專利名稱：作為一種遺傳標(biāo)記用于增加豬的一胎多仔數(shù)量之催乳素受體基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及豬的繁殖能力的遺傳變異的測定，特別是用一種遺傳標(biāo)記，即催乳素受體基因，來表示一胎多仔的可遺傳的特征。
本發(fā)明的背景繁殖能力用每個具有繁殖能力的雌性豬所生產(chǎn)一胎多仔數(shù)量來確定，是豬肉生產(chǎn)效率的主要限定因素。在美國出生并存活的豬的數(shù)量平均約為每胎9.5只。一胎仔數(shù)的可遺傳性是低的(10％～15％)，根據(jù)以往的一胎數(shù)量來選擇能繁殖的雌性的標(biāo)準(zhǔn)的遺傳方法已無效，因此需要一種能在分子或DNA水平上選擇繁殖能力的方法。
中國豬品種以其年齡不大時就進入繁殖期，并且一胎多仔而著稱。美國豬品種則以其增長速度較快，是瘦肉型的而著稱。因此，理想的作法是將兩個品種類型最好的特征結(jié)合起來，以改進美國豬肉的生產(chǎn)效率。通過發(fā)現(xiàn)與豬一胎多仔有關(guān)的基因或遺傳標(biāo)記將大大加速這些效果。
限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的分析法已被若干研究組用來研究豬的DNA。見Jung等人所作《應(yīng)用遺傳法則》77:271-274(1989)，本說明書引入該文作為參考，該文公開了用RFLP技術(shù)來顯示兩個豬品種之間的遺傳變異性。在這些品種中，豬白細(xì)胞抗原(SLA)Ⅰ類基因證明為多形質(zhì)。本文引入Hoganson等人的文章作為參考，見《美國社會中西部地區(qū)動物科學(xué)年會文摘》，1990年3月26-28。豬的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)基因的多形質(zhì)的報導(dǎo)相對于中國的豬，用RFLP分析也被證明。Jung等人《動物遺傳學(xué)》(1989)2679-91，本說明書引入該文作為參考，用RFLP對某些雄性豬的白細(xì)胞抗原Ⅰ類基因的分析的報導(dǎo)。作者提出在豬白細(xì)胞抗原/主要組織相容性復(fù)合物(SLA/MHC)的Ⅰ類基因與繁殖及完成這種特征之間能有一種聯(lián)系。用SLA Ⅰ類限制片段，作為遺傳標(biāo)記的進一步的情況會在未來改善豬的生長性能方面有發(fā)展。
進而，美國專利5,550,024中Rothschild等人公開了在豬雌激素受體基因中的多形質(zhì)與一胎較多仔數(shù)量有聯(lián)系，本說明書引入這個公開作為參考。
另一個與豬成功繁殖有關(guān)的激素是催乳素。催乳素(PRL)是一種前垂體肽激素，包括了多種不同的內(nèi)分泌活性，而且對繁殖成功是必要的。它的最好的特性之一是調(diào)節(jié)成年哺乳動物的乳的產(chǎn)生。PRL需要生乳的刺激或乳蛋白的合成。這種反應(yīng)是通過它的受體(PRLR)作中介。PRLR屬于細(xì)胞因子生長激素受體/催乳素受體(GHR)/PRLR超科。當(dāng)催乳素(PRL)被激活，催乳素受體(PRLR)開始一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，基因的最終活化轉(zhuǎn)錄β-酪蛋白和α-乳清蛋白。當(dāng)PRL被激活時，PRLR開始于一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括酪氨酸激酶Jak2。在蛋白質(zhì)羧基末端的突變能改變一種特殊的磷酸酪氨酸殘基，防止受體激活Jak2并最終用β-酪蛋白基因的活化轉(zhuǎn)錄進行干預(yù)(Lebrun)。長和短形式的受體蛋白質(zhì)及不同的轉(zhuǎn)錄方式已在大鼠、小鼠、兔及人類中表現(xiàn)出其特征。(Boutin,Edery,Lesueur)。然而，已顯示短形式的受體是不能激活乳蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。已知在兔及人類的未翻譯區(qū)，由于可變剪接mRNAs產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄遠不如它的初期。最近也已證明催乳素(PRL)能刺激黃體酮的產(chǎn)生，對維持妊娠是需要的，體外實驗存在大量黃體細(xì)胞。在牛中催乳素受體(PRLR)能協(xié)調(diào)生長激素(bST)參于產(chǎn)生較多的乳的作用。因此，對于豬產(chǎn)生較多的乳也可能是重要的。在人類和小鼠中，生長激素受體(GHR)和催乳素受體(PRLR)的遺傳圖譜靠在一起(Arden等人1990；Barker等人1992)在豬中這兩種基因是連接在一起的。已經(jīng)在豬的遺傳圖譜上發(fā)現(xiàn)GHR在染色體16上。而PRLR還未在遺傳圖譜中發(fā)現(xiàn)，并且已有報導(dǎo)沒有遺傳變異性。
本發(fā)明提供一個遺傳標(biāo)記，基于在催乳素受體基因中多形質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，它與增加豬的一胎多仔數(shù)量有關(guān)。用豬的催乳素受體基因能進行基因分型，并用于測定特殊的限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)豬仔與增加豬的一胎多仔數(shù)量的關(guān)系。也能用于識別雌雄個體攜帶的一胎較多仔的基因。在此情況下的雌性個體，有可能繁殖出一個比他們的品種平均數(shù)量大的豬仔，或雄性個體因為他們的雌性個體后代有比他們繁殖的平均值較大的一胎較多仔數(shù)量。因此這種標(biāo)記在繁殖計劃中可作為選擇工具促進譜系和品種的發(fā)展，使其繁殖生產(chǎn)出大量后代的小仔。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的目的是提供一種篩選豬的方法，測定那些可能繁殖一胎較多仔的豬。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于鑒別豬的一胎多仔數(shù)量的遺傳標(biāo)記的方法。
本發(fā)明的進一步的目的是提供用于一胎多仔數(shù)量的遺傳標(biāo)記。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于評價豬的脫氧核糖核酸(DNA)的樣品的工具，用于一胎多仔數(shù)量的具體的遺傳標(biāo)記。
其它的目的和本發(fā)明的優(yōu)點一部分在說明書中解釋，一部分明顯地可從說明書或由本發(fā)明實施例中得知。本發(fā)明的上述目的和優(yōu)點可通過說明書，并在結(jié)合附加的權(quán)利要求而得到。
