專利名稱：具有葡聚糖酶活性的重組酶的制作方法
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及編碼具有葡聚糖酶活性的酶的克隆的DNA序列、包括所說的DNA序列的重組表達載體、絲狀真菌宿主細胞、生產(chǎn)所說的重組葡聚糖酶的方法，以及分離并純化的酶。
本發(fā)明還涉及含有重組酶的組合物、口腔保健組合物和產(chǎn)品及在去除齒斑中的應(yīng)用。
發(fā)明的背景葡聚糖酶是降解葡聚糖分子中α-1,6-糖苷鍵的α-1,6-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.11)，也稱為1,6-α-D-葡聚糖6-葡聚糖水解酶。
已知葡聚糖酶具有多方面的用途，例如作為潔齒劑的成分用于預(yù)防齲齒、齒斑和/或牙石，以及用于水解甘蔗和甜菜的粗糖汁或糖漿。
已知有幾類微生物能夠產(chǎn)生葡聚糖酶，其中包括青霉屬、擬青霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、穗霉屬、輪技孢屬、長蠕孢屬和毛殼霉屬的真菌；乳桿菌屬、鏈球菌屬、纖維弧菌屬、纖維粘菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、節(jié)桿菌屬和黃桿菌屬的細菌，以及斯達氏脂肪酵母等酵母。
市售的用來分解粗糖汁的工業(yè)用葡聚糖酶是Novo Nordisk公司發(fā)酵擬青霉菌生產(chǎn)的葡聚糖酶50L。
下文綜述有關(guān)葡聚糖酶及其應(yīng)用的現(xiàn)有文獻?，F(xiàn)有技術(shù)文獻EP663443(Centro de Ingenieria Genetica y Biotechnologia)描述了衍生于Penicillium minioluteum的葡聚糖酶?？稍诎退沟庐叧嘟湍钢挟愒幢磉_該葡聚糖酶。所說的重組酶的最適溫度為55℃至60℃,N-糖基化百分比為13至15％,50℃半壽期大約7.6小時。
附圖簡要說明

圖1顯示質(zhì)粒pCaHj483；圖2顯示質(zhì)粒pToC343；圖3顯示質(zhì)粒pToC325；圖4顯示重組和野生型淡紫擬青霉(paecilomyces lilacinus)葡聚糖酶的pH變化曲線；圖5顯示重組和野生型淡紫擬青霉葡聚糖酶的溫度變化曲線；圖6顯示重組和野生型淡紫擬青霉葡聚糖酶的溫度穩(wěn)定性；圖7顯示37℃生長于BHI中的S.mutans、A.viscosus和F.nucleatum的混合培養(yǎng)物的間接Malthus標準曲線；圖8顯示表達質(zhì)粒pJW111，圖中標出了SP387啟動子和終止子，指示了限制性酶切位點及其在質(zhì)粒中的相對位置。其中箭頭指示bar、β-內(nèi)酰胺酶(ampR)和葡聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄方向。
發(fā)明的概要本發(fā)明的目的是提供在絲狀真菌宿主細胞中異源產(chǎn)生的淡紫擬青霉的重組葡聚糖酶。
本發(fā)明人已首次克隆了編碼具有淡紫擬青霉中的葡聚糖酶活性的完整DNA序列，并在絲狀真菌宿主細胞中異源產(chǎn)生了該葡聚糖酶。以前只是在淡紫擬青霉中同源產(chǎn)生了這種酶。因此，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，包括具有葡聚糖酶活性的酶產(chǎn)物是與具有其他酶活性的混合物一起產(chǎn)生的。能夠在適當?shù)乃拗髦挟愒串a(chǎn)生重組葡聚糖酶是有利的，因為這樣有可能提供單一成分的葡聚糖酶。此外，其有利于以工業(yè)規(guī)模提供本發(fā)明的分離并純化的酶。
本說明書中，術(shù)語“異源”產(chǎn)生是指在不同于原始的供體生物的宿主生物體中表達重組酶。
術(shù)語“同源”產(chǎn)生是指由原生物體表達野生型酶。
已將包含于質(zhì)粒pToc325中編碼本發(fā)明的葡聚糖酶的SEQ ID No.1的完整DNA序列轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH52菌株中。已將該菌侏保藏在DSM，登記號為DSM10706。下文將對其作進一步地詳細描述。
經(jīng)數(shù)據(jù)庫序列對比檢索，發(fā)現(xiàn)SEQ ID No:1中所示的DNA序列是新的。發(fā)現(xiàn)其與上面提到的于1994年8月22日按布達佩斯條約有關(guān)規(guī)定保藏于Mycotheque de l’Universite Catholigue de Louvain(MUCL)的Penicillium minioluteum(MUCL No.38929)的最高同源性為59％。EP0663443中公開了后者的DNA和氨基酸序列。
本發(fā)明的第一個方面涉及DNA構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含編碼具有葡聚糖酶活性的酶的DNA序列，所說的DNA序列包括a)SEQ ID No:1中所示DNA序列，和/或可從大腸桿菌DSM10706中得到的DNA序列的葡聚糖酶編碼部分，或者b)a)中所限定的DNA序列的類似物，該類似物ⅰ)與SEQ ID No.1中所示的DNA序列和/或可從大腸桿菌DSM10706得到的DNA序列至少有80％同源性，或ⅱ)與SEQ ID No.1中所示DNA序列和/或可從大腸桿菌DMS10706得到的DNA序列的同樣寡核苷酸探針雜交，或ⅲ)編碼與由包括SEQ ID No.1中所示DNA序列和/或可從大腸桿菌DSM10706得到的DNA序列的DNA序列編碼的多肽有80％同源性的肽，或ⅳ)編碼與抗衍生于淡紫擬青霉的和/或可從大腸桿菌DSM10706得到的DNA序列編碼的純化葡聚糖酶的抗體有免疫學(xué)反應(yīng)性的多肽。
本說明書中，SEQ ID No:1中所示的DNA序列和/或可從大腸桿DSM10706得到的DNA序列的“類似物”是指編碼具有葡聚糖酶活性的酶的，至少有ⅰ)-ⅳ)中所述的一種性質(zhì)的任何DNA序列。
類似DNA序列-例如可以使用本文所述的方法，基于SEQ ID No:1中所示的和/或可從大腸桿菌DSM 10706得到的DNA序列的部分序列，從產(chǎn)生有葡聚糖酶活性的酶的其他或相關(guān)(如同一種)生物體中分離的，例如為本文所示的DNA序列的等位或種變異體，-可以基于SEQ ID No:1中所示的DNA序列的任何部分DAN序列，例如可經(jīng)導(dǎo)入不產(chǎn)生與該DNA序列編碼的葡聚糖有不同氨基酸序列的，但相當于欲產(chǎn)生該酶的宿主生物體的密碼子選擇的核苷酸取代，或者導(dǎo)入可產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代而構(gòu)建的。但在后一種情況下，最好是引起小范圍的氨基酸改變，即導(dǎo)致并不顯著地影響多肽折疊或活性的保守氨基酸取代，如一般1至大約30個氨基酸的小的缺失，小的氨基或羧基末端延伸、多達大約20-25個殘基的小的接頭肽，或利于純化的小的延伸，如多聚組氨酸序列段、抗原表位或結(jié)合區(qū)(參見Ford等人.，(1991)，蛋白質(zhì)的表達和純化2,95-107)。保守性取代的例子包括堿性氯基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，可以在對于分子的功能很關(guān)鍵的區(qū)域以外進行這些取代，而仍可產(chǎn)生活性酶?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知的方法，例如位點特異性誘變法或丙氨酸掃描誘變法(Cunningham和Wells,(1989),科學(xué)244,1081-1085)鑒定那些對于本發(fā)明的DNA構(gòu)建物編碼的多肽的活性必不可少的，因而最好不進行取代的氨基酸。在后一種技術(shù)中，在分子的每個殘基上導(dǎo)入突變，并試驗所得突變體分子的生物學(xué)(即葡聚氨糖酶)活性，以鑒定對于分子的活性起重要作用的氨基酸殘基。也可以用核磁共振、結(jié)晶學(xué)或光親和標記等技術(shù)分析分子的晶體結(jié)構(gòu)，以確定底物-酶相互作用的位點(例如參見de vos等人.，(1992)，科學(xué)255,306-312；Smith等人.，(1992)，分子生物學(xué)雜志224,899-904；Wlodaver等人.，(1992),FEBS Lett.309,59-64)。
應(yīng)明確的是，SEQ ID No.1中所示的DNA序列，和/或轉(zhuǎn)化到已保藏的大腸桿菌菌株DSM 10706中的DNA序列的蛋白質(zhì)編碼部分內(nèi)的任何部分DNA序列，均可用于分離編碼本發(fā)明的重組葡聚糖酶的完整DNA序列。SEQ ID No.2中顯示根據(jù)SEQ ID No.1中所示的DNA序列推測的氨基酸序列。
上文ⅰ)中提到的同源性是指從第二個序列衍生第一個序列的兩個序列間的同一性程度。可借助本領(lǐng)域已知的計算機程序，例如GCG軟件包中提供的GAP來適當?shù)卮_定同源性(Needleman S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學(xué)雜志48,p.443-453)。使用帶有下列DNA序列比較設(shè)置的GAP(版本8):5.0的GAP新增補償和0.3的GAP延伸補償，DNA序列的編碼區(qū)與SEQ ID No.1中所示DNA序列或可從大腸桿菌DSM 10706所含質(zhì)粒中得到的DNA序列的編碼區(qū)表現(xiàn)有至少80％，例如至少90％，較好至少95％，特別是至少99％的相同程度。
上文ⅱ)中提到的雜交是指在如下文材料和方法部分中詳細描述的某些特定條件下，類似DNA序列與如編碼葡聚糖酶的DNA序列的同樣探針雜交。
正常情況下，類似DNA序列是與DNA序列高度同源的，例如至少80％同源于SEQ ID No.1中所示的DNA序列或可得自大腸桿菌DSM10706所含質(zhì)粒的，編碼本發(fā)明的葡聚糖酶的DNA序列，例如至少90％，較好至少95％，例如至少99％同源于SEQ ID No.1中所示的DNA序列和/或可得自大腸桿菌DSM10706中所含質(zhì)粒的DNA序列。
