專利名稱：作為3－羥基－3－甲基戊二?；鵆oA(HMG－CoA)還原酶抑制劑的橙皮苷和橙皮素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抑制哺乳動物的3-羥基-3-甲基戊二?；鵆oA(HMG-CoA)還原酶活性的藥物組合物，該組合物包括作為活性組分的有效量的橙皮苷或橙皮素以及藥物上可接受的載體，此外，還涉及包括有效量的橙皮苷或橙皮素的抑制HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物。
背景技術(shù)：
近年來，冠狀心循環(huán)疾病，如動脈粥樣硬化和血膽甾醇過多已上升成為死亡的主要原因。據(jù)報道，血漿中膽甾醇濃度的提高能引起脂肪、巨噬細胞和泡沫細胞沉積在血管上，這種沉積導致形成斑，繼而導致動脈粥樣硬化(Ross,R.,Nature,362,801-809(1993))。降低血漿中膽甾醇濃度的一種方法是營養(yǎng)療法，減少撮入膽甾醇和脂肪。另一種方法是降低肝臟中膽甾醇的生物合成速率。據(jù)報道，血膽甾醇過多可以通過抑制HMG-CoA還原酶(它是合成羥基戊酸的媒介，生物合成甾醇或類異戊二烯的是中間體)來降低膽甾醇生物合成速度有效地治療(Cardiovascular Pharmacology,William W.Parmley and Kanu ChatterjeeEd.,Wolfe Publishing,pages8.6-8.7,1994)。
因此，人們做了很多工作，主要是開發(fā)抑制HMG-CoA還原酶的藥物；其結(jié)果是可以從市場上買到由Penicillium sp.和Aspergillus sp.衍生的各種化合物。特別是由美國Merck Co.開發(fā)的Lovastatin和Simvastatin以及日本Sankyo Co.開發(fā)的Pravastatin已經(jīng)商業(yè)化(C.D.R.Dunn,Stroke:Trends,Treatment and Markets(中風趨勢、治療和市場)，SCRIPT Report,PJB Publications Ltd.,1995)。然而，藥物是非常昂貴的，長期服用會產(chǎn)生副作用，肝臟中肌酸激酶增加。所以，還需要開發(fā)一種便宜的無毒性HMG-CoA還原酶抑制劑。
橙皮苷和橙皮苷的糖苷配基、橙皮素是在檸檬、柚子、橘子和橙子(Citrus sinensis)中發(fā)現(xiàn)的類黃酮，它們具有如下結(jié)構(gòu)(Horowitz,Gentili,Tetrahedron.19.773(1943))
橙皮苷已用于防止和治療大腦貧血、視網(wǎng)膜出血和表紫斑(pelioma)，但是沒有報道過橙皮苷或橙皮素對HMG-CoA還原酶的抑制活性。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供一種抑制哺乳動物的HMG-CoA還原酶活性的藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種抑制哺乳動物的HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物。
在本發(fā)明的一方面，提供了一種抑制哺乳動物的3-羥基-3-甲基戊酰基CoA(HMG-CoA)還原酶活性的藥物組合物，它包括作為活性組分的有效量的橙皮苷或橙皮素，以及藥物上可接受的載體。發(fā)明詳細描述本發(fā)明提供一種抑制HMG-CoA還原酶活性的藥物組合物，包括作為活性組分的橙皮苷或橙皮素，以及藥物上可接受的賦形劑、載體和稀釋劑。
橙皮苷和橙皮素可以從柑桔屬的皮中提取，也可以按Zemplen,Bognar,Ber..75.1043(1943)和Seka,Prosche,Monatsh.,69,284(1936)上公開的方法合成。進一步說，橙皮素可以通過橙皮苷水解來制備。
橙皮苷或橙皮素在0.5mg/Kg體重/天或更高的劑量下對HMG-CoA還原酶具有抑制作用，隨用量的增加抑制作用也升高。
此外，不管它們的潛在功效，在使用小鼠進行的試驗中，橙皮苷和橙皮素表現(xiàn)出低的毒性或促有絲分裂性(mitogenicity)。具體地說，當小鼠口服1,000mg橙皮苷/Kg體重的劑量時，未表現(xiàn)出毒性，這一量相當于體重為50Kg的人口服50-100g橙皮苷/Kg體重。進一步說，橙皮苷和橙皮素對肝臟功能沒有副作用。
藥物制劑可以按任何常規(guī)方法通過組合物來制備。在制劑的制備過程中，活性組分優(yōu)選與載體混合或用載體稀釋，或包封在載體中，載體可以是膠囊、球囊(sachet)或其它容器的形式。當載體作為稀釋劑時，可以是固體、半固體或液體材料，起活性組分載體(vehicle)、賦形劑或介質(zhì)的作用。所以，制劑可以是藥片、藥丸、粉劑、球囊、酏劑、分散液、乳化液、溶液、糖漿、氣溶膠、軟或硬凝膠膠囊、無菌注射液、無菌包裝粉末等。
