專(zhuān)利名稱：帶有非天然核苷酸的嵌合突變載體的制作方法
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于使真核細(xì)胞目的基因組發(fā)生特異基因改變的化合物和方法。更特別涉及稱為嵌合突變載體(CMV)的寡核堿基化合物向目的細(xì)胞的核導(dǎo)入，該載體序列與目的細(xì)胞中要改變的基因(目的基因)有同源區(qū)和一或多個(gè)不同區(qū)域。設(shè)計(jì)CMV的構(gòu)建方法使CMV與目的基因之間發(fā)生基因重組，即CMV序列取代目的基因序列。
2．發(fā)明背景2.1真核細(xì)胞基因的定點(diǎn)改變分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究人員認(rèn)識(shí)到不僅希望能將一個(gè)新的多核酸序列即一個(gè)新基因?qū)胍粋€(gè)目的真核細(xì)胞，而且希望能改變目的細(xì)胞中特定的已存在基因。目的細(xì)胞可用于培養(yǎng)或構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
DNA導(dǎo)入培養(yǎng)的真核細(xì)胞的技術(shù)非常多，包括磷酸鈣沉淀，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞，電穿孔，脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合和用復(fù)制缺陷的病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。但這些技術(shù)雖經(jīng)常用來(lái)將功能基因?qū)胝婧思?xì)胞，但是它們并不容易完成特定存在的基因的改變(突變)。導(dǎo)入后，外源基因通過(guò)不正常重組，分散于細(xì)胞基因組的隨機(jī)位置，而不是通過(guò)同源重組位于特定位置。
本發(fā)明之前，在高等真核細(xì)胞，即哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)細(xì)胞中沒(méi)有普遍令人滿意的方法導(dǎo)入定點(diǎn)基因改變。盡管可通過(guò)導(dǎo)入核酸大片段(71kb)在高等真核細(xì)胞中得到同源重組，但這一技術(shù)篩選工作困難，因?yàn)楦叩日婧思?xì)胞中的不正常重組率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于同源重組。Thomas,K.R.＆Capecchi M.R.,1987，細(xì)胞(Cell)52:503.也參見(jiàn)Valancius,V.＆Smithies O.,1991，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)11:4389(真核細(xì)胞中線形和超螺旋質(zhì)粒同源重組的比較)。
能獲得優(yōu)勢(shì)的定點(diǎn)突變的一個(gè)方法是將單鏈寡脫氧核苷酸直接導(dǎo)入細(xì)胞。這一技術(shù)已成功用于釀酒酵母(Saccharomyces cerecisiae)，該酵母菌同源重組比在高等真核細(xì)胞中活躍得多。Moerschell,R.P．等，1988，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.)85:524-28；Yamamoto,T.等，1992，酵母(Yeast)8:935-48。但目前為止，未有在哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)細(xì)胞中用單鏈寡核苷酸轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道。
研究表明在嘌呤和嘧啶堿基交替的區(qū)域即[d(TG)30d(AC)30]顯示出提高的重組率，提示目的DNA結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物中同源重組率的相關(guān)性。這些影響因素在對(duì)培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的非復(fù)制型質(zhì)粒的研究中被證明。Wahls,W.P.，等，1990，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)10:785-93。這些實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)一步顯示外源核酸與細(xì)胞基因組間的重組。
曾試圖將細(xì)菌大腸桿菌中促進(jìn)同源重組的蛋白質(zhì)RecA用于促進(jìn)真核細(xì)胞同源重組。但這些嘗試沒(méi)有顯著成效。如授予W.Bertling的美國(guó)專(zhuān)利NO.4,950,599公開(kāi)了在真核細(xì)胞中用RecA只取得極低頻率的定點(diǎn)突變，同源重組率沒(méi)有提高。D.Zarling和E.Sena的專(zhuān)利公開(kāi)WO93/22443和D.C.Gruenert和K.Kun zelmann的94/04032聲稱在與囊性纖維變性相關(guān)的培養(yǎng)細(xì)胞系中糾正了一個(gè)遺傳缺陷。這些出版物主要公開(kāi)證明原理的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)而不是涉及操作方法的數(shù)據(jù)。因此為將多核苷酸/RecA化合物導(dǎo)入核內(nèi)，Zarling＆Gruenert使用膜通透的細(xì)胞，盡管這種細(xì)胞不能再生長(zhǎng)。然而，即使據(jù)稱RecA促進(jìn)的同源重組在完整細(xì)胞中發(fā)生時(shí)，公開(kāi)物未給出定量的重組率。因此使用原核recA沒(méi)有令人信服地表明它在任何活真核細(xì)胞中導(dǎo)致同源重組率比自發(fā)同源重組率大得多。2.2．帶有DNA.RNA堿基對(duì)的嵌合寡核苷酸本節(jié)包括的出版物或?qū)＠暾?qǐng)不應(yīng)理解為承認(rèn)該出版物或申請(qǐng)先于本發(fā)明發(fā)生，或來(lái)自于非發(fā)明人的其它人的構(gòu)思。
Kmiec,E.B．等，1994年11月，分子細(xì)胞生物學(xué)14:7163-7172描述了一個(gè)帶有互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的寡核苷酸，它包含噬菌體M13mp19片段的同源序列。該寡核苷酸有一個(gè)單一核糖核苷酸的連續(xù)片段。Kmiec等指出該寡核苷酸是來(lái)自玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)的REC2同源配對(duì)酶的底物。
E.B.Kmiec公開(kāi)于1995年6月15的專(zhuān)利公開(kāi)WO95/15972，和相應(yīng)的申請(qǐng)于1994年12月9日的U.S專(zhuān)利申請(qǐng)登記號(hào)08/353,657描述CMV用于向真核細(xì)胞導(dǎo)入基因改變，并報(bào)道了在玉蜀黍黑粉菌基因和鼠ras基因中的實(shí)施例。后者是為了在ras基因中導(dǎo)入轉(zhuǎn)化突變，以便NIH3T3細(xì)胞中的ras基因的成功突變引起細(xì)胞集落生長(zhǎng)(轉(zhuǎn)化)。WO95/15972公開(kāi)物報(bào)道了NIH3T3最大的轉(zhuǎn)化率小于0.1％，即每106個(gè)ras CMV處理的細(xì)胞中形成大約100個(gè)轉(zhuǎn)化子。在玉蜀黑粉菌體系中的轉(zhuǎn)化率約為600/106。Kmiec,E.B．在1996年2月腫瘤學(xué)研討會(huì)(Seminarsin oncology)23:188中敘述設(shè)計(jì)一個(gè)嵌合載體向人bc1-2基因?qū)胍粋€(gè)突變。
Kmiec,E.B．在1995年12月的Advanced Drug Delivery Reviews17:333-40描述一個(gè)用來(lái)修復(fù)K-ras 12號(hào)密碼子的突變的CMV，該CMV在Capan 2中試驗(yàn)，用LIPOFECTINTM導(dǎo)入來(lái)源于人胰腺癌的Capan2細(xì)胞系，暴露給CMV后24小時(shí)，收集細(xì)胞，提取基因組DNA,PCR擴(kuò)增含K-ras 12號(hào)密碼子的片段，用等位基因特異探針雜交估計(jì)轉(zhuǎn)變率，據(jù)稱修復(fù)率是18％。
Yoon K等，1996年3月，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)93:2071報(bào)道設(shè)計(jì)一個(gè)用來(lái)修復(fù)肝/骨/腎型堿性磷酸酶編碼基因的一個(gè)突變的CMV。將磷酸酶基因用質(zhì)粒瞬間導(dǎo)入CHO細(xì)胞，6小時(shí)后，導(dǎo)入CMV，導(dǎo)入CMV后24小時(shí)收集質(zhì)粒進(jìn)行分析，結(jié)果表明CMV修復(fù)了約30-38％的堿性磷酸酶基因。
Kmiec,E.B.,A.Cole-Strauss和Yoon,K.的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)登記號(hào)NO08/640,517,1996年5月1日申請(qǐng)，公開(kāi)了用于治療造血細(xì)胞的遺傳病如鐮刀型貧血病，地中海貧血病，和高歇氏病的方法和CMV。
3．附圖簡(jiǎn)述

圖1．嵌合突變載體的一個(gè)實(shí)施方案的一般形式圖2A和2B．圖2A顯示寡核苷酸Ch1(序列18)，嵌合寡核苷酸Ch1(序列15),Ch2(序列16),Ch3(序列17)的序列和結(jié)構(gòu)。圖2B詳細(xì)說(shuō)明嵌合載體Ch1和堿性磷酸酶基因(序列19)693-728核苷酸之間的關(guān)系。DNA核苷酸序列在上；RNA核苷酸序列在下。
圖3．βS-珠蛋白(序列21,1-25核苷酸)，βA-珠蛋白(序列201-25核苷酸)，δ-珠蛋白(序列25)和嵌合載體SCl-SC5(序列20-24)的序列。DNA與RNA核苷酸表示方法與圖2A相同。
圖4A和4B．圖4A和4B分別表示在EB轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞培養(yǎng)物中，由βs變?yōu)棣翧的珠蛋白拷貝分?jǐn)?shù)對(duì)加入的nMSCl的函數(shù)；和由βA變?yōu)棣耂的拷貝分?jǐn)?shù)對(duì)加入的SC2的nM的函數(shù)。
圖5．表示由βA變?yōu)棣耂的珠蛋白拷貝分?jǐn)?shù)對(duì)向cd34+造血干細(xì)胞培養(yǎng)物中加入的ng SC2的函數(shù)。
4．定義按照下列定義理解本發(fā)明。
寡核堿基是核堿基的聚合物，該聚合物可按照Watson-Crick堿基互補(bǔ)原則與有互補(bǔ)序列的DNA雜交。