上文ⅲ)中提到的同源性是指從第二個序列衍生第一個序列的兩個序列間的相同性程度。可借助本領(lǐng)域已知的計算機程序，例如GCG軟件包中提供的GAP來適當?shù)卮_定同源性(Needleman S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學(xué)雜志48,p.443-453)。使用帶有下列DNA序列比較設(shè)置的GAP(版本8):5.0的GAP新增補償和0.3的GAP延伸補償，DNA序列的編碼區(qū)與SEQ ID No.1中所示DNA序列或可從大腸桿菌DSM 10706所含質(zhì)粒中得到的DNA序列的編碼區(qū)表現(xiàn)有至少80％，例如至少90％，較好至少95％，特別是至少99％的相同程度。
與上文所述特征ⅳ)有關(guān)的術(shù)語“衍生于”不僅是指由DSM 10706的菌株產(chǎn)生的葡聚糖酶，而且還指由分離自菌株DSM 10706的DNA序列編碼的，并且在用所說的DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物體中產(chǎn)生的葡聚糖酶?？捎孟挛摹安牧虾头椒ā辈糠种忻枋龅姆椒ù_定免疫學(xué)反應(yīng)性。
本發(fā)明的再一個方面涉及攜帶本發(fā)明的DNA構(gòu)建物的表達載體、含有DNA構(gòu)建物或表達載體的細胞，以及生產(chǎn)表現(xiàn)有葡聚糖酶活性的酶的方法，該方法包括在允許產(chǎn)生該酶的條件下培養(yǎng)所說的細胞，并從培養(yǎng)物中回收酶。
本發(fā)明的再一個目的是提供富含本發(fā)明的重組葡聚糖酶的酶制劑。
另外，本發(fā)明提供一種口腔保健組合物，其進一步含有選自顯示齒斑葡聚糖酶、氧化酶、過氧化物酶、鹵過氧化物酶、漆酶、蛋白酶、內(nèi)切葡糖苷酶、脂酶、淀粉酶、抗微生物酶的酶活性的酶及其混合物。
最后，本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組葡聚糖酶的應(yīng)用。可使用本發(fā)明的酶或含有這種酶的本發(fā)明的組合物預(yù)防齲齒，齒斑或/和牙石。發(fā)明的詳細描述克隆可以使用基于本文公開的DNA序列制備的合成的寡核苷酸探針，從適當來源，例如下文提到的任何生物體的DNA中方便地分離編碼有本發(fā)明的葡聚糖酶活性的酶的DNA序列。
例如，可以基于SEQ ID No.1中所示核苷酸序列和/或可從大腸桿菌DSM10706所含質(zhì)粒中得到的核苷酸序列，或SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列或其任何適當?shù)膩喰蛄兄苽溥m當?shù)墓押塑账崽结槨?br> 按照該方法設(shè)計能夠編碼這些作為SEQ ID No.2之一部分的肽的引物。然后使用這些引物PCR擴增待克隆的基因片段。使用這些片段作為克隆完整基因的探針。
下文實施例1和2中給出了篩選方法的更詳細的說明。
或者，也可用包括下述步驟的一般方法分離編碼表現(xiàn)葡聚糖酶活性的酶的本發(fā)明的DNA序列-在適當?shù)妮d體中克隆淡紫擬青霉的DNA文庫，-用所說的載體轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗鳎?在適當條件下培養(yǎng)宿主細胞，以表達由DNA文庫中的克隆編碼的任何感興趣的酶，-經(jīng)確定由這些克隆產(chǎn)生的酶的葡聚糖酶活性來篩選陽性克隆，并且-從這些克隆中分離編碼酶的DNA。
WO93/11249中進一步公開了該通用方法，文獻內(nèi)容列為本文參考文獻。
例如可篩選供體生物體的DNA文庫，并選擇表達適當?shù)拿富钚?即根據(jù)酶水解AZCL-葡聚糖的能力而定義的葡聚糖酶活性)，以分離編碼本發(fā)明的重組葡聚糖酶的DNA序列。然后可用標準方法從克隆中分離適當?shù)腄NA序列。
葡聚糖酶序列的保藏已將包含在質(zhì)粒pUC19中的，從編碼本發(fā)明葡聚糖酶的淡紫擬青霉菌株中得到的完整全長度DNA序列轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中。發(fā)明人已按照國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定，將所說的細菌保藏在Deutshe Sammlung von Mikroorganismen undFellkulturen GmbH.(Mascheroder Weg 1b,D-38124 BraunschweigFederal Republic of Germamy)(DSM)。
保藏日1996年6月7日保藏人編號NN49245=ToC 1065DSM登記號E.coli DSM No.10706。
Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH.是滿足布達佩斯條約的國際公認保藏機構(gòu)，其按條約有關(guān)條款和實施細則，特別是條約第9條的規(guī)定永久保藏樣品。按照C.F.R.第37卷第1.14段和U.S.C第35卷第122段的規(guī)定，在該專利申請至由美國專利與商標局局長簽署授權(quán)期間將可以得到保藏物。另外，上面提到的保藏物符合EPC第28條涉及微生物的歐洲專利申請的要求。
上述保藏物代表分離的細菌的實質(zhì)上純的培養(yǎng)物。在提交了主題申請的對應(yīng)物或其子代的國家，可按外國專利法的要求使公眾得到保藏物。但應(yīng)明確的是，已保藏的菌株的可利用性并不構(gòu)成實踐主題發(fā)明的許可，這樣將嚴重損害由政府機構(gòu)授予的專利權(quán)。
可按標準方法從上述已保藏的菌株中分離編碼表現(xiàn)有葡聚糖酶活性的酶的DNA序列。
微生物來源預(yù)期可從下列絲狀真菌、酵母或細菌等其他微生物中得到編碼同源酶的DNA序列，即類似DNA序列。例如，DNA序列可衍生于擬青霉屬的菌株如淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)，或青霉屬的菌株如薄青霉或P.minioluteum，曲霉屬、鐮孢屬、穗霉屬、輪枝孢屬、長蠕孢屬或毛殼霉屬的真菌；乳桿菌屬、鏈球菌屬、纖維弧菌屬、纖維粘菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、節(jié)桿菌屬和黃桿菌屬的細菌；以及斯達氏脂肪酵母等酵母。
葡聚糖酶的生產(chǎn)然后可將編碼葡聚糖酶的DNA序列插入到重組表達載體中?？梢允褂媚軌蚍奖愕剡M行重組DNA操作的任何載體，對載體的選擇常常取決于它將要導(dǎo)入的宿主細胞。
因此，載體可以是自動復(fù)制載體，即作為染色體外整體存在的，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒。另外，載體也可以是在被導(dǎo)入宿主細胞后即整合到宿主細胞基因組中并與其整合的染色體一起復(fù)制的載體。
在載體中，編碼葡聚糖酶的DNA序列應(yīng)可操作地連接到適當?shù)膯幼雍徒K止子序列上。啟動子可以是在宿主細胞中表現(xiàn)有轉(zhuǎn)錄活性的，并可衍生于編碼同源或異源于宿主細胞的蛋白質(zhì)的任何DNA序列。用于分別連接編碼葡聚糖酶的DNA序列、啟動子及終止子的方法，以及將它們插入到適當?shù)妮d體中的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如參見Samkbrook等人，(1989)，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港，紐約)。
用編碼葡聚糖酶的DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞較好是絲狀真菌細胞。具體地說，宿主細胞可以是曲霉屬的菌株，特別是米曲霉或黑曲霉，或者是鐮孢屬的菌株，例如尖鐮孢、禾本科鐮孢的菌株(完好狀況下稱為玉蜀黍赤霉，以前稱為玉蜀黍球殼霉，別名是粉紅赤霉和粉紅粘帚霉五谷變種)，或硫磺鐮孢(完好狀態(tài)下稱為小麥赤霉，別稱Fusariumtrichothecioides，桿孢狀鐮孢，接骨本鐮孢、粉紅鐮孢和粉紅鐮孢禾谷變種)、五谷鐮孢(別稱F.crokkwellnse)，或毒性鐮孢。
優(yōu)選的宿主細胞可以是WO96/00787中所述的禾谷鐮孢(得自NovoNordisk A/S)，例如以登記號禾谷鐮孢ATCC20334保藏的菌株。菌株ATCC20334以前被錯誤地分類為禾谷鐮孢(Yoder,W.和Christianson,L.,1997)?，F(xiàn)在已基于RAPD分析和經(jīng)典分類學(xué)分析證明，Quorn真菌，ATCC 20334的真實身分是毒性鐮孢Nirenburg新種。
在下文實施例中，使用毒性鐮孢(F.venenatum)和米曲霉作為宿主細胞舉例描述葡聚糖酶的表達。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是缺乏蛋白酶的蛋白酶-菌株。
例如可以是已刪除了稱為“alp”的堿性蛋白酶基因的蛋白酶缺陷型菌株米曲霉JaL125。PCT/DK97/00135(Novo Nordisk A/S)中描述了該菌株。
可以按照原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，然后再按已知方式再生細胞壁的方法轉(zhuǎn)化絲狀真菌。EP238023(Novo Nordisk A/S)中描述了曲霉作為宿主微生物的應(yīng)用(其內(nèi)容列為本文參考文獻)。
生產(chǎn)本發(fā)明的酶的方法再一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明的酶的方法，其中在允許產(chǎn)生酶的條件下培養(yǎng)用編碼酶的DNA序列轉(zhuǎn)化的適當宿主細胞，并從培養(yǎng)物中回收所得到的酶。
用于培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細胞的培養(yǎng)基可以是適于生長所研究的宿主細胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基。所表達的葡聚糖酶可以方便地被分泌到培養(yǎng)基中并可用已知的方法回收，這些方法包括經(jīng)離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞，借助適當?shù)柠}例如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)成分，然后進行離子交換層析、親和層析等層析處理。
酶本發(fā)明也涉及基本上具有SEQ ID No.2中所示氨基酸序列或其片段的，有葡聚糖酶活性的分離的重組酶。質(zhì)譜分析顯示重組葡聚糖酶的平均質(zhì)量約為65.3KD。
