專利名稱：疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及保護治療性疫苗，包括單純皰疹病毒疫苗，涉及預防單純皰疹病毒感染并治療受單純皰疹病毒感染的個體的方法，以及涉及制備單純皰疹病毒的預防性和治療性疫苗的組合物和制備方法。
背景技術：
單純皰疹病毒(HSV)包括單純皰疹病毒1型(HSV1)和單純皰疹病毒2型(HSV2)，它們嚴重影響了受病毒感染和未受感染人的健康。人們已經(jīng)作了大量努力來確定有效的治療組合物和緩解癥狀、減少或消除潛伏病毒由于生殖或口腔組織潰瘍而激活并顯示在存在的方法。另外，預防未感染個體受感染的疫苗也正在開發(fā)中。一類正在開發(fā)的疫苗是含有純化的糖蛋白D(gD)的亞單位疫苗。gD蛋白可從HSV-1(gD-1)或HSV-2(gD-2)衍生獲得。
盡管這些治療性組合物和疫苗可以提供一些好處，但是，仍然需要有效的組合物以及免疫接種個體的方法以預防HSV感染和治療受HSV感染個體。還需要這類預防性和治療性疫苗的組合物及其制備方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包括HSV2 gD2在內的分離的單純皰疹病毒，以及該基因的修飾形式。HSV2 gD2的修飾形式包括缺少功能性跨膜區(qū)和/或功能性信號肽的那些形式。
本發(fā)明涉及包含編碼HSV2 gD2或其修飾形式的核苷酸序列的質粒，該核苷酸序列與在真核細胞表達所需的調控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及一種誘導個體內HSV2 gD2免疫應答的方法，該方法包括向個體給予一種質粒的步驟，該質粒包含編碼HSV2 gD2或其修飾形式的核苷酸序列，該核苷酸序列與在真核細胞表達所需的調控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及一種治療受HSV感染個體的方法，該方法包括向個體給予一種質粒的步驟，該質粒包含編碼HSV2 gD2或其修飾形式的核苷酸序列，該核苷酸序列與在真核細胞表達所需的調控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及一種預防個體受HSV感染的方法，該方法包括使用編碼HSV2gD2或其修飾形式的核苷酸序列，該核苷酸序列與在真核細胞表達所需的調控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及一種DNA疫苗，該疫苗包括編碼HSV2 gD2或其修飾形式的核苷酸序列，該核苷酸序列與在真核細胞中表達所需的調控元件操作性相連。在一些實例中，疫苗包含包的質粒含有括編碼HSV2 gD2或其修飾形式的核苷酸序列。在一些實例中，疫苗是易化(facilitatde)的DNA疫苗，它還包含多核苷酸功能增強子或其它易化組分。
附圖簡述

圖1A-1D表示gD構建物。
圖2表示Genbank中的HSV gD的序列。
圖3A-3E表示各種插入物和HSV gD2編碼序列中有gD2缺失的質粒。
圖4A-4E表示免疫接種小鼠中的體液應答。用指明的gD2表達載體免疫接種的小鼠79天時以標準ELISA測定抗gD2特異性血清抗體。血清樣品作1∶100稀釋。
圖5顯示抗體的同型。用標準ELISA測定79天時的IgG1和IgG2A gD2特異性抗體的相對水平。
圖6A-6E顯示了免疫接種后小鼠脾細胞的淋巴增殖反應。將40μgDNA免疫接種的小鼠的105全脾細胞與每孔20ng gD2一起培養(yǎng)。培育4天后，加1μCi-3H胸苷培育細胞18小時。然后測定3H胸苷攝取來衡量淋巴增殖情況。
圖7顯示了本發(fā)明的構建物。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及改進的DNA疫苗和疫苗方案，以及疫苗組合物及其制備方法。本發(fā)明涉及改進的抗HSV的DNA疫苗和疫苗方案，以及疫苗組合物及其制備方法。本發(fā)明提供了可摻入疫苗的HSV2 gD2 cDNA。另外，本發(fā)明提供了可摻入疫苗的修飾的HSV2 gD2的編碼序列。在一些實例中，修飾的HSV gD2缺乏功能性信號肽。在一些實例中，修飾的HSVgD2缺少功能性跨膜區(qū)(TMR)。在一些實例中，經(jīng)修飾的HSV gD2缺乏功能性信號肽和功能性跨膜區(qū)。
野生型或全長構建物含有將gD多肽指向使其糖基化的胞質內質網(wǎng)的信號肽。它通過分泌途徑移動到細胞表面，并憑借跨膜區(qū)(TMR)(靠近C端的疏水區(qū))與表面膜保持相聯(lián)。
構建TMR缺失的gD的目的是使其從細胞中分泌出來，被抗原呈遞細胞獲得，并增強對gD的體液應答。還可增強細胞應答。我們已經(jīng)證實，轉染了該構建物的細胞可將其分泌到培養(yǎng)基中，且沒有檢測到gD與細胞膜相聯(lián)。
