGT AAGGATTCCG AGTGGGAATC TCGTCCATAG 240CTGCAGACCT TGACTGGAAA AAAATAGTGT 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(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物煙草(nicotiana tabacum)(B)種類Samsun NN(F)組織類型葉(ⅹⅰ)SE Q ID NO:21的序列描述ATCATATGGG GCAGCTTCAG CAATCTTGAT CTTCCTGAAA CGGAGGCAAA AGTCTTCGGA60ACTCGGCAGC AGTTTAATCA TCAGGGGAGG ACATTGTTGC TGGGAGTTGA TGACATGGAC 120ATATTTAAAG GCATCAGTTT GAAGTTATTA GCAATGGAAC AACTTCTATT GCAGCACCCG 180GAGAAGCAGG GGAAGGTTGT TTTGGTGCAG ATAGCCAATC CTGCTAGAGG CAAAGGAAAA 240GATGTCAAAG AAGTGCAGGA AGAAACTCAT TGACGGTGAA GCGAATTAAT GAAGCATTTG 300GAAGACCTGG GTACGAACCA GTTATCTTGA TTGATAAGCC ACTAAAGTTT TATGAAAGGA 360TTGCTTATTA TGTTGTTGCA GAGTGTTGCC TAGTCACTGC TGTCAGCGAT GGCATGAACC 420TCGTCTC 427(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度315個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物煙草(nicotiana tabacum)
(B)種類Samsun NN(F)組織類型葉(ⅹⅰ)SE Q ID NO:22的序列描述GATGTGGATG CATGACTACC AATCCAAGAG GGGGTATATT GGTCTTGACT ATTATGGTAA60ACTGTGACCA TTAAAATCCT TCCAGTTGGT ATTCACATGG GACAACTCCA AAATGTTATG 120TCACTACAGA CACGGGAAAG AAAGCAAAGG AGTTGAAAGA AAAATATGAG GGGAAAATTG 180TGATGTTAGG TATTGATGAT ATGGACATGT TTAAAGGAAT TGGTCTAAAG TTTCTGGCAA 240TGGGGAGGCT TCTAGATGAA AACCCTGTCT TGAGGGGTAA AGTGGTATTG GTTCAATCAC 300CAGGCCTGGA AATTA315(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度352個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物煙草(nicotiana tabacum)(B)種類Samsun NN(F)組織類型葉(ⅹⅰ)SE Q ID NO:23的序列描述AGAAGTAAAG GGAGTGAGTC CCCGAGGTTC AAAAAGAGGT CAACAGAATT GCAGTGAAAT60TAATAAAAAA TATGGCAAAC CGGGGTACAA GCCGATTGTT TGTATCAATG GTCCAGTTTC 120GACACAAGAC AAGATTGCAC ATTATGCGGT CTTGAGTGTG TTGTTGTTAA TGCTGTTAGA 180GATGGGATGA ACTTGGTGCC TTATGAGTAT ACGGTCTTTA GGCAGGGCAG CGATAATTTG 240GATAAGGCCT TGCAGCTAGA TGGTCCTACT GCTTCCAGAA AGAGTGTGAT TATTGTCTTG 300AATTCGTTGG GTGCTCGCCA TCTTTAGTGG CGCCATCCGC GTCAACCCCT GG 352(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2640個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物向日葵(Helianthus annuus)(F)組織類型葉(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置171..2508(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞不定(B)位置置換(2141..2151,“caatnnntta”)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞不定(B)位置置換(2237.2243,“actnaaa”)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:24的序列描述GGATCCTGCG GTTTCATCAC ACAATATGAT ACTGTTACAT CTGATGCCCC TTCAGATGTC60CCAAATAGGT TGATTGTCGT ATCGAATCAG TTACCCATAA TCGCTAGGCT AAGACTAACG 120ACAATGGAGG GTCCTTTTGG GATTTCACTT GGGACGAGAG TTCGATTTAC ATG CAC 176Met His1ATC AAA GAT GCA TTA CCC GCA GCC GTT GAG GTT TTC TAT GTT GGC GCA 224Ile Lys Asp Ala Leu Pro Ala Ala Val Glu Val Phe Tyr Val Gly Ala5 10 15CTA AGG GCT GAC GTT GGC CCT ACC GAA CAA GAT GAC GTG TCA AAG ACA 272Leu Arg Ala Asp Val Gly Pro Thr Glu Gln Asp Asp Val Ser Lys Thr20 25 30TTG CTC GAT AGG TTT AAT TGC GTT GCG GTT TTT GTC CCT ACT TCA AAA 320Leu Leu Asp Arg Phe Asn Cys Val Ala Val Phe Val Pro Thr Ser Lys35 40 45 50TGG GAC CAA TAT TAT CAC TGC TTT TGT AAG CAG TAT TTG TGG CCG ATA 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Ile Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg His Phe165 170 175CTA ACG TGT TGT AGT CGA ATG TTT GGT TTG GAT CAT CAG TTG AAA AGG 752Leu Thr Cys Cys Ser Arg Met Phe Gly Leu Asp His Gln Leu Lys Arg180 185 190GGG TAC ATT TTC TTG GAA TAT AAT GGA AGG AGC ATT GAG ATC AAG ATA 800Gly Tyr Ile Phe Leu Glu Tyr Asn Gly ArG Ser Ile Glu Ile Lys Ile195 200 205 210AAG GCG AGC GGG ATT CAT GTT GGT CGA ATG GAG TCG TAC TTG AGT CAG 848Lys Ala Ser Gly Ile His Val Gly Arg Met Glu Ser Tyr Leu Ser Gln215 220 225CCC GAT ACA AGA TTA CAA GTT CAA GAA CTA AAA