核堿基包含一個(gè)堿基，即嘌呤，嘧啶或它們的衍生物或類(lèi)似物。核堿基包括肽核堿基，肽核酸的亞基，和1,4-氮氧六環(huán)核堿基以及核苷，類(lèi)核苷和核苷酸。核苷是含有一個(gè)戊糖呋喃糖基部分的核堿基，如一個(gè)任選被取代的核苷或2’-脫氧核苷，并與其他不含磷的核堿基連接。類(lèi)核苷酸是含戊糖呋喃糖基部分的核堿基，連接鍵含磷，如硫代磷酸酯，磷酸酰胺，和甲基磷酸酯，但不是磷酸酯。核苷酸是含戊糖呋喃糖基的通過(guò)非取代的磷酸二酯鍵連接的核堿基。
寡核堿基鏈(chain)有一個(gè)5’和3’末端(terminus)，即聚合物最后的核堿基。一個(gè)特定的寡核堿基鏈可以含有所有類(lèi)型的核堿基。寡核堿基化合物是含有一或多個(gè)按Watson-Crick堿基配對(duì)原則互補(bǔ)雜交的寡核堿基鏈的化合物。
核堿基是脫氧核糖型或核糖型。核糖型核堿基含戊糖呋喃糖基的核堿基，其2’碳是被羥基，烷氧基或鹵素取代的亞甲基。脫氧核糖型核堿基是非核糖型核堿基的核堿基，包括所有不含戊糖呋喃糖基部分的核堿基。
寡核堿基鏈一般包括寡核堿基鏈(chain)和寡核堿基鏈(chain)片段或區(qū)域。寡核堿基鏈有一個(gè)3’端點(diǎn)(end)和一個(gè)5’端點(diǎn)。當(dāng)寡核堿基鏈與單鏈(chain)同向延伸時(shí)，鏈的3’和5’端點(diǎn)即是鏈(chain)的3’和5’末端(terminus)。
區(qū)域是寡核堿基的一部分，其序列來(lái)源特殊，如有一個(gè)區(qū)域包括至少15個(gè)核苷酸是人β-珠蛋白基因的一個(gè)片段的序列的CMV。片段是CMV中有某些特征性結(jié)構(gòu)特征的一部分。給定片段或給定區(qū)域可含有2’-脫氧核苷酸和核糖核苷酸。然而，核糖型片段或2’-脫氧核糖型片段分別只含有核糖型和2’-脫氧核糖型核堿基。5．概述本發(fā)明提供稱為嵌合突變載體(CMV)的寡核堿基化合物。CMV可用于在植物和動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入特異的基因變化。本發(fā)明適用于醫(yī)藥領(lǐng)域的基因治療，生物醫(yī)藥、藥物制品研究領(lǐng)域，和農(nóng)業(yè)中構(gòu)建特異突變的植物和動(dòng)物。CMV包含兩個(gè)互補(bǔ)的寡核堿基鏈。兩個(gè)鏈可位于一條單鏈(chain)或任選地以寡核苷酸交聯(lián)的任何化學(xué)鍵連接的兩條鏈(chain)上。
CMV鏈序列中除了用于向目的基因?qū)牖蜃兓耐蛔冏訁^(qū)外，與目的基因是同源的，CMV也可含有與目的基因不相關(guān)的序列區(qū)域。突變子區(qū)在3’和5’方向都必須緊挨至少一個(gè)同源區(qū)的一個(gè)堿基。
CMV的寡核堿基可以是核糖型或2’-脫氧核糖型。核糖型核堿基含有帶2’氧或鹵素的戊糖呋喃糖基部分。第一鏈同源區(qū)至少有三個(gè)連續(xù)堿基是核糖型核堿基，是與第二鏈的脫氧核糖型核堿基Warson-Crick堿基配對(duì)的。本發(fā)明不優(yōu)選使用對(duì)RNase敏感的核堿基。6．發(fā)明詳述本發(fā)明提供名為嵌合突變載體(CMV)的化合物，其可用于真核細(xì)胞基因組特異突變。CMV由嘌呤和嘧啶的聚合物組成，能與合適序列的DNA雜交，即形成嘌呤和嘧啶的Watson-Crick堿基配對(duì)。每個(gè)CMV分為第一鏈和第二鏈，各含有至少15個(gè)互補(bǔ)堿基，可以，但不必須共價(jià)連接。嘌呤和嘧啶的聚合物，名為寡核堿基，含有兩種亞基，稱為核堿基。有兩種類(lèi)型核堿基。核糖型核堿基是含有2’-OH，取代OH或2’-鹵代核糖的核糖核苷。除核糖型核堿基外，所有核堿基是脫氧核糖型核堿基。
第一和第二來(lái)鏈序列至少含有兩個(gè)區(qū)域與目的基因同源，并有一或多個(gè)區(qū)域(突變子區(qū))與目的基因不同，從而向目的基因引入基因變化。突變子區(qū)在3’和5’方向均緊鄰?fù)磪^(qū)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，每個(gè)突變子區(qū)在3’和5’方向與至少三個(gè)堿基的同源區(qū)緊鄰。本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)突變子區(qū)在3’和5’方向側(cè)鄰包含至少三個(gè)堿基的核糖型寡核堿基片段，這些片段不需與突變子區(qū)緊鄰。側(cè)翼的核糖型核堿基片段不需緊接突變子區(qū)，即可插有(intervene)同源區(qū)的含脫氧核糖型核堿基的一段。優(yōu)選同源區(qū)總長(zhǎng)度至少14個(gè)堿基。若CMV含有兩個(gè)被一個(gè)突變子區(qū)分開(kāi)的同源區(qū)，則每個(gè)同源區(qū)更優(yōu)選長(zhǎng)度為8-12堿基，最優(yōu)先為10堿基長(zhǎng)。
第一鏈的至少兩個(gè)同源區(qū)含有至少三個(gè)連續(xù)的核糖型核堿基，其與第二鏈的脫氧核糖型核堿基Watson-Crick配對(duì)。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一鏈有9-25個(gè)核糖型堿基，更優(yōu)選20個(gè)核糖型堿基，其與第二鏈的脫氧核糖型堿基第二鏈不含核糖型核堿基。一個(gè)實(shí)施方案中，第一鏈的突變子區(qū)含有脫氧核糖型核堿基Watson-Crick配對(duì)。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，兩側(cè)連接脫氧核糖型核堿基?？蛇x擇地，突變子區(qū)由第一鏈的核糖型核堿基和第二鏈的脫氧核糖型核堿基組成。
CMV進(jìn)一步特征在于含有至少三個(gè)核酸酶抗性的核糖型核堿基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所有核糖型核堿基是核酸酶抗性的。
突變子區(qū)可長(zhǎng)達(dá)2kb并編碼一個(gè)外顯子。優(yōu)選突變子區(qū)含有20或更少堿基，更優(yōu)選6或更少堿基，最優(yōu)選3或更少堿基。突變子區(qū)長(zhǎng)度可與分隔與CMV同源區(qū)同源的目的基因區(qū)的序列的長(zhǎng)度不同，這樣可對(duì)目的基因進(jìn)行插入或刪除。用CMV導(dǎo)入刪除時(shí)，突變子區(qū)內(nèi)設(shè)有可鑒定的堿基。而是通過(guò)目的基因中離散的兩個(gè)同源區(qū)的并列影響突變。一個(gè)實(shí)施方案中，突變子區(qū)是從6個(gè)堿基到1個(gè)堿基的刪除，更優(yōu)選3個(gè)到1個(gè)堿基的刪除。多個(gè)離散的突變可以通過(guò)一個(gè)單一CMV導(dǎo)入，在這種情況下相同CMV中有多突變子區(qū)?？蛇x擇地，同時(shí)用多個(gè)CMV在一個(gè)基因中引入多個(gè)基因改變或者在同一個(gè)細(xì)胞的多個(gè)基因中引入基因改變。
優(yōu)選實(shí)施方案中，CMV是RNase抗性的，因此，只使用天然存在的核糖型核堿基對(duì)Rnase敏感，不適用于本發(fā)明。一個(gè)CMV的核糖型核堿基應(yīng)包括至少三個(gè)核糖型核堿基，優(yōu)選選自非磷二酯鍵連接的核糖核苷酸“核糖類(lèi)核苷酸”、2’-氧取代或2’-鹵代核糖核苷酸，2’-氧取代或2’-鹵代類(lèi)核糖核苷酸，及可以任選2’取代的核糖核苷。CMV優(yōu)選實(shí)施方案中，使用無(wú)核酸酶敏感性的，即2’O-核糖核苷酸。
一個(gè)實(shí)施方案中，CMV是40-100堿基的寡核堿基單鏈，可選擇方案中，CMV含有第一和第二寡核堿基鏈(chain)，每個(gè)有20-100堿基；其中第一鏈(chain)含有第一鏈，第二鏈(chain)含第二鏈。第一鏈(chain)和第二鏈(chain)可以共價(jià)連接，或可選擇地僅通過(guò)Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)締合。6.1嵌合突變載體應(yīng)用嵌合突變載體可用于向任何序列已知的真核基因序列導(dǎo)入突變。突變可造成一或多個(gè)核苷酸的替代或可以是一或多個(gè)核苷酸的插入或刪除。在優(yōu)選方案中，替代、插入或刪除可是20或更少連續(xù)堿基，更優(yōu)選實(shí)施方案中，替代，插入或刪除可以是6或更少堿基，最優(yōu)選3或更少堿基。插入可長(zhǎng)達(dá)大約2kb，插入或刪除可以在基因的編碼和調(diào)節(jié)區(qū)。
可以用CMV按照任何已知或改進(jìn)的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞技術(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些技術(shù)包括電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移和磷酸鈣沉淀。一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染是用一個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移化合物如DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-三甲銨硫酸甲酯，Boehringer-Mannheim)或等效試劑如LIPOFECTIN進(jìn)行的。CMV用量不是實(shí)施本發(fā)明的關(guān)鍵，用10nM/105細(xì)胞可取得良好結(jié)果?？刹捎眉s3μg DOTAP中用大約500ng CMV/每105細(xì)胞的比率。實(shí)施例1--3的轉(zhuǎn)染技術(shù)可做改進(jìn)使用，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中、培養(yǎng)基補(bǔ)充有人血清白蛋白或人血清。
本發(fā)明包括嵌合突變載體的使用方法。嵌合突變載體的應(yīng)用包括修復(fù)遺傳疾病如高歇氏病、地中海貧血病和鐮刀形貧血病。其它應(yīng)用包括引入終止密碼子或閱讀框遷移突變以產(chǎn)生“knock-outs”，即缺少某一特定基因的一個(gè)功能性拷貝的轉(zhuǎn)基因植物或動(dòng)物，以及有特異突變的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物。本發(fā)明包括的CMV進(jìn)一步的使用方法是為了研究所感興趣基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的目的而進(jìn)行特異突變。可選擇地，若在一個(gè)物種中確定了一個(gè)期望的突變，可以用CMV將它導(dǎo)入其它物種的同源基因。
為醫(yī)療目的，本發(fā)明可以用于可從被試者體內(nèi)分離、培養(yǎng)、并再植回被試者的任何類(lèi)型細(xì)胞中的突變的修復(fù)或?qū)?。分離、培養(yǎng)、再植肝細(xì)胞、特別是肝儲(chǔ)備(干)細(xì)胞的技術(shù)在1994年4月28日的Nanghton G.B.和Sibanda B.的專(zhuān)利公告WO94/08598中有敘述。能夠在肝細(xì)胞中通過(guò)修復(fù)突變治療的遺傳病的例子包括LDL受體突變引起的家族性血膽固醇過(guò)多、α1-抗胰蛋白酶基因突變引起的肺氣腫、及分別由凝血因子Ⅷ和Ⅸ的突變引起的血友病和圣誕節(jié)病。