發(fā)現(xiàn)重組葡聚糖酶的最適pH為3.5至5.5，此相當于野生型葡聚糖酶的最適pH(見圖4)。發(fā)現(xiàn)在pH5.5時重組和野生型葡聚糖酶的最適溫度均為60℃左右(見圖2)。此外，在pH5.5和pH7時，重組和野生型葡聚糖酶是穩(wěn)定的。在70℃時，只保留有很少的殘留活性。
口腔保健組合物再一個方面，本發(fā)明涉及作為口腔保健產(chǎn)品的成分的口腔保健組合物。
本發(fā)明的口腔保健組合物包括適當量的重組淡紫擬青霉葡聚糖酶，其相當于計算的口腔保健終產(chǎn)品中約含0.001KDU至1000KDU/ml，較好0.01KDU/ml至500KDU/ml，特別是0.1KDU/ml至100KDU/ml的酶活性。
根據(jù)本發(fā)明，口腔保健組合物中還可包括除葡聚糖酶活性以外的其他酶活性。預(yù)期的酶活性包括選自齒斑葡聚糖酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶或L-氨基酸氧化酶、過氧化物酶例如WO95/10602(Novo NordiskA/S)中所述的Coprinus sp.過氧化物酶或乳過氧化物酶或鹵過氧化物酶、漆酶、蛋白酶如木瓜蛋白酶或酸性蛋白酶(例如WO95/02044(NovoNordisk A/S)中所述的酸性蛋白酶)、內(nèi)切葡糖苷酶、脂酶、淀粉酶、包括淀粉葡糖苷酶如AMG(Novo Nordisk A/S)、抗微生物酶及其混合物的活性。
口腔保健產(chǎn)品口腔保健產(chǎn)品可以具有任何適當?shù)奈锢硇问?如粉末、膏狀物、凝膠、液體、軟膏、片劑等)?！翱谇槐＝‘a(chǎn)品”可定義為可用于保持或改善人和動物的口腔衛(wèi)生、預(yù)防齲齒、預(yù)防齒斑和牙石形成、去除齒斑和牙石、預(yù)防和/或治療口腔疾病等的產(chǎn)品。
至少在本說明書中，口腔保健產(chǎn)品還包括清潔牙托、假牙等的產(chǎn)品。
這樣的口腔保健產(chǎn)品的實例包括牙膏、牙乳、凝膠或牙粉、洗牙水、漱口液、刷牙前或刷牙后漱洗配方、口香糖、錠劑和糖果。
牙膏和牙凝膠一般都包括研磨拋光材料、起泡劑、香味劑、潤濕劑、粘結(jié)劑、增稠劑、甜味劑、增白劑/漂白劑/色斑清除劑、水，及選擇性存在的酶。
包括牙斑去除液在內(nèi)的漱口劑一般包括水/醇溶液、香味劑、濕潤劑、甜味劑、起泡劑、著色劑及選擇性存在的酶。
磨料本發(fā)明的潔齒劑產(chǎn)品中也可摻入研磨拋光材料。根據(jù)本發(fā)明，所說的研磨拋光材料包括氧化鋁和水合氧化鋁，如α三水合氧化鋁、三硅酸鎂、碳酸鎂、高嶺土、硅鋁酸鹽如煅燒的硅酸鋁和碳酸鋁、碳酸鈣、硅酸鋯、以及粉末狀塑料，如聚氯乙烯、聚酰胺、聚丁烯酸甲酯、聚苯乙烯、酚-甲醛樹脂、蜜胺-甲醛樹脂、脲-甲醛樹脂、環(huán)氧樹脂、粉末狀聚乙烯、硅干凝膠、水凝膠和氣溶膠等。適用的研磨劑還包括焦磷酸鈣、非水溶性偏磷酸堿金屬鹽、磷酸二鈣和/或其二水合物、正磷酸二鈣、磷酸三鈣、微粒羥磷灰石等。也可利用這些物質(zhì)的混合物。
根據(jù)口腔保健產(chǎn)品的不同，研磨產(chǎn)品含量可以是0至70％(重量)，較好為1％至70％。在牙膏中，研磨材料含量一般為最終牙膏產(chǎn)品的10％至70％(重量)。
利用潤濕劑防止水從牙膏中丟失。用于本發(fā)明的口腔保健產(chǎn)品中的適當?shù)臐櫆貏┌ㄏ铝谢衔锛捌浠旌衔锔视?、多元醇、山梨醇、聚乙二?PEG)、丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、部分氫化的水解多糖等。牙膏中潤濕劑含量一般為0％至80％，較好為5％至70％(重量)。
適用的增稠劑和粘結(jié)劑的例子包括硅石、淀粉、黃蓍膠、黃原膠、愛爾蘭蘚提取物、海藻酸、果膠、纖維素衍生物如羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉和羥丙基纖維素、聚丙烯酸及其鹽、聚乙烯吡咯烷酮等，其可幫助穩(wěn)定牙粉產(chǎn)品。牙膏乳劑和凝膠中增稠劑的含量為0.1至20％(重量)，粘結(jié)劑含量為終產(chǎn)品的0.01至10％(重量)。
起泡劑可使用肥皂、陰離子、陽離子、非離子、兩性和/或兩性離子表面活性劑作為起泡劑。這些起泡劑可占終產(chǎn)品重量的0％至15％，較好占0.1至13％，最好占0.25至10％。
表面活性劑表面活性劑只是那些對本發(fā)明的酶沒有失活作用的表面活性劑。表面活性劑包括脂肪醇硫酸酯、磺化單酸甘油酯或有10至20個碳原子的脂肪酸的鹽、脂肪酸-白蛋白縮合產(chǎn)物、脂肪酸酰胺和氨基乙磺酸的鹽和/或羥乙磺酸脂肪酸酯的鹽。
甜味劑適用的甜味劑包括糖精。
香味劑常常加有少量，例如0.01％至大約5％(重量)，特別是0.1％至5％的香味劑，例如薄荷。
增白劑/漂白劑增白劑/漂白劑包括H2O2，并可按終產(chǎn)品重量的不足5％，較好0.25至4％的量加入。
增白劑/漂白劑可以是酶，例如氧化還原酶。適用的牙齒漂白酶的例子是WO97/06775(Novo Nordisk A/S)中描述的酶。
水通常以可使例如牙膏產(chǎn)生流動的量加入水。
其他添加劑另外還可包括水溶性抗菌劑，例如二葡糖酸氯己定(Chlorhexidinedigluconate)、雙辛氫啶、阿來西定、季銨抗菌化合物及水溶性來源的某些金屬離子如鋅、銅、銀和二價錫(例如鋅、銅和二價錫氯化物、及硝酸銀)。
根據(jù)本發(fā)明，另外還可加入用作氟化物來源的化合物、染料/著色劑、防腐劑、維生素、pH調(diào)節(jié)劑、抗齲劑、脫敏劑等。
酶用于本發(fā)明的口腔保健產(chǎn)品中的其他基本成分是酶。在活體中，酶是化學(xué)反應(yīng)的生物催化劑。酶與其作用的底物結(jié)合形成中間體酶-底物復(fù)合物。然后該復(fù)合物轉(zhuǎn)化成反應(yīng)產(chǎn)物，并釋放出繼續(xù)發(fā)揮其特異性酶促功能的酶。
當用于清潔口腔時，酶可提供幾方面的好處。蛋白酶分解唾液蛋白質(zhì)，后者吸附到牙齒表面上形成菌膜，即所得齒斑的第一層。蛋白酶和脂酶一起溶解那些構(gòu)成細菌細胞壁和膜的結(jié)構(gòu)成分的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，從而破壞細菌。
葡聚糖酶破壞由細菌產(chǎn)生的、形成細菌粘附基質(zhì)的有機骨架結(jié)構(gòu)。蛋白酶和淀粉酶不僅防止齲斑形成，而且經(jīng)過破壞與鈣結(jié)合的碳水化合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物，防止礦化進而防止牙石的生成。
由本發(fā)明的口腔保健組合物生產(chǎn)的牙膏一般可包括下列成分(以所占最終牙膏組合物的重量百分比表示)研磨劑材料 10至70％潤濕劑 0至80％
增稠劑 0.1至20％粘結(jié)劑 0.01至10％甜味劑 0.1至5％起泡劑 0至15％增白劑 0至5％酶 0.0001至20％在本發(fā)明的一個特定實施方案中，口腔保健產(chǎn)品是含有下列成分的，pH范圍為6.0至大約8.0的牙膏a)10％至70％研磨劑材料b)0至80％ 潤濕劑c)0.1至20％ 增稠劑d)0.01至10％粘結(jié)劑e)0.1至15％ 甜味劑f)0至5％起泡劑g)0至5％增白劑i)0.0001％至20％酶ⅰ)下所述的酶包括本發(fā)明的重組葡聚糖酶，并且也可以是上文提到的可用于牙膏等產(chǎn)品中的其他類型的酶。
由本發(fā)明的口腔保健組合物生產(chǎn)的漱口液一般可包括下列成分(以所占最終漱口液組合物的重量百分比表示)0至20％ 潤濕劑0-2％ 表面活性劑0-5％ 酶0-20％ 乙醇0-2％ 其他成分(例如香料、甜味劑、氟化物等活性成分)0-70％ 水可用pH范圍6-7.5的檸檬酸或磷酸鈉等適當?shù)木彌_液緩沖漱口組合物。
漱口液可以是未稀釋形成的(即使用前必須進行稀釋)。
制造方法可以使用的口腔保健產(chǎn)品生產(chǎn)領(lǐng)域已知的方法制造本發(fā)明的口腔保健組合物和產(chǎn)品。
應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的重組葡聚糖酶和包括重組葡聚糖酶的組合物可有多種用途，包括用于人和/或動物的口腔保健產(chǎn)品中，以用于預(yù)防齒斑的形成或用于去除齒斑；用于水解糖汁或糖漿；用于食品、飼養(yǎng)和/或龐物食品中。材料和方法材料微生物大腸桿菌DSM no.10706已按照國際公認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定保藏在Deutshe Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH.(Mascheroder weg 1b,D-38124 Braunschweig，聯(lián)邦德國)(DSM)。
米曲霉JaL 125米曲霉IFO 4177可得自日本大阪發(fā)酵研究所(Institute for Fermention,Osaka,17-25 Juso Hammachi 2-ChomeYodogawa-ku,Osaka,Japan)，其具有按一步驟基因置換法(參見G.May，“絲狀真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)”(1992),pp.1-25,Eds.J.R.Kinghorn和G.Turner；Blackie Academic and Professional)，使用米曲霉pyr G基因作為標志刪除的稱為“alp”的堿性蛋白酶基因(參見Murakami K.等人，(1991)，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，55,p.2807-2811)。
鐮孢霉CC1-3鐮孢霉A3/5的形態(tài)學(xué)突變體(ATCC20334)(Wiebe等人，1992，霉菌學(xué)研究96∶555-562；Wiebe等人，1991，霉菌學(xué)研究95∶1284-1288；Wiebe等人，1991，霉菌學(xué)研究96:555-562)是高度分支的，菌株變異體。菌落ATCC20334是WO96/00787中稱為禾谷鐮孢ATCC20334的菌株。以前錯誤地將菌株ATCC20334分類為禾谷鐮孢(Yoder和Christianson,(1997))。基于RAPD的分析和經(jīng)典分類學(xué)分析表明Quorn真菌ATCC20334實際是毒性鐮孢的Nirenburg新種。
大腸桿菌DH5α大腸桿菌菌株JM101質(zhì)粒和載體pCaHj483(圖1)pToC343(圖2)pToC325(圖3)pICAMG/Term(EP238 023)pUC19(Yanish-Perron等人，(1985)，基因33,p.103-119)pJ111在大腸桿菌菌株JM101中構(gòu)建和擴增的表達質(zhì)粒(圖8)。