合適的載體、賦形劑和稀釋劑的例子乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、凝膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酯鎂和礦物油。此外，制劑中可以包括填料、抗絮凝劑、潤滑劑、增濕劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。本發(fā)明的組合物可以通過任何本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制成在哺乳動物施服用后提供快速、持久或緩釋活性組分的形式。
本發(fā)明的藥物制劑可以通過種種方式施用，包括口服、經(jīng)皮、皮下、靜脈和肌內(nèi)引入。對于人，橙皮苷或橙皮素的日服用量典型地為0.5-300mg/Kg體重/天，優(yōu)選5-30mg/Kg體重/天，可以一次服用，也可以分幾次服用。然而，應(yīng)當理解，活性組分的實際服用量應(yīng)根據(jù)不同因素確定，包括要治療的情況、所選擇的給藥途徑、各個病人年齡、性別、體重，以及病人癥狀的嚴重程度；因此，上述劑量的不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明。
此外，橙皮苷和橙皮素可以引入到食品或飲料中以抑制HMG-CoA還原酶的活性。因此，本發(fā)明還提供了一種抑制HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物，包括有效量的橙皮苷或橙皮素。
正如上面所述，橙皮苷或橙皮素可以作為有效的、無毒藥劑使用，以抑制HMG-CoA還原酶的活性。
以下實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不是限定本發(fā)明的范圍。
另外，除特別聲明外，在下面給出的百分數(shù)，對于固體混合物中的固體、液體中的液體、液體中的固體分別是以重量/重量，體積/體積，重量/體積為基礎(chǔ)的，所有反應(yīng)都在室溫下進行。實施例1給動物施用橙皮苷和橙皮素體重為約90-110克的24只四周齡的Sprague-Dawley鼠(Taihanlaboratory animal center,Korea)平均隨機分成三個食療組。三組小鼠喂給不同的高膽甾醇食物，即AIN-76實驗動物食物(ICN Biochemicals,Cleveland,OH,USA)，分別含有1％膽甾醇(對照組)，1％膽甾醇和0.1％橙皮苷(橙皮苷組)，1％膽甾醇和0.1％橙皮素(橙皮素組)。喂給三組小鼠的食物的組成列于表Ⅰ。
表Ⅰ<
>*1從TEKLAD Premier Co.(Madison,WI,USA)購得*2從Sigma Chemical Company(St.Louis,Mo,USA)購得鼠按特定食物和水自由進食六周，每天記錄撮取食量，每七天稱重，然后記錄分析。所有老鼠都表現(xiàn)出正常的生長速度，從食物撮取量和體重的增長上三個組中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異。實施例2確定血漿內(nèi)的總膽甾醇、HDL-膽甾醇和中性脂的含量給鼠施用橙皮苷或橙皮素對血漿中膽甾醇和中性脂含量的效果按以下方法確定。
從三個食療組的鼠采取血樣，使用含有硫酸葡萄糖酯的HDL-膽甾醇試劑(Sigma Chemical Co.,Cat.No.352-3)分離血漿HDL組分?？偰戠薮己虷DL-膽甾醇濃度用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.352-100(SigmaChemical Co.,USA)(Allain等，Clin.Chem.,20,470-475(1974))確定。中性脂的濃度用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.339-50(Bucolo,G.and David,H.,Clin.Chem.,19,476-482(1973))確定。結(jié)果列于表Ⅱ，與對照組比較，喂給橙皮苷的一組鼠中總血漿膽甾醇濃度降低了11％，在喂給橙皮素的一組鼠中降低了15％。
表Ⅱ
*總-C總膽甾醇*HDL-C:HDL-膽甾醇*TG甘油三脂實施例3橙皮苷和橙皮素在HMG-CoA還原酶抑制中的活性(步驟1)制備微粒體為了確定喂給鼠的橙皮苷和橙皮素對HMG-CoA還原酶-肝臟中合成膽甾醇的調(diào)節(jié)酶-的活性影響，從肝臟組織中分離微粒體作為酶源。
首先，用斷頭法殺死三組老鼠，切下肝臟，立即放入冰-冷的均化介質(zhì)中(50mM K2PO4(pH7.0),0.2M蔗糖，2mM二硫蘇糖醇(DTT))。在均化介質(zhì)(2ml介質(zhì)/g肝臟)中，用Waring攪拌器攪拌15秒鐘將肝臟均化(在Potter-Elvehjem型玻璃均化器中用馬達驅(qū)動的四氟乙烯杵沖擊三次)。均漿在15,000xg下離心10分鐘，獲得的上清液在100,000xg下離心75分鐘，獲得微粒體粒狀沉淀，然后再分散到含有50mM EDTA的均化介質(zhì)中，并在100,000xg下離心60分鐘。含有微粒體的上清液作為酶源。(步驟2)HMG-CoA還原酶測定按照Shapiro等人的方法用[14C]HMG-CoA確定HMG-CoA還原酶的活性(Biochemica et Biophysica Acta,370,369-377(1974))如下。