本發(fā)明更進(jìn)一步的應(yīng)用，用CMV使一群細(xì)胞突變，從而獲得表現(xiàn)型可選擇的突變株。根據(jù)本發(fā)明該項(xiàng)內(nèi)容，合成帶有由1或幾個(gè)核苷酸組成的突變子區(qū)的CMV的混合物，在突變子區(qū)的每個(gè)位置有非野生型的三核苷酸。用該CMV混合物處理一群細(xì)胞將在目的基因引入一系列突變。通過(guò)適當(dāng)?shù)暮Y選步驟，可獲得帶有所需表現(xiàn)型的突變株。6.2例舉的嵌合突變載體的結(jié)構(gòu)6.2.1單鏈嵌合突變載體一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合突變載體(CMV)是5’,3’一連接的寡核堿基單鏈(chain)，由大約40～100個(gè)含有戊糖呋喃糖基的核堿基組成。一個(gè)單鏈CMV可含有未配對(duì)的核苷酸，其形成一或兩個(gè)發(fā)夾轉(zhuǎn)角，這個(gè)或這些轉(zhuǎn)角將CMV分成第一和第二鏈。這樣第一鏈的至少15個(gè)堿基可與第二鏈的堿基Watson-Crick配對(duì)。
圖1表示包含(a)-(h)片段的單鏈(chain)CMV的方案的結(jié)構(gòu)。圖1的實(shí)施方案中，第一鏈包含片段(c)、(d)和(e)，與包含片段(a)的第二鏈互補(bǔ)。在這個(gè)具體實(shí)施方案中，詳述了CMV的3’末端(terminus)在(a)片段的3’端點(diǎn)，5’末端(terminus)在(h)片段的5’端點(diǎn)。但是，對(duì)于片段，CMV的終止子位置和3’和5’方向的取向可以在其它位置，只要終止子不中斷第一或第二鏈的同源或突變區(qū)。片段順序編號(hào)為(a)到(h)。
一個(gè)實(shí)施方案中，片段的長(zhǎng)度和特性如下片段(a)是16到40核苷酸，優(yōu)選20到30核苷酸。片段(a)區(qū)的序列可以是包含所需突變的基因(突變的目的基因)的編碼鏈或非編碼鏈序列。片段(a)序列位置必須包括目的基因中欲被改變的部分。除非目的基因在目的細(xì)胞中不被正常轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選片段(a)序列是目的基因編碼鏈序列。當(dāng)目的基因在目的細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄時(shí)，則編碼鏈序列或非編碼鏈序列均是優(yōu)選的。片段(a)序列決定了必須與片段(a)互補(bǔ)的(c)-(e)片段的序列和總長(zhǎng)度。
片段(a)中與(c)和(e)片段堿基互補(bǔ)的寡核堿基可以是任一種2’-脫氧核糖核堿基。稱為核糖核苷酸片段的(c)和(e)片段的核堿基，可以是任一種核糖型核堿基2’O-核糖核苷酸，即已知或改進(jìn)的核苷酸。優(yōu)選實(shí)施方案中，稱為間插片段的(d)片段的核苷酸是2’-脫氧核糖型核堿基?？蛇x擇地，(d)片段由核糖型核堿基組成；這種情況不限定片段(c)、(d)和(e)之間的界線。片段(b)和(f)到(h)可以是任何種類(lèi)核堿基。
優(yōu)選實(shí)施方案中，片段(c)和(e)序列與目的基因完全同源。但是(c)或(e)片段中的一個(gè)一堿基的突變子區(qū)可造成目的基因在同源位置的突變。
片段(b)和(g)約4核苷酸長(zhǎng)，形成單鏈發(fā)夾轉(zhuǎn)角，使得片段(a)、(c)-(e)與片段(f)和(h)形成Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)，即形成雙螺旋核酸。在可選擇的實(shí)施方案中，片段(b)和(c)共價(jià)連接第一和第二鏈的功能由非寡核堿基部分提供。
片段(c)和(e)，也稱為第一和第二核糖型片段，由一個(gè)實(shí)施方案中，含有2’-O-甲基核糖核苷酸。優(yōu)選實(shí)施方案中，片段(c)和(e)各自含有6到13核苷酸。
片段(d)，也稱為間插片段，在一個(gè)實(shí)施方案中，是4到20核苷酸長(zhǎng)。如果目的基因含有兩個(gè)或多個(gè)被15個(gè)以下核苷酸分開(kāi)的點(diǎn)突變，則同一個(gè)CMV可將每個(gè)突變修復(fù)。
片段(f)和(h)形成雙螺旋，其帶來(lái)CMV的3’和5’端點(diǎn)，在片段(a)和(h)間形成有切口的并列。片段(f)、(g)和(h)形成的結(jié)構(gòu)稱為發(fā)夾帽。發(fā)夾帽含有一個(gè)末端(terminus)的端點(diǎn)和一個(gè)非末端(terminus)的端點(diǎn)。末端(terminus)的端點(diǎn)形成鏈的末端(terminus)，可是5’或3’末端(terminus)。發(fā)夾帽的功能是控制3’或5’末端(terminus)的位置。發(fā)夾帽的非末端(terminus)的端點(diǎn)可連接到一個(gè)鏈的端點(diǎn)，通過(guò)其互補(bǔ)鏈的端點(diǎn)，鏈的第二個(gè)末端(terminus)端點(diǎn)與發(fā)夾帽的末端(terminus)端點(diǎn)并列，如圖1所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，3’和5’末端(terminus)可以是去磷酸化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，3’t 5’末端(terminus)可以通過(guò)磷酸二酯鍵或相當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)鍵共價(jià)連接，則CMV是一個(gè)閉環(huán)寡核苷酸。片段(f)和(h)可任選地從閉環(huán)CMV中刪去。優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)夾帽寡核堿基的取向與它所連接的鏈的取向一致。如果發(fā)夾帽的取向、反平行于它所連接的鏈，則發(fā)夾的3’或5’末端(terminus)端點(diǎn)的設(shè)計(jì)由互補(bǔ)的末端端點(diǎn)結(jié)構(gòu)決定。
優(yōu)選實(shí)施方案中，CMV是含有一個(gè)與鏈平行取向的發(fā)夾帽，3’和5’端點(diǎn)并列的單鏈(chain)CMV。這種類(lèi)型有8個(gè)具體的實(shí)施方案，由發(fā)夾帽和鏈之間連接的位置以及通過(guò)第一鏈序列是否是目的基因的編碼鏈或非編碼鏈的序列確定。表1給出8種種類(lèi)。圖1所示為表1的第2和第6種類(lèi)。
表1種類(lèi)發(fā)夾帽與鏈連接位置第一鏈的序列1 3’第一鏈 編碼鏈2 5’第二鏈 編碼鏈3 3’第二鏈 編碼鏈4 5’第二鏈 編碼鏈5 3’第一鏈 非編碼鏈6 5’第一鏈 非編碼鏈7 3’第二鏈 非編碼鏈8 5’第二鏈 非編碼鏈6.2.2雙鏈嵌合突變載體可選擇地，CMV包含兩條鏈，每鏈有一個(gè)3’和一個(gè)5’末端(terminus)，第一鏈(chain)包含第一鏈，第二鏈(chain)包含第二鏈。第一和第二鏈(chain)可通過(guò)共價(jià)接頭交聯(lián)，或第一和第二鏈(chain)只是通過(guò)Watson-crick堿基互補(bǔ)配對(duì)締合。雙鏈CMV的第一和第二鏈的區(qū)域和片段長(zhǎng)度參照上述關(guān)于單鏈CMV的指導(dǎo)構(gòu)建。一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二鏈(chain)還包含側(cè)連第一和第二鏈兩側(cè)連接的3-10個(gè)堿基的互補(bǔ)片段，其增強(qiáng)了第一和第二鏈(chain)之間的締合的穩(wěn)定性。
一個(gè)可選擇的雙鏈(chain)CMV方案包含兩條寡核堿基鏈和兩個(gè)發(fā)夾帽；第一鏈?zhǔn)堑谝粭l鏈的一部分，第二鏈?zhǔn)堑诙l鏈的一部分。發(fā)夾帽可以兩者連接到一鏈的兩端。在一個(gè)具體構(gòu)型中，稱之為“搖籃”構(gòu)型中，第二鏈的每一個(gè)端點(diǎn)連接一個(gè)發(fā)夾帽。在“反搖籃”構(gòu)型中，發(fā)夾帽連在第一鏈的兩端。一種可選擇的構(gòu)型，稱之為“從頭到尾”，包含連在每一鏈上的發(fā)夾帽。因?yàn)镃MV的鏈只以反平行雜交，只有兩種從頭到尾的類(lèi)型的特異構(gòu)型發(fā)夾帽兩者都連在鏈的3’或5’端點(diǎn)。
6.3 CMV的合成和核堿基的選擇CMV可通過(guò)用來(lái)合成寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的任何技術(shù)合成。對(duì)單鏈長(zhǎng)度達(dá)約100堿基的CMV，優(yōu)選技術(shù)是固相合成?？蛇x擇地，長(zhǎng)于約50個(gè)堿基的CMV鏈亞片段可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的固相合成，并通過(guò)液相技術(shù)連接。Wosnick,M.A.,1987，基因(gene)60:115-117。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，互補(bǔ)的亞片段可用固相技術(shù)合成，從而退火時(shí)，亞片段的端點(diǎn)形成交錯(cuò)切口。通過(guò)使相鄰亞片段具有互補(bǔ)的交錯(cuò)切口端點(diǎn)，就可以通過(guò)公知的酶促方法連接相鄰片段。利用這一技術(shù)可以合成比100堿基大得多的CMV鏈。
CMV一條鏈(chain)的核堿基可是任何已知或改進(jìn)的能通過(guò)Watson-Crickd堿基配對(duì)與DNA雜交的核堿基。合適的核堿基包括核苷酸和類(lèi)核苷酸。帶有類(lèi)核苷酸的寡核堿基的結(jié)構(gòu)和合成參見(jiàn)硫代磷酸，Eckstein,F.，生物化學(xué)評(píng)論年刊(Ann.Rev.Biochem.,1985,54,367；氨基磷酸酯，F(xiàn)roehler,B.C.，等，核酸研究(Nucleic Acid Research,1988,16,4831；甲基膦酸酯，Miller,P.S.，等，1985，生物化學(xué)(Biochimie),1985,67,769。手性特異的含磷鍵寡類(lèi)核苷酸制備方法在美國(guó)專(zhuān)利No.5,212,295中有敘述。帶有適當(dāng)?shù)倪x擇的異構(gòu)體的手性特異寡核苷酸與DNA雜交的穩(wěn)定性提高。
以非磷核堿基連接的含戊糖呋喃糖基的核堿基，可以用作脫氧核糖型核堿基，稱為核苷。能夠與DNA形成至少具有DNA/DNA雙螺旋穩(wěn)定性的雙螺旋的核苷可用多種化學(xué)鍵連接。用于寡核堿基的化學(xué)物質(zhì)和方法如下所述甲基羥胺連接，Vasseur等，美國(guó)化學(xué)雜志(J.Am.Chem.Soc.1992,114,4006，美國(guó)專(zhuān)利No.5,386,023和5,489,677；亞烷基-氧基連接，美國(guó)專(zhuān)利No.5,223,618；和3’-硫代乙縮醛，Jones等，有機(jī)化學(xué)雜志(J.org.chem.)1993,58,2983。