AAA CGT TTC GAA GGG 896Pro Asp Thr Arg Leu Gln Val Gln Glu Leu Lys Lys Arg Phe Glu Gly230 235 240AAA ATC GTG CTA CTT GGA GTT GAT GAT TTG GAT ATA TTC AAA GGT GTG 944Lys Ile Val Leu Leu Gly Val Asp Asp Leu Asp Ile Phe Lys Gly Val245 250 255AAC TTC AAG GTT TTA GCG TTG GAG AAG TTA CTT AAA TCA CAC CCG AGT 992Asn Phe Lys Val Leu Ala Leu Glu Lys Leu Leu Lys Ser His Pro Ser260 265 270TGG CAA GGG CGT GTG GTT TTG GTG CAA ATC TTG AAT CCC GCT CGC GCG1040Trp Gln Gly Arg Val Val 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NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅹⅰ)SE Q ID NO:35的序列描述TTYGAYTAYG AYGGIACIYT 20(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
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sativa)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:41的序列描述ATAAACTTCC TCGGACCAAA GAAGAGCATG TTGGTTGTGT CGGAGTTTAT TGGTTGCTCA60CCTTCACTGA GTGGAGCCAT TCGTGTTAAC CCGTGGAATA TCGAGGCAAC TGCAGAGGCA 120CTGAATGAGG CCATCTCAAT GTCAGAGCGT AAAAGCAGCT GAGGCACGAA AAACATTACC 180GTTATGTCAG CACCCATGAT GTTGCATATT GGTCTAAGAG CTTTGTACAG GACCTGGAGA 240GGGCTTGCAA GGATCACTTT AGGAAACCAT GCTGGGGCAT TGGATTGGAT TTCGCTCAGG 300(2)SEQ ID NO:42的信息(ⅰ)序列特征(A)長度627個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物卷柏(Selaginella lepidophylla)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置4..627(D)其它信息/部分(ⅹⅰ)SE Q ID NO:42的序列描述ATT ATG TGG GTG CAT GAT TAC CAC CTC TGT CTG GTC CCT CAG ATG ATC 48Met Trp Val His Asp Tyr His Leu Cys Leu Val Pro Gln Met Ile1 5 10 15CGC CAA AAG CTG CCA GAT GTG CAG ATT GGC TTC TTC CTC CAC ACC GCT 96Arg Gln Lys Leu Pro Asp Val Gln Ile Gly Phe Phe Leu His Thr Ala20 25 30TTT CCC TCG TCA GAG GTC TTC CGC TGC TTG GCC GCA CGA AAG GAG CTG 144Phe Pro Ser Ser Glu Val Phe Arg Cys Leu Ala Ala Arg Lys Glu Leu35 40 45CTG GAC 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AGGCTTGACA TGATTAAAGG AATTCCACAG 360AAGCTGCTAG CCTTTGAAAA ATTCCTCGAG GAGAACTCCG AGTGGCGTGA TAAGGTCGTC 420CTGGTGCAAA TCGCGGTGCC GACTAGAACG GACGTCCTCG AGTACCAAAA GCTTACGAGC 480CAGGTTCACG AGATTGTTGG TCGCATAAAT GGACGTTTCG GCTCCTTGAC GGCTGTTCCT 540ATCCATCACC TCGATCGGTC CATGAAATTT CCGGAGCTTT GTGCGTTATA TGCAATCACT 600GATGTCCTGC TCGTGACATC CCTGCGCGAC GGCATGAACT TCGTC 645(2)SEQ ID NO:45的信息(ⅰ)序列特征(A)長度498個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:45的序列描述GCCGTTGTGG ATTCATCGCC TCGCACAAGC ACTCTTGTCG TGTCTGAGTT TATTGGATGC60TCACCTTCTT TGAGTGGTGC CATTAGGGTG AATCCATGGG ATGTGGATGC TGTTGCTGAA 120GCGGTAAACT CGGCTCTTAA AATAGTGAGA CTGAGAAGCA ACTACGGCAT GAGAAACATT 180ATCATTATAT TAGCACTCAT GATGTTGGTT ATTGGGCAAA GAGCTTTATG CAGGATCTTG 240AGAGAGCGTG CCGAGATCAT TATAGTAAAC GTTGTTGGGG GATTGGTTTT GGCTTGGGGT 300TCAGAGTTTT GTCACTCTCT CCAAGTTTTA GGAAGCTATC TGTGGACACA TTTGTTCCAG 360TTTATAGGAA AACCACAGAG AGGGCTAATA TTCTTTTATA ATGGTACTCT TTGTTCCGAA 420AGCTCATTGT TCAAGATCCA GCAACGGGTT CCTTGTCCTA AGCCCCTTAA GGCCCCATAA 480CCGGTGTTTT TTAGTGAG 498(2)SEQ ID NO:46的信息(ⅰ)序列特征(A)長度463個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:46的序列描述GCCGTTGTGG ATTCATCGCC TCGCACAAGC ACTCTTGTCG TGTCTGAGTT TATTGGATGC 60TCACCTTCTT TGAGTGGTGC CATTGGGTGA ATCCATGGGA TGTGGATGCT GTTGCTGAAG120CGGTAAACTC GGCTCTTAAA ATGAGTGAGA CTGAGAAGCA ACTACGGCAT GAGAAACATT180ATCATTATAT TAGCACTCAT GATGTTGGTT ATTGGGCAAA GAGCTTTATG CAGGATCTTG240AGAGAGCGTG CCGAGATCAT TATAGTAAAC GTTGTTGGGG GATTGGTTTT GGTTTGGGGT300TCAGAGTTTT TGTCACTCTC TCCAAGTTTA GGAAGCTATC TTGGGACAAT TGTTCCAGTT360TTTAGGGAAA ACACAGGGAA GGTTATTTCC TTGATTATAA TGGACCTTGT CCAAGCCCCA420TTTTTAAGGC CCAGGAACCG GGTTTTTTTT TCTTAAAGCC CCT 463(2)SEQ ID NO:47的信息(ⅰ)序列特征(A)長度394個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:47的序列描述GGTATTGATG TAGAGGAAAT