構建信號肽缺失的gD，可使其局限于細胞質中并可能發(fā)生錯折疊。這就使得更多的gD被運送到蛋白酶體，從而使更多的gD衍生肽能與MHCI類分子復合。這加強了對gD的細胞應答。有兩種信號肽缺失型構建物。一種有TMR而另一種則沒有。預計兩種蛋白均局限于細胞質中，但是由于它們的疏水性不同，它們在細胞質中的分布可能不同。
我們已經(jīng)證實，轉染了這些構建物的細胞所表達的gD局限于細胞質中。沒有檢測到gD與細胞膜相聯(lián)，且在轉染細胞的培養(yǎng)基中也沒有檢測到gD。根據(jù)表達的gD的分子量來看，它顯示出未經(jīng)糖基化。
圖1A顯示了HSV gD2蛋白。在一些實例中，疫苗中包括了受調控序列控制的編碼該蛋白的核苷酸序列。在一些較佳的實例中，疫苗是DNA疫苗。
圖1B顯示了有TMR缺失的HSV2 gD2蛋白。在一些實例中，整個TMR是缺失的。在一些實例中，TMR功能由于大部分TMR編碼序列缺失而受到抑制。在一些實例中，疫苗中包括了受調控序列控制的編碼該蛋白的核苷酸序列。在一些較佳的實例中，疫苗是DNA疫苗。
圖1C顯示了信號肽缺失的HSV2 gD2蛋白。在一些實例中，整個信號肽是缺失的。在一些實例中，信號肽功能由于大部分信號肽編碼序列缺失而受到抑制。在一些實例中，疫苗中包括了受調控序列控制的編碼該蛋白的核苷酸序列。在一些較佳的實例中，疫苗是DNA疫苗。
圖1D顯示了TMR缺失和信號肽缺失的HSV gD2蛋白。在一些實例中，整個TMR是缺失的。在一些實例中，TMR功能由于大部分TMR編碼序列缺失而受到抑制。在一些實例中，整個信號肽是缺失的。在一些實例中，信號肽功能由于大部分信號肽編碼序列缺失而受到抑制。在一些實例中，疫苗中包括了受調控序列控制的編碼該蛋白的核苷酸序列。在一些較佳的實例中，疫苗是DNA疫苗。
圖4A-4E、5和6A-6E的數(shù)據(jù)表明，通過除去HSV gD蛋白的TMR，可以使IgG抗體同型從IgG2a變?yōu)镮gG1。認為這一變化是表示從主要是TH1應答變?yōu)橹饕荰H2應答，或從細胞應答變?yōu)榭贵w應答的代表性標記。因此，預計細胞釋放的細胞因子也將不同。
通過正常固定在膜上的蛋白(如其它皰疹病毒HSV1、HSV2、EBV、CMV、HZV的包膜蛋白)的TMR或膜結合區(qū)編碼序列的缺失或突變，可獲得類似效果。該病毒清單只是部分病毒的清單，本領域普通技術人員很容易選擇其它病毒來實施本發(fā)明。另外，可采用的其它蛋白包括細胞包膜相聯(lián)蛋白。同樣，通過TMR或其它膜保留信號的除去或缺失，可使進入分泌途徑但含有其它膜保留信號(如其它病毒的內質保留信號)的蛋白以及與細胞包膜相聯(lián)的宿主細胞蛋白分泌。此外，通過加入信號肽和除去膜或細胞區(qū)室定位信號，可將細胞或病毒編碼的非細胞包膜相聯(lián)蛋白設計成可分泌性蛋白。
要實現(xiàn)向主要是TH2應答轉變的分泌(指膜相聯(lián)蛋白的分泌)，需要對構建物作下列改變1)除去或突變TMR或膜結合區(qū)；2)加入信號或前導序列；3)共同表達蛋白酶，此酶可在加入的位點處斷裂膜結合區(qū)；4)加入可自身斷裂的intein編碼序列。intein編碼序列插入基因中的方式應導致斷裂，而此斷裂能將TMR與其余基因分開。這樣，就可以維持含有免疫表位的TMR蛋白表達，并且使TMR不具有將蛋白固定在細胞包膜上的功能。
如果希望將蛋白保留在細胞內，則可除去信號或前導序列，或者，如果希望使其特異性靶向ER(內質網(wǎng))，則可以加入ER保留信號和分泌性肽的序列。
從主要為Th1型變?yōu)橹饕獮門h2型的免疫應答的能力使我們可以設計出改進的疫苗方案。在一些實例中，可將初次和可能的第一次加強接種設計成產(chǎn)生Th1應答。第一次加強或隨后的加強接種則可設計成促進Th2應答，從而賦予疫苗接受者改進的保護力。
在一些較佳的實例中，圖1A-1D中描述的構建物被摻入DNA疫苗中。DNA疫苗在美國專利No.5,589,466和美國專利No.5,593,971、PCT/US90/01515、PCT/US93/02338、PVT/US93/048131、PCT/US93/00899及其中引用的在先申請、美國申請?zhí)?8/642,045(1996年5月6日提交)中有所描述，這些文獻均納入本文作參考。除了上述申請中描述的遞送方案外，美國專利No.4,945,050和5,036,006中還描述了另一種遞送DNA的方法，這兩篇文獻也納入本文作參考。
采用DNA疫苗技術，將包括了如圖1A-1D所述的與基因表達所需調控元件操作性相連的編碼序列的質粒DNA給予個體，個體細胞攝取了質粒DNA并表達編碼序列。如此產(chǎn)生的抗原成為免疫應答針對的靶。針對抗原的免疫應答為個體抵御HSV提供了預防或治療效果。