其它可用于CMV的核苷包括氨基甲酸酯，Stirchak等，有機(jī)化學(xué)雜志，1987,52,4202；磺酸鹽＆磺胺，Glemarec等，四面體(Tetrahedron)1993,49,2287,Reynolds等，有機(jī)化學(xué)雜志，1992,57,2983；砜；Huang,Z.，有機(jī)化學(xué)雜志，1991,56,3869；磺酸鹽，Huie,E.M.，等，有機(jī)化學(xué)雜志，1992,57,4569和二異丙基甲硅烷基＆甲硅烷基，Cormier和Ogilvie，核酸研究1988,16,4583,Ogilvie＆Cormier，四面體快報(bào)1985,26,4159。
含戊糖呋喃糖基的核堿基可以是核糖型或2′-脫氧核糖型，用在CMV中的核糖型核堿基中至少有3個(gè)必須是核酸酶抗性的?？蓮暮颂呛怂崦缚剐缘暮藟A基中選擇適當(dāng)?shù)暮怂崦缚剐缘暮颂切秃藟A基，包括2’AX-核苷，2’AX-類(lèi)核苷，2’AR-核苷酸，A=O,F,Cl或Br，當(dāng)A=O,X=H或C1-6，且R=C1-6，或者當(dāng)A是鹵素時(shí)，X和R可省略。
缺乏戊糖呋喃糖基部分的核堿基可用作脫氧核糖型核堿基，合適的例子包括用嗎啉氨基甲酸酯代替磷酸戊糖呋喃糖基酯部分，Wang＆Weller，四面體快報(bào)，1991,32,7385和其中氨乙基甘氨酸取代磷酸戊糖呋喃糖基酯部分的肽核酸。肽核酸(PNA)詳述見(jiàn)Egholm等，美國(guó)化學(xué)會(huì)雜志，1992,114,1895和Huang,B.S.等，有機(jī)化學(xué)雜志，1991,56,5006和Buchardt等的Wo92/20703，制備PBA/寡核苷酸嵌合聚合物的方法在Wo95/14706中詳述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道PNA可從任一取向與DNA雜交，即PNA任一個(gè)端點(diǎn)可以是3’或5’端點(diǎn)。Peffter,N.J.，等，1993，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)90:10648-52。當(dāng)肽堿基位于具有含戊糖呋喃糖基核堿基的寡核堿基鏈中時(shí)，鏈的3’和5’端由戊糖呋喃糖糖基部分的取向決定，或者如果具有肽核堿基的鏈不含戊糖呋喃糖基部分，則鏈的3’和5’端由互補(bǔ)鏈的戊糖呋喃糖糖基核堿基的取向決定。注意，CMV的第一鏈至少含有三個(gè)戊糖呋喃糖基核堿基。
7．實(shí)施例實(shí)施例7.1 CMV修復(fù)附加型堿性磷酸酶的用途制備帶有由SV40早期啟動(dòng)子調(diào)控的野生型人肝/骨/腎堿性磷酸酶cDNA的表達(dá)質(zhì)粒，命名為pHAP。獲得帶有突變cDNA的相同質(zhì)粒，并命名為p711。用于使pHAP和p711序列互換的CMV的設(shè)計(jì)如圖2A所示。設(shè)計(jì)CMV Ch1用于修復(fù)711位點(diǎn)的錯(cuò)義突變。野生型序列在突變相應(yīng)位置是G殘基。Ch2與Ch1設(shè)計(jì)相同，只是在711的相應(yīng)位點(diǎn)由A代替G。Ch3與Chl序列相同，但核糖核苷酸片段的序列是堿性磷酸酶的編碼鏈序列而不是非編碼鏈序列。寡核苷酸Dh1含有與Ch1相同的序列，但只含2’-脫氧核苷酸。
圖2B中p711示意圖顯示堿性磷酸酶cDNA編碼區(qū)711位的點(diǎn)突變A，SV40早期啟動(dòng)子(PE),SV40復(fù)制起點(diǎn)(Ori)，多聚腺苷酸化位點(diǎn)和剪接小t內(nèi)含子序列(SV40 PolyA)。圖2B加點(diǎn)的框表示來(lái)自PBR322的編碼復(fù)制起點(diǎn)和β一內(nèi)酰胺酶(AMPR)基因的序列。用p711轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，6小時(shí)后，CMV,Chl導(dǎo)入事先用p711轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞，兩次均用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。在生物化學(xué)和DNA序列水平檢測(cè)向野生型表型轉(zhuǎn)化的程度，用比色法、組織化學(xué)染色和Hirt DNA分析。材料與方法寡核苷酸合成和純化用1000A大孔CPG在ABI 394 DNA/RMANA合成儀合成嵌合寡核苷酸0.2μmol.DNA亞磷酰胺(Applied Biosystems,Foster city,CA)的環(huán)外氨基用苯甲酰基保護(hù)腺嘌呤和胞嘧啶，異丁基保護(hù)烏嘌呤。2’-O-甲基RNA亞磷酰胺(Glen Research,Sterling,VA)用乙酰苯氧基保護(hù)腺嘌呤，二甲基甲酰脒保護(hù)鳥(niǎo)嘌呤，異丁基保護(hù)胞嘧啶。合成完畢，堿基保護(hù)基團(tuán)在乙醇∶濃氨水(1∶3)中55℃加熱20小時(shí)去除。寡核苷酸粗品與7M脲和10％甘油混合，加熱至70℃，加樣至含有7M脲的10％聚丙烯酰胺凝膠。凝膠電泳后，UV照射，從凝膠上切下DNA條帶，碾碎，在TE(10mM Tris-HCl和1mm EDTA,pH7.5)緩沖液振蕩過(guò)夜洗脫。含有碎凝膠片的洗脫液離心過(guò)0.45μm自旋濾膜(Millipore,Bedford,MA)并用乙醇沉淀。樣品用G-25離心柱(Boehringer Mannheim,Indianapolis,TN)進(jìn)一步脫鹽，95％以上純化寡核苷酸是全長(zhǎng)的。
瞬間轉(zhuǎn)染和組織化學(xué)染色CHO細(xì)胞保存于含10％FBS(B.R.L.Bethesda,MD)的DMEM(B.R.L,Bethesda,MD)中。將含有10μg脂質(zhì)體的1m1 OPTIMEM加入每個(gè)小槽進(jìn)行瞬間轉(zhuǎn)染。寡核苷酸轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，測(cè)定堿性磷酸酶活性。做組織化學(xué)染色，則用0.1 5M NaCl將細(xì)胞洗3次，與染色液溫育20分鐘，用50％乙醇固定。染色液50ml水中含有2mg FastVio1et,2ml Naphtol AS-MX堿性磷酸鹽溶液(Sigma Chemical Company,St.Louis,Mo)。堿性磷酸酶活性的比色測(cè)定1μg質(zhì)粒P711和l00αl含有1μg脂質(zhì)體的OPTIMEM(B.R.L.Bethesda)加入96凹槽板上的1×104CHO細(xì)胞做三次進(jìn)行瞬間轉(zhuǎn)染。6小時(shí)后，不同量的Chl或其它CMV與100μl含有1μg脂質(zhì)體的OPTIMEM混合，加入每個(gè)凹槽，18小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，每槽加入200ul含10％FBS的DMEM。嵌合寡核苷酸轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，測(cè)堿性磷酸酶活性。用Elisa Amplification System(B.R.L,Bethesda,MD)進(jìn)行比色檢測(cè)。細(xì)胞用0.15M Nacl洗三次，在100μl含有10mM NaCl 0.5％NP40、3mM MgCl2、10mM Tris-HCl,pH7.5的NP40緩沖液中溶解。一份細(xì)胞溶解物(20μl)與50μlElisa底物和50μlElisa擴(kuò)增劑(B.R.L.Bethesda,MD)溫育，與擴(kuò)增劑溫育5分鐘后通過(guò)加入50μl0.3MH2SO4中止反應(yīng)。反應(yīng)程度控制在測(cè)定方法的線性范圍內(nèi)，Elisa PlateReader讀出490nm波長(zhǎng)處的吸光度。Hirt DNA分離、菌落雜交及PCR片段測(cè)序轉(zhuǎn)染嵌合寡核苷酸24小時(shí)后，收集細(xì)胞用改進(jìn)的堿溶方法分離載體DNA，細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶解，清洗，重新懸浮于100μl含有50mM Tris-HCl,pH8.0,10mM EDTA的溶液和110μl含50mM Tris-HCl,pH8.0,10mM EDTA和100μg/ml RNase A的溶液中。加入等體積的細(xì)胞裂解液(0.2N NaOH和1％SDS)，再加100μl中和液(3M KAc,pH5.5)。室溫溫育10分鐘，接著10,000rpm離心10分鐘。上清液用等體積的酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。Hirt DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞(B.R.L.Bethesda,MD)，用設(shè)計(jì)來(lái)區(qū)別點(diǎn)突變的各個(gè)探針篩選特異雜交的Hirt DNA形成的菌落。菌落生長(zhǎng)于氨芐平板，影印至硝酸纖維素膜，進(jìn)行菌落雜交。印跡用32P端點(diǎn)標(biāo)記的寡核苷酸探針711-A(5’-CCGCCTACACCCACTCG-3’)(序列1)或711-G(5’-CCGCCTACGCCCACTCG-3’)(序列2)37℃雜交，雜交液含有5X Denhardts,1％SDS,2X SSC和100μg/ml變性鮭精DNA。52℃在TMAC溶液中(3.0M氯化四甲銨/50mM Tris-HCl,pH8.0,2mM EDTA和0.1％SDS)洗滌雜交斑。用Qiagen miniprep試劑盒(Chatworth,CA)從與711-G或711-A雜交的20個(gè)菌落中提取質(zhì)粒DNA。用自動(dòng)測(cè)序儀(ABI 373A,Applied Biosystem,Foster City,CA)從兩個(gè)方向測(cè)定每個(gè)質(zhì)粒711位點(diǎn)兩側(cè)的幾百個(gè)堿基。用VentR聚合酶(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)合成一個(gè)190bp的PCR擴(kuò)增片段，所用引物(5’-CAATGTCCCTGATGTTATGCA-3’)(序列3)和5’-CGCTGGGCCAAGGACGCT-3’(序列4)，分別對(duì)應(yīng)堿性磷酸酶cDNA 711位點(diǎn)兩側(cè)的630-650和803-822片段。擴(kuò)增片段經(jīng)凝膠純化，進(jìn)行DNA自動(dòng)測(cè)序(ABI 373A,Applied Biosystem,Foster City,CA)。