ACGTGGTGAA ATCGAAGAAA GCTGCAGGAG GATCAATGGA60GAGTTTGGGA AACCGGATAT CAACCTATCA TATATATTGA TACCCGGTTT CGATTAATGA 120AATAAATGCT TATACCATAT TGCTGAGTGC GTGGTCGTTA CAGCTGTTAG AGATGGTATG 180AACCTTACTC CCTACGAATA TATCGTTTGT AGACAAGGTT TACTTGGGTC TGAATCAGAC 240TTTAGTGGCC CAAAGAAGAG CATGTTGGTT GCATCAAGTT TATTTGGATG TCCCCTTTCG 300CTTAGTGGGG CTATACGCGT AAACCCATGG AACCGTTGAA GCTACTTGAG GAGCCTTAAT 360TAGGCCCCTC AAATATGCTG GAACACTACG GATG 394(2)SEQ ID NO:48的信息(ⅰ)序列特征(A)長度428個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:48的序列描述AAGTCCGTTG TGGATTCACG CCTCGCACAA GCACTCTTGT CGTGTCTAGT TTATTGGATG 60CTCACCTTCT TTAGTGGTGC CATTAGGGTG AATCCATGGA TGTGGATGCT GTTGCTGAAG120CGGTAAACTC GGCTCTTAAA ATAGTGAGAC TGAGAAGCAA CTACGGCATG AGAAACATTA180TCATTATATT AGCACTCATG ATGTTGGTTA TTGGGCAAAG AGCTTTATGC AGGACTTAGA240GAGCGTGCCG AGATCATTAT AGTAAACGTT GTTGGGGGAT TGGTTTTGGT TTGGGGTTCA300AGTTTTGTCA CTCTCTCCAA GTTTTAGGAA GCTATCTTGT GGACACATTG TTCCAGTTTA360TAGAAACACA GGGAAGGGGC TATATTCTTG TTTAAATGGG ACCCCTTGTC CCTAAAAGTC420CCATTTGT 428(2)SEQ ID NO:49的信息(ⅰ)序列特征(A)長度481個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:49的序列描述CAAACGAAGA GCTTCGTGGG AAAGTGGTTC TCGTGCAGAT TACTAATCCT GCTCGTAGTT60CAGGTAAGGA TGTTCAAGAT GTAGAGAAAC AGATAAATTT ATTGCTGATG AGATCAATTC 120TAAATTTGGG AGACCTGGTG GTTATAAGCC TATTGTTTTG TAATGGACCT GTTAGTACTT 180TGGATAAAGT TGCTTATTAC GCGATCTCGG AGTGTGTTGT CGTGAATCTG TGAGAGATGG 240GATGAATTTG GTGCCTTATA AGTACACAGT GACTCGGCAA GGGAGCCCTG CTTTGGATGC 300AGCTTTGGTT TTGGGGAGGA TGATGTTAGG AAGAGTGTGA TTATTGTTTC TGAGGTTCAA 360CCGGTTGTCC TCCATCTCTA GTGGTGCGAT CCCTTTTAAT CCGTGGACAT CGATCAGCAC 420TTACGCCATG AGCTTCAAAT CCGGTTTCCG CAAAGGGAAA ATTGCCCCGA GCTTAAGGCC 480A 481(2)SEQ ID NO:50的信息(ⅰ)序列特征(A)長度395個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:50的序列描述AGACCTGGTG GTTATAAGCC TATTGTGTTT GTCAATGGAC CTGTTAGTAC TTTGGATAAA60TTGCTTATTA CGCGATCTCG GAGTGTGTTG TCGTGAATCT GTGAGAGATG GGATGAATTT 120GGTGCCTTAT AAGTACACAG TGACTCGGCA AGGGAGCCCT GCTTTGGATG CAGCTTTAGG 180TTTTGGGGAG GATGATGTTA GGAAGAGTGT GATTATTGTT TCTAGTTCAT CGGTTGTCTC 240CATCTCTGAG TGGTGCGATC CGTTAATCCG TGGAACATCG TGCAGTCACT AAACGCCATG 300AGCCTGCAAT ACGATGTCGC AAAGGGAAAA TCTTTGCCAC CAGAAGCATC ATAAGTACAT 360AAAGCCTCAC AATTGCCTAT TTGGGCCGGG GTTTT 395(2)SEQ ID NO:51的信息(ⅰ)序列特征(A)長度431個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物水稻(Oryza sativa)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature
(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)準(zhǔn)名=“GENBANK ID:D22143”(ⅹⅰ)SE Q ID NO:51的序列描述GGGAATGGAG GGTCTCCGAG CTGCAGCAGC AATTTGAGGG GAAGACTGTG TTGCTCGGTG60TGGATGACAT GGATATCTTC AAGGGTATCA ACTTGAAGCT TCTTGCCTTC GAGAATATGT 120TGAGGACACA TCCCAAGTGG CAGGGGCGGG CAGTGTTGGT GCAAATTGCT AATCCGGCCC 180GTGGAAAGGG TAAGGATCTT GAAGCCATCC AGGCTGAGAT TCATGAGAGC TGCAAGAGGA 240TTAATGGAGA GTTTGGCCAG TCAGGATACA GCCCTGTTGT CTTCATTGAC CGTGATGTGT 300CAAGTGTGGA GGAAGATTGC CTACTACACA ATAGCAGAAT GTGTGGTGGT GACTGCTGTT 360AGGGATGGGA TTGACTTGAC ACCATATGGA TATATTGTCT GTAGGGCAGG GGTCTTACTC 420ACATCAGAGG T431(2)SEQ ID NO:52的信息(ⅰ)序列特征(A)長度496個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物水稻(Oryza sativa)(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc feature(B)位置1(D)其它信息/標(biāo)準(zhǔn)名=“GENBANK ID:D40048”(ⅹⅰ)SE Q ID NO:52的序列描述CTACCGTTCC CTCCCTGTTC GCGACGAGAT CCTCAAATCA CTGCTAAACT GCGATCTGAT60TGGGTTCCAC ACCTTTGATT ACGCGCGGCA TTTCCTGTCC TGCTGCAGCC GGATGCTGGG 120GATCGAGTAC CAGTCGAAGA GGGGATATAT CGGTCTCGAT TACTTTGGCC GCACTGTTGG 180GATAAAGATC ATGCCTGTTG GGATTAACAT GACGCAGCTG CAGACGCAGA TCCGGCTGCC 240TGATCTTGAG TGGCGTGTCG CGAACTCCGG AAGCAGTTTG ATGGGAAGAC TGTCATGCTC 300GGTGTGGATG ATATGGACAT ATTTAAGGGG