DNA疫苗包括裸疫苗和易化疫苗。另外，它們還可通過各種方法(包括幾種用來給予組織制劑的不同裝置)來給藥。已出版的文獻中有幾篇綜述文章，它們描述了DNA疫苗技術，并引述了采用該技術獲得的許多報道的結果。下列綜述文章以及每篇中引用的每篇討論DNA疫苗技術的參考文獻均納入本文作參考McDonnel W.M.和F.K.Askari 1996 New Engl.J.Med.334(1)42-45；Robinson，A.1995 Can.Med.Assoc.J.152(10)1629-1632；Fynan，E.F.等，1995 Int.J.Immunopharmac.17(2)79-83；Pardoll，D.M.和A.M.Beckerleg 1995 Immunity3165-169；和Spooner等，1995 Gene Therapy 2173-180。
根據(jù)本發(fā)明，將圖1A-1D中描述的插入物的編碼序列插入質粒中，然后將該質粒用于疫苗組合物中。
本文所用的術語“插入物”指編碼圖1A-1D所述gD2蛋白的核苷酸序列，它包括編碼具有無功能性TMR和/或無功能性信號肽的gD2蛋白的核苷酸序列。
本文所用的術語“基因構建物”指包含了插入物的質粒，該插入物與它在真核細胞中表達所需的調控元件操作性相連。DNA表達的調控元件包括啟動子和聚腺苷酸化信號。另外，基因構建物中還可包括其它元件，如Kozak區(qū)。起動和終止信號是所需的調控元件，它們通常被認為是編碼序列的一部分。本發(fā)明的基因構建物的編碼序列包括功能性起動和終止信號。
本發(fā)明涉及將基因物質導入個體細胞中以誘導抗HSV免疫應答的方法。該方法包括向所述個體的組織給予DNA的步驟，該DNA包括如圖1A-1D所示的插入物的編碼序列，該編碼序列與表達所需的調控元件操作性相連。
本發(fā)明提供了用作DNA疫苗的基因構建物，該構建物包括如圖1A-1D所示的那些插入物的編碼序列。
在一些實例中，用Watson等1983 Gene 26307-312(納入本文作參考)中報道的cDNA來構建插入物。序列公開在Genbank登錄號K01408中，其納入本文作參考，并顯示在圖2中。Watson克隆的編碼序列是268-1449。編碼信號肽的序列包括268-342。TMR由1249-1446編碼。
在一些實例中，插入物包括整個編碼序列。在一些實例中，插入物由整個編碼序列組成。
在一些實例中，插入物包括整個編碼序列，只是有一個讀框移位、缺失或插入使得信號肽不可操縱，而對蛋白的其余部分卻沒有影響。在一些實例中，編碼信號肽的序列缺失，且插入物包含其余的編碼序列。在一些實例中，插入物并沒有包括編碼信號肽的全部序列，例如只包括核苷酸287-1449、297-1449、307-1449、317-1449、327-1449和337-1449的插入物。
在一些實例中，插入物包括整個編碼序列，只是有一個讀框移位、缺失或插入使得TMR不可操縱，而對蛋白的其余部分卻沒有影響。在一些實例中，編碼TMR的序列缺失，且插入物包含其余的編碼序列。在一些實例中，插入物不包括編碼TMR的全部序列，例如只包括核苷酸268-1426、268-1406、268-1386、268-1366、268-1346、268-1326、268-1306、268-1286、268-1266和268-1246的插入物。
在一些實例中，插入物包括整個編碼序列，只是有一個讀框移位、缺失或插入使得信號肽不可操縱，一個讀框移位、缺失或插入使得TMR不可操縱，而對蛋白的其余部分卻沒有影響。在一些實例中，編碼信號肽的序列缺失，且插入物包含具有缺失或不可操縱TMR的其余編碼序列。在一些實例中，編碼TMR的序列缺失，且插入物包含具有缺失或不可操縱信號肽的其余編碼序列。在一些例子中，編碼信號肽和TMR的序列缺失。在一些實例中，插入物由核苷酸278-1426、288-1386、298-1306、298-1346、318-1266、328-1246和342-1248組成。
在一些實例中，插入物被插入PCT/US94/00899(1994年1月26日提交，1994年8月4日公開，WO94/16737，該文內容納入本文作參考)中所述的質粒中。在一些實例中，插入物被插入美國專利申請?zhí)?8/642,045(1996年5月6日提交，該文內容納入本文作參考)中所述的質粒中。
根據(jù)本發(fā)明，提供了對個體進行預防性和/或治療性免疫接種以抵御HSV(包括HSV1和HSV2，尤其是HSV2)的組合物和方法?；蛭镔|(即插入物)編碼了靶蛋白(即gD2)，帶有或不帶有功能性信號肽和/或TMR。此基因物質由個體細胞表達，其作用是引發(fā)免疫應答的免疫原性靶。