pDM181鐮孢霉表達質(zhì)粒(Jones等人，1996)是編碼SP387啟動子和終止子，以及賦予Bastar抗性的bar基因(Thompson等人，1987,EMBO 6(9):2519-2514)的單一載體系統(tǒng)。已在SP387調(diào)節(jié)序列之間導(dǎo)入兩個限制性酶切位點，SwaⅠ和PacⅠ的位點，以有利于克隆。
酶由淡紫擬青霉產(chǎn)生的葡聚糖酶L50(Novo Nordisk A/S)；由無色桿菌(Achromobacter)產(chǎn)生的賴氨酰特異性蛋白酶；NOVOZYM 234TM(Novo Nordisk A/S)培養(yǎng)基、底物和溶液YPG培養(yǎng)基1％酵母提取物、2％細菌蛋白胨和2％葡萄糖；YPD:10g酵母提取物、20g蛋白胨，加水至900ml。高壓滅菌，加入100ml 2％葡萄糖(無菌過濾的)；葡聚糖500(Pharmacia)AZCL-葡聚糖(MegaZyme)pCRⅡ(Invitrogen TA克隆試劑盒)Britton-Robinson緩沖液DAPI:4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(Sigma D-9542)BHI腦心灌注液。
Vogel’s/Basta培養(yǎng)基Vogel氏鹽(Vogel,H.J.,1964,Am.Nat.98:436-446)、25mM NaNO3、5mg/ml Basta(Hoechst)、25g/L蔗糖、25g/L純凈瓊脂，pH6.0。
M400Da培養(yǎng)基每升含50g麥芽糖糊精、2.0gMgSO4.7H2O、2.0g KH2PO4、4.0g檸檬酸、8.0g酵母提取物、2.0g尿素、和0.5ml微量金屬溶液。用5N NaOH將培養(yǎng)基的pH調(diào)到6.0。微量金屬溶液每升含有14.3g ZnSO4.7H2O、25g CuSO4.5H2O、0.5g NiCl2.6H2O、13.8gFeSO4.7H2O、8.5g MnSO4.H2O和3.0g檸檬酸。
孢子形成培養(yǎng)基12.1g/L NaNO3、25g/L琥珀酸(二鈉鹽)1g/L葡萄糖和1×Vogel氏鹽，調(diào)到pH6.0。
STC:0.8M山梨醇、25mM Tris(pH8.0)、50mM CaCl2。
SPTC:40％PEG4000、0.8M的山梨醇、25mM Tris(pH8.0)、50mM CaCl2。
儀器10KDa截止超濾盒(Alpha Minisette，購自Filtron)；苯基-瓊脂糖FF(高微細)柱(Pharmacia)；Seitz EK1過濾板；Q-瓊脂糖FF柱(Pharmacia)；Applied Biosystems 473A蛋白質(zhì)序列分析儀；2升Kieler發(fā)酵罐；Olvmpus BX50型顯微鏡；Malthus Flexi M2060(Malthus儀器有限公司)。
引物8001 GA(A/G)AA(T/C)TA(T/C)GC(T/C/G/A)TA(T/C)ATGGC (SEQ ID No15)8002 GCCAT(G/A)TA(G/A/T/C)GC(A/G)TA(G/A)TT(T/C)TC (SEQ ID No16)8003 TGGAC(A/G/T/C)CA(A/G)TT(T/C)CA(A/G)TA(T/C)GC (SEQ ID No17)8004 GC(A/G)TA(T/C)TG(A/G)AA(T/C)TG(A/G/T/C)GTCC (SEQ ID No.18)8005 AA(T/C)TGGCA(A/G)AT(T/C/A)GG(A/G/T/C)GG (SEQ ID No.19)8006 CC(A/G/T/C)CC(T/A/G)TA(T/C)TGCCA(A/G)TT (SEQ ID No.20)8864 CGCGGATCCACCATGCGTTGGCCTGGTAATTTTC (SEQ ID No.23)8867 CCGCTCGAGCCTGCCTCATTCAATGCTCC(SEQ ID No.24)方法葡聚糖酶活性試驗葡聚糖酶活性試驗是選用堿性3.5-二硝基唾液酸(在540nm處有吸收)檢測從葡聚糖分子釋放出的還原糖。
條件40℃下，2.5％葡聚糖500(Pharmacia)在0.1M醋酸鈉(pH5.4)中。酶濃度約為1DU/ml。
1DU酶等于1小時內(nèi)產(chǎn)生相當于1mg麥芽糖的還原糖的酶含量。
也可使用AZCL-葡聚糖(megaZyme)檢測葡聚糖酶活性。將溶于0.1M醋酸鈉(pH5.5)或50mM Britton-Robinson緩沖液中的500μl0.4％AZCL-葡聚糖溶液加到用MilliQ過濾水稀釋的500μl酶樣品中并于40℃保溫10分鐘。然后以15000g將樣品離心2分鐘并將200μl上清液加到微量滴定板的小孔內(nèi)，于595nm檢測吸光率。
淡紫擬青霉野生型葡聚糖酶的分子特征質(zhì)譜在VG Analytical TofSpec.中，使用基質(zhì)輔助的激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜法對純化的野生型葡聚糖酶進行質(zhì)譜分析。為進行質(zhì)譜分析，將2ml樣品與2ml飽和的基質(zhì)溶液(溶于0.1％TFA∶乙腈(70∶30)中的α-氰基-4-羥基肉桂酸)混合，并將2ml混合物點樣在靶板上。在導(dǎo)入質(zhì)譜儀中之前，蒸發(fā)除去溶劑。使樣品解吸并以閾值激光能量經(jīng)4次激光脈沖(337nm)使之離子化，以25KV的加速電壓加速到自由場飛行管中。以1850V微通道板檢測離子。
羥基磷灰石圓片(HA)制備在壓片模內(nèi)，以大約5900kg(13000lbs)的壓力將250mg羥基磷灰石壓5分鐘，制成羥基磷灰石片。然后于600℃燒結(jié)4小時，最后用無菌去離子水水合。
羥基磷灰石圓片(HA)的蝕斑包被干燥滅菌(121℃,2bar,20分鐘)處理羥基磷灰石圓片(HA)并用濾膜除菌的唾液37℃包被18小時。將HA圓片放在燒杯中的無菌架上，向覆蓋圓片的燒杯內(nèi)倒入含有0.2％蔗糖的腦心灌注液(BHI)。接種前立即加入無菌Na2S(pH7.0)，使終濃度達到5g/升。將厭氧生長(BHI,37℃,24小時)的齒斑葡聚糖鏈球菌，粘放線菌和具核梭桿菌的1∶1∶1混合物作為約106cfu/ml濃度的接種物。在輕輕攪拌下將圓片37℃厭氧溫育4天。
蝕斑的Malthus方法Malthus方法是基于Johnston等人，(1995)，微生物學(xué)方法雜志21,p.15～26和Johansem等人，(1995)，應(yīng)用細菌學(xué)雜志78,p.297～303所述的方法建立的。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使含有Advantage cDNA PCR核心試劑盒(Clontech,Palo Alto)的成分、0.1mg pToC343和各50pmol引物o-dexSwaⅠ{GCATTTAAATATG CGT TGG CCT GGT}和o-dexPacⅠ{CGTTAAT TAA TCA TTC AAT GCT CCA GTC}的PCR反應(yīng)混合物進行下列循環(huán)95℃4分鐘1次循環(huán)；(95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃2分鐘)25次循環(huán)；72℃5分鐘1次循環(huán)。
實施例實施例1野生型葡聚糖酶的純化步驟1超濾將1升葡聚糖酶50L(Novo Nordisk A/S)與8升50mM乙酸鈉/HCl(pH5.4)混合。在10KDa截留超濾盒(Alpha Minisette,Filtron)上將混合物濃縮到大約0.5升。加入另外8升50mM乙酸鈉/HCl(pH5.4)再次將酶溶液濃縮到大約0.5升。
步驟2在苯基-瓊脂糖FF柱上層析將飽和硫酸銨加至終濃度為1.0M。用3％NaOH調(diào)pH至6.0并在Seitz EK1濾板上過濾酶。將EK1濾液分成兩等份。
在25mM乙酸鈉/HCl、1.0M(NH4)2SO4,pH6.0中平衡1升苯基-瓊脂糖FF(高微細)柱。將一半EKI濾液加于柱上并用5倍體積的平衡緩沖液洗以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。為了洗脫葡聚糖酶，在柱上加入5倍柱體積的硫酸銨梯度(1.0→0.0M)。對另一半K1濾液重復(fù)苯基-瓊脂糖FF-柱洗脫步驟。收集合葡聚糖酶活性的各管洗脫物。
步驟3在Q-瓊脂糖FF柱上層析在10KDa截留超濾盒上將合并的各管內(nèi)容物濃縮到大約250ml。將超濾的酶對10mM乙酸鈉/HCl(pH6.0)透析，中間更換幾次緩沖液。
在20mM乙酸鈉/HCl(pH6.0)中平衡1升Q-瓊脂糖FF柱。將酶溶液上柱并用平衡緩沖液洗柱直到OD280信號返回到基線。用5倍柱體積的線性NaCl梯度(0→75mM)洗脫葡聚糖酶。
分析柱上洗脫的各管中的葡聚糖酶活性，并用SDS-PAGE法分析含葡聚糖酶活性的部分。合并酶純度達到至少90％的各管洗脫物作為純化的葡聚糖酶。最后通過0.20μ濾膜過濾酶液。實施例2野生型葡聚糖酶的N末端序列分析N末端氨基酸序列分析在Applied Biosystems 473A蛋白質(zhì)序列分析儀中進行N末端氨基酸序列分析。
為了產(chǎn)生肽，還原的和S-羧甲基化的葡聚糖酶，于37℃用溶于含有1.3M尿素的40mM NH4HCO3中的無色桿菌賴氨酰特異性蛋白酶(20mg)消化按材料和方法部分所述方法純化的野生型葡聚糖酶(＞＞500mg)。使用Vydac C18柱以反相HPLC法分離所得到的肽，其中用含有0.08％TFA的80％2-丙醇(在0.1％TFA水溶液中)的線性梯度洗脫。
再次使用Vydac C18柱以反相HPLC法純化肽，其中用含有0.08％TFA的80％乙腈(在0.1％TFA水溶液中)的線性梯度洗脫，然后進行N末端氨基酸序列分析。
測定的氨基酸序列如下所示。Xaa代表未確定的殘基，Asx是尚不可能區(qū)別Asp與Asn的殘基。
N末端Asp-Gln-Gln-Asn-Gln-Ala-Leu-His-Thr-Trp-Trp-His-Glu-Lys-Ser-(SEQID No.3)
實際上對葡聚糖酶的直接N末端氨基酸測序揭示有3個彼此交錯的序列。發(fā)現(xiàn)分別在Asp1、Gln3和Asn4處開始的序列比例為2∶1∶2。
肽1:Ser-Tyr-Val-Asn-Asp-Gly-Gly-Val-Leu-Val-Ser-Glu-Glu-Pro-Arg-Asn-Ala-Leu-Leu-Ile-Phe-Ala-Ser-Pro-Phe-Ile-Pro-Gln (SEQ ID No.4).