ATTAATCTGA AAGTTCTTGC GTTTTGAGCA 360GATGCTGAGG ACACACCCAA AATGGCAGCC AAGGCAGTTT TGGTGCAGAT TCAAACCAAG 420GGTGGTTGTT GGGAGGACTT AGGTACAGCT AGATATGAGT TCAGGGGTAA TGACATTTCA 480GGCGGTATTT CCTTGG 496(2)SEQ ID NO:53的信息(ⅰ)序列特征(A)長度288個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物水稻(Oryza sativa)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:53的序列描述GGACCAAAGA AGAGCATGTT GGTTGTGTCG GAGTTTATTG GTTGCTCACC TTCACTGAGT60GGAGCCATTC GTGTTAACCC GTGGAATATC GAGGCAACTG CAGAGGCACT GAATGAGGCC 120ATCTCAATGT CAGAGCGTAA AAGCAGCTGA GGCACGAAAA ACATTACCGT TATGTCAGCA 180CCCATGATGT TGCATATTGG TCTAAGAGCT TTGTACAGGA CCTGGAGAGG GCTTGCAAGG 240ATCACTTTAG GAAACCATGC TGGGGCATTG GATTGGATTT CGCTCAGG288(2)SEQ ID NO:54的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2207個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型cDNA至mRNA(ⅲ)假設(shè)非(ⅲ)反義否(ⅵ)初始來源(A)生物馬鈴薯(Solanum tuberosum)(B)種類Kardal(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置161..1906(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc-feature(B)位置842..850(D)其它信息/功能=“推定的糖基化位點(diǎn)”(ⅹⅰ)SE Q ID NO:54的序列描述CTTTTCTGAG TAATAACATA GGCATTGATT TTTTTTCAAT TAATAACACC TGCAAACATT 60CCCATTGCCG GCATTCTCTG TTCTTACAAA AAAAAACATT TTTTTGTTCA CATAAATTAG 120TTATGGCATC AGTATTGAAC CCTTTAACTT GTTATACAAT ATG GGT AAA GCT ATA175Met Gly Lys Ala Ile1 5ATT TTT ATG ATT TTT ACT ATG TCT ATG AAT ATG ATT AAA GCT GAA ACT 223Ile Phe Met Ile Phe Thr Met Ser Met Asn Met Ile Lys Ala Glu Thr10 15 20TGC AAA TCC ATT GAT AAG GGT CCT GTA ATC CCA ACA ACC CCT TTA GTG 271Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro Thr Thr Pro Leu Val25 30 35ATT TTT CTT GAA AAA GTT CAA GAA GCT GCT CTT CAA ACT TAT GGC CAT 319Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Gly His40 45 50AAA GGG TTT GAT GCT AAA CTG TTT GTT GAT ATG TCA CTG AGA GAG AGT 367Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met Ser Leu Arg Glu Ser55 60 65CTT TCA GAA ACA GTT GAA GCT TTT AAT AAG CTT CCA AGA GTT GTG AAT 415Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu Pro Arg Val Val Asn70 75 80 85GGT TCA ATA TCA AAA AGT GAT TTG GAT GGT TTT ATA GGT AGT TAC TTG 463Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe Ile Gly Ser Tyr Leu90 95 100AGT AGT CCT GAT AAG GAT TTG GTT TAT GTT GAG CCT ATG GAT TTT GTG 511Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu Pro Met Asp Phe Val105 110 115GCT GAG CCT GAA GGC TTT TTG CCA AAG GTG AAG AAT TCT GAG GTG AGG 559Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys Asn Ser Glu Val Arg120 125 130GCA TGG GCA TTG GAG GTG CAT TCA CTT TGG AAG AAT TTA AGT AGG AAA 607Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys Asn Leu Ser Arg Lys135 140 145GTG GCT GAT CAT GTA TTG GAA AAA CCA GAG TTG TAT ACT TTG CTT CCA 655Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu Tyr Thr Leu Leu Pro150 155 160 165TTG AAA AAT CCA GTT ATT ATA CCG GGA TCG CGT TTT AAG GAG GTT TAT 703Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg Phe Lys Glu Val Tyr170 175 180TAT TGG GAT TCT TAT TGG GTA ATA AGG GGT TTG TTA GCA AGC AAA ATG 751Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu Leu Ala Ser Lys Met185 190 195TAT GAA ACT GCA AAA GGG ATT GTG ACT AAT CTG GTT TCT CTG ATA GAT 799Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu Val Ser Leu Ile Asp200 205 210CAA TTT GGT TAT GTT CTT AAC GGT GCA AGA GCA TAC TAC AGT AAC AGA 847Gln Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala Tyr Tyr Ser Asn Arg215 220 225AGT CAG CCT CCT GTC CTG GCC ACG ATG ATT GTT GAC ATA TTC AAT CAG 895Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val Asp Ile Phe Asn Gln230 235 240 245ACA GGT GAT TTA AAT TTG GTT AGA