本發(fā)明可用來引發(fā)針對HSV2 gD2蛋白的免疫應答。引發(fā)的免疫應答可與HSV1 gD1蛋白交叉反應。本發(fā)明可用來對個體免疫接種以抵御HSV(尤其是HSV2)，這樣，針對HSV2 gD2的免疫應答就提供了抗HSV的保護性免疫力。通過引發(fā)指向表達病毒蛋白的受感染細胞的抗HSV gD2免疫應答，本發(fā)明可用來與受感染個體內的HSV作斗爭。
根據(jù)本發(fā)明，編碼未經(jīng)修飾或經(jīng)修飾的HSV2 gD2蛋白的DNA與調控元件操作性相連。DNA表達的調控元件包括啟動子和聚腺苷酸化信號。另外，基因構建物中還可包括其它元件，如Kozak區(qū)。
本文所用的術語“可表達形式”指基因構建物含有與插入物操作性相連的必需的調控元件，這樣當構建物存在個體細胞內時，插入物可被表達。
當基因構建物被細胞攝取后，可以作為功能性染色體外分子存在于細胞內和/或整合入細胞染色體DNA中。DNA可以導入細胞內，在細胞內DNA以質粒形式的分開的遺傳物質，或作為質粒而存留。或者，可將須整合入染色體的線性DNA導入細胞內。當將DNA導入細胞內后，可以加入促進DNA整合入染色體的試劑。DNA分子中還可包括用來促進整合的DNA序列?；蛘?，可給予細胞RNA。也可考慮提供線性微型染色體形式的基因構建物，該微型染色體包括著絲粒、端粒和復制起始點?；驑嫿ㄎ锟杀Ａ魷p毒活微生物或存活于細胞中的重組微生物載體的部分遺傳物質。當此遺傳物質整合入細胞染色體中或保留在染色體外時，基因構建物可以是重組病毒疫苗基因組的一部分。
基因構建物包括核酸分子基因表達所需的調控元件。該元件包括一個啟動子、一個起始密碼子、一個終止密碼子和一個聚腺苷酸化信號。另外，編碼免疫原性靶蛋白的序列的基因表達通常需要增強子。這些元件必須與編碼所需蛋白的序列操作性相連，且這些調控元件必須在所給予的個體中可操縱。
起始密碼子和終止密碼子通常被認為是編碼免疫原性靶蛋白的核苷酸序列的一部分。然而，這些元件必須在給予基因構建物的個體內具有功能。起始密碼子和終止密碼子必須位于編碼序列的讀框內。
采用的啟動子和聚腺苷酸化信號必須在個體細胞內具有功能。
用于實施本發(fā)明、尤其是人用基因疫苗生產(chǎn)中的啟動子例子包括(但不局限于)來自猴病毒40(SV40)、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)(如HIV長末端重復序列(LTR)啟動子)、Moloney病毒、ALV、巨細胞病毒(CMV)(如CMV立即早期啟動子)、EB病毒(EBV)、Rous肉瘤病毒(RSV)的啟動子，以及來自人基因(如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸和人金屬硫蛋白)的啟動子。
用于實施本發(fā)明、尤其是人用基因疫苗生產(chǎn)中的聚腺苷酸化信號例子包括(但不局限于)SV40聚腺苷酸化信號和LTR聚腺苷酸化信號。特別是，采用了在pCEP4質粒(Invitrogen，San Diego CA)中的SV40聚腺苷酸化信號(稱為SV40聚腺苷酸化信號)。
除了DNA表達所需的調控元件外，DNA分子還可包括其它元件。這類附加的元件包括增強子。增強子可以選自(但不局限于)人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸的增強子和病毒的增強子，如CMV、RSV和EBV的那些增強子。
可向基因構建物提供哺乳動物復制起始點，以使構建物保持在染色體外，并在細胞內產(chǎn)生多拷貝構建物。來自Invitrogen(San Diego，CA)的質粒pCEP4和pREP4含有EB病毒的復制起始點和產(chǎn)生高拷貝游離型復制而非整合的核抗原EBNA-1編碼區(qū)。
如果出于任何原因，希望消除接受基因構建物的細胞，則可加入附加的元件作為細胞破壞的靶?；驑嫿ㄎ镏锌砂杀磉_形式的皰疹胸苷激酶(tK)基因?？蓪⑺幬?-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤給予個體，該藥物將導致選擇性地殺死產(chǎn)生tK的任何細胞，從而提供了選擇性破壞具有基因構建物的細胞的方法。
為了使蛋白生產(chǎn)最大化，可以選擇最適合于在給予構建物的細胞中表達基因的調控序列。而且，可以選擇在細胞內最有效轉錄的密碼子。本領域普通技術人員可產(chǎn)生在細胞內有功能的DNA構建物。
本發(fā)明的方法包括將核酸分子給予個體組織的步驟。在一些較佳的實例中，核酸分子是經(jīng)肌內、鼻內、腹膜內、皮下、真皮內、或局部、或通過灌洗來給予鞘、直腸、尿道、頰和舌下的粘膜組織。