為實現(xiàn)本發(fā)明上述目的，本發(fā)明提供一種用于篩選豬方法，以測定那些更能繁殖出一胎較多仔的小豬，或淘汰那些等位基因顯示一胎較少仔的豬。測定那些繁殖時更能生產(chǎn)一個一胎較多仔或淘汰的豬是有等位基因指出一胎較少仔。因為“一胎較多仔”表示在一個所給種群的平均值之上的重要的一胎多仔數(shù)量。因此本發(fā)明提供一種用于篩選豬方法，測定那些更能生產(chǎn)一胎較多仔的豬，和/或那些很少能生產(chǎn)一胎較多仔的豬。這種方法包括如下步驟1)從一頭豬中得到基因組DNA的樣品；2)分析由1)得到的基因組DNA以測定催乳素受體的等位基因是存在的。簡言之，從一頭豬中得到一個遺傳物質(zhì)樣品，并分析樣品以測定在催乳素受體基因的編碼區(qū)的多形質(zhì)是否存在，這與增加一胎多仔的數(shù)量是相關(guān)的。
在一個優(yōu)選實施例中，多形質(zhì)是一個限制片段長度多形質(zhì)，實驗包括鑒別從豬的遺傳物質(zhì)中分離出來的豬的催乳素受體基因；基因與限制酶發(fā)生作用以產(chǎn)生不同長度基因限制片段；從一個限制模式中分離限制片段，通過電泳或高壓液相層析分離(HPLC)；對一頭豬的催乳素受體基因的限制片段模式進行比較，判斷是否帶有希望的標(biāo)記。如果豬在標(biāo)記實驗中為陽性，它將包括在繁殖方案中。如果豬在標(biāo)記基因型實驗中不是陽性，它將被從這組中挑出而作它用。
在最佳實施例中，基因通過應(yīng)用引物和DNA聚合酶而被分離，放大含有多形質(zhì)該基因的一個特殊的區(qū)。之后，被放大的區(qū)域用限制酶消化，片段又再次被分離。這種限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)模式的顯色通過片段的簡單染色來完成，或在放大時或者用引物或者用核苷三磷酸作標(biāo)記。
在另一實施例中，本發(fā)明包括一種方法，在一個特殊種群中鑒別用于豬一胎多仔數(shù)量的遺傳標(biāo)記。雌雄豬以相同的品種或雜交或相似的遺傳譜系來繁殖，以測定每個雌豬產(chǎn)生的后代數(shù)量。在每個豬的催乳素受體基因中的一種多形質(zhì)可以鑒定，并與后代的數(shù)量有關(guān)。最好限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析被用于測定多形質(zhì)，優(yōu)選用限制性內(nèi)切核酸酶Alul消化DNA。
在可選擇DNA標(biāo)記的具體的等位基因和與一個特殊的基因(如催乳素受體基因在此討論過)有關(guān)的DNA標(biāo)記的等位基因之間建立連接也是可能的，如上所述與一個特殊的性能有關(guān)。因此，在目前狀況下，至少在短期內(nèi)，取得催乳素受體基因是可能的，選擇能生產(chǎn)一胎較多仔的豬，另一方面間接地淘汰生產(chǎn)一胎較少仔的豬，通過對染色體16標(biāo)記的具體的等位基因的選擇，選用與一個催乳素受體有關(guān)的某些等位基因來標(biāo)記。這些標(biāo)記物包括SW1305,S0077,S0006,SW2411,SW1035和S0111與豬的染色體16上的催乳素受體有關(guān)，這些標(biāo)記物都是微衛(wèi)星和生長激素受體(GHR)。
本發(fā)明還包括一個評價豬的DNA樣品的工具，以評價一個希望的遺傳標(biāo)記是否存在于豬的遺傳物質(zhì)中，表現(xiàn)出一胎多仔的遺傳特征的豬的催乳素受體基因。最低限度，這個工具是一個含有一種或多種試劑的容器，它能鑒定豬催乳素受體基因的多形質(zhì)。最好這種試劑是一組低核苷酸引物，能放大含有多形質(zhì)的豬催乳素受體基因的片段。優(yōu)選地，這種工具還含有限制酶，它能至少在一個地方剪切豬催乳素受體基因。在一個優(yōu)選實施例中，這種限制酶是Alul或它能在相同的識別位點進行剪切。
下面結(jié)合附圖，對說明書實施例進行詳細(xì)解釋。
附圖的說明

圖1描繪了3’編碼序列和豬催乳素受體(PRLR)基因的未翻譯區(qū)(SEQ ID No:3)。這種豬的聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段由來自兔或人類引物，用Amicon Microcon Filters作指導(dǎo)(Amicon，有限公司)被純化。由艾奧瓦洲大學(xué)的DNA序列和合成的設(shè)備來做序列分析，用斜體部分表示的不確定性序列可能為ccaaaactac(SEQ ID No:3)-豬PCR引物一兔/人序列。
圖2表示用Alul消化PCR產(chǎn)品的多形模式。正向的引物5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG-3’，反向的引物5’-GGCAAG TGG TTG AAA ATG GA-3’用在下列PCR條件93℃,3分鐘，35個循環(huán)93℃30秒，60℃1分鐘，70℃1分鐘，最終72℃3分鐘。最后加Taq聚合酶，而樣品被加熱維持在80℃。用Alul剪切PCR產(chǎn)品(新英國生物實驗室)，在室溫120伏用6％NuSieve(FMC)瓊脂糖凝膠上分離4小時，凝膠用溴化乙錠染色，泳道1是1-kb梯度，泳道2～4是三種不同的基因型。
圖3表示PRLR在豬染色體16的位置，用CriMap得到多點連鎖，以對數(shù)LOD比數(shù)，產(chǎn)生一個中性最好的圖譜，3或大于3認(rèn)為有意義。
圖4表示用PCR引物SEQ ID NOS:1和2由聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實驗得到的片段。
本發(fā)明的詳細(xì)說明現(xiàn)在本發(fā)明提供具體的詳細(xì)的說明，結(jié)合下列例子，解釋本發(fā)明的原則。
本發(fā)明涉及用于豬的一胎多仔數(shù)量的遺傳標(biāo)記。它提供了一種篩選豬的方法，測定那些繁殖時更能生產(chǎn)一胎較多豬鑒定其催乳素受體基因中和增加一胎多仔數(shù)量相關(guān)的多形質(zhì)的存在與否。這里術(shù)語“增加的一胎多仔”，指一胎多仔數(shù)量在所給群體的平均值之上的一個生物學(xué)意義的增加。
因此，本發(fā)明涉及遺傳標(biāo)記和識別那些遺傳標(biāo)記在特殊的品種，株系，群體或類別的豬中的方法，因而雌豬更能生產(chǎn)小仔，對于這樣特殊的品種、株系、群體、或類別的豬，在豬仔數(shù)量的平均值之上可明顯增加它的數(shù)量。使用一些方法鑒別這種標(biāo)記的存在或缺失，包括例如單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，異源雙鏈分析(HDA)，變性梯度凝膠電泳法，溫度梯度電泳法，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，甚至催乳素受體基因的直接排序及測定在3’翻譯區(qū)用Alul的識別模式。