AGA TCC CTT CCT GCT TTG CTC AAG 943Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu Pro Ala Leu Leu Lys250 255 260GAG AAT CAT TTT TGG AAT TCA GGA ATA CAT AAG GTG ACT ATT CAA GAT 991Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys Val Thr Ile Gln Asp265 270 275GCT CAG GGA TCA AAC CAC AGC TTG AGT CGG TAC TAT GCT ATG TGG AAT1039Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr Tyr Ala Met Trp Asn280 285 290AAG CCC CGT CCA GAA TCG TCA ACT ATA GAC AGT GAA ACA GCT TCC GTA1087Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser Glu Thr Ala Ser Val295 300 305CTC CCA AAT ATA TGT GAA AAA AGA GAA TTA TAC CGT GAA CTG GCA TCA1135Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr Arg Glu Leu Ala Ser310 315 320 325GCT GCT GAA AGT GGA TGG GAT TTC AGT TCA AGA TGG ATG AGC AAC GGA1183Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg Trp Met Ser Asn Gly330 335 340TCT GAT CTG ACA ACA ACT AGT ACA ACA TCA ATT CTA CCA GTT GAT TTG1231Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile Leu Pro Val Asp Leu345 350 355AAT GCA TTC CTT CTG AAG ATG GAA CTT GAC ATT GCC TTT CTA GCA AAT1279Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile Ala Phe Leu Ala Asn360 365 370CTT GTT GGA GAA AGT AGC ACG GCT TCA CAT TTT ACA GAA GCT GCT CAA1327Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe Thr Glu Ala Ala Gln375 380 385AAT AGA CAG AAG GCT ATA AAC TGT ATC TTT TGG AAC GCA GAG ATG GGG1375Asn Arg Gln Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp Asn Ala Glu Met Gly390 395 400 405CAA TGG CTT GAT TAC TGG CTT ACC AAC AGC GAC ACA TCT GAG GAT ATT1423Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp Thr Ser Glu Asp Ile410 415 420TAT AAA TGG GAA GAT TTG CAC CAG AAC AAG AAG TCA TTT GCC TCT AAT1471Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gln Asn Lys Lys Ser Phe Ala Ser Asn425 430 435TTT GTT CCG CTG TGG ACT GAA ATT TCT TGT TCA GAT AAT AAT ATC ACA1519Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser Asp Asn Asn Ile Thr440 445 450ACT CAG AAA GTA GTT CAA AGT CTC ATG AGC TCG GGC TTG CTT CAG CCT1567Thr Gln Lys Val Val Gln Ser Leu Met Ser Ser Gly Leu Leu Gln Pro455 460 465GCA GGG ATT GCA ATG ACC TTG TCT AAT ACT GGA CAG CAA TGG GAT TTT1615Ala Gly Ile Ala Met Thr Leu Ser Asn Thr Gly Gln Gln Trp Asp Phe470 475 480 485CCG AAT GGT TGG CCC CCC CTT CAA CAC ATA ATC ATT GAA GGT CTC TTA1663Pro Asn Gly Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Ile Ile Glu Gly Leu Leu490 495 500AGG TCT GGA CTA GAA GAG GCA AGA ACC TTA GCA AAA GAC ATT GCT ATT1711Arg Ser Gly Leu Glu Glu Ala Arg Thr Leu Ala Lys Asp Ile Ala Ile505 510 515CGC TGG TTA AGA ACT AAC TAT GTG ACT TAC AAG AAA ACC GGT GCT ATG1759Arg Trp Leu Arg Thr Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Lys Thr Gly Ala Met520 525 530TAT GAA AAA TAT GAT GTC ACA AAA TGT GGA GCA TAT GGA GGT GGT GGT1807Tyr Glu Lys Tyr Asp Val Thr Lys Cys Gly Ala Tyr Gly Gly Gly Gly535 540 545GAA TAT ATG TCC CAA ACG GGT TTC GGA TGG TCA AAT GGC GTT GTA CTG1855Glu Tyr Met Ser Gln Thr Gly Phe Gly Trp Ser Asn Gly Val Val Leu550 555 560 565GCA CTT CTA GAG GAA TTT GGA TGG CCT GAA GAT TTG AAG ATT GAT TGC1903Ala Leu Leu Glu Glu Phe Gly Trp Pro Glu Asp Leu Lys Ile Asp Cys570 575 580TAATGAGCAA GTAGAAAAGC CAAATGAAAC ATCATTGAGT TTTATTTTCT TCTTTTGTTA 1963AAATAAGCTG CAATGGTTTG CTGATAGTTT ATGTTTTGTA TTACTATTTC ATAAGGTTTT 2023TGTACCATAT CAAGTGATAT TACCATGAAC TATGTCGTTC GGACTCTTCA AATCGGATTT 2083TGCAAAAATA ATGCAGTTTT GGAGAATCCG ATAACATAGA CCATGTATGG ATCTAAATTG 2143TAAACAGCTT ACTATATTAA GTAAAAGAAA GATGATTCCT CTGCTTTAAA AAAAAAAAAA 2203AAAA 2207(2)SEQ ID NO:55的信息(ⅰ)序列特征(A)長度581個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)SE