肽2:Ser-Asp-Arg-Thr-Ser-Leu-Arg-Ile-Phe-Ser-His-Gln-Ala-Val-Ser-Asp-Ser-Gln-Ile-Trp-His-Xaa-Ile (SEQ ID NO.5)肽3:Asn-Asp-Phe-Tyr-Thr-Val-Gly-His-Gly-Val-Val-Ser-Gly-Glu-Asn-Tyr-Ala-Tyr-Met-Ala-Asn-Thr-Ala-Lys (SEQ ID No.6)肽4:Ile-Asn-Ala-Ala-Trp-Thr-Gln-Phe-Gln-Tyr-Ala-Lys (SEQ ID No.7)肽5:Asp-Gly-Ser-Ala-Leu-Gly-Pro-Thr-Ser-Asn-Val-Val-Ile-Arg-Pro-Ser-Asp-Ile-Arg-Tyr-Asp-Ile-Ser-Ser-Pro-Asp (SEQ ID No.8)肽6:Asn-Trp-Gln-Ile-Gly-Gly-Asn-Arg-Val-Asp-Gly-Ser-Asn-Trp-Gln-Val-Asn-Gln (SEQ ID No.9)肽7:Ser-Glu-Thr-Val-Val-Pro-Ser-Ala-Ile-Ile-Gly-Ala-Ser-Pro-Tyr-Tyr-Gly-Asp-Pro (SEQ ID No.10)肽8:Leu-Asx-Ala-Asx-Thr-His-Tyr-Val-Tyr-Phe-Glu-Pro-Gly-Thr-Tyr-Ile-Lys (SEQ ID No.11).
肽9:Val-Ile-His-Thr-Arg-Trp-Phe (SEQ ID No.12)肽10:Ser-Ala-Val-Asn-Asp-Ala-Gly-Ala-Val-Ala-Ala-Asp-Glu-Val-Arg-Gln-Ser-Asg-Lys (SEQ ID No.13)
肽11:Xaa-His-Asn-Asp-Pro-Val-Ile-Gln-Met-Gly-Xaa-Lys (SEQ ID No.14).買施例3淡紫擬青霉葡聚糖酶的克隆基于實施例2中所述的部分氨基酸序列克隆得自淡紫擬青霉的葡聚糖酶基因。設(shè)計能夠編碼肽3、4、和6的簡并PCR引物。制得在兩個方向上編碼同一序列的引物。在用淡紫擬青霉的染色體DNA進行的PCR反應(yīng)中使用6個引物的所有組合。這些反應(yīng)中有些產(chǎn)生了編碼葡聚糖酶基因的DNA片段。使用這些片段作為探針進行基因組Southern分析。雜交，然后克隆并測定6kb BamHⅠ片段。所有體外DNA操作均按已知的標準方法進行(Sambrook等人，分子克隆，實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989))。
PCR片段合成下列引物。8001 GA(A/G)AA(T/C)TA(T/C)GC(T/C/G/A)TA(T/C)ATGGC8002 GCCAT(G/A)TA(G/A/T/C)GC(A/G)TA(G/A)TT(T/C)TC8003 TGGAC(A/G/T/C)CA(A/G)TT(T/C)CA(A/G)TA(T/C)GC8004 GC(A/G)TA(T/C)TG(A/G)AA(T/C)TG(A/G/T/C)GTCC8005 AA(T/C)TGGCA(A/G)AT(T/C/A)GG(A/G/T/C)GG8006 CC(A/G/T/C)CC(T/A/G)TA(T/C)TGCCA(A/G)TT引物8001和8002在一個或另一個方向上編碼肽3的氨基酸14-20。引物8003和8004編碼肽4的氨基酸5-11，引物8005和8006編碼肽6的氨基酸1-6?；旧习凑誝elton等人(美國國家科學(xué)院院報，(1984),81,p.1470-1474)所述的方法制備淡紫擬青霉Li-3的染色體DNA。
以所有的引物組合，按標準方法進行PCR反應(yīng)。引物組8001/8006和8003/8002產(chǎn)生的片段經(jīng)在載體pCRⅡ(Invitrogen TA克隆試劑盒)中克隆并在Applied Biosystems DNA序列儀上測序后顯示含有葡聚糖酶基因的一部分。用引物組8001/8006得到的片段約為0.9kb。對該片段的末端測序表明其為一個編碼2號肽的DNA序列。
用8003/8002得到的片段約為0.6kb。測序結(jié)果表明該片段中含有編碼肽5、1和8的序列。
基因組克隆用BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ切割淡紫擬青霉的染色體DNA，并與32P標記的PCR片段雜交以進行Southern印跡分析。兩片段均與約6kb BamHⅠ片段雜交。制備克隆到pUC19中的淡紫擬青霉的約6kb BamHⅠ片段的文庫。與PCR片段之一進行集落雜交以篩選文庫，并分離陽性質(zhì)粒pToC325(參見圖2)。測足pToC325中2994bp的序列，SEQ ID NO.1和SEQ ID No.2中分別顯示了DNA序列和推測的氨基酸序列。轉(zhuǎn)化到E.coli DH 5α中的pToC325已作為菌株10706保藏于DSM。實施例4重組葡聚糖酶在米曲霉中的表達在葡聚糖酶的起始和終止密碼子處導(dǎo)入限制性酶切位點，并借以將基因克隆到米曲霉表達載體pCaHj483中。將所得到的葡聚糖酶表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到米曲霉菌株中。分離轉(zhuǎn)化株并分析葡聚糖酶的表達。
pCaHj483的構(gòu)建從下列片段構(gòu)建pCaHj483(見圖1)a)用EcoRⅠ和XbaⅠ切割的載體pToC65(WO91/17243)。
b)攜帶amdS基因的構(gòu)巢曲霉的27kb XbaⅠ片段(C.M.Corrick等人.，1987，基因53,63-71)。在真菌轉(zhuǎn)化中使用amdS基因作為選擇標記。已對amdS基因進行了修飾，使正常存在于基因中的Bam HⅠ位點受到破壞。為此，使用引物5’-AGAAATCGGGTATCCTTTCAG-3’(見SEQ ID NO.21)導(dǎo)入了沉默點突變。
c)攜帶黑曲霉NA2啟動子的0.6kb EcoRⅠ/bAMHⅠ片段，所說的啟動子融合到編碼構(gòu)巢曲霉tpi基因之mRNA的5’未翻譯端的序列的60bpDNA片段上。從質(zhì)粒pNA2(EP-B-0383779,Novo NordiskA/S)中分離NA2啟動子并以PCR法融合到60 bp tpi序列上。編碼60bp tpi序列的引物具有下示序列5′-GCTCCTCATGGTGGATCCCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGAGGAAGGAAGAGAAGTGTGGATAGAGGTAAATTGAGTTGGAAACTCCAAGCATGGCATCCTTGC- 3′(See SEQ IDNo.22)
d)攜帶黑曲霉葡糖淀粉酶轉(zhuǎn)錄終止子的675bp Xba片段。從質(zhì)粒pICAMG/Term(EP238023,Novo Nordisk A/S)中分離該片段。
通過pIC19R接頭(BamHⅠ至XbaⅠ)將片段C的BamHⅠ位點連接到片段d上轉(zhuǎn)錄終止子前面的XbaⅠ位點上。
將葡聚糖酶基因克隆到pCaHj483中使用下列引物，經(jīng)PCR反應(yīng)將BamHⅠ和XhoⅠ位點導(dǎo)入ATG的前面和葡聚糖酶基因的終止密碼子之后8864 CGCGGATCCACCATGCGTTGGCCTGGTAATTTTC (SEQ ID No.23)8867 CCGCTCGAGCCTGCCTCATTCAATGCTCC (SEQ ID No.24)重新進行基因的序列分析以檢查是否有PCR錯誤，并通過BamHⅠ和XhoⅠ位點克隆到表達載體pCaHj483中。所得到的葡聚糖酶表達質(zhì)粒被定名為pToC343，并圖示于圖3中。
pToC343的米曲霉轉(zhuǎn)化株按EP 0238023中所述方法用pToC343轉(zhuǎn)化米曲霉JaL125。根據(jù)其利用乙酰胺作為唯一氮源的能力選擇轉(zhuǎn)化體。通過在最小乙酰胺平板上的分生孢子再次重新分離后，將轉(zhuǎn)化體在10ml YPD中30℃發(fā)酵培養(yǎng)4天。將發(fā)酵液樣品加到SDS-PAGE上。用考馬斯亮藍染凝膠。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)液中可見有約65kD的帶，而JaL125的培養(yǎng)液中則沒有。
在含有麥芽糖糊精的培養(yǎng)基中，將產(chǎn)生65kD蛋白質(zhì)的三個轉(zhuǎn)化株置于2升Kieler發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)5天，并以酶促方法測定葡聚糖酶含量。
轉(zhuǎn)化株在發(fā)酵液中產(chǎn)生多達11000DU/ml的葡聚糖酶，而未被轉(zhuǎn)化的宿主的酶產(chǎn)量則不足100DU/ml。實施例5重組葡聚糖酶的純化在Amicon小室(膜截留10kD)中過濾并濃縮培養(yǎng)液。用MilliQ過濾的水稀釋樣品并將pH調(diào)至7.5。然后將樣品加于用20mM磷酸鈉(pH7.5)平衡的Q-Sepharose柱(Pharmacia)上，并用加在20mM磷酸鈉(pH7.5)中的0至0.5M NaCl線性梯度洗脫葡聚糖酶。合并含葡聚糖酶的各管，向其中加入(NH4)2SO4至1M的濃度并上樣于用1M(NH4)2SO4平衡的苯基-瓊脂糖柱(Pharmacia)上。以1至0M(NH4)2SO4的線性梯度洗脫葡聚糖酶。
經(jīng)N末端蛋白質(zhì)序列測定進一步證實純化的重組葡聚糖酶的N末端氨基酸序列。實際上發(fā)現(xiàn)了兩個N末端氨基酸序列一個在Asp1處開始(Asp-Gln-Gln-Asn-Gln)，一個在Asn4處開始(Asn-Gln-)，兩者比例為2∶3。實施例6葡聚糖酶的分子量根據(jù)SDS-PAGE分析結(jié)果，純化的重組葡聚糖酶與野生型葡聚糖酶一樣具有大約65kD的分子量?；|(zhì)輔助的激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜分析進一步證實了這一結(jié)果，其中測得分子量約為65kD。
野生型葡聚糖酶的質(zhì)譜分析表明，其平均分子量為大約65.3kDa。實施例7重組和野生型葡聚糖酶的pH分布曲線在不同pH下，使酶樣品與AZCL-葡聚糖在50mM Britton-Robinson緩沖液中一起保溫。重組和野生型葡聚糖酶具有大約pH6的最適pH(見圖4)。實施例8重組和野生型葡聚糖酶的溫度分布曲線在0.1M乙酸鈉(pH5.5)中，于不同溫度下使酶樣品與AZCL-葡聚糖一起保溫。重組和野生型酶有相似的溫度分布曲線，最適溫度約為60℃(見圖5)。實施例9重組和野生型葡聚糖酶的溫度穩(wěn)定性在pH5.5或pH7的50mM Britton-Robinson緩沖液中將酶樣品在不同溫度下預(yù)保溫30分鐘。用0.1M乙酸鈉(pH5.5)將樣品稀釋10倍，然后測定殘留活性。兩種酶在pH5.5和pH7條件下可見有差不多的溫度穩(wěn)定性。葡聚糖酶在60℃是穩(wěn)定的。70℃保溫后觀察到很少的殘留活性(見圖6)。實施例10重組葡聚糖酶抗齒斑活性使蝕斑生物膜厭氧生長于唾液包被的如材料和方法部分中所述的羥基磷灰石圓片上。該蝕斑是齒斑葡聚糖鏈球菌(SFAG,CBS 350.71)、粘放線菌(DSM 43329)和具核梭桿菌多形亞種(DSM 20482)的混合培養(yǎng)物。
將帶有蝕斑的HA圓片轉(zhuǎn)移到含有1KDU/ml重組淡紫擬青霉葡聚糖酶的乙酸鹽緩沖液(pH5.5)中，并旋轉(zhuǎn)2分鐘(使用無菌緩沖液作為對照)。
酶處理后，用DAPI著染HA圓片或轉(zhuǎn)移到Malthus小室內(nèi)。
當計數(shù)活的粘附細胞時使用間接阻抗檢測法(Malthus FlexiM2060,Malthus儀器有限公司)。
為了進行阻抗檢測，將3ml BHI轉(zhuǎn)移到間接Malthus小室的外腔中，并將0.5ml無菌KOH(0.1M)轉(zhuǎn)移到內(nèi)腔中。葡聚糖酶處理后用磷酸鹽緩沖液輕輕淋洗帶有蝕斑的HA圓片并轉(zhuǎn)移至外腔內(nèi)。使用與dt相關(guān)的cfu/ml的校正曲線，將Malthus中的檢測時間(dt)轉(zhuǎn)換成集落計數(shù)(見圖7)。
使用從混合的培養(yǎng)物制備的一系列10倍稀釋率構(gòu)成校正曲線。在BHI中檢測各稀釋步驟的傳導(dǎo)dt,并構(gòu)成混合培養(yǎng)物的BHI中10倍稀釋液的cfu/ml對dt的校正曲線。
也使用熒光顯微鏡檢測從HA圓片上去除的蝕斑，酶處理后用DAPI(3mM)著染圓片，并于暗處20℃保溫5分鐘。用配有200W水銀燈和紫外濾片的Olympus BX50型顯微鏡，以X100油浸熒光目鏡檢查DAPI著染的細胞。將結(jié)果與使用阻抗檢測法得到的定量數(shù)據(jù)相比較。
葡聚糖酶處理后，以Malthus方法檢測唾液處理的HA表面上活細胞的數(shù)目，并示于表1中。
然而，使用Malthus方法不可能區(qū)分開酶的殺菌活性或是酶促去掉了蝕斑。因此，須將表面上活細菌數(shù)的減少與使用DAPI染色估計的同時去除的表面蝕斑進行比較。
表1以阻抗檢測法檢測的從唾液處理的羥基磷灰石中酶促蝕斑去除率(pH5.5,2分鐘)