在一些實例中，將核酸分子與易化劑給藥結合遞送給細胞。易化劑也指多核苷酸功能增強子或基因疫苗易化劑。易化劑在美國專利申請08/008,342(1993年1月26日提交)、美國專利申請08/029,336(1993年3月11日提交)、美國專利申請08/125,012(1993年9月21日提交)、國際專利申請No.PCT/US95/00899(1994年1月26日提交)中有所描述，這些內容均納入本文作參考。此外，PCT專利申請No.PCT/US95/04071(1995年3月30日提交)中也描述了易化劑，該文內容納入本文作參考。與核酸分子結合給藥的易化劑可以與核酸分子的混合物形式給藥，或者單獨地在給予核酸分子前后或同時給藥。另外，能起轉染劑和/或復制劑和/或炎性劑作用的、且可以與或不與易化劑共同給藥的其它試劑包括生長因子、細胞因子和淋巴因子，如干擾素、γ干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、GC-SF、GM-CSF、TNF、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和B7.2以及成纖維細胞生長因子、表面活性劑如免疫刺激復合物(ISCOMS)、Freund不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰脂質A(MPL))、胞壁酰肽、醌類似物和泡囊(如鯊烯)，另外，透明質酸也可與基因構建物結合給藥。
在一些較佳的實例中，本發(fā)明的基因構建物與選自苯甲酸酯、酰苯胺、脒、氨基甲酸乙酯及其鹽酸鹽(如局部麻醉劑家族的那些試劑)的易化劑結合給藥。
在一些較佳的實例中，易化劑可以是有下式之一的化合物Ar-R1-O-R2-R3或Ar-N-R1-R2R3或R4-N-R5-R6或
R4-O-R1-N-R7，其中Ar是苯、對氨基苯、間氨基苯、鄰氨基苯、取代的苯、取代的對氨基苯、取代的間氨基苯、取代的鄰氨基苯、其中氨基苯化合物中的氨基是氨基、C1-C5烷基胺、C1-C5，C1-C5二烷基胺，取代的化合物中的取代基是鹵素、C1-C5烷基和C1-C5烷氧基；R1是C＝O；R2是C1-C10烷基，包括支鏈烷基；R3是氫、胺、C1-C5烷基胺、C1-C5，C1-C5二烷基胺；R2+R3可以形成環(huán)烷基，C1-C10烷基取代的環(huán)烷基、環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)，包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán)；R4是Ar，R2或C1-C5烷氧基、環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基、環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)，包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán)；R5是C＝NH；R6是Ar，R2或C1-C5烷氧基、環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基、環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)，包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán)；和R7是Ar，R2或C1-C5烷氧基、環(huán)烷基、C1-C10烷基取代的環(huán)烷基、環(huán)脂族胺、C1-C10烷基取代的環(huán)脂族胺、雜環(huán)、C1-C10烷基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)和C1-C10烷氧基取代的雜環(huán)(包括C1-C10烷基N-取代的雜環(huán))。
酯的例子包括苯甲酸酯，如哌吡卡因、甲丙卡因和異布卡因；對氨基苯甲酸酯，如普魯卡因、四卡因、丁乙胺、丙氧卡因和氯普魯卡因；間氨基苯甲酸酯，包括間莫諾卡因(metabuthamine)和間丁氧卡因；和鄰乙氧基苯甲酸酯，如鄰乙氧卡因。酰苯胺的例子包括利多卡因、衣鐵卡因、卡波卡因、丁哌卡因、吡咯卡因和丙胺卡因。這些化合物的其它例子包括辛可卡因、苯佐卡因、達克羅寧、普莫卡因、丙美卡因、布他卡因、奧布卡因、卡布卡因(carbocaine)、甲基布比卡因、布他星苦味酸鹽(butasin picrate)、非那卡因、第奧散(diothan)、魯卡因(luccaine)、吲卡因(intracaine)、努普卡因(nupercaine)、美布卡卡因、匹多卡因、二苯胺和植物衍生的雙環(huán)物如可卡因、西那莫卡因(cinnamoylcocaine)、特魯西啉(truxilline)和古柯乙烯(cocaethylene)和所有這些化合物與鹽酸鹽的復合物。
在較佳的實例中，易化劑是丁哌卡因。丁哌卡因與卡波卡因間的差別是丁哌卡因的N丁基代替了卡?？ㄒ虻腘甲基。該N處可有C1-C10的化合物?；衔锟捎名u素來替代，如普魯卡因和氯普魯卡因。酰苯胺是較佳的。