寡核苷酸穩(wěn)定性檢測(cè)10ng32P端點(diǎn)標(biāo)記的寡核苷酸與500ng未標(biāo)記寡核苷酸混合，如上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用PBS和含1M NaCl/HAc pH2.5的溶液充分沖洗細(xì)胞以減少寡核苷酸的非特異結(jié)合。用含有10mM Tris-HClpH7.5,0.5mM MgCl2和0.5％Triton X-100的溶液溶解細(xì)胞，接著用酚-氯仿抽提制得粗裂解液。裂解液在含7M脲的15％聚丙烯酰胺凝膠中電泳，接著放射自顯影。含10％FBS的DMEM溫育的寡核苷酸按同樣方法處理和分析。
在我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中將各種嵌合寡核苷酸導(dǎo)入已轉(zhuǎn)染P711的CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)變成野生型表型的程度用組織化學(xué)染色檢測(cè)；紅素沉積在表達(dá)活性酶的細(xì)胞上。當(dāng)帶有突變基因的細(xì)胞用平均為11nM ch1轉(zhuǎn)染，紅色細(xì)胞出現(xiàn)幾率大約是每三個(gè)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞有一個(gè)，相反，Ch2或Dh1都不引起酶活性升高。用Ch3轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧退胶艿?。野生型質(zhì)粒PHAP表達(dá)所測(cè)定的轉(zhuǎn)染率估計(jì)為30％。
酶活性也可用上述比色法測(cè)定。在有P711質(zhì)粒時(shí)，Ch1達(dá)到17nM，堿性磷酸酶活性表現(xiàn)劑量依賴性的升高。用17nM Ch1處理的細(xì)胞，其酶活性接近野生型質(zhì)粒PHAP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的酶活性的60％。這種升高是序列特異的，因?yàn)橄嗤康腃h1不影響用pHAP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的酶活性。而且，含有來(lái)自Ch1序列的僅一個(gè)堿基對(duì)改變的Ch2不引起酶活性升高。寡核苷酸Dh1與Ch1序列相同，但不含核糖核苷酸片段，就不出現(xiàn)酶活性升高。因此比色法測(cè)定的堿性磷酸酶活性與組織化學(xué)染色所得結(jié)果一致。
嵌合寡核苷酸糾正目的DNA序列的點(diǎn)突變?yōu)榱舜_定DNA序列水平上的變化，用改進(jìn)的堿裂解方法(Wang G，等，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)15，1759)在嵌合寡核苷酸轉(zhuǎn)染24小時(shí)后從P711和各種寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中制備Hirt提取物。Hirt DNA高效轉(zhuǎn)化DH5 α細(xì)胞，在106轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞中產(chǎn)生104個(gè)Ampk菌落。用區(qū)別點(diǎn)突變(A)序列和野生型(G)序列的設(shè)計(jì)的探針篩選特異雜交的DH5α轉(zhuǎn)化體，兩個(gè)序列分別對(duì)應(yīng)突變和正常cDNA的703-719位點(diǎn)，Weiss,MJ.2988，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)85:7666。將至少兩次轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的多平板中的500個(gè)以上菌落中與探針711-G或711-A雜交的菌落數(shù)平均得到糾正率(表Ⅱ)。分開(kāi)合成制備的兩批Ch1得到相似的轉(zhuǎn)變率。從轉(zhuǎn)染P711和Ch1的細(xì)胞中制備的Hirt DNA形成的菌落的大約70％與711-A探針雜交，30％的菌落表現(xiàn)出與711-G探針雜交(表Ⅰ)。因此在11nM Ch1時(shí)，糾正率為30％，數(shù)值可再現(xiàn)。雜交是特異的，兩組間無(wú)交叉雜交。將20個(gè)上述菌落制備的質(zhì)粒DNA雙向測(cè)序，所用引物(5’-CAATGTCCCTGATGTTATGCA-3’)(序列5)和5’-CGCTGGGCCAAGGACGCT-3’(序列6)對(duì)應(yīng)堿性磷酸酶cDNA 711位點(diǎn)兩側(cè)的630-650和803-822位點(diǎn)。每種情況下證實(shí)序列均發(fā)生轉(zhuǎn)變，且在目的核苷酸周?chē)鷰装賯€(gè)堿基中未發(fā)現(xiàn)其它序列變化。從Ch2或DH1處理的細(xì)胞中制備的Hirt提取物形成的菌落，全部只與711-A探針雜交(表Ⅰ),Ch3的Hirt提取物形成的菌落中有一些與野生型探針雜交，但比率比Ch1小得多(表Ⅱ)。這些結(jié)果證實(shí)表現(xiàn)出的堿性磷酸酶活性不同歸困于DNA序列水平下點(diǎn)突變的糾正(A到G)。
表2．來(lái)自p711質(zhì)粒和11nM各種寡核苷酸雙份轉(zhuǎn)染制備的Hirt提取物轉(zhuǎn)化物的雜交方式
用于增殖質(zhì)粒DNA的RecA-缺陷的大腸桿菌菌株有用附加型DNA進(jìn)行修復(fù)和同源配對(duì)的功能。為了排除大腸桿菌介導(dǎo)的序列轉(zhuǎn)變的可能性，將Hirt DNA的PCR擴(kuò)增片段直接測(cè)序DNA。連接711位點(diǎn)的兩個(gè)引物被用來(lái)產(chǎn)生通過(guò)VentR聚合酶作用的190bp片段。結(jié)果表明當(dāng)Hirt DNA樣品來(lái)自用p711和Ch1結(jié)合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞時(shí)，711位點(diǎn)是A(70％)和G(30％)的混合物。相反，Hirt DNA來(lái)自寡核苷酸Dhl時(shí)，711位點(diǎn)不是混合的序列。這些結(jié)果確證在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)生通過(guò)嵌合寡核苷酸的序列糾正。
嵌合寡核苷酸的穩(wěn)定性在細(xì)胞內(nèi)和含10％FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中測(cè)定嵌合寡核苷酸的穩(wěn)定性。在進(jìn)行組織化學(xué)染色和Hirt DNA分析的同一轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中(見(jiàn)材料與方法)加入10ng放射標(biāo)記的寡核苷酸Ch1。嵌合寡核苷酸非常穩(wěn)定。它在含10％FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可測(cè)的降解。而且從細(xì)胞中分離的寡核苷酸在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)也沒(méi)有降解。培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞中分離的只檢測(cè)到嵌合寡核苷酸的單體。因此在所利用的實(shí)驗(yàn)條件下，未發(fā)現(xiàn)嵌合寡核苷酸首尾連接。實(shí)施例7.2 CMV突變EBV-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系的β-珠蛋白基因的應(yīng)用設(shè)計(jì)用來(lái)修復(fù)鐮刀形貧血病β-珠蛋白的突變的CMV是設(shè)計(jì)的SC1。圖3，該分子由兩個(gè)各有10個(gè)2’-O-甲基RNA殘基的間插區(qū)，連接一個(gè)5個(gè)DNA殘基的小片段的DNA殘基組成。當(dāng)分子折疊形成雙螺旋構(gòu)型，一鏈只含有DNA殘基，另一鏈含有RNA/DNA區(qū)。本例中，internal序列與βS珠蛋白序列中25個(gè)殘基的一段互補(bǔ)，除了圖中用粗體和星號(hào)示意的成基(T)，該段跨越βS突變位點(diǎn)。側(cè)接RNA殘基的5個(gè)DNA殘基集中在βS編碼序列中突變的T附近。同樣方式設(shè)計(jì)一個(gè)嵌合寡核苷酸對(duì)照物，但粗體和星號(hào)所示是堿基(A)。圖3A中列出βA、βS及密切相關(guān)的δ-珠蛋白基因的基因序列，βS突變特異位點(diǎn)粗體印刷。
如下述制備成淋巴細(xì)胞、從鐮刀形貧血病患者和一個(gè)無(wú)該病歷史和癥狀的觀察對(duì)象的遺棄的臨床材料制得肝素處理的血液。在Ficoll中密度梯度離心由血液≈8ml制備單核細(xì)胞，感染培養(yǎng)在絨細(xì)胞系B95-8(Coriell Institute for Medical Rosearch#GM07404D)中的Epstein-Barr病毒。感染時(shí)要在T25燒瓶中10ml補(bǔ)充有20％胎牛血清的RPMT培養(yǎng)基中加入0.1mg白細(xì)胞凝集素PHA-L。培養(yǎng)物從第5天開(kāi)始每周加兩次，在第21天仍有60～70％細(xì)胞存活即可。βA和βS成淋巴細(xì)胞保留在含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中。
如下所述將CMV導(dǎo)入βS等位基因純合的成淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前一天，將細(xì)胞(1×106/ml)接種在24-槽組織培養(yǎng)板的每個(gè)槽1ml培養(yǎng)基中。將嵌合寡核苷酸與3mg DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-三甲銨硫酸二甲酯)，在20ml 20mMHEPES,pH7.3中混合，室溫溫育15分鐘進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并加至培養(yǎng)細(xì)胞中，6小時(shí)后離心收集細(xì)胞，洗滌，準(zhǔn)備PCR擴(kuò)增，參照E.S.Kawasaki,PCR手冊(cè)，M.A.Innis,D.H.Gelfand,J.J.Sninsky和T.J.White編，146-152頁(yè)，科學(xué)出版社，(1990)。
利用公知的βS突變引起的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性估計(jì)單堿基突變糾正，R.F.Greeves等，1981，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)78:5081；J.C.Chang和Y.W.Kan,1982,N.Eng.J.Med.307:30S.H.Orkin等，ibid,p32；J.T.Wilson等，1982，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)79:3628。βS等位基因中A到T的顛換引起B(yǎng)su36Ⅰ限制酶切位點(diǎn)(CCTGAGG)丟失。這樣，可用Bsu36Ⅰ酶切基因組DNA進(jìn)行Southern雜交分析檢測(cè)βS等位基因。β-珠蛋白基因的一個(gè)1.2kb的Bsu36I DNA片段正常下不存在于βS等位基因中，而是由一個(gè)診斷性1.4kbp片段取代。用這個(gè)步驟分析βS純合的成淋巴細(xì)胞的基因組DNA時(shí)，觀測(cè)到預(yù)料的1.4kbp片段。但是，來(lái)自SC1 CMV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的DNA觀測(cè)到兩個(gè)片段。除1.4kb片段外的1.2kb片段的存在表明βS等位基因以劑量依賴方式發(fā)生了部分糾正。