其它的技術(shù)包括非凝膠系統(tǒng)，如TaqManTM(Perkin Elmer)。在此系統(tǒng)設(shè)計低核苷酸聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，突變的側(cè)面問題，允許此區(qū)域PCR放大。然后設(shè)計一個第三低核苷酸探針使其雜化含有堿基的區(qū)域，該堿基受不同等位基因之間變化的控制。該探針用熒光染料在5’和3’兩端被標(biāo)記。這些染料選擇互相靠近的方式，而其中一個熒光被另一個猝滅而不能被測定。用Taq DNA聚合酶使PCR引物從5’位置延伸到模板相對處，使探針導(dǎo)致剪切，染料被連接到5’端，通過Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性探針退火。去除這種猝滅效應(yīng)能由染料在探針的3’端進行熒光測定。辨別不同DNA序列的產(chǎn)生可發(fā)現(xiàn)探針對模板分子的雜交是不能完成的，即有一些形式的一種錯配序列，染料的剪切不會發(fā)生。因此，如果僅為低核苷酸探針的核苷酸序列對模板分子是完全互補的，這樣它被結(jié)合，猝滅被除去。一種反應(yīng)混合物中含有兩個不同的探針序列，每個設(shè)計為相反的不同的等位基因，因此能在一個反應(yīng)中測定兩個等位基因。
這種限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的應(yīng)用提供了一種測定多形質(zhì)的方法。然而，因為RFLP分析的應(yīng)用依賴于最終在多形質(zhì)和DNA限制位點單個核酸分子上，其它測定多形質(zhì)的方法也可被應(yīng)用。這些方法包括分析多形的基因產(chǎn)品和用測定在基因產(chǎn)品中各種不同結(jié)果來測定多形質(zhì)。
RFLP分析一般是現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)。如美國專利4,582,788,1986年4月15日出版，Erlich；和Gusella的4,666,828,1987年5月19日出版，F(xiàn)rossard的4,772,549,1988年9月20日出版和Frossard的4,861,708,1989年8月29日出版所有這些都引入該文作為參考。廣言之，這種技術(shù)包括對于得到的DNA進行研究，用限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA，分離結(jié)果片段，并測定各種基因的片段。
在本發(fā)明中，從一頭豬中得到一種遺傳物質(zhì)的樣品。樣品可由血液、組織、精液等中得到。通常，外周血液細(xì)胞被用作來源，遺傳物質(zhì)是DNA。獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量以提供足夠的DNA的量來進行分析，這個量是已知或能被現(xiàn)有技術(shù)中的方法測出。這種將DNA從血液細(xì)胞中分離出來的方法是現(xiàn)有技術(shù)。
下一個含有多形質(zhì)的區(qū)域用引物和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)放大，如聚合酶鏈反應(yīng)。這種技術(shù)已被公開如美國專利Mullis等的4,683,195,1987年7月28日出版，Mullis等人的4,683,202,1987年7月28日出版，Mullis等人的4,800,159,1989年1月24日出版，Gelfand等人的4,889,818,1989年12月26日出版，和Clumbus等人的4,902,624,1990年2月20日出版，所有這些都引入該文作為參考。引物的選擇在提到的參考資料中被討論并引入該文作為參考。這種引物能放大豬的催乳素受體基因的3’編碼區(qū)和未翻譯區(qū)，如圖2所示。其它引物能按照現(xiàn)有技術(shù)中的那些方法結(jié)合在此來設(shè)計。
將分離出的DNA然后用限制性內(nèi)切核酸酶消化，這樣在一種具體的核苷酸序列，稱為一個限止位點上DNA被水解地分裂或剪切。這種內(nèi)切核酸酶也稱為限制酶，在現(xiàn)有技術(shù)中這些方法是已知的。在本發(fā)明中，選擇一個豬的催乳素受體基因編碼區(qū)來剪切，在一個地方至少產(chǎn)生兩個基因片段?？膳卸ㄊ欠袢魏芜@樣的片段都是多形的，是否任何的多形質(zhì)的限止性片段長度多態(tài)性(RFLP)通過與現(xiàn)有技術(shù)結(jié)合而與一胎多仔數(shù)量相關(guān)。優(yōu)選的，這種限制性內(nèi)切核酸酶是Alul。Alul在序列5’-AGCT-3’剪切DNA雙股鏈。由專業(yè)人員用現(xiàn)有技術(shù)的方法決定，將一定量的酶加到含有豬DNA的樣品中和其它適于處理樣品的適合的條件，所給的技術(shù)包含在此。
這種限制性片段然后用已知技術(shù)分析，一般包括無論是片段的分離和通過染色而顯色，還是篩選序列和雜交得到一種特殊的模式，或測定不同類型的片段。后者允許鑒別一個或多個片段(標(biāo)記物)用于增加的一胎多仔數(shù)量。優(yōu)選的分離技術(shù)是凝膠電泳。
在此技術(shù)中，已消化的片段在支持的介質(zhì)上被分離，片段的類型受所用電的范圍影響。凝膠板，如瓊脂糖或丙烯酰胺被用于支持介質(zhì)。含有限制性片段的樣品被加到凝膠的一端。一種或多種類型的標(biāo)記物在相同的凝膠上作為對照能夠評價這種限制性片段的類型。這種程序一般有一個溶解度，分離的片段互相有不同類型，有的為1或2個堿基對那么小。
在另一個實施例中片段被變性，并物理地由凝膠轉(zhuǎn)移到一種固體支持物上，優(yōu)選一個尼龍膜，接觸的凝膠用一個含有適當(dāng)試劑的過濾器過濾，在適當(dāng)?shù)臈l件下促進DNA的轉(zhuǎn)化。這種試劑和條件是現(xiàn)有技術(shù)中那些已知的方法。因此，從分離程序中得到的DNA片段的相關(guān)的位點是存在的。
下一步驟包括測定不同類型的片段的種類或測定一個特殊的類型的片段。后者是一個遺傳標(biāo)記并與增加一胎多仔數(shù)量有關(guān)。優(yōu)選用溴化乙錠或類似物通過對片段染色來完成。