Q ID NO:55的序列描述Met Gly Lys Ala Ile Ile Phe Met Ile Phe Thr Met Ser Met Asn Met1 5 10 15Ile Lys Ala Glu Thr Cys Lys Ser Ile Asp Lys Gly Pro Val Ile Pro20 25 30Thr Thr Pro Leu Val Ile Phe Leu Glu Lys Val Gln Glu Ala Ala Leu35 40 45Gln Thr Tyr Gly His Lys Gly Phe Asp Ala Lys Leu Phe Val Asp Met50 55 60Ser Leu Arg Glu Ser Leu Ser Glu Thr Val Glu Ala Phe Asn Lys Leu65 70 75 80Pro Arg Val Val Asn Gly Ser Ile Ser Lys Ser Asp Leu Asp Gly Phe85 90 95Ile Gly Ser Tyr Leu Ser Ser Pro Asp Lys Asp Leu Val Tyr Val Glu100 105 110Pro Met Asp Phe Val Ala Glu Pro Glu Gly Phe Leu Pro Lys Val Lys115 120 125Asn Ser Glu Val Arg Ala Trp Ala Leu Glu Val His Ser Leu Trp Lys130 135 140Asn Leu Ser Arg Lys Val Ala Asp His Val Leu Glu Lys Pro Glu Leu145 150 155 160Tyr Thr Leu Leu Pro Leu Lys Asn Pro Val Ile Ile Pro Gly Ser Arg165 170 175Phe Lys Glu Val Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Val Ile Arg Gly Leu180 185 190Leu Ala Ser Lys Met Tyr Glu Thr Ala Lys Gly Ile Val Thr Asn Leu195 200 205Val Ser Leu Ile Asp Gln Phe Gly Tyr Val Leu Asn Gly Ala Arg Ala210 215 220Tyr Tyr Ser Asn Arg Ser Gln Pro Pro Val Leu Ala Thr Met Ile Val225 230 235 240Asp Ile Phe Asn Gln Thr Gly Asp Leu Asn Leu Val Arg Arg Ser Leu245 250 255Pro Ala Leu Leu Lys Glu Asn His Phe Trp Asn Ser Gly Ile His Lys260 265 270Val Thr Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Asn His Ser Leu Ser Arg Tyr275 280 285Tyr Ala Met Trp Asn Lys Pro Arg Pro Glu Ser Ser Thr Ile Asp Ser290 295 300Glu Thr Ala Ser Val Leu Pro Asn Ile Cys Glu Lys Arg Glu Leu Tyr305 310 315 320Arg Glu Leu Ala Ser Ala Ala Glu Ser Gly Trp Asp Phe Ser Ser Arg325 330 335Trp Met ser Asn Gly Ser Asp Leu Thr Thr Thr Ser Thr Thr Ser Ile340 345 350Leu Pro Val Asp Leu Asn Ala Phe Leu Leu Lys Met Glu Leu Asp Ile355 360 365Ala Phe Leu Ala Asn Leu Val Gly Glu Ser Ser Thr Ala Ser His Phe370 375 380Thr Glu Ala Ala Gln Asn Arg Gln Lys Ala Ile Asn Cys Ile Phe Trp385 390 395 400Asn Ala Glu Met Gly Gln Trp Leu Asp Tyr Trp Leu Thr Asn Ser Asp405 410 415Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Lys Trp Glu Asp Leu His Gln Asn Lys Lys420 425 430Ser Phe Ala Ser Asn Phe Val Pro Leu Trp Thr Glu Ile Ser Cys Ser435 440 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權(quán)利要求
1．通過誘導(dǎo)海藻糖-6-磷酸代謝可得量的改變?cè)隗w內(nèi)改變細(xì)胞、組織或器官的發(fā)育和/或組成的方法。
2．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量在細(xì)胞內(nèi)糖酵解方向中促進(jìn)碳流動(dòng)的方法。
3．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量在細(xì)胞內(nèi)糖酵解方向中抑制碳流動(dòng)的方法。
4．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量在細(xì)胞內(nèi)抑制光合作用的方法。
5．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量在細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)光合作用的方法。
6．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量促進(jìn)池相關(guān)活性的方法。
7．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量促進(jìn)細(xì)胞或組織生長的方法。
8．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量抑制細(xì)胞或組織生長的方法。
9．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量增強(qiáng)細(xì)胞代謝的方法。
10．依據(jù)權(quán)利要求2、4、7或9的方法，其特征在于所述細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸濃度的降低是由磷酸海藻糖磷酸酶(TPP)活性增加的造成的。
11．依據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于TPP活性的增加是通過用一個(gè)能表達(dá)TPP酶的載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。
12．依據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于用含有編碼TPP的異源基因的一種載體轉(zhuǎn)化所述的細(xì)胞。
13．依據(jù)權(quán)利要求2、4、7或9的方法，其特征在于所述的細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸濃度的降低是由磷酸海藻糖合成酶(TPS)活性降低造成的。
14．依據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于所述的TPS活性降低是由能表達(dá)抑制TPS的分子的載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞造成的。