用量光顯微鏡測知，在經(jīng)葡聚糖酶處理后，蝕斑被大量的去除。因此重組葡聚糖酶降低了粘附細胞的量。如此檢測到的活性是根據(jù)蝕斑去除確定的，而不是對抗蝕斑中的細殺菌活性。實施例11毒性鐮孢中重組淡紫擬青霉葡聚糖酶的表達毒性廉孢的葡聚糖酶表達質(zhì)粒的構(gòu)建使用引物o-dex Swa(SEQ ID NO.25)和o-dexPac(SEQ IDNO.26)從表達質(zhì)粒pToC343 PCR擴增葡聚糖酶基因(參見材料和方法)。用SwaⅠ和PacⅠ消化所得到的1860nt擴增子，并連接到已用二種同樣酶切成線性的pDM181上。將構(gòu)建物導(dǎo)入大腸桿菌并用菌落雜交法篩選所得菌落，以鑒定含有葡聚糖酶編碼區(qū)的細胞。根據(jù)篩選結(jié)果選擇出質(zhì)粒pJW111(圖8)。測定pJW111中插入片段的序列證明，該片段為葡聚糖酶基因，并且該序列完全相同于pToC343中葡聚糖酶基因的序列。
毒性鐮孢的轉(zhuǎn)化按下述方法將質(zhì)粒pJW111導(dǎo)入鐮孢A3/5(ATCC20334)的形態(tài)學(xué)突變體(定名為CC1-3)中28℃下，在孢子形成培養(yǎng)基中將菌株ATCC 20334 CC1-3以150rpm培養(yǎng)2-4天，以產(chǎn)生分生孢子。通過Miracloth過濾分生孢子、離心濃縮并重新懸浮于無菌水中。用108分生孢子接種50ml YPG培養(yǎng)基，并于24℃以150rpm保溫14小時。將所得的菌絲重新懸浮于20mlNOVOZYM 234溶液(2.5mg/ml，在1.0MMgSO4中)并于28℃,80rpm消化15-45分鐘。加入30ml STC并離心(1500rpm,SorvallRT 6000離心機)10分鐘以沉淀原生質(zhì)體。重復(fù)兩次STC洗滌步驟。以每毫升約5×107原生質(zhì)體的濃度將其懸浮于STC∶SPTC∶DMSO(8∶2∶0.1)中。
向200ml原生質(zhì)體中加入質(zhì)粒DNA(2-20mg)并在冰上保溫30分鐘。緩慢加入2ml SPTC，然后在室溫下保溫20分鐘。向轉(zhuǎn)化反應(yīng)混合物中加入50ml在40℃下熔融的覆蓋層(1×Vogel氏鹽、25mMNaNO3、0.8M蔗糖、1％低熔點瓊脂糖)。顛倒混合樣品并分加于兩個空的156mm培養(yǎng)皿內(nèi)。24小時后向各平板內(nèi)加入25ml覆蓋層+10ml/ml Bastar。在室溫下保溫平板。
葡聚糖酶活性的表達將16個轉(zhuǎn)化體移入Vogel’s/Bastar中并在室溫下培養(yǎng)7天。用得自Vogel’s/Bastar平板的1cm2菌絲體片接種裝在125ml燒瓶中的20mlM400 Da培養(yǎng)基。30℃下將培養(yǎng)物以150rpm保溫7天。離心培養(yǎng)物樣品并檢測上清液中的葡聚糖酶(按上述方法)。用葡聚糖酶活性檢測法和SDS-PAGE分析法選擇最好的生產(chǎn)轉(zhuǎn)化株。在10-27％梯度Tris-甘氨酸凝膠上，葡聚糖酶在大約60kD處顯示有電泳帶。
N末端序列分析表明，毒性鐮孢中表達的葡聚糖酶100％被正確加工成Asn-Gln-Ala-Leu-；相反，由米曲霉產(chǎn)生的葡聚糖酶中有40％被不正確地加工成N末端序列為Asp-Gln-Gln-Asn-Gln-Ala-Leu-的產(chǎn)物。序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵政編碼(ZIP):DK-2880(G)電話+45 4444 8888(H)傳真+45 4449 3256(ⅱ)發(fā)明名稱具有葡聚糖酶活性的重組酶(ⅲ)序列數(shù)24(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度2993個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)來源(C)單個分離物淡紫擬青霉(ⅸ)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位875…2701(ⅸ)特征
(A)名稱/鍵信號肽(B)定位875…958(ⅸ)特征(A)名稱/鍵成熟肽(B)定位959…2701(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GACGACCATG ACAGGTGTCG CACAACAGGA ACAATCAGGA CCCTGATACG GCCATAAGGT60GAAACACCCC CTTGATGACA ACGGGAAGAA ACAGCTGGTC CGTATGTTCT AGACAATTCA 120AAGACACATC TTCCCCTCCC TGTCCATGAC ACTGTGGTAG GACGATGACA CCGATGCATG 180ATCATGAAAG GACAATGAAC ATGGGCGATC GATTTAGCTG ACATGAAGTG TAGCGAAGAC 240AAGTGCCTCC GTGTTTCGTA GATCGAGACC AGAGTGGTGG CAATTGCTCC GGCTCCAACC 300CGATCCAGAG ATGGGCCGAG TATAACTGAT ATGCGCCCGC TTTCGTTAGA CTGCGCATGG 360AGCTGTGGCA CATCGTCGTC CAGACCAAGG AAGACTAGCA ATGGTTTGGC CGCTGTGTGA 420GCCACGTTCG TTTTACATCC AACTGCCGCC GGCCCCCCGT GGGGTAACAA GGCGGAGGCG 480TGGGGTAACC GGGCGGTTCC CGTTCTGAGT AATACGCCTT CTGATTGTGC CAATCTGGAG 540CGGTGGTCGC TGCAGGGGGA TGGCCCTTCT AACTTCTTTC TTTTAAGCTT ATGAAACTAG 600GCCAGGTGGT GGCTGTGGCA AGTCTCAACA GCGCCATAGA TTGAATCAGA CATGGACCCC 660CCGCAACATG TGTCCCGCCC CAGAACTCCT GCGTCTTCGG TCCTCTCCCG GGAAGAGAGT 720GCGCCGTCAC CAAGGCTATA AATACTTGGG GTATGTTAGC ATAGTCTCGA AATGATATCC 780CATTTCAATC TTTACTGGTC CATCTCTAAA GGCATACACA CAGTGAGGCT GATTTTCGGC 840CATTGTCCTG TACACTTACC TGTCAAGCGG CATC ATG CGT TGG CCT GGT AAT 892Met Arg Trp Pro Gly Asn-28 -25TTT CTC ACT CTC GCG ACG GCG CTG CAA GCT GCT GGG AAC CTC GCC GCA 940Phe Leu Thr Leu Ala Thr Ala Leu Gln Ala Ala Gly Asn Leu Ala Ala-20 -15 -10AGC GTC CAT CAC AGG TGT GAT CAG CAG AAT CAA GCG CTA CAC ACA TGG 988Ser Val His His Arg Cys Asp Gln Gln Asn Gln Ala Leu His Thr Trp-5 1 5 10TGG CAC GAA AAG TCT GCT GTC AAC GAC GCG GGG GCT GTC GCA GCA GAT1036Trp His Glu Lys Ser Ala Val Asn Asp Ala Gly Ala Val Ala Ala Asp15 20 25GAA GTT CGC CAA TCG CGC AAG TAC GAT GTC TCT GTG TCC GTT CGC GAA1084Glu Val Arg Gln Ser Arg Lys Tyr Asp Val Ser Val Ser Val Arg Glu30 35 40GAA TCC AAA TTC CGG GAC TCG TTT GTC TAC GAG ACC ATC CCG CGG AAC1132Glu Ser Lys Phe Arg Asp Ser Phe Val Tyr Glu Thr Ile Pro Arg Asn45 50 55GGC AAC GGC AAG ATG TAC GAC CCG GCC AAT CCT GGT CAG GAA TAC AAC1180Gly Asn Gly Lys Met Tyr Asp Pro Ala Asn Pro Gly Gln Glu Tyr Asn60 65 70CTG GCG GAC GGG GAT GGC ATC ACC GTC GAA GAG GAC GCA AAG ATC AAC 1228Leu Ala Asp Gly Asp Gly Ile Thr Val Glu Glu Asp Ala Lys Ile Asn75 80 85 90ATG GCT TGG ACG CAG TTT CAA TAC GCC AAA GAT GTT GAA GTT CGC ATC 1276Met Ala Trp Thr Gln Phe Gln Tyr Ala Lys Asp Val Glu Val Arg Ile95 100 105ACC TCC AAG GAT GGT TCT GCA CTG GGG CCA ACT AGC AAC GTT GTC ATC 1324Thr Ser Lys Asp Gly Ser Ala Leu Gly Pro Thr Ser Asn Val Val Ile110 115 120CGC CCC TCG GAT ATC AGG TAC GAC ATC AGA AGC CCA GAC AGC AGC ACT 1372Arg Pro Ser Asp Ile Arg Tyr Asp Ile Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr125 130 135GTT ATA ATC CAG GTT CCA TAC GAC CTG AGG GGC CGA CGA TTC TCC GTC 1420Val Ile Ile Gln Val Pro Tyr Asp Leu Arg Gly Arg Arg Phe Ser Val140 145 150GAG TTC CAA AAC GAC TTA TAC GCC TAC CGC TCG AAC GGC AAA TCA TAT 1468Glu Phe Gln Asn Asp Leu Tyr Ala Tyr Arg Ser Asn Gly Lys Ser Tyr155 160 165 170GTC AAT GAC GGC GGC GTT CTC GTG AGC GAG GAA CCG CGC AAT GCG CTG 1516Val Asn Asp Gly Gly Val Leu Val Ser Glu Glu Pro Arg Asn Ala Leu175 180 185CTT ATC TTC GCC AGT CCA TTC ATT CCC CAG GAA CTC ATC CCG TCC AAG 1564Leu Ile Phe Ala Ser Pro Phe Ile Pro Gln Glu Leu Ile Pro Ser Lys190 195 200ACA TCA GGC GAT ACG CAA GTC CTC AAG CCG GGC AAG ATC ACC GAC AGC 1612Thr Ser Gly Asp Thr Gln Val Leu Lys Pro Gly Lys Ile Thr Asp Ser205 210 215ACC ATT GGC GCG AAG CCG ACA CTC TAC TTT GAG GCA GGC ACC TAC TGG 1660Thr Ile Gly Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Phe Glu Ala Gly Thr Tyr Trp220 225 230GTA GAG AAA GAC GGC CGC CTC GGT AAA AGT CAC ATC AAG CTG AAC GCC 1708Val Glu Lys Asp Gly Arg Leu Gly Lys Ser His Ile Lys Leu Asn Ala235 240 245 250AAC ACG CAC TAC GTC TAC TTC GAG CCA GGA ACT TAT ATC AAA GGC GCC 1756Asn Thr His Tyr Val Tyr Phe Glu Pro Gly Thr Tyr Ile Lys Gly Ala255 260 265TTT GAG TAC ACC ACT TCG AAG AAT GAC TTT TAT ACC GTC GGA CAT GGA 1804phe Glu Tyr Thr Thr Ser Lys Asn Asp Phe Tyr Thr Val Gly His Gly270 275 280GTA GTC TCG GGC GAA AAT TAC GCA TAC ATG GCA AAC ACT GCC AAG AAC 1852Val Val Ser Gly Glu Asn Tyr Ala Tyr Met Ala Asn Thr Ala Lys Asn285 290 295TAT GTT GCG GAA AAG AGT GAC CGG ACC AGT CTT AGG ATC TTT TCG CAC 1900Tyr Val Ala Glu Lys Ser Asp Arg Thr