另一種技術(shù)是雜交探針的應(yīng)用，這種探針是一種低核苷酸或聚核苷酸用它們使片段雜交可以足夠互補或同源，形成探針一片段復(fù)合物。優(yōu)選地，探針是一個cDNA探針。這種低核苷酸或聚核苷酸用一個可測定的實體來標(biāo)記。這樣能夠測定限止性片段，探針被雜交。探針用標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記。如用一種射線標(biāo)記、酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物素-抗生物素蛋白標(biāo)記等。如美國專利Ward等人，專利號為4,711,955,1987年12月8日出版。及Stavrianopoulos等人，4,868,103,1989年9月19日出版，本說明書引入兩者作為參考。
探針和含有限止片段的尼龍膜在一段足夠的時間和適當(dāng)?shù)碾s交條件下接觸，使探針與片段雜交，然后通過過濾器清洗除去未結(jié)合的探針和其它不需要的物質(zhì)。
這種探針一片段復(fù)合物與過濾器結(jié)合，然后用已知技術(shù)測定。例如如果此探針已用放射性標(biāo)記(32P)，測定包括用一片放射性敏感的膜接觸這尼龍膜層。然后在一個適當(dāng)?shù)恼丈淦?，所研究的片段包括對照片段被顯色。
測定步驟提供一個模式，結(jié)果根據(jù)類型從片段上分離。用已知類型的對照片段比較這些片段，這樣的實驗也在凝膠上同樣進行，能評價片段類型的不同種類。也可測定在豬催乳素受體基因中的不同的多形質(zhì)，通過從一定數(shù)量的不同的豬的類似的DNA分析產(chǎn)生的模式進行比較，這種模式不同于大部分其它的豬產(chǎn)生的一般的模式，這導(dǎo)致由于一個或多個限制性片段長度的多形質(zhì)，如不同長度的限制性片段由豬催乳素受體基因被內(nèi)切核苷酸酶剪切而產(chǎn)生。這里示出在這些豬中有不同的堿基對序列。
一種特殊的RFLP已被鑒別，例如一個特殊長度的限制性片段，用已知技術(shù)能構(gòu)成一個探針到此片段，這樣允許用另一種更快的形式測定這樣的多形質(zhì)。例如，這種DNA被消化，能用一種夾心雜交的形式，這樣的實驗公開于美國專利Ranki等人的4,486,539,1984年12月4日出版，Ranki等人的4,563,419,1986年1月7日出版。本說明書引入兩者作為參考。樣品被帶入與一個捕捉探針接觸，在固體載體上固定化，探針與片段結(jié)合，然后清洗載體，加入一個標(biāo)記的測定探針，再清洗，對測定探針進行測定，由此證明這種理想的片段存在。
在另一個實施例中，這種RFLP模式被測定，或一個特殊的多形的片段已經(jīng)被測定，將它與第二種比較，已知RFLP模式或片段是與增加一胎多仔數(shù)量相關(guān)的，第二個模式或片段也由豬催乳素受體基因測定，使其在相同條件下用同樣的限制性內(nèi)切核苷酸酶作為和第一種同樣或一個相同的探針進行。
本發(fā)明的另一個改變的實施例中，這種限制性片段能用雜交溶液測定。在此技術(shù)中，這種片段首先被用探針雜交，然后被分離。這種分離的探針一片段復(fù)合物然后如上所述被測定。通常，這樣的復(fù)合物在凝膠上被測定，沒有轉(zhuǎn)移到過濾器上。
在大部分優(yōu)選實施例中，多形質(zhì)用聚合鏈?zhǔn)降姆磻?yīng)(PCR)放大測定，沒有任何探針。這樣的程序在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，在美國專利中也有討論，如4,795,699名稱為“DNA聚合酶”和美國專利4,965,188“放大的方法，測定和/或使用一種熱穩(wěn)定的酶來克隆核苷酸序列”本說明書引入兩者作為參考。
這種程序引物用于構(gòu)成放大的區(qū)域，多形質(zhì)位于其中。引物可優(yōu)選4～30個堿基，取決于多形質(zhì)周圍的序列來設(shè)計，包括一個多形質(zhì)的正向5’引物和一個反向的或抗一感覺引物3’。引物不需要精確的互補，實際上相等的序列也能被接受。然后加入一種DNA聚合酶，如Taq聚合酶(許多這樣的聚合酶是已知的，商業(yè)上有用)，常用4種核苷三磷酸作一種緩沖試劑。測定是通過簡單的染色，如用溴化乙錠，分離出的產(chǎn)品根據(jù)放大區(qū)域的長度用預(yù)知的類型進行測定。反應(yīng)的時間，試劑和引物的設(shè)計都是現(xiàn)有技術(shù)中的那些已知方法，并在本專利中討論，引入該文作參考。進一步聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)放大可具體的用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)。見Orita等人“用凝膠電泳作為單鏈構(gòu)象多態(tài)性測定人的DNA的多形質(zhì)”。PNAS 86(8),1989年4月(2766-2770)；Lessa等人“摩爾生態(tài)學(xué)”2(2)119-129頁，1993年4月，“篩選技術(shù)用于測定DNA序列中變異的等位基因”均被引入本文作參考。
盡管上述方法的敘述，在術(shù)語上用了一個簡單的限制酶和簡單的成組引物，這些方法不限于此，一種或多種附加限制酶和/或探針和/或引物均能被應(yīng)用，如果需要，附加的酶構(gòu)成探針和引物能通過常規(guī)途徑測定。
用于豬一胎多仔數(shù)量的遺傳標(biāo)記物測定如下。相同的品種或雜交品種或來自相似遺傳譜系衍生的雌雄豬配對，測定每個雌豬生產(chǎn)的后代數(shù)。為了測定每個豬的催乳素受體基因中的多形質(zhì)，親代DNA的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的分析如上所述方法進行。這種多形質(zhì)和后代的數(shù)量有關(guān)。至少20最好取40只雌豬用于做這些測定。每只雌豬生產(chǎn)小仔的次數(shù)(如同一窩后代)至少是一次，優(yōu)選循環(huán)繁殖，重復(fù)生產(chǎn)至少2次，最好為3次。