易化劑可在給予基因構建前后或同時給予。易化劑和基因構建物可配制入同一組合物中。
丁哌卡因-HCl在化學上命名為2-哌啶羧酰胺、1-丁基-N-(2，6-二甲基苯基)-單鹽酸鹽，一水合物，它可從商業(yè)上多種途徑獲得用于藥物用途，包括從AstraPharmaceutical Products Inc.(Westboro，MA)和Sanofi Winthrop Pharmaceuticals(New York，NY)Eastman Kodak(Rochester，NY)購得。在商業(yè)上，丁哌卡因與和不與羥苯甲酸甲酯、與和不與腎上腺素一起配制。這些制劑均可采用。商業(yè)上購得用于藥物用途的濃度為0.25％、0.5％和0.75％，這些濃度可用于本發(fā)明中。如果需要，可以配制能誘導所需效果的其它濃度，尤其是0.05-0.1％間的濃度。根據(jù)本發(fā)明，可給予約250μg至10mg的丁哌卡因。在一些實例中，給予了約250μg至約7.5mg。在一些實例中，給予了約0.05mg至約5.0mg。在一些實例中，給予了約0.5mg至約3.0mg。在一些實例中，給予了約5至50μg。例如，在一些實例中，在給予疫苗前后或同時，在疫苗接種相同部位處給予50μl至約2ml(較佳的為50μl至約1500μl，更佳的為大約1ml)0.25-0.50％丁哌卡因鹽酸和0.1％羥苯甲酸甲酯的等滲藥學載體。同樣，在一些實例中，在給予疫苗前后或同時，在疫苗接種相同部位處給予50μl至約2ml(較佳的為50μl至約1500μl，更佳的為大約1ml)0.25-0.50％丁哌卡因鹽酸鹽的等滲藥學載體。丁哌卡因和其它所有類似的活性化合物，尤其是局部麻醉要相關家族的那些化合物，它們的給藥濃度為細胞攝取基因構建物提供了所需的易化。
在本發(fā)明的一些實例中，在給予基因構建物前，首先對個體注射給予易化劑。即，在給予基因構建物前一周至10天時，首先將易化劑注射給個體。在一些實例中，在給予基因構建物之前或之后，給個體注射易化劑1至5天，在一些實例中為注射24小時。或者，既然使用，易化劑可在給予基因構建物同時、數(shù)分鐘之前或之后給予。因此，易化劑和基因構建物可以組合成單一的藥物組合物。
在一些實例中，可給予基因構建物而不給予易化劑，即制劑中不含易化劑，采用基因構建物不與易化劑結合給藥的給藥方法。
單純皰疹病毒2型糖蛋白D(gD)基因編碼了與病毒包膜和受感染細胞質膜相聯(lián)的糖蛋白。gD編碼的信號肽將新生多肽轉運到內質網(wǎng)腔中，新生多肽在內質網(wǎng)腔中進入分泌途徑并被糖基化和折疊。蛋白通過疏水C-端區(qū)域(稱為跨膜區(qū)或TMR)與質膜保持相聯(lián)。
用表達單純皰疹病毒2型糖蛋白D基因的質粒進行DNA免疫接種，在幾個動物模型中顯示能誘導體液和細胞免疫應答。在小鼠中，發(fā)現(xiàn)由最初的gD表達質粒產(chǎn)生的免疫應答主要是TH1型或細胞應答。我們已經(jīng)證實，如果對基因加以修飾使疫苗質粒組件表達的主要為分泌形式的gD，則在接種期內可以誘導出TH2型或體液應答。編碼的蛋白與天然gD2蛋白的不同之處僅僅在于缺失最后66個編碼TMR的氨基酸。我們已經(jīng)證實，工程改造的編碼TMR缺失蛋白的構建物所表達的蛋白主要被分泌入轉染細胞的培養(yǎng)基中。只有少量蛋白保持與細胞相聯(lián)。已經(jīng)表明，高水平的可溶性抗原會刺激Th2應答，而低劑量的可溶性抗原則刺激產(chǎn)生IL-12導致Th1應答(Abbas，A.K.Murphy，K.M.，Sher，A.(1996)Functionaldiversity of helper T lymphocytes.Nature 381787-793)。設計出有利于抗原分泌的構建物會促進Th2型免疫應答。
因此，本發(fā)明涉及工程改造的多核苷酸構建物，該構建物能表達出誘導所需TH1或TH2型免疫應答的抗原蛋白，還涉及含有并能表達這些工程改造的多核苷酸構建物的質?；蚱渌d體構建物，以及用這些構建物來免疫接種哺乳動物以實現(xiàn)所需TH1或TH2免疫應答的方法。在一個所希望的實例中，本發(fā)明涉及工程改造一種或一組基因的方法，以使編碼蛋白從細胞中分泌出來，從而能產(chǎn)生TH2型應答。在另一個所希望的實例中，本發(fā)明涉及一種免疫接種的方法，其中首先用編碼誘導TH1型應答蛋白的質粒免疫接種哺乳動物至少一次，然后用能有效分泌該蛋白的質粒系統(tǒng)來免疫接種，從而使應答向TH2型應答變化。在一些應用中，本發(fā)明涉及一種方法，其中首先用誘導TH2型應答的多核苷酸疫苗來免疫接種哺乳動物，然后用促進TH1型應答的疫苗來強化。在本發(fā)明的另一個實例中，通過用促進TH1和TH2型應答的一種或多種疫苗組合物同時免疫接種，實現(xiàn)TH1和TH2型應答。