為了快速、靈敏地檢測(cè)糾正的效率，采取基于PCR的RFLP分析。為了分析β-珠蛋白序列，從粗細(xì)胞裂解液用引物BG02(5’-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGA-3’)(序列7)和BG05(5’-CTATTGGTCTCCTTAAACCTG-3’)(序列8)及Expand Taq聚合酶擴(kuò)增制備345bp PCR片段。對(duì)于分析δ-珠蛋白基因，在擴(kuò)增反應(yīng)中用同樣的細(xì)胞提取物，擴(kuò)增引物DG06(5’-CTCACAAACTAATGAAACCCTGC-3’)(序列9)和DG07(5’-GAAAACAGCCCAAGGGACAG-3’)(序列10)產(chǎn)生335bp片段。凝膠用SYBRTMgreen(FMC Bioproducts)染色，熒光亮度用分子動(dòng)力學(xué)熒光造影儀定量。用ABI 373A測(cè)序儀對(duì)DNA雙向測(cè)序。
設(shè)計(jì)上述引物，得到基因組DNA PCR擴(kuò)增后跨越βS突變位點(diǎn)的345bp片段。來(lái)自正常細(xì)胞的片段含有Bsu36Ⅰ識(shí)別序列，產(chǎn)生228bp和117bp片段，而來(lái)自βS基因的DNA含有CCTGTGG序列，不被酶切。分析表明SC1處理的βS細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)生的345bp DNA片段，部分被Bsu36Ⅰ切割，說(shuō)明突變的糾正發(fā)生在部分、但不是全部染色體。比較電泳分離后用熒光染料SYBRTMgreen染色的三條DNA片段的相對(duì)亮度，可進(jìn)行量化檢測(cè)。染色條帶用激光熒光造影儀成像，計(jì)算相對(duì)亮度水平。轉(zhuǎn)變率用熒光造影儀掃描cyber green-染色的瓊脂糖凝膠來(lái)定量。劑量為2.5到25.0pM SC1/105βS成淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)顯示大約40％到55％βS轉(zhuǎn)變?yōu)棣翧(圖4A)。
CMV SC2導(dǎo)入鐮刀形突變的頻率也用上述方法確定。分析表明在嵌合分子最高濃度25nM，糾正超過(guò)50％，但即使?jié)舛葹?.5nM,β-珠蛋白基因也有30％糾正(圖4B)。
對(duì)PCR擴(kuò)增得到的345bp片段直接測(cè)序以確定編碼鏈中T轉(zhuǎn)變?yōu)锳。從濃度大于12nM/106細(xì)胞的嵌合分子SC1轉(zhuǎn)染的βS細(xì)胞提取DNA樣品，序列分析顯示在βS突變位點(diǎn)有接近等量的A和T殘基的混合。來(lái)自未處理的βS細(xì)胞的DNA在該位點(diǎn)只有T，用SC1處理βA細(xì)胞，只有A。用CMV對(duì)照SC2轉(zhuǎn)染βS細(xì)胞的處理不會(huì)引起β-珠蛋白基因序列變化。但是，來(lái)自SC2轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞的DNA部分轉(zhuǎn)變?yōu)棣耂突變型，這一點(diǎn)經(jīng)在突變位點(diǎn)是T和A殘基的混合物的證實(shí)。
對(duì)與β-珠蛋白基因同源性大于90％的相關(guān)的δ-珠蛋白基因測(cè)序，檢測(cè)CMV作用的特異性。β和δ珠蛋白基因中SC1的5bp DNA核心靶區(qū)是相同的。圖3中兩處堿基差別加了下劃線。為了檢測(cè)SC2是否轉(zhuǎn)變了δ-珠蛋白基因，如上述進(jìn)行DNA序列分析。結(jié)果表明與SC2在βA-珠蛋白序列中導(dǎo)致的變化相反，SC2 CMV未引起δ-珠蛋白基因轉(zhuǎn)換。實(shí)施例7.3 CMV突變HSC的β-珠蛋白基因的實(shí)驗(yàn)性應(yīng)用方法與材料干細(xì)胞分離和轉(zhuǎn)染正常的志愿者給藥G-CSF 300μg S.C．每天兩次，共5天。在第四和第五天，用COBE Spectra pheresis儀進(jìn)行4小時(shí)干細(xì)胞apheresis。在Ficoll-Hypaque(密度1.077g/ml,Pharmacia)密度梯度離心(2000rpm,10分鐘，室溫)收集單核細(xì)胞。大部分單核細(xì)胞貼在塑料壁上后被除去(30分鐘，37℃在5％CO2在含10％FBS的RPMI中)。用PBS旋渦洗滌三次除去與塑料壁結(jié)合松弛的細(xì)胞，收集其余細(xì)胞，與生物素標(biāo)記鼠抗CD34抗體在PBS/1％BSA中室溫溫育25分鐘，細(xì)胞濃度100×106細(xì)胞/ml。抗體處理的細(xì)胞過(guò)抗生物素蛋白柱，收集流出的細(xì)胞進(jìn)行分析，然后用PBS洗柱子，擠壓柱子回收吸附在柱上的CD34+細(xì)胞。最終的純度用FACS測(cè)定。
細(xì)胞重新懸浮于含10％熱滅活的FCS的RPMI中，1×105細(xì)胞/ml鋪24槽的板，每槽加1×105細(xì)胞。定量的嵌合寡核苷酸與3μGDOTAP在20μl20mM HEPES(pH7.3)中混合?；旌弦罕?5分鐘，然后加至細(xì)胞中。37℃,5％CO2條件下，16小時(shí)后，收集球化的細(xì)胞，用PBS洗，裂解緩沖液裂解。
PCR擴(kuò)增和分析基因組DNA分別以PCO2(5’-TCCTAAGCCAGTGCCAGAAGA-3’)(序列11)和PCO5(5’-CTATTGGTCTCCTTAAACCTG-3’)(序列12)為引物，用Expand Tag聚合酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)催化擴(kuò)增，50μl反應(yīng)液，94℃30秒，52.5℃30秒，72℃30秒，35個(gè)循環(huán)生成345bp片段。對(duì)δ位點(diǎn)，5’引物是5’-CTCACAAACCTAATGAAACCCTGC-3’(序列13),3’引物是5’-GAAAACAGCCCAAGGGACAG-3’(序列14),94℃30秒，59℃30秒，72℃30秒，35個(gè)循環(huán)。
PCR產(chǎn)物用DdeⅠ或BSU36Ⅰ限制性內(nèi)切酶(New England Biolabs,Beverly,MA)消化，裝入1.2％瓊脂糖凝膠(1×TBE)，電泳。凝膠在含1∶20,000Cyber Green(FMC,Rockland,ME)的200ml 1×TBE中，暗處染色20分鐘，用熒光造影儀(Molecalar Dynamics,Swmyvale,CA)定量。PCR產(chǎn)物溶于水旋轉(zhuǎn)過(guò)Qiaguick PCR純化旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen,Chatsworth,CA)，真空干燥至5μl,260nm比色測(cè)OD，確定濃度。DNA樣品(30μg)用Applied Biosystems Model 373A DNA自動(dòng)測(cè)序系統(tǒng)(Applied Biogstems,Poster City,CA)直接測(cè)序。
寡核苷酸合成和純化用ABI 394 DNA/RNA合成儀，1000A大孔CPG合成0.2μmol規(guī)模的嵌合寡核苷酸。在構(gòu)造中，DNA亞磷酰胺(AppliedBiosystems)的環(huán)外氨基用苯甲?；Ｗo(hù)腺嘌呤和胞嘧啶，異丁酰基保護(hù)烏嘌呤。2’-O-甲基RNA亞磷酰胺(Glen Research,Sterling,VA)用苯氧基乙酰保護(hù)腺嘌呤，二甲基甲酰脒保護(hù)鳥(niǎo)嘌呤，異丁?；Ｗo(hù)胞嘧啶。合成完畢，堿基保護(hù)基團(tuán)在乙醇∶濃氨水(1∶3)中55℃加熱20小時(shí)去除。寡核苷酸粗品與7M脲和10％甘油混合，加熱至70℃，加樣至含有7M脲的10％聚丙烯酰胺凝膠上純化。凝膠電泳后，UV照射，從膠上切下DNA條帶，碾碎，在TE(10mM Tris-HCl和1mm EDTA,pH7.5)緩沖液振蕩過(guò)夜洗脫。含有碎膠片的洗脫液旋轉(zhuǎn)過(guò)0.45乙酰m自旋濾膜(Millipore,Bedford,MA)，用乙醇沉淀。樣品用G-25旋轉(zhuǎn)柱(Boehringer Mannheim)進(jìn)一步脫鹽，95％以上純化寡核苷酸是全長(zhǎng)的結(jié)果分離到的富含CD34+組分首先用于寡核苷酸攝入實(shí)驗(yàn)。嵌合分子SC2與脂質(zhì)體形成劑DOTAP混合，實(shí)驗(yàn)條件同前述除了在寡核苷酸5’端點(diǎn)設(shè)置一個(gè)放射性標(biāo)記物。用量漸增的標(biāo)記和末標(biāo)記寡核苷酸與脂質(zhì)體溫育15分鐘?；旌弦号c細(xì)胞溫育6小時(shí)后，用PBS充分洗滌細(xì)胞以消除非特異結(jié)合。細(xì)胞離心，成球部分用0.2M氨基乙酸(pH4.5)洗滌以消除任何殘留的非特異結(jié)合。細(xì)胞球中的放射性能通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)確定。細(xì)胞提取嵌合寡核苷酸是劑量依賴方式。因?yàn)槲覀兊膶?shí)驗(yàn)策略集中在nM濃度，沒(méi)有在25nM以外延伸曲線?；诜派錁?biāo)記的嵌合寡核苷酸的特異活性，并假定每個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力等同，估計(jì)近50％的CD34細(xì)胞組分被底物轉(zhuǎn)染。每個(gè)實(shí)驗(yàn)，不加DOTAP，通過(guò)混合放射標(biāo)記的嵌合分子和細(xì)胞測(cè)定本底水平，從未超過(guò)0.05％。
富含CD34+的細(xì)胞組分含有βA基因型兩個(gè)等位基因，用不同量的SC2和3μg/mlDOTAP轉(zhuǎn)染。如上所述轉(zhuǎn)染16小時(shí)后，分離基因組DNA,βA到βS的轉(zhuǎn)變率用限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性和直接測(cè)序確定。分離自105細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物用PCO2和PCO5，產(chǎn)生一個(gè)345bp片段。βA的特異序列用限制性內(nèi)切酶DdeⅠ切開(kāi)產(chǎn)生三個(gè)片段，分別為192，108和45堿基對(duì)。而βS序列只被切開(kāi)一次，生成300bp和45bp片段。未切開(kāi)的300bp片段逐漸增多表明由βA轉(zhuǎn)變?yōu)棣耂基因型是濃度增加的SC2的功能，圖5。嵌合寡核苷酸在較低濃度下(600ny=30nM×1ml)，轉(zhuǎn)變率為50％。相反，SC1處理的細(xì)胞中沒(méi)有轉(zhuǎn)變，雖然嵌合分子與βA位點(diǎn)完全互補(bǔ)配對(duì)。