在步驟1中獲得的含有微粒體的上清液中酶在37℃下活化30分鐘。向反應(yīng)管中加入20μl的HMG-CoA還原酶測定緩沖液(0.25M K2PO4(pH7.0),8.75mM EDTA,25mM DTT,0.45M KCl和0.25mg/ml BSA),5μl的50mM NADPH,5μl的[14C]HMG-CoA(0.05μCi/管，最終濃度為120μM)，以及10μl的活化微粒體酶(0.03-0.04mg)，混合物在37℃下培養(yǎng)30分鐘。通過向該混合物中加入10μl的6M HCl，反應(yīng)被終止，混合物在37℃培養(yǎng)15分鐘，使產(chǎn)物(甲羥戊酸)完全內(nèi)酯化。在10,000xg下離心1分鐘除去沉淀，上清液涂布到硅膠60G TLC板上(Altech,Inc.,Newark,USA)，然后，用苯∶丙酮展開(1∶1,v/v)。用一次性蓋板刮掉Rf值為0.65-0.75的區(qū)域，并用1450Microbeta液體閃爍計數(shù)器(Wallacoy,Finland)測定其放射性。以每分鐘內(nèi)每mg蛋白質(zhì)合成3,5-二羥基-3-甲基戊酸的皮摩爾數(shù)(pmol/min/mg蛋白質(zhì))計算酶的活性。所得結(jié)果列于表Ⅲ。
表Ⅲ
從表Ⅲ可以看出，對照組的鼠具有相對高的HMG-CoA還原酶的活性，而喂給橙皮苷組和橙皮素組的鼠中觀察到的HMG-CoA還原酶的活性分別比對照組低24％和19％。實施例4口服橙皮苷的毒性7-8周齡的無特定病原體的ICR雌性小鼠(8只)，每只體重約25-29g，以及雄性小鼠(8只)，每只體重約34-38g，在22±1℃的溫度、55±5％的濕度和12L/12D光周期下飼養(yǎng)，飼料(Cheiljedang Co.小鼠及大鼠飼料)和水經(jīng)滅菌后喂給小鼠。
橙皮苷溶解在0.5％的吐溫80中，其濃度為100mg/ml，小鼠口服該溶液，其量為0.2ml/20g小鼠體重。服用溶液后，對老鼠進行為期10天的觀察，觀察其副作用或死亡服用后1、4、8、12小時觀察一次，以后是每隔12小時觀察一次。每天記錄小鼠的體重變化以考察橙皮苷的作用。在第10天，殺掉小鼠以肉眼觀察其內(nèi)臟。
在第10天，所有的小鼠都存活，表明劑量為1,000mg/kg的橙皮苷對小鼠沒有毒性。尸檢表明，在10天的試驗中，小鼠沒有任何病理異常，體重也沒有減少。因此，可以推斷，口服橙皮苷對人體沒有毒性。
以下配方實施例僅用于說明本發(fā)明，而不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。配方實施例按以下配方制備硬凝膠膠囊量(mg/膠囊)活性組分(橙皮苷)20淀粉，干160硬脂酸鎂20總量200mg本發(fā)明已根據(jù)具體實施方案進行了描述，應(yīng)當認識到，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以作出各種改進和變化，但都在本發(fā)明的權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種抑制哺乳動物的3-羥基-3-甲基戊二?；鵆oA(HMG-CoA)還原酶活性的藥物組合物，包括有效量的作為活性組分的橙皮苷或橙皮素和藥物學上可接受的載體。
2．如權(quán)利要求1的組合物，其中，該哺乳動物是人類。
3．如權(quán)利要求2的藥物組合物，其中，所述的有效量的橙皮苷為0.5-300mg/kg體重/天。
4．如權(quán)利要求2的藥物組合物，其中，所述的有效量的橙皮素為0.5-300mg/kg體重/天。
5．一種抑制哺乳動物的3-羥基-3-甲基戊二?；鵆oA(HMG-CoA)還原酶活性的食品組合物，包括有效量的橙皮苷或橙皮素。
6．一種抑制哺乳動物的3-羥基-3-甲基戊二?；鵆oA(HMG-CoA)還原酶活性的飲料組合物，包括有效量的橙皮苷或橙皮素。
全文摘要
一種抑制哺乳動物的3－羥基－3－甲基戊二?；鵆oA(HMG－CoA)還原酶活性的藥物組合物,包括有效量的作為活性組分的橙皮苷或橙皮素和藥物學上可接受的載體,以及抑制哺乳動物的3－羥基－3－甲基戊二?；鵆oA(HMG－CoA)還原酶活性的食品或飲料組合物,包括有效量的橙皮苷或橙皮素。
文檔編號A23L1/222GK1233175SQ97198803
公開日1999年10月27日 申請日期1997年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月14日
發(fā)明者卜成海, 孫光熙, 鄭泰淑, 權(quán)柄穆, 金永國, 崔度一, 金成郁, 裴基煥, 樸鏞福, 崔明淑, 黃仁奎, 文錫植, 權(quán)容國, 安貞娥, 李恩淑 申請人:韓國科學技術(shù)研究院