15．依據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于所述載體包含TPS的反義基因。
16．依據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述的降低是由于內(nèi)源TPP酶的突變。
17．依據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于海藻糖-6-磷酸的降低是由磷酸-α-(1,1)-葡糖苷酶的相對(duì)過量表達(dá)造成的。
18．依據(jù)權(quán)利要求3、5、6或8的方法，其特征在于所述的細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸濃度的增加是由TPS活性的增加造成的。
19．依據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于TPS活性的增加是通過用能表達(dá)TPS酶的載體轉(zhuǎn)化所述的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的。
20．依據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于用含有編碼TPS的異源基因的載體轉(zhuǎn)化所述的細(xì)胞。
21．依據(jù)權(quán)利要求3、5、6或8的方法，其特征在于所述的細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸濃度的增加是由TPP活性的降低造成的。
22．依據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于所述的TPP活性的降低是通過用能表達(dá)抑制TPP的分子的載體轉(zhuǎn)化所述的細(xì)胞。
23．依據(jù)權(quán)利要求22的方法，其特征在于所述的載體含有TPS的反義基因。
24．依據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于所述的增加是由于內(nèi)源TPS酶的突變。
25．依據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述的細(xì)胞位于植物內(nèi)。
26．依據(jù)權(quán)利要求25的方法，其特征在于所述的植物是一種轉(zhuǎn)基因植物。
27．依據(jù)權(quán)利要求26的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因植物是用根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。
28．依據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述的細(xì)胞位于動(dòng)物內(nèi)，優(yōu)選為哺乳類，更優(yōu)選為人類。
29．依據(jù)權(quán)利要求1-24中任何一項(xiàng)的方法，其特征在于所述的細(xì)胞是微生物，優(yōu)選的選自細(xì)菌、微生物、酵母、真菌、細(xì)胞培養(yǎng)物、卵母細(xì)胞、精細(xì)胞、雜交瘤、原生生物和愈傷組織。
30．一種包含編碼TPP的基因的克隆載體。
31．依據(jù)權(quán)利要求30的克隆載體，其特征在于其包括選自描述于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17以及來自由SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44所編碼的兩分酶的TPP編碼部分的核苷酸序列。
32．一個(gè)克隆載體，其包括TPS的反義基因，該基因一旦表達(dá)則能防止內(nèi)源TPS基因的功能活性。
33．一個(gè)包含TPS基因的克隆載體，其特征在于其包括選自描述于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NNO:51,SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53中的核苷酸序列。
34．一個(gè)克隆載體，其包括TPP的反義基因，該基因一旦表達(dá)則能防止內(nèi)源TPP基因的功能活性。
35．特征在于用包含編碼TPP核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化此植物或其祖先之一的植物。
36．特征在于用包含編碼TPP反義基因核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化此植物或其祖先之一的植物。
37．特征在于用包含編碼TPS反義基因核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化此植物或其祖先之一的植物。
38．海藻糖-6-磷酸影響細(xì)胞內(nèi)碳水化合物分配的用途。
39．海藻糖-6-磷酸增加生物量的用途。
40．海藻糖-6-磷酸影響己糖激酶的活性的用途。
41．海藻糖-6-磷酸影響己糖激酶的信號(hào)傳遞功能的用途。
42．海藻糖-6-磷酸影響細(xì)胞壁合成的用途。
43．影響細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量以增加生物量的化合物的用途。
44．影響細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量以影響己糖激酶活性的化合物的用途。
45．影響細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量以影響光合作用的化合物的用途。
46．影響細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量以影響糖酵解途徑中碳流動(dòng)的化合物的用途。
47．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量防止冷甜化的方法。
48．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量在甜菜收獲后抑制蔗糖酶的方法。
49．影響細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸可得量以影響冷甜化或蔗糖酶的抑制的化合物的用途。
50．依據(jù)權(quán)利要求47或48的方法，其特征在于細(xì)胞內(nèi)T-6-P可得量的增加來源于磷酸海藻糖合成酶活性的增加。
51．依據(jù)權(quán)利要求47的方法，其特征在于在馬鈴薯塊莖中T-6-P可得量的調(diào)節(jié)被特異性地改變。
52．依據(jù)權(quán)利要求51的方法，其特征在于編碼磷酸海藻糖合成酶的基因在塊莖中特異性表達(dá)。
53．依據(jù)權(quán)利要求52的方法，其特征在于所述的基因是來源于大腸桿菌的TPS基因。
54．依據(jù)權(quán)利要求48的方法，其特征在于在甜菜主根中T-6-P可得量的調(diào)節(jié)被特異性地改變。
55．依據(jù)權(quán)利要求54的方法，其特征在于編碼磷酸海藻糖合成酶的基因在主根中特異性表達(dá)。
56．積累海藻糖的方法，其特征在于用編碼兩分TPS-TPP酶的DNA序列轉(zhuǎn)化生物體。
57．依據(jù)權(quán)利要求56的方法，其特征在于所述的基因是來源于擬南芥的兩分基因。
58．依據(jù)權(quán)利要求56的方法，其特征在于所述的基因是來源于卷柏的兩分基因。
59．依據(jù)權(quán)利要求56的方法，其特征在于所述的基因是人兩分基因。
60．依據(jù)權(quán)利要求56的方法，其特征在于所述的基因是來源于向日葵的兩分基因。