本發(fā)明的構建物可按下述方法進行工程改造在一個較佳的實例中，經(jīng)修飾的構建物含有TMR缺失，結果所表達的抗原蛋白分泌入胞外區(qū)室得到增加，從而增強了TH2型或體液免疫應答。在一個較佳的實例中，經(jīng)修飾的構建物含有信號或前導肽缺失，該缺失使得表達的抗原蛋白局限于細胞內胞質區(qū)室中，從而增強了TH1型或細胞免疫應答。在另一個較佳的實例中，信號和TMR均缺失，導致免疫原性蛋白的表達局限于胞質區(qū)室內，從而增強了TH1型或細胞免疫應答。
下面描述了一組使細胞相聯(lián)蛋白分泌的方法。首先，需要在不進入分泌途徑的細胞相聯(lián)蛋白氨基端工程改造出一個信號肽。這是這些蛋白中的一些實現(xiàn)有效分泌的全部需求，而這些蛋白中的另一些則還需作進一步修飾。例如，通常不分泌的一些蛋白可能含有與膜相互作用的區(qū)域，而這種相互作用可能抑制那些蛋白的分泌?；蛘?，這些蛋白可能含有使蛋白局限于某些亞細胞區(qū)室(如胞核)內的基序，這些序列也可能組織蛋白的有效分泌。因此，需要通過缺失或突變來破壞這些區(qū)域。在許多情況下，這些序列是已知的，而在其它情況下，可通過掃描序列來確定其與已知區(qū)域和定位基序的同源性。在其它情況下，可對未經(jīng)鑒定的抑制性序列作圖并通過選擇基于誘變的方法來破壞抑制性序列。
對于正常進入分泌途徑、但是通過膜保留區(qū)或使蛋白局限在分泌途徑的亞細胞區(qū)室的結構區(qū)域而與細胞維持相聯(lián)的蛋白，首先必須除去這些區(qū)域。這些區(qū)域可通過缺失或突變來除去。在一些情況下，這些蛋白基因編碼的天然信號肽可能不能有效地將蛋白轉運到內質網(wǎng)中。在這些情況下，可用異源信號肽來代替天然信號肽。異源信號肽的一個例子是HSV2 gD基因編碼的信號肽。
序列缺失可通過構建物本身的序列缺失或突變來實現(xiàn)(圖7)?；蛘撸谝恍┣闆r下，當抑制性序列作為獨特的區(qū)域存在(即它們在整個蛋白中沒受修飾(marbled))時，它們位于蛋白C端，且出于免疫原性目的希望在構建物中保留這些序列，則可以這樣來工程改造構建物，即，使這些序列不與注定要分泌的蛋白部分共價連接。這可通過在蛋白分泌部分與蛋白的抑制分泌的序列部分之間插入編碼某個蛋白酶的位點來實現(xiàn)。該蛋白酶位點是某蛋白酶的斷裂位點，對于表達疫苗蛋白的細胞而言，此蛋白酶是內源性的。或者，此蛋白酶可以反式提供在編碼疫苗蛋白的同一構建物中，或在與疫苗質粒共同注射的另一分開的質粒上。在這種情況下，斷裂不依賴于表達疫苗質粒細胞內天然存在的蛋白酶。在此蛋白待分開的區(qū)域之間加入自斷裂蛋白酶(如polio 3C蛋白酶(2)或intein(3))也是可行的。在有些情況下則不能通過蛋白酶方法來除去抑制性區(qū)域。例如，亞細胞定位區(qū)域首先被表達成前體多肽的一部分(在蛋白水解前)，并能有效地干擾新生多肽轉運到內質網(wǎng)中。在這種情況下，則必須通過缺失或定點突變來除去該區(qū)域。另外，還必須確定內質網(wǎng)中是否會發(fā)生所需的蛋白水解反應。
定向分泌的另一個考慮因素是蛋白在胞外區(qū)室中的穩(wěn)定性。如果蛋白不穩(wěn)定，則可通過使其與另一肽或蛋白(如融合蛋白)融合來提高其穩(wěn)定性，維持其抗原性。在一些情況下，可用融合蛋白來裝配血清穩(wěn)定顆粒。
本發(fā)明還涉及工程改造的能表達成裝配顆粒的融合蛋白的多核苷酸構建物，以及用這些多核苷酸構建物免疫接種的方法。這些蛋白不僅穩(wěn)定，而且其大小可被APC(抗原呈遞細胞)優(yōu)先攝取，并且被加工后由MHC 1類和2類分子提呈。
被修飾成其編碼的蛋白主要是分泌蛋白的本發(fā)明構建物，對于誘導TH2型應答或體液應答所需的許多抗原是合適的，例如在抗病毒、寄生蟲和細菌感染的預防性疫苗中的抗原。選用來表達的蛋白是組成病毒顆粒、寄生蟲、細菌或孢子的抗原性蛋白，然而，本身并非傳染性生物體一部分、卻與受感染細胞的膜特殊相聯(lián)的蛋白也可作為表達的靶，因為針對這些抗原的體液應答能通過補體途徑或ADCC途徑而導致細胞死亡。
實施例實施例1插入物TMR由37個核苷酸的HSV2 gD2 5′側接序列以及編碼HSV gD2前導肽和成熟蛋白的前302個氨基酸的序列組成。其羧基端缺失66個氨基酸。構建物有3′HSV gD2側接序列的1個核苷酸。
將該插入物克隆到載體APL-400-004中，制得如圖3A所示的APL-400-004TMR。
在一些實例中，制得第二個構建物APL-400-024。該質粒與APL-400-004 TMR相同，只是載體APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美國專利申請08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性結構所代替。