為了確證正常細(xì)胞中DNA序列變化(A到T),345bp片段進(jìn)行DNA測(cè)序。含有純合βA等位基因的CD34-組分如上述用23nM SC2轉(zhuǎn)染。分離基因組DNA,PCR擴(kuò)增，樣品自動(dòng)DNA測(cè)序。βADNA序列和用SC1處理的βADNA序列中都含T。相反，SC2處理的βA細(xì)胞的DNA序列在預(yù)料位點(diǎn)T到A的轉(zhuǎn)換表現(xiàn)劑量依賴性。SC2 CMV含有一個(gè)(a)片段與β-珠蛋白基因編碼鏈相同。命名為SC5的CMV含有與β-珠蛋白基因非編碼鏈的一個(gè)片段相同的(a)片段。我們用SC2和SC5重復(fù)上述轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖5，表明SC5具有活性，但比SC2低，濃度低于20nM時(shí)明顯無(wú)活性。
來(lái)自SC2處理的βA細(xì)胞的基因組DNA用兩個(gè)δ-珠蛋白特異引物PCO6和PCO7進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只發(fā)現(xiàn)野生型δ-珠蛋白序列，證實(shí)SC2 CMV是β-珠蛋白特異性的。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Kmiec,Eric B.
(ⅱ)發(fā)明名稱帶有非天然核苷酸的嵌合突變載體(ⅲ)序列數(shù)目14(ⅳ)通信地址(A)收信人Pennie＆Edmons(B)街道1155 Avenue of the Americas(C)城市紐約(D)州紐約(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼10036-2711(ⅴ)微機(jī)閱讀形式(A)媒體類(lèi)型軟盤(pán)(B)微機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專(zhuān)利公報(bào)#1.0，版本#1.30(ⅵ)申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)柎?B)申請(qǐng)日同日(C)分類(lèi)(ⅸ)電信信息(A)電話(212)790-9090(B)電傳(212)869-9741/8864(C)用戶電報(bào)66141 PENNI(2)序列1資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)1:CCGCCTACAC CCACTCG(2)序列2資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)2:CCGCCTACGC CCACTCG(2)序列3資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)3:CAATGTCCCT GATGTTATGC A(2)序列4資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)4:CGCTGGGCCA AGGACGCT(2)序列5資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)5:CAATGTCCCT GATGTTATGC A(2)序列6資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)6:CGCTGGGCCA AGGACGCT(2)序列7資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)7:TCCTAAGCCA GTGCCAGAAG A(2)序列8資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形
(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)8:CTATTGGTCT CCTTAAACCT G(2)序列9資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)9:CTCACAAACT AATGAAACCC TGC(2)序列10資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)10:GAAAACAGCC CAAGGGACAG(2)序列11資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)11:TCCTAAGCCA GTGCCAGAAG A(2)序列12資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)12:CTATTGGTCT CCTTAAACCT G(2)序列13資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)13:CTCACAAACC TAATGAAACC CTGC(2)序列14資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)14:GAAAACAGCC CAAGGGACAG(2)序列15資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA
(ⅸ)特征(A)名稱/圖例ch1(B)位置1---68(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)15:
AGCGCCGCCT ACGCCCACTC GGCTGTTTTC AGCAGCGUGG GCGTAGGCGGCGCUGCGCGT TTTCGCGC(2)序列16資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/圖例ch2(B)位置1---68(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)16:
AGCGCCGCCT ACACCCACTC GGCTGTTTTC AGCCGAGUGG GTGTAGGCGGCGCUGCGCGT TTTCGCGC(2)序列17資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/圖例ch3
(B)位置1---68(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)1 7:
GCGCGTTTTC GCGCAGCGCC GCCUACGCCC ACUCGGCUGT TTTCAGCCGAGTGGGCGTAG GCGGCGCT(2)序列18資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/圖例Dh1(B)位置1---68(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)18:
AGCGCCGCCT ACGCCCACTC GGCTGTTTTC AGCCGAGTGG GCGTAGGCGGCGCTGCGCGT TTTCGCGC(2)序列19資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)19:
ACCCCCAGCG CCGCCTACAC CCACTCGGCT GACCGG(2)序列20資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/圖例SC1(B)位置1---68(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)20:
ACCTGACTCC TGAGGAGAAG TCTGCTTTTG CAGACUUCUC CTCAGGAGUCAGGUGCGCGT TTTCGCGC(2)序列21資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/圖例SC2(B)位置1---68(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)21:
ACCTGACTCC TGTGGAGAAG TCTGCTTTTG CAGACUUCUC CACAGGAGUCAGGUGCGCGT TTTCGCGC(2)序列22資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/圖例SC3(B)位置1---68(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)22ATCTGACTCC TGAGGAGAAG ACTGCTTTTG CAGUCUUCUC CTCAGGAGUCAGAUGCGCGT TTTCGCGC(2)序列23資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/圖例SC4(B)位置1-68(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)23:
ACCTGACTCC TGAGGAGAAG ACTGCTTTTG CAGUCUUCUC CTCAGGAGUCAGGUGCGCGT TTTCGCGC(2)序列24資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/圖例SC5(B)位置1---68(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)24:
GCGCGTTTTC GCGCACCUGA CUCCTGTGGA GAAGUCUGCT TTTGCAGACTTCTCCACAGG AGTCAGGT(2)序列25資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ⅱ)分子類(lèi)型DNA(ⅸ)特征(A)名稱/圖例Delta(B)位置1---25(C)其他資料(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列編號(hào)25:
ATCTGACTCC TGAGGAGAAG ACTGC
權(quán)利要求
1．一種向真核細(xì)胞基因?qū)朕D(zhuǎn)變的寡核堿基化合物，包含a)有一個(gè)3’端點(diǎn)和一個(gè)5’端點(diǎn)的第一核堿基鏈，該第一鏈包含1)總共至少15個(gè)核堿基；2)至少三個(gè)選自2’AX-核苷，2’AX-類(lèi)核苷酸，和2’AR-核苷酸的核酸酶抗性的核糖型核堿基，其中A=O,F,Cl，或Br；當(dāng)A=O時(shí)，則X=H或C1-6烷烴和R=C1-6烷烴；當(dāng)A≠O時(shí)，則X和R可忽略，3)至少3個(gè)連續(xù)的核糖型核堿基，是與核酸酶抗性的核糖型核苷酸相同或其外的，b)有一個(gè)3’端點(diǎn)和一個(gè)5’端點(diǎn)的第二核堿基鏈，該第二鏈的核堿基與第一鏈核堿基Watson-Crick配對(duì)，其中所述第一鏈的連續(xù)核糖型核堿基與2’-脫氧核糖型核堿基Watson-Crick配對(duì)，且其中至少一個(gè)核糖型核堿基不是2’O-甲基取代核苷酸。