當(dāng)進行這種分析時，多形質(zhì)通過限止性內(nèi)切核苷酸酶Alul進行聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)的分析測定，由于多形質(zhì)周圍區(qū)的高的同源性，用類似于人類或兔的已知的催乳素序列能設(shè)計放大引物，也可用已知的豬的催乳素基因序列資料如圖1表示的來設(shè)計，或甚至用基因周圍緊密連接得到的序列資料來設(shè)計。根據(jù)本發(fā)明已選擇一組引物來放大一個第457堿基對片段(正向引物5’-CCC AAA ACA GCA GGA CG-3’(SEQ IDNo:1)和這種反向的引物5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATGGA-3’(SEQ ID No:2))，其后產(chǎn)生限制性多形的片段約為124,110,79,77和67堿基對。這種多形位點位于110堿基對片段。多形的剪切位點產(chǎn)生一個90堿基對片段。這種多形的片段作為等位基因顯示，而每個都顯示和不同品種的增加一胎多仔數(shù)量相關(guān)。這樣一個豬的雜合子用Alul片段顯示一個模式為124,110,90,79,77和67，一個純合子用多形的剪切位點顯示了一個模式為124,90,79,77,67，而另一個純合子顯示了一個模式為124,110,79,77,67。這種基因型與一胎較多仔數(shù)量相關(guān)，另一個用在不同的品種?？偨Y(jié)出相似的情況，公開于美國專利5,374,523名稱為“牛的生長激素基因的變異的等位基因產(chǎn)生較多牛奶的牛的遺傳標(biāo)記”，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一個多形質(zhì)等位基因是生長激素基因，一個等位基因形式有益于澤西種乳牛，另一個形式有益于(荷蘭)霍爾斯坦種乳牛。
本發(fā)明的方法適用的試劑可包裝成方便的試劑盒。這種試劑盒提供了必要的物質(zhì)，如成組試劑包裝成適合的容器。最少試劑盒含有一種試劑，能鑒定豬催乳素受體基因的多形質(zhì)，這與增加小仔數(shù)量有關(guān)。優(yōu)選地，這種試劑是一組聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的試劑(一組引物，DNA聚合酶和4種核苷三磷酸)用豬催乳素受體基因或其一個片段雜交。優(yōu)選地，這種成組的聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和一個限制酶能至少包括在這試劑盒中的一個地方剪切豬的催乳素受體基因。本發(fā)明特殊優(yōu)選實施例中引物是SEQ ID No:1或SEQ ID No:2，限制酶為Alul。優(yōu)選地，這個試劑盒進一步包括其它的裝置，如試劑用于測定或測量這些可檢測的實體或提供一個對照。其它的試劑如果需要，也可用于雜交，預(yù)雜交，DNA提取，顯色等。
本發(fā)明的方法和物質(zhì)也能用于評價豬的DNA，個體豬的遺傳的類型和檢測豬的遺傳變異。特別地，一個豬的基因組DNA的樣品能用一個或多個對照參考評價，測定是否一個多形質(zhì)存在于催乳素受體基因中。優(yōu)選地，限制性片段長度多形性(RFLP)分析是用有關(guān)的豬催乳素受體基因來進行。并且將結(jié)果與對照比較，對照是一個不同豬的催乳素受體基因的一個RFLP分析的結(jié)果，其豬的催乳素受體基因的多形質(zhì)是已知的。相似地，一個豬的催乳素受體基因型通過獲得的基因組DNA的樣品來測定，對這種DNA中的催乳素受體基因的RFLP進行分析，并與對照比較結(jié)果。另，對照是一個不同豬的催乳素受體基因的RFLP分析的結(jié)果。這個豬的基因型的結(jié)果通過它的催乳素受體基因的多形質(zhì)來確定。最后，不同豬的遺傳變異能由至少來自兩頭豬得到的基因組DNA的樣品來測定，鑒別在催乳素受體基因中的一種多形質(zhì)的存在與否，并比較結(jié)果。
這些實驗對鑒別和一胎多仔數(shù)量有關(guān)的遺傳標(biāo)記是有用的，如上所述，用于鑒別和其它特征相關(guān)的催乳素受體基因中的其它的多形質(zhì)，并用于一般的豬的基因型和類型的科學(xué)實驗。
本發(fā)明的遺傳標(biāo)記、方法和工具對在豬的品種、譜系和種群中改善一胎多仔數(shù)量的一個繁殖計劃也是有用的。母豬繁殖的連續(xù)選擇至少是雜合子最好是純合子，用于和增加一胎多仔數(shù)量相關(guān)的多形質(zhì)能導(dǎo)致品種或譜系的雌性的每個小仔有較高數(shù)量的后代。因此，標(biāo)記是選擇性工具。
盡管本發(fā)明是對一個特殊問題或環(huán)境的解釋，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠從中理解，本發(fā)明的產(chǎn)品和方法將在下面實施例中進行說明實施例1由于高的序列同源性和轉(zhuǎn)錄方法的相似性，人類的(Boutin等人，1989)和兔的(Edery等人，1989)催乳素受體的cDNA序列編碼被用來設(shè)計簡并引物重疊在3’編碼處和未翻譯區(qū)。在豬基因組DNA樣品和用人的作對照引物放大一個片段中約在第500堿基對。這種正向引物為5’-TCA CAA GGT CAA C/TAA AGA AG-3’(SEQ ID No:4)而反向引物為5’-TGG/A AGA AAG/A AGGCAA G/ATG GT-3’(SEQ ID No5)用在下列聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)條件為93℃,3分鐘；6個循環(huán)93℃,30秒；47℃,2分鐘；72℃,3分鐘，36個循環(huán)93℃,30秒；53℃,2分鐘，72℃,5分鐘，最后72℃,5分鐘。最后加入Taq聚合酶，樣品保持在80℃。
從兩種動物來的片段被純化，在正向和反向定向排序。來自編碼區(qū)的序列被翻譯成氨基酸，并和已知的序列比較。一個數(shù)據(jù)庫研究報導(dǎo)兔和人的催乳素受體(PRLR)序列作為兩個最好的吻合，分別為82％和74％為陽性。來自豬DNA序列，引物(正向物5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG-3’(SEQ ID No:1)和反向引物5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA-3’(SEQ ID No:2))被設(shè)計來放大一個457堿基對片段(圖1)。這種限制性內(nèi)切核酸酶為Taq1,Sau3a,Pvull,Mspl和Alul被用來消化放大的產(chǎn)品，通過Alul在基因的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)一種多形質(zhì)。用瓊脂糖凝膠電泳(圖2)得到帶狀分離。這種片段的類型，它的聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)約在片段的124,110,79,77和67堿基對，具有多形的位點位于110堿基對片段。當(dāng)這種多形的剪切位點出現(xiàn)在片段的90堿基對。見圖4用于片段產(chǎn)生的模式。一個PiGMaP參考家系(Archibald等人1995)用提供信息的所用的家系進行基因分型，用CriMap軟件對基因型用兩點連接來分析(Green等人1990)以優(yōu)勢對數(shù)(LOD)比數(shù)大于3為有意義。這種催乳素受體(PRLR)的基因座與3個標(biāo)記物緊密相連，它公開發(fā)表的PiGMaP連接圖譜中的豬染色體16上發(fā)現(xiàn)。也做了多點分析產(chǎn)生一個最好的染色體16基因圖譜(圖3)，包括所有的連接標(biāo)記。