Ser Leu Arg Ile Phe Ser His300 305 310CAG GCA GTT TCG GAC AGC CAG ATA TGG CAT TGC ATT GGA CCT ACC CTT 1948Gln Ala Val Ser Asp Ser Gln Ile Trp His Cys Ile Gly Pro Thr Leu315 320 325 330AAT GCA CCG CCC TTT AAT ACC GTG GAC CTG TTT CCA AAG AAC CAG ACG 1996Ash Ala Pro Pro Phe Asn Thr Val Asp Leu Phe Pro Lys Asn Gln Thr335 340 345CCA AAC GAG GAA GAC AAC AAG GTG CGG AAC GAC ATC TCT GAC TAC AAA 2044Pro Asn Glu Glu Asp Asn Lys Val Arg Asn Asp Ile Ser Asp Tyr Lys350 355 360CAG GTC GGC GCG TTC TAC TTC CAG ACT GAT GGG CCG CAA ATA TAC TCT 2092Gln Val Gly Ala Phe Tyr Phe Gln Thr Asp Gly Pro Gln Ile Tyr Ser365 370 375GGA ACC GTC AAG GAC TGC TTC TGG CAT GTT AAT GAC GAC GCT ATC AAG 2140Gly Thr Val Lys Asp Cys Phe Trp His Val Asn Asp Asp Ala Ile Lys380 385 390TTG TAC CAC TCG GAC GCG AAG GTC GAA CGG GTG ACC ATC TGG AAG TGT 2188Leu Tyr His Ser Asp Ala Lys Val Glu Arg Val Thr Ile Trp Lys Cys395 400 405 410CAC AAC GAC CCC GTT ATC CAA ATG GGC TGG AAA CCA CGT GGA GTC TCT 2236His Ash Asp Pro Val Ile Gln Met Gly Trp Lys Pro Arg Gly Val Ser415 420 425GGA ACT ACC ATT TCT GAA CTC AAG GTC ATC CAC ACT CGA TGG TTT AAG 2284Gly Thr Thr Ile Ser Glu Leu Lys Val Ile His Thr Arg Trp Phe Lys430 435 440AGC GAG ACG GTT GTT CCT TCC GCC ATT ATT GGA GCC TCA CCC TAC TAC 2332Ser Glu Thr Val Val Pro Ser Ala Ile Ile Gly Ala Ser Pro Tyr Tyr445 450 455GGC GAC CCA AAG ATT GTG GAT GCG TCT AGG ACA ATG AGC GTT CGA ATT 2380Gly Asp Pro Lys Ile Val Asp Ala Ser Arg Thr Met Ser Val Arg Ile460 465 470TCT GAC GTG ACC TGC GAA GGT CGT TGC CCT GCG CTC CTT CGG ATT GGT 2428Ser Asp Val Thr Cys Glu Gly Arg Cys Pro Ala Leu Leu Arg Ile Gly475 480 485 490CCG CTC CAG AAT TAT GAC ATG ACC ATT GAG AAC GTG AAA TTC GAT GAA 2476Pro Leu Gln Asn Tyr Asp Met Thr Ile Glu Asn Val Lys Phe Asp Glu495 500 505CTT TTG AGG GAT GAC AAC GTC AAG CTA GGA CAG AGT CTG GTT GGT ATG 2524Leu Leu Arg Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Gln Ser Leu Val Gly Met510 515 520AGG ATC AGC GAC CAA GAG GAC GCC TAC ATA CCC GGC CAA GAA AAG CTC 2572Arg Ile Ser Asp Gln Glu Asp Ala Tyr Ile Pro Gly Gln Glu Lys Leu525 530 535AAG CTA GGG ATA CAT ATC AAG AAT TGG CAG ATT GGG GGC AAC AGA GTG 2620Lys Leu Gly Ile His Ile Lys Asn Trp Gln Ile Gly Gly Asn Arg Val540 545 550GAT GGA TCA AAC TGG CAA GTC AAC CAA CTT GGG CAG TTG AAC ATC CAC 2668Asp Gly Ser Asn Trp Gln Val Asn Gln Leu Gly Gln Leu Asn Ile His555 560 565 570CCC GAT TAT TGG GGT GAC TGG AGC ATT GAA TGA GGCAGGCTAC CAGAGGATAC 2721Pro Asp Tyr Trp Gly Asp Trp Ser Ile Glu *575 580GTGTGTTTCC GTGTTGGCGC ACTTCCAAAC CCATCACGCC GACTGTTTCA ATTCTTCGCA 2781TCCAGAAGGA TGCTGCGGCG TCTGCCGCAA TCTGTATGTC CTACTTCAAT GGAGAAATGA 2841TTATCGAAAA ACCAGACCTC ACCAAAGAAA GTGCACGTGG TTAACTAGGG ACATGAGATG 2901CCCGACACTG TAGACTCTGC TCATCAAGAT AATCCTTCTT GCACAGCGCT GATAACGTGA 2961TGGCGCCCAG TACGTGTAGG GGCATCCGAG TC 2993(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度609個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Arg Trp Pro Gly Asn Phe Leu Thr Leu Ala Thr Ala Leu Gln Ala-28 -25 -20 -15Ala Gly Asn Leu Ala Ala Ser Val His His Arg Cys Asp Gln Gln Asn-10 -5 1Gln Ala Leu His Thr Trp Trp His Glu Lys Ser Ala Val Asn Asp Ala5 10 15 20Gly Ala Val Ala Ala Asp Glu Val Arg Gln Ser Arg Lys Tyr Asp Val25 30 35Ser Val Ser Val Arg Glu Glu Ser Lys Phe Arg Asp Ser Phe Val Tyr40 45 50Glu Thr Ile Pro Arg Asn Gly Asn Gly Lys Met Tyr Asp Pro Ala Asn55 60 65Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Leu Ala Asp Gly Asp Gly Ile Thr Val Glu70 75 80Glu Asp Ala Lys Ile Asn Met Ala Trp Thr Gln Phe Gln Tyr Ala Lys85 90 95 100Asp Val Glu Val Arg Ile Thr Ser Lys Asp Gly Ser Ala Leu Gly Pro105 110 115Thr Ser Asn Val Val Ile Arg Pro Ser Asp Ile Arg Tyr Asp Ile Arg120 125 130Ser Pro Asp Ser Ser Thr Val Ile Ile Gln Val Pro Tyr Asp Leu Arg135 140 145Gly Arg Arg Phe Ser Val Glu Phe Gln Asn Asp Leu Tyr Ala Tyr Arg150 155 160Ser Asn Gly Lys Ser Tyr Val Asn Asp Gly Gly Val Leu Val Ser Glu165 170 175 180Glu Pro Arg Asn Ala Leu Leu Ile Phe Ala Ser Pro Phe Ile Pro Gln185 190 195Glu Leu Ile Pro Ser Lys Thr Ser Gly Asp Thr Gln Val Leu Lys Pro200 205 210Gly Lys Ile Thr Asp Ser Thr Ile Gly Ala Lys Pro Thr Leu Tyr Phe215 220 225Glu Ala Gly Thr Tyr Trp Val Glu Lys Asp Gly Arg Leu Gly Lys Ser230 235 240His Ile Lys Leu Asn Ala Asn Thr His Tyr Val Tyr Phe Glu Pro Gly245 250 255 260Thr Tyr Ile Lys Gly Ala Phe Glu Tyr Thr Thr Ser Lys Asn Asp Phe265 270 275Tyr Thr Val Gly His Gly Val Val Ser Gly Glu Asn Tyr Ala Tyr Met280 285 290Ala Asn Thr Ala Lys Asn Tyr Val Ala Glu Lys Ser Asp Arg Thr Ser295 300 305Leu Arg Ile Phe Ser His Gln Ala Val Ser Asp Ser Gln Ile Trp His310 315 320Cys Ile Gly Pro Thr Leu Asn Ala Pro Pro Phe Asn Thr Val Asp Leu325 330 335 340Phe Pro Lys Asn Gln Thr Pro Asn Glu Glu Asp Asn Lys Val Arg Asn345 350 355Asp Ile Ser Asp Tyr Lys Gln Val Gly Ala Phe Tyr Phe Gln Thr Asp360 365 370Gly Pro Gln Ile Tyr Ser Gly Thr Val Lys Asp Cys Phe Trp His Val375 380 385Asn Asp Asp Ala Ile Lys Leu Tyr His Ser Asp Ala Lys Val Glu Arg390 395 400Val Thr Ile Trp Lys Cys His Asn Asp Pro Val Ile Gln Met Gly Trp405 410 415 420Lys Pro Arg Gly Val Ser Gly Thr Thr Ile Ser Glu Leu Lys Val Ile425 430 435His Thr Arg Trp Phe Lys Ser Glu Thr Val Val Pro Ser Ala Ile Ile440 445 450Gly Ala Ser Pro Tyr Tyr Gly Asp Pro Lys Ile Val Asp Ala Ser Arg455 460 465Thr Met Ser Val Arg Ile Ser Asp Val Thr Cys Glu Gly Arg Cys Pro470 475 480Ala Leu Leu Arg Ile Gly Pro Leu Gln Asn Tyr Asp Met Thr Ile Glu485 490 495 500Asn Val Lys Phe Asp Glu Leu Leu Arg Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly505 510 515Gln Ser Leu Val Gly Met Arg Ile Ser Asp Gln Glu Asp Ala Tyr Ile520 525 530Pro Gly Gln Glu Lys Leu Lys Leu Gly Ile His Ile Lys Asn Trp Gln535 540 545Ile Gly Gly Asn Arg Val Asp Gly Ser Asn Trp Gln Val Asn Gln Leu550 555 560Gly Gln Leu Asn Ile His Pro Asp Tyr Trp Gly Asp Trp Ser Ile Glu565 570 575 580(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Asp Gln Gln Asn Gln Ala Leu His Thr Trp Trp His Glu