61．在海藻糖生產(chǎn)的過程中通過編碼兩分TPS-TPP酶的DNA序列的表達(dá)防止代謝轉(zhuǎn)向的方法。
62．依據(jù)權(quán)利要求1-24的方法，其特征在于TPS或TPP的表達(dá)被限制在特定的組織中。
63．依據(jù)權(quán)利要求1-24的方法，其特征在于TPP或TPS的表達(dá)在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下。
64．通過在海藻糖酶代謝可得量上誘導(dǎo)一種改變?cè)隗w內(nèi)改變細(xì)胞、組織或器官發(fā)育和/或組成的方法。
65．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖酶的可得量在細(xì)胞中糖酵解方向上促進(jìn)碳流量的方法。
66．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖酶的可得量在細(xì)胞中糖酵解方向上抑制碳流量的方法。
67．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖酶的可得量促進(jìn)池相關(guān)活性的方法。
68．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖酶的可得量促進(jìn)細(xì)胞或組織生長的方法。
69．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖酶的可得量抑制細(xì)胞或組織生長的方法。
70．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖酶的可得量增加細(xì)胞代謝的方法。
71．通過海藻糖-6-磷酸磷酸酶的表達(dá)在細(xì)胞中糖酵解方向上促進(jìn)碳流量的方法。
72．通過海藻糖-6-磷酸合成酶的表達(dá)在細(xì)胞中糖酵解方向上抑制碳流量的方法。
73．通過海藻糖-6-磷酸磷酸酶的表達(dá)抑制細(xì)胞內(nèi)光合作用的方法。
74．通過海藻糖-6-磷酸合成酶的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)光合作用的方法。
75．通過海藻糖-6-磷酸合成酶的表達(dá)促進(jìn)池相關(guān)活性的方法。
76．通過海藻糖-6-磷酸磷酸酶的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞或組織生長的方法。
77．通過海藻糖-6-磷酸合成酶的表達(dá)抑制細(xì)胞或組織生長的方法。
78．通過海藻糖-6-磷酸磷酸酶的表達(dá)增加細(xì)胞代謝的方法。
79．通過海藻糖-6-磷酸合成酶的表達(dá)防止冷甜化的方法。
80．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖酶的可得量防止冷甜化的方法。
81．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸的可得量防止抽苔的方法。
82．通過海藻糖-6-磷酸磷酸酶的表達(dá)防止抽苔的方法。
83．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸的可得量誘導(dǎo)抽苔的方法。
84．通過海藻糖-6-磷酸合成酶的表達(dá)誘導(dǎo)抽苔的方法。
85．通過降低細(xì)胞內(nèi)海藻糖酶的可得量誘導(dǎo)抽苔的方法。
86．通過用編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的酶的轉(zhuǎn)化以提高植物產(chǎn)量的方法。
87．通過增加細(xì)胞內(nèi)海藻糖-6-磷酸的可得量以提高植物產(chǎn)量的方法。
88．編碼海藻糖-6-磷酸合成酶的多核苷酸，其特征在于是一個(gè)兩分酶，其在編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的部分有突變。
89．編碼海藻糖-6-磷酸磷酸酶的多核苷酸，其特征在于是一個(gè)兩分酶，其在編碼海藻糖-6-磷酸合成酶的部分有突變。
90．依據(jù)權(quán)利要求88或89的多核苷酸，其特征在于兩分基因是人TPS/TPP。
91．依據(jù)權(quán)利要求90的多核苷酸，其特征在于人TPS/TPP有如SEQID NO:11的氨基酸序列。
92．依據(jù)權(quán)利要求91的多核苷酸，其特征在于它包括SEQ ID NO:10的多核苷酸序列。
93．依據(jù)權(quán)利要求88或89的多核苷酸，其特征在于兩分基因是擬南芥TPS/TPP。
94．依據(jù)權(quán)利要求93的多核苷酸，其特征在于人TPS/TPP有如SEQID NO:40的氨基酸序列。
95．依據(jù)權(quán)利要求94的多核苷酸，其特征在于它包括SEQ ID NO:39的多核苷酸序列。
96．依據(jù)權(quán)利要求88或89的多核苷酸，其特征在于兩分基因是卷柏TPS/TPP。
97．依據(jù)權(quán)利要求96的多核苷酸，其特征在于人TPS/TPP包括如SEQ ID NO:43或其突變蛋白的氨基酸序列。
98．依據(jù)權(quán)利要求97的多核苷酸，其特征在于它包括SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44的多核苷酸序列。
99．依據(jù)權(quán)利要求88或89的多核苷酸，其特征在于兩分基因是向日葵TPS/TPP。
100．依據(jù)權(quán)利要求99的多核苷酸，其特征在于人TPS/TPP包括如SEQ ID NO:25或其突變蛋白的氨基酸序列。
101．依據(jù)權(quán)利要求100的多核苷酸，其特征在于它包括SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28的多核苷酸序列。
102．帶有依據(jù)權(quán)利要求88至101中任一項(xiàng)的多核苷酸的載體。
103．包含依據(jù)權(quán)利要求102的載體的宿主生物。
104．依據(jù)權(quán)利要求103的宿主生物，其特征在于它是根癌土壤桿菌。
105．用依據(jù)權(quán)利要求103或104的宿主生物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
106．依據(jù)權(quán)利要求105的細(xì)胞，其特征在于是一種植物細(xì)胞。
107．從依據(jù)權(quán)利106的植物細(xì)胞中再生的植物或植物部分。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)胞代謝中碳流調(diào)節(jié)的領(lǐng)域。已發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)海藻糖－6－磷酸(T－6－P)可得量的改變會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞、組織和器官發(fā)育和/或組成的改變。這些改變可通過導(dǎo)入或抑制能形成T－6－P的磷酸海藻糖合成酶(TPS)和能降解T－6－P至海藻糖的磷酸海藻糖磷酸酶(TPP)來誘導(dǎo)。通過細(xì)胞內(nèi)T－6－P水平的下降會(huì)促進(jìn)通過糖酵解的碳流量。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1221454SQ97195449
公開日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年5月2日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月3日
發(fā)明者O·J·M·格迪津, J·彭, J·C·M·斯米肯斯, M·T·斯米茨 申請(qǐng)人:莫根國際股份有限公司