實施例2用催乳素受體遺傳標(biāo)記的聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實驗聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)放大實驗優(yōu)選下列參數(shù)。
引物正向引物5’-CCCAAAACAGCAGGAGAACG-3’(SEQ IDNo:1)反向引物5’-GGCAAGTGGTTGAAAATGGA-3’(SEQ ID No:2)PCR條件混合物混合 25uL反應(yīng)物10×PCR緩沖液(Promega) 2.5uL25mM Mgcl2(Promega) 2.0uL10mM dNTP’s(Boehringer Mannheim)0.5uL20pmol/uL正向引物0.5uL20pmol/uL反向引物0.5uLdd無菌水 17.5uL12.5ng/uL DNA1.5uLTaq聚合酶(Promega) 0.125uL前面六種試劑混合為18.5uL，預(yù)混合加入每個試管。然后加入DNA，再重疊滴加滅菌的礦物油，試管放在循環(huán)儀的一端保持在80℃，將Tag與保留的混合液混合并加5uL到試管，使其確實埋在油的頂層之下。
熱循環(huán)儀計劃1．93℃3分鐘2．93℃30秒3．60℃1分鐘4．72℃1分鐘5．回到第2步驟，進行34個循環(huán)6．72℃3分鐘7．保持在4℃5uL的PCR產(chǎn)品加入2uL的6×加樣染料被放到一個1％瓊脂糖凝膠上進行檢測。在120V用溴化乙錠染色30分鐘。
用Alul消化消化混合液(每20uL PCR產(chǎn)品) 每uL10×NEBuffer2(新英國生物實驗室) 2.5uL8U/uL Alul(新英國生物實驗室)0.5uL加滅菌水2.0uL混合這些試劑并加5uL到每個試管，在37℃培養(yǎng)這種樣品一夜。
凝膠電泳由加樣分離片段，消化產(chǎn)品加5uL6×加樣染料于一個6％NuSieve(FMC)瓊脂糖凝膠上，在120V室溫下3小時。用具有溴化乙錠的凝膠染色。用PCR-RFLP實驗確定片段的類型約在124,110,79,77和67堿基對，用多形的位點位于片段的110堿基對。片段的多形剪切點存在一個90堿基對上產(chǎn)生。因此，一個雜合子能有帶狀存在于124,110,90,79,77和67位點上。而純合子的帶狀分別在124,90,79,77和67及124,110,79和67。
圖4是一個由PCR實驗得到的片段圖(A是沒有Alul位點的等位基因，B是有Alul位點的等位基因)。
實施例3基因型和一胎多仔數(shù)量有關(guān)聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實驗由豬改進公司(PIC)在幾個母豬中如實施例2詳細(xì)地進行。由PIC公司列出19只母豬用作實驗動物，它們是6個月期間內(nèi)的同一窩，小豬在這期間出生，它們保持作為繁殖的家系。采集血或組織樣品，并送到實驗室，提取樣品的DNA，用作催乳素受體(PRLR)和聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實驗。有1～3個雌性豬實驗記錄用于分析。用新生的小仔的總數(shù)來評價繁殖系數(shù)(BV TNB)，母豬的每次成功的產(chǎn)子數(shù)用一個混合的線狀的模型作為一個重復(fù)的記錄。只用前三窩的母豬。這種模型包括一窩內(nèi)嵌組的小仔的相關(guān)的壽命，窩數(shù)固定的作用，所用的類型(自然地或人為地)飼養(yǎng)小仔的月份，及隨機的永久的環(huán)境和動物影響。采用的電流h2為0.10并可重復(fù)為0.21。平均生產(chǎn)的小仔數(shù)(AV NB)用每個雌豬總的窩數(shù)(1-3)取算術(shù)均數(shù)來計算。用新生產(chǎn)的小仔總數(shù)來評價繁殖的系數(shù)(BV TNB)和平均生產(chǎn)小仔數(shù)(AV NB)做基因型的比較，將BV TNB和AV NB單個地平均用于每個基因型。結(jié)果見表1。
表1用催乳素受體(PRLR)基因型同一譜系的19個母豬的樣品的平均數(shù)BB基因型(n=18) BV TNBAV NB平均 0.203610.32Std Dev0.39841.746193Std Err0.09390.411838AB基因型(n=75) BV TNBAV NB平均AB 0.12039.66Std Dev AB 0.53172.77238Std Err AB 0.06220.320136AA基因型(n=109)BV TNBAV NB平均AA 0.07559.75Std Dev AA 0.57572.51 3279Std Err AA 0.05510.243064實施例4用一種大白系，一種Meishan合成系和Landrace系的豬做催乳素受體分析的概括來自1077只母豬的總的2714只記錄的小仔，包括一胎多仔數(shù)量分析。特征包括5種不同的來自PIC系的母豬新生的小仔總數(shù)(TNB)，新生的存活的仔數(shù)(NBA)。這5個測試系是大白種(兩個不同的起源)，Landrace起源種，以及合成系由3/4的Duroc種，1/4大白種組成，大白種/Meishan起源種。這種催乳素受體(PRLR)基因型顯示了這些實驗系中有3個系在一胎多仔變異上解釋為在統(tǒng)計學(xué)上有意義。有兩個系沒有顯示任何統(tǒng)計學(xué)上有意義的影響(P＞0.1，結(jié)果沒有顯示)。3個系有統(tǒng)計學(xué)意義的每個系的新生的小仔的總數(shù)(TNB)和新生的存活仔數(shù)(NBA)的最小適合的平均值總結(jié)在表2中。
由血液和尾組織提取DNA，如上述實施例2一樣分析DNA。
模型包括固定的作用如畜群活動期，使用的類型，催乳素受體，窩數(shù)(1,2,3+)，相關(guān)變異；雌激素(ESR)和隨機的影響種畜。
畜群之間的相互作用，雌激素受體(ESR)和催乳素受體(PRLR)用于實驗也有意義，用于小仔特征的遺傳率表面分別為0.10和可重復(fù)為0.21。等位基因的可替代的作用通過催乳素受體(PRLR)可替代的基因型來評價一個相關(guān)變異的雜合子，它包括一個等位基因存在的數(shù)(0,1或2)。由純合子平均基因型的平均值作為雜合子的偏差的意義來評價優(yōu)勢作用。
主要結(jié)論·大白種合成種·指出一個優(yōu)勢作用樣品用1197只記錄的小仔的400只母豬組成。AA動物在新生的存活仔數(shù)量(NBA)方面有一個0.66豬/小仔的優(yōu)點，超過其它兩個基因型(P＜0.05)。指出了B等位基因的優(yōu)勢作用。
·Meishan合成種·顯性作用有意義(超顯性)一超過所有的窩，但主要是第一窩。