2．權(quán)利要求1的化合物，其第一鏈?zhǔn)且粋€(gè)寡核堿基鏈(chain)的一個(gè)區(qū)域，該鏈(chain)包含一個(gè)3’末端(terminus)和一個(gè)5’末端(terminus)。
3．權(quán)利要求2的化合物，其第一鏈包含至少兩個(gè)有至少3個(gè)相鄰核糖型核堿基的片段，所述核糖型核堿基與2’-脫氧核糖型核堿基Watson-Crick配對(duì)。
4．權(quán)利要求3的化合物，其第一鏈的每個(gè)核糖型核堿基與第二鏈的脫氧核糖型核堿基Watson-Crick配對(duì)。
5．權(quán)利要求4的化合物，其第一鏈的每個(gè)核糖型核堿基選自2’AX-類(lèi)核苷，2’AX-核苷酸，和2’AR-核苷酸，其中A=O,F,Cl，或Br；當(dāng)A=O時(shí)，X=H或C1-6烷烴和R=C1-6烷烴；當(dāng)A≠O時(shí)，則X和R可忽略。
6．權(quán)利要求5的化合物，其包含第一鏈(chain)和第二鏈(chain)，第一鏈(chain)包含有第一個(gè)3’末端(terminus)和第一個(gè)5’末端(terminus)，第一鏈(chain)包含第一鏈，第二鏈(chain)含有第二個(gè)3’末端(terminus)和第二個(gè)5’末端(terminus)，第二鏈(chain)含有第二鏈。
7．權(quán)利要求5的化合物，其中至少一個(gè)核糖型核堿基A=F。
8．權(quán)利要求6,7的化合物，其中第一和第二鏈(chain)僅以Watson-Crick互補(bǔ)配對(duì)的核堿基相連。
9．權(quán)利要求5的化合物，還含有一個(gè)包含至少14個(gè)相連的核堿基序列的區(qū)域，或包含至少7個(gè)相連的核堿基序列的一對(duì)區(qū)域，其中所述每個(gè)序列是哺乳動(dòng)物基因的一個(gè)片段序列或其互補(bǔ)片段。
10．權(quán)利要求5的化合物，還含有一個(gè)包含至少14個(gè)相連的核堿基序列的區(qū)域，或包含至少7個(gè)核堿基序列的一對(duì)區(qū)域，其中所述每個(gè)序列是植物基因的一個(gè)片段序列或其互補(bǔ)片段。
11．權(quán)利要求5的化合物，其第一鏈含有至少9個(gè)核糖型核堿基。
12．權(quán)利要求5的化合物，其第二鏈不含核糖型核堿基。
13．權(quán)利要求5的化合物，不含肽核堿基。
14．權(quán)利要求13的化合物，僅包含戊糖呋喃糖基核堿基。
15．權(quán)利要求14的化合物，包含一個(gè)寡核堿基鏈(chain)。
16．權(quán)利要求15的化合物，還包含a)結(jié)合在第一鏈或第二鏈的一個(gè)發(fā)夾帽；和b)帶有第一端點(diǎn)和第二端點(diǎn)的一個(gè)接頭，所述第一端點(diǎn)與第一鏈的3’端點(diǎn)共價(jià)連接，第二端點(diǎn)與第二鏈的5’端點(diǎn)共價(jià)連接。
17．權(quán)利要求16的化合物，第一鏈的5’端點(diǎn)是5’末端(terminus)。
18．權(quán)利要求16的化合物，第二鏈的3’端點(diǎn)是3’末端(terminus)。
19．權(quán)利要求15的化合物，還包含c)結(jié)合在第一鏈或第二鏈的一個(gè)發(fā)夾帽；和b)帶有第一末端端點(diǎn)和第二末端端點(diǎn)的一個(gè)接頭，所述第一端點(diǎn)與第一鏈的5’端點(diǎn)共價(jià)連接，第二端點(diǎn)與第二鏈的3’端點(diǎn)共價(jià)連接。
20．權(quán)利要求19的化合物，第一鏈的3’端點(diǎn)是3’末端(terminus)。
21．權(quán)利要求19的化合物，第二鏈的5’端點(diǎn)是5’末端(terminus)。
22．權(quán)利要求5的化合物，其第一鏈所含第一核糖片段包含至少6個(gè)核糖型核堿基，第二核糖片段包含至少3個(gè)核糖型核堿基，以及一個(gè)包含至少4個(gè)2’-脫氧核糖型核堿基的間插脫氧核糖型片段。
23．權(quán)利要求5的化合物，還含有一個(gè)保護(hù)基團(tuán)，保護(hù)第一鏈或第二鏈的3’端點(diǎn)或第一鏈或第二鏈的5’端點(diǎn)。
24．權(quán)利要求5的化合物，其第一鏈包含非2’O-甲基取代核糖核苷酸的一個(gè)核酸酶抗性的核糖型核堿基。
25．權(quán)利要求5的化合物，其第二鏈包含一個(gè)2’-脫氧核糖型核苷或肽核堿基。
26．一種分離其細(xì)胞染色體上目的序列帶有變化的真核細(xì)胞的方法，所述變化引起細(xì)胞發(fā)生可選表型變化，方法包括以下步驟a)提供一個(gè)寡核堿基，它包括1)有一個(gè)3’端點(diǎn)和一個(gè)5’端點(diǎn)的第一鏈核堿基，該第一鏈包含?。偣仓辽?5個(gè)核堿基；ⅱ．至少三個(gè)選自2’AX-核苷，2’AX-類(lèi)核苷酸，和2’AR-核苷酸的核酸酶抗性的核糖型核堿基，其中A=O,F,Cl，或Br；當(dāng)A=O時(shí)，X=H或C1-6烷烴和R=C1-6烷烴；當(dāng)A≠O時(shí)，則X和R可忽略，ⅲ．至少三個(gè)相連的核糖型核堿基，可以是與核堿基酶抗性的核糖型核苷酸相同的或附加的。其中至少一個(gè)核糖型核堿基是非2’O-甲基取代核苷酸；2)有一個(gè)3’端點(diǎn)和一個(gè)5’端點(diǎn)的第二核堿基鏈，所述第二鏈的核堿基與第一鏈的核堿基Watson-Crick互補(bǔ)配對(duì)，并且其中第一鏈的相鄰核糖型核堿基與2’-脫氧核糖型核堿基Watson-Crick互補(bǔ)配對(duì)，該寡核堿基還含有兩個(gè)同源區(qū)域，每個(gè)與目的序列的一個(gè)區(qū)域同源，和一個(gè)位于兩個(gè)區(qū)域之間的突變子區(qū)；b)在細(xì)胞核中保留所述寡核堿基；c)選擇具有可選表現(xiàn)型變化的細(xì)胞。
27．權(quán)利要求26的方法，突變子區(qū)是6個(gè)或更少的核堿基。
28．權(quán)利要求26的方法，所述改變是6個(gè)到1個(gè)核堿基的刪除。
29．權(quán)利要求26的方法，所述同源區(qū)共包含至少9個(gè)而不超過(guò)25個(gè)核糖型核堿基。
30．一種向培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體上的目的序列導(dǎo)入改變的方法，包括如下步驟a)提供一個(gè)寡核堿基，它包括1)有一個(gè)3’端點(diǎn)和一個(gè)5’端點(diǎn)的第一核堿基鏈，第一鏈包含?。偣仓辽?5個(gè)核堿基；ⅱ．至少三個(gè)選自2’AX-核苷，2’AX-類(lèi)核苷酸，和2’AR-核苷酸的核酸酶抗性的核糖型核堿基，其中A=O,F,Cl，或Br；當(dāng)A=O時(shí)，X=H或C1-6烷烴和R=C1-6烷烴；當(dāng)A≠O時(shí)，則X和R可忽略，ⅲ．至少三個(gè)相連的核糖型核堿基，可以是與核堿基酶抗性的核糖型核苷酸相同的或附加的，2)有一個(gè)3’端點(diǎn)和一個(gè)5’端點(diǎn)的第二核堿基鏈，其中所述第二鏈的核堿基與第一鏈的核堿基Watson-Crick配對(duì)互補(bǔ)，第一鏈的連續(xù)核糖型核堿基與2’-脫氧核糖型核堿基Watson-Crick配對(duì)互補(bǔ)，該寡核堿基還含有兩個(gè)同源區(qū)，每個(gè)與目的序列的一個(gè)區(qū)域同源，和一個(gè)位于它們之間的突變子區(qū)；b)在細(xì)胞核中保留所述寡核堿基；借此將改變導(dǎo)入目的序列，前提是該改變是產(chǎn)生可選擇表現(xiàn)型的改變之外的改變。
31．權(quán)利要求30的方法，所述突變子區(qū)是6個(gè)或更少的核堿基。
32．權(quán)利要求30的方法，所述改變是6個(gè)到1個(gè)核堿基的刪除。
33．權(quán)利要求30的方法，所述同源區(qū)共包含至少9個(gè)而不超過(guò)25個(gè)核糖型核堿基。
34．權(quán)利要求30的方法，所述改變修復(fù)人類(lèi)細(xì)胞中致病突變。
35．權(quán)利要求30的方法，所述改變可引起包含目的序列的基因失活。
36．一個(gè)向植物細(xì)胞染色體上的目的序列導(dǎo)入改變的方法，包括如下步驟a)提供一個(gè)寡核堿基，它包括1)有一個(gè)3’端點(diǎn)和一個(gè)5’端點(diǎn)的第一核堿基鏈，該第一鏈包含?。偣仓辽?5個(gè)核堿基；ⅱ．至少三個(gè)選自2’AX-核苷，2’AX-類(lèi)核苷酸，和2’AR-核苷酸的核酸酶抗性的核糖型核堿基，其中A=O,F,Cl，或Br；當(dāng)A=O時(shí)，X=H或C1-6烷烴和R=C1-6烷烴；當(dāng)A≠O時(shí)，則X和R可忽略，ⅲ．至少三個(gè)相連的核糖型核堿基，可以是與核堿基酶抗性的核糖型核苷酸相同的或附加的，和2)有一個(gè)3’端點(diǎn)和一個(gè)5’端點(diǎn)的第二核堿基鏈，其中所述第二鏈的核堿基與第一鏈的核堿基Watson-Crick配對(duì)，第一鏈的相連核堿基與2’-脫氧核糖型核堿基Watson-Crick配對(duì)，該寡核堿基還含有兩個(gè)分別與目的序列的一個(gè)區(qū)域同源的兩個(gè)同源區(qū)，和一個(gè)位于它們之間的突變子區(qū)；b)在細(xì)胞核中保留所述寡核堿基；藉此將改變導(dǎo)入目的序列。
37．權(quán)利要求36的方法，所述突變子區(qū)是6個(gè)或更少的核堿基。
38．權(quán)利要求36的方法，所述改變是6個(gè)到1個(gè)核堿基的刪除。
39．權(quán)利要求36的方法，所述同源區(qū)共包含至少9個(gè)而不超過(guò)25個(gè)核糖型核堿基。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及稱為嵌合突變載體(CMV)的小雙螺旋寡核苷酸和核苷酸類(lèi)似物的寡聚物的設(shè)計(jì)和應(yīng)用,CMV通過(guò)與目的基因的同源重組作用于真核細(xì)胞目的基因的突變。CMV包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸及它們的類(lèi)似物(統(tǒng)稱“核堿基”)。本申請(qǐng)公開(kāi)CMV包含至少兩個(gè)最少有三個(gè)與脫氧核糖型核堿基配對(duì)的核糖型核堿基的片段,位于CMV中相應(yīng)于向目的基因?qū)胪蛔兊膮^(qū)域的兩側(cè)。所述核糖型核堿基優(yōu)選是核酸酶抗性的,即不是天然存在的核糖核苷酸。CMV的應(yīng)用包括遺傳病的基因治療和構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1222158SQ97195599
公開(kāi)日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1997年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月16日
發(fā)明者E·B·克米?？?申請(qǐng)人:托馬斯杰弗遜大學(xué)