Lys Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽1(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Ser Tyr Val Asn Asp Gly Gly Val Leu Val Ser Glu Glu Pro Arg Asn1 5 10 15Ala Leu Leu ILe Phe Ala Ser Pro Phe Ile Pro Gln20 25(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽2(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Ser Asp Arg Thr Ser Leu Arg Ile Phe Ser His Gln Ala Val Ser Asp Ser Gln1 5 10 15Ile Trp His Xaa Ile20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽3(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Asn Asp Phe Tyr Thr Val Gly His Gly Val Val Ser Gly Glu Asn Tyr1 5 10 15Ala Tyr Met Ala Asn Thr Ala Lys20(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽4(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Ile Asn Ala Ala Trp Thr Gln Phe Gln Tyr Ala Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅱ)序列特征(A)長度26個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽5(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Asp Gly Ser Ala Leu Gly Pro Thr Ser Asn Val Val Ile Arg Pro Ser1 5 10 15Asp Ile Arg Tyr Asp Ile Ser Ser Pro Asp20 25(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽6(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Asn Trp Gln Ile Gly Gly Asn Arg Val Asp Gly Ser Asn Trp Gln Val Asn Gln1 5 10 15(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽7(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Ser Glu Thr Val Val Pro Ser Ala Ile Ile Gly Ala Ser Pro Tyr Tyr1 5 10 15Gly Asp Pro(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽8(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Leu Asx Ala Asx Thr His Tyr Val Tyr Phe Glu Pro Gly Thr Tyr Ile LysI 5 10 15(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽9(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽10(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Ser Ala Val Asn Asp Ala Gly Ala Val Ala Ala Asp Glu Val Arg Gln1 5 10 15Ser Asg Lys(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽11(ⅴ)片段類型N末端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Xaa His Asn Asp Pro Val Ile Gln Met Gly Xaa Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物8001”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:GA(A/G)AA(T/C)TA(T/C)G C(T/C/G/A)TA(T/C)ATGGC 20(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物8002”GCCAT(G/A)TA(G/A/T/C)GC (A/G)TA(G/A)TT(T/C)TC 19(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物8003”TGGAC(A/G/T/C)CA(A/G)T T(T/C)CA(A/G)TA(T/C)GC 20(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物8004”GC(A/G)TA(T/C)TG(A/G)A A(T/C)TG(A/G/T/C)GTCC 19(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物8005”AA(T/C)TGGCA(A/G)A T(T/C/A)GG(A/G/T/C)GG 17(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物8006”CC(A/G/T/C)CC(T/A/G)TA(T/C)T GCCA(A/G)TT 17(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物”AGAAATCGGG TATCCTTTCA G 21(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度105個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物”GCTCCTCATG GTGGATCCCC AGTTGTGTAT ATAGAGGATT GAGGAAGGAA GAGAAGTGTG 60GATAGAGGTA AATTGAGTTG GAAACTCCAA GCATGGCATC CTTGC 105(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物8864”CGCGGATCCA CCATGCGTTG GCCTGGTAAT TTTC 34(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物8867”CCGCTCGAGC CTGCCTCATT CAATGCTCC 29(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物o-dexSwaⅠ”GCATTTAAAT ATG CGT TGG CCT GGT25(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物o-dexPacⅠ”CGTTAAT TAA TCA TTC AAT GCT CCA GTC 28
權(quán)利要求
1．DNA構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含編碼顯示葡聚糖酶活性的酶的DNA序列，所說的DNA序列包括a)SEQ ID No:1中所示DNA序列，和/或可從大腸桿菌DSM10706中得到的DNA序列的葡聚糖酶編碼部分，或者b)a)中所限定的DNA序列的類似物，該類似物ⅰ)與SEQ ID No.1中所示的DNA序列和/或可從大腸桿菌DSM10706得到的DNA序列至少有80％同源性，或ⅱ)與SEQ ID No.1中所示DNA序列和/或可從大腸桿菌DMS10706得到的DNA序列的同樣寡核苷酸探針雜交，或ⅲ)編碼與由包括SEQ ID No.1中所示DNA序列和/或可從大腸桿菌DSM10706得到的DNA序列的DNA序列編碼的多肽有80％同源性的肽，或ⅳ)編碼與抗衍生于淡紫擬青霉的和/或可從大腸桿菌DSM10706得到的DNA序列編碼的純化葡聚糖酶的抗體有免疫學(xué)反應(yīng)性的多肽。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建物，其中DNA序列可得自真菌微生物，例如絲狀真菌或酵母。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建物，其中DNA序列可得自擬青霉屬，例如淡紫擬青霉的菌株，可得自青霉屬，例如薄青霉或P.mimoluteum的菌株。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建物，其中DNA序列是從淡紫擬青霉的核酸文庫中分離的或基于該文庫產(chǎn)生的。
5．含有根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的DNA構(gòu)建物的重組表達載體。
6．含有根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的DNA構(gòu)建物或根據(jù)權(quán)利要求5的重組表達載體的細胞。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的細胞，其為絲狀真菌。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的細胞，其中細胞屬于曲霉屬的菌株，特別是黑曲霉或米曲霉的菌株，或鐮孢屬的菌株，例如尖鐮孢、禾木科鐮孢、硫磺鐮孢、五谷鐮孢或毒性鐮孢的菌株，或青霉屬的菌株，例如薄青霉或P.minioluteum的菌株，或擬青霉屬例如淡紫擬青霉的菌株。
9．生產(chǎn)表現(xiàn)有葡聚糖酶活性的重組酶的方法，該方法包括在允許表達根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的DNA構(gòu)建物或根據(jù)權(quán)利要求5的表達載體的條件下，在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項的宿主細胞，并從培養(yǎng)物中回收酶。
10．具有由權(quán)利要求1至4中任一項的DNA構(gòu)建物編碼的葡聚糖酶活性的重組酶。
11．按照權(quán)利要求9的方法生產(chǎn)的重組酶。
12．含有根據(jù)權(quán)利要求10或11的重組葡聚糖酶的組合物。
13．含有根據(jù)權(quán)利要求10或11的酶，或根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，并進一步含有常規(guī)用于口腔保鍵產(chǎn)品中的成分的口腔保健產(chǎn)品。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的口腔保健產(chǎn)品是潔齒劑，例如牙膏、牙粉或漱口液。
15．根據(jù)權(quán)利要求13和14任一項的口腔保健產(chǎn)品進一步包含選自齒斑葡聚糖酶、氧化酶、過氧化物酶、鹵過氧化物酶、漆酶、蛋白酶、內(nèi)切葡糖苷酶、脂酶、淀粉酶、抗微生物酶和其混合物的酶活性。
16．根據(jù)權(quán)利要求10或11的重組葡聚糖酶或根據(jù)權(quán)利要求12的組合物或根據(jù)權(quán)利要求13和14的口腔保健產(chǎn)品用于預(yù)防齒斑形成或去除齒斑。
17．根據(jù)權(quán)利要求10或11的重組葡聚糖酶或根據(jù)要求12的組合物用于水解糖汁或糖漿。
18．根據(jù)權(quán)利要求10或11的重組葡聚糖酶或根據(jù)要求12的組合物或根據(jù)權(quán)利要求13和14的口腔保健組合物用于動物的口腔保健產(chǎn)品中。
19．根據(jù)權(quán)利要求10和11的重組葡聚糖酶或權(quán)利要求12的組合物用于食物、飼料和/或?qū)櫸锸称分小?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及編碼具有葡聚糖酶活性的酶的克隆的DNA序列、包括所說的DNA序列的重組表達載體、絲狀真菌宿主細胞、生產(chǎn)所說的重組葡聚糖酶的方法,以及分離并純化的酶。本發(fā)明還涉及含有重組酶的組合物、口腔保健組合物和產(chǎn)品及在去除齒斑中的應(yīng)用。
文檔編號C12N9/46GK1226283SQ9719683
公開日1999年8月18日 申請日期1997年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月28日
發(fā)明者T·克里斯坦森, C·C·弗格爾桑, T·豪吉爾, C·約安森 申請人:諾沃挪第克公司