樣品用832只記錄的小仔的261只母豬組成。有一個另外的顯性作用，其新生的總的小仔數(shù)TNB(P＜0.05)，新生的小仔存活數(shù)NBA(P＜0.05)，在此系中NBA有超顯性的作用(＜0.01)。
·Landrace合成種·指出一種附加作用樣品用685只記錄的小仔的416只母豬組成。已經(jīng)測定一個豬的每個小仔中兩個純合子基因型之間存在一個較大的不同，用兩者表示TNB(P＜0.08)和NBA(P＜0.1)，具有A等位基因是可用的。
在新生的小仔的總數(shù)(TNB)的作用和新生的小仔的存活數(shù)(NBA)在每個種群都顯示了相同的傾向。結(jié)果在表2中指出催乳素受體(PRLR)在3個商業(yè)系中對一胎多仔，如TNB和NBA測量的結(jié)果都產(chǎn)生一個有意義的作用。這表明每個不同的品系的遺傳背景在它的品種和數(shù)值大小中起著作用，這些就是特征的作用。另外，用此系的任何新生的后代出生重量的平均值在實驗中沒有發(fā)現(xiàn)有意義的變異，這是一個潛在的觀察價值，如在小仔數(shù)量和新生小仔的平均重量之間有一個正常的相反的關(guān)系。催乳素受體的等位基因可能因此而提供一個增加一胎較多仔的重量的方法。
表2用三種商業(yè)豬系在每種催乳素受體(PRLR)基因型的最小的適合的平均值用TNB,NBA和平均的出生重量(ABW)表示超過每一代的平均值。
<p>a=附加作用；d=優(yōu)勢作用；作用是有意義的在aP＜0.1,bP＜0.05,cP＜0.01實施例5不同品種之間的變異另外，樣品來自七種已分類的品種，包括美國品種ChesterWhite種；Duroc種Hampshire種；Landrace種；和Yorkshire種；中國的Meishan種和European Large White種(表3)表3<
一些品種在PRLR的基因頻率存在不同，一個多形質(zhì)存在位于基因的3’區(qū)是重要的，因為PRLR另一個剪接在這個基因區(qū)的另一地方發(fā)現(xiàn)，許多品種的等位基因的頻率不同，建議一個等位基因在一些種群的選擇可能和另一種的相反。
下面參考資料引入本發(fā)明作為參考。
Archibald,A.,Haley,C.,Brown,J.,Couperwhite,S.,McQueen,H.,Nicholson,D.,Coppieters,W.,Van de Weghe,A.,Stratil,A.,Wintero,A.,Fredholm,M.,Larsen,N.,Nielsen,V.,Milan,D.,Woloszyn,N.,Robic,A.,Dalens,M.,Riquet,J.,Gellin,J.,Caritez,J.C.,Burgaud,G.,Ollivier,L.,Bidanel,J.P.,Vaiman,M.,Renard,C.,Geldermann,H.,Davoli,R.,Ruyter,D.,Verstege,E.,Groenen,M.,Davies,W.,Hoyheim,B.,Keiserud,A.,Andersson,L.,Ellegren,H.,Johansson,M.,Marklund,L.,Miller,J.,Anderson Dear,D.,Signer,E.,Jeffreys,A.,Moran,C.,Le Tissier,P.,Muladno.,Rothschild,M.,Tuggle,C.,Vaske,D.,Helm,J.,Liu,H.C.,Rahman,A.,Yu,T.P.,Larson,R.G.,Schmitz,C.(1995年)豬的聯(lián)合連鎖圖(PiGMaP)(Sus scofa)哺乳動物基因組6,157-175.
Boutin,J.,Edery,M.,Shirota,M.,Jolicoeu r,C.,LeSueur,L.,Ali,S.,Gould,D.,Djiane,J.,Kelly,P.(1989)鑒別人的肝癌和乳腺癌細(xì)胞的催乳素受體的一個長的編碼形式的cDNA.Mol.Endocrinol.3,1455-1461.
Edery,M.,Jolicoeur,C.,Levi-Meyrueis,C.,Dusanter-Fourt,l.,Petridou,B.,Boutin,J.,LeSueur,L.,Kelly,P.,Djiane,J.(1989)來自兔的乳腺的互補DNA的分子編碼的催乳素受體一個第二形式的鑒別和序列分析，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,2112-2116.
Green,P.,Falls,K.,Crooks S.(1990)CRIMAP文件資料，2.4版本，華盛頓醫(yī)科大學(xué)，St.Louis.
Jammes,H.,Schirar,A.,Djiane,J.(1985)在妊娠的母豬和母羊中黃體的催乳素和促黃體素(LH)受體鑒別的模式，J.Reprod.Fertil.73,27-35.
Kelly,P.,Djiane,J.,Postel-Vinay,M.,Edery,M.(1991)，家族的催乳素/生長激素受體，內(nèi)分泌受體12.235-251.
Lebrun,J.,Ali,S.,Groffin,V.,Ullrich,A.,Kelly,P.(1995).一個催乳素受體的單磷酸殘基用基因轉(zhuǎn)錄的激活效應(yīng)。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,4031-4035.
LeSueur,L.,Edery,M.,Ali,S.,Paly,J..Kelly,P.(1991)在催乳素一誘導(dǎo)乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄上催乳素受體的長和短形式的比較。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,824-828.
Rothschild,M.,Jacobson,C.,Vaske,D.,Tuggle,C.,Wang,L.,Short,T.,Eckardt,G.,Sasaki,S.,Vincent,A.,McLaren,D.,Southwood,O.,van der Steen,H.,Mileham,A.,Plastow,G.(1996)雌激素受體基因座和主基因影響豬仔數(shù)量有關(guān)Proc.Natl.Acad.Sci.93,201-205.
Rui,H.,Djeu,J.,Evans,G.,Kelly,P.,Farrar,W.(1992)引發(fā)催乳素受體J.Biol.Chem.267,24076-24081.
Yuan,W.,Lucy,M.(1996)在豬的黃體細(xì)胞中生長激素，催乳素，胰島素-類似生長因子和促黃體素對孕酮分泌的影響J.Anim.Sci.74,866-872.
權(quán)利要求
1．一種篩選豬的方法，它用于測定那些更能生產(chǎn)一胎較多仔的豬，包括由豬得到基因物質(zhì)的樣品；在催乳素受體基因中存在一種多形質(zhì)的實驗；所述的樣品與增加一胎多仔數(shù)量有關(guān)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的實驗步驟可從一組中選擇，包括分析限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)，變性梯度凝膠電泳(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(TGGE)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的實驗步驟用于所述的多形質(zhì)的存在，包括步驟用限制酶消化所述的基因物質(zhì)，那樣至少在一個地方剪切豬的催乳素受體基因；分離來自所述的消化液得到的片段；測定所述的片段產(chǎn)生的限制模式；還包括用所述的限制酶得到的豬的催乳素受體基因的所述的模式具有一個第二限制模式，其特征在于所述的第二限制模式和增加小仔數(shù)量有關(guān)。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述的限制酶是Alul。
5．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述的分離是用凝膠電泳。
6．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述比較限制模式的步驟包括鑒定具體片段和比較片段的大小。
7．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，進一步的步驟包括用前述的消化步驟放大一定量或一部分豬的催乳素受體基因，因為那里含有所述的多形質(zhì)。
8．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述的多形質(zhì)是一個多形的Alul限止位點。
9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于所述的限止位點位于豬的催乳素受體基因的3’編碼位。
10．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述的放大包括的步驟選擇能夠放大含有一個多形的Alul位點的豬催乳素受體基因的一個區(qū)的正向和反向序列引物。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述的正向和反向引物的選擇是依賴于SEQ ID No:3。
12．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述的引物是SEQID No:4和SEQ ID No:5。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述的正向引物選自一組包括SEQ ID No:1和SEQ ID No:4，而所述的反向引物選自一組包括SEQ ID No:2和SEQ ID No:5。
14．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述的成組的引物包括SEQ ID No:1和SEQ ID No:2。
15．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述測定所述的片段的不同類型的步驟包括存在已知類型的一個對照DNA片段的凝膠電泳類型來分離所述的片段；用一個探針與所述的分離片段接觸使其和所述的片段雜交形成探針片段復(fù)合物；并用測定探針片段復(fù)合物的存在來測定分離片段的類型并用有關(guān)的所述的對照DNA片段來測定它們的相對位置。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于所述的限制酶是Alul，而所述的RFLP是從一組包括一個110堿基對片段和一個90堿基對片段提取的。
17．一種用于豬仔數(shù)量的鑒別基因標(biāo)記的方法包括步驟來自同一品種或雜交品種或類似的基因譜系的衍生物的雌雄豬繁殖；測定每個母豬產(chǎn)生的后代的數(shù)量；測定每個母豬的催乳素受體基因的多形質(zhì)；每個母豬具有的多形質(zhì)和產(chǎn)生的后代數(shù)量有關(guān)，因此可用于鑒別豬仔數(shù)量的一種多形質(zhì)。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，還包括通過所述標(biāo)記對預(yù)測能增加一胎多仔數(shù)的育種豬的選擇的步驟。
19．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，所述的分析包括用限制酶Alul消化PCR放大的DNA。
20．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于與增加一胎多仔相關(guān)的多形質(zhì)，用第一和第二引物SEQ ID No:1和2其中至少包括4個相接續(xù)的堿基對來測定。
21．用于評價豬的DNA樣品的一種試劑盒包括一種容器和一組試劑能鑒定豬的催乳素受體基因中的一種多形質(zhì)。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒，其特征在于所述的試劑是一種用具有豬催乳素受體基因或及其一個片段放大的引物。
23．根據(jù)權(quán)利要求24的試劑盒，進一步包括一種DNA聚合酶，一種在至少一個地方剪切豬的催乳素受體基因的限制酶；和能夠放大含有多形的位點的豬催乳素受體基因的一個區(qū)的第一和第二引物。
24．一種用于評價豬催乳素受體基因中存在多形的Alul位點的引物，其特征在于所述的引物包括選自一組的序列包括SEQ IDNo:1,SEQ ID No:2,SEQ ID No:4和SEQ ID No:5。
25．一種與增加豬的一胎多仔的數(shù)量有關(guān)的遺傳標(biāo)記，所述的標(biāo)記包括在豬催乳素受體基因中的一種多形質(zhì)。
26．根據(jù)權(quán)利要求25的遺傳標(biāo)記，其特征在于所述的多形質(zhì)是一個Alul限止位點。
27．根據(jù)權(quán)利要求25的標(biāo)記，其特征在于所述的多形質(zhì)是位于豬催乳素受體基因的翻譯的和未翻譯的3’區(qū)。
28．來自豬催乳素受體基因的3’翻譯的和未翻譯區(qū)的DNA序列，所述的序列包括SEQ ID No:3。
29．為放大豬催乳素受體基因的多形的Alul限止位點而設(shè)計的一種引物，所述的引物是4個或更多個來自SEQ ID No:3的連續(xù)的堿基。
30．用于放大豬催乳素受體基因的多形的Alul限止位點而設(shè)計的引物，其特征在于所述的引物是從SEQ ID No:3產(chǎn)生的一種反向引物。
31．一種篩選豬的方法，用于測定那些更能生產(chǎn)一胎較多仔的豬，和/或那些很少能生產(chǎn)一胎較多仔的豬，這種方法包括的步驟測定豬催乳素受體存在的等位基因；用已知的基因測定影響一胎多仔的其它標(biāo)記的等位基因；選擇能夠結(jié)合的等位基因的動物，淘汰那些不能結(jié)合的等位基因的動物。
32．根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其特征在于測定一胎多仔數(shù)量的第二基因是ESR。
33．根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其特征在于催乳素受體的等位基因的測定包括測定至少與一種DNA標(biāo)記無論是直接還是間接連鎖到催乳素受體有關(guān)的至少一種等位基因的存在。
34．根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其特征在于DNA標(biāo)記是一種微衛(wèi)星。
35．根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其特征在于DNA標(biāo)記是SW1305,S0077,S0006,SW2411,SW1035和S0111。
36．根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其特征在于DNA標(biāo)記是生長激素受體(GHR)。
37．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述的標(biāo)記與維持一胎較多仔的出生重量有關(guān)。
38．一種篩選豬的方法，用于測定那些更能生產(chǎn)一胎較多仔的豬，包括從豬得到基因物質(zhì)的樣品；在催乳素受體基因中一種多形質(zhì)存在的實驗，所述的樣品與維持一胎較多仔的豬出生重量有關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于豬的一胎多仔數(shù)量的基因標(biāo)記,鑒別這些標(biāo)記的方法,篩選豬的方法,測定那些更能生產(chǎn)一胎多仔的豬并取篩選的那些豬用于進一步繁殖目的。這種標(biāo)記依賴于豬催乳素受體基因編碼含有的特定多形質(zhì)的存在或缺失。
文檔編號C12Q1/68GK1230227SQ9719774
公開日1999年9月29日 申請日期1997年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月19日
發(fā)明者馬克思·F·羅切斯特, 埃米·L·文森特, 克里斯托弗·K·塔格爾 申請人:衣阿華大學(xué)研究基金會有限公司