實施例2插入物L-I包括9bp的側接HSV2 gD2的ATG的真實(authentic)5′序列，其后是ATG、再后是從氨基酸26起的成熟蛋白編碼區(qū)的編碼序列。包括前導肽的前25個氨基酸的編碼序列已經(jīng)缺失。插入物還包括約550bp側接終止密碼子的3′序列。
將該插入物克隆到載體APL-400-004中，制得如圖3B所示的APL-400-004L-I，它還包括39bp的來自TA載體(PCR II，In Vitrogen)的5′真實側接(5′)序列。
在一些例子中，制得第二構建物APL-400-024L-I。該質粒與APL-400-004L-I相同，只是載體APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美國專利申請08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性結構所代替。
實施例3插入物L-II包括41bp的側接HSV2 gD2的ATG的真實5′序列，其后是ATG、再后是從氨基酸26起的成熟蛋白編碼區(qū)的編碼序列。包括前導肽的前25個氨基酸的編碼序列已經(jīng)缺失。該插入物還包括約550bp的終止密碼子后的3′序列。
將該插入物克隆到載體APL-400-004中，制得如圖3C所示的APL-400-004L-II。
在一些例子中，制得第二構建物APL-400-024L-II。該質粒與APL-400-004L-II相同，只是載體APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美國專利申請08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性結構所代替。
實施例4插入物L-3包括41bp的側接HSV2 gD2的ATG的真實5′序列，其后是ATG，ATG后有6個bp以保留Kozak位點，再后是從氨基酸26起的成熟蛋白編碼區(qū)的編碼序列。包括前導肽的前25個氨基酸的編碼序列已經(jīng)缺失。該插入物還包括約550bp的終止密碼子后的3′序列。
將該插入物克隆到載體APL-400-004中，制得如圖3D所示的APL-400-004L-3。
在一些例子中，制得第二構建物APL-400-024L-3。該質粒與APL-400-004L-3相同，只是載體APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美國專利申請08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性結構所代替。
實施例5插入物L-3TMR包括41bp的側接HSV2 gD2的ATG的真實5′序列，其后是ATG，ATG后有6個bp以保留Kozak位點，再后是從氨基酸26起的成熟蛋白編碼區(qū)的編碼序列。包括前導肽的前25個氨基酸的編碼序列以及成熟蛋白羧基端66個氨基酸(包括了跨膜區(qū))的編碼序列已經(jīng)缺失。該插入物還包括1bp的終止密碼子后的3′序列。
將該插入物克隆到載體APL-400-004中，制得如圖3E所示的APL-400-004L-3TMR。
在一些例子中，制得第二構建物APL-400-024L-3TMR。該質粒與APL-400-004L-3相同，只是載體APL-400-004中的卡那霉素抗性基因被美國專利申請08/642,045(1996年5月6日提交)中所述的嵌合卡那霉素抗性結構所代替。
實施例6在第0天和第14天用20μg DNA/0.4％丁哌卡因給小鼠免疫接種。小鼠在第14天和第42天取血，測定血清中抗gD抗體的存在。用TMR缺失型免疫接種的小鼠表現(xiàn)出體液應答升高，比用全長HSV gD構建物免疫接種的小鼠更高。用信號肽缺失型免疫接種的小鼠沒有檢測到有血清抗體轉變。
權利要求
1.一種分離的單純皰疹病毒HSV2 gD2基因，該基因編碼功能性跨膜區(qū)和/或功能性信號肽缺失的HSV2 gD2。
2.一種質粒，它包含權利要求1所述的單純皰疹病毒HSV2 gD2基因，其中所述基因與在真核細胞中表達所需的調控元件操作性相連。
3.一種在個體內誘導抗HSV2 gD2免疫應答的方法，該方法包括向個體給予權利要求2所述質粒的步驟。
4.一種治療受HSV感染的個體的方法，該方法包括向個體給予權利要求2所述質粒的步驟。
5.一種預防個體免受HSV感染的方法，該方法包括向個體給予權利要求2所述質粒的步驟。
全文摘要
揭示了保護性和治療性疫苗。揭示了用于預防或治療單純皰疹病毒感染的疫苗。揭示了預防單純皰疹病毒感染的方法和治療受單純皰疹病毒感染的個體的方法,以及制備單純皰疹病毒的預防性和治療性疫苗的組合物和方法。
文檔編號C12P21/02GK1242053SQ97199045
公開日2000年1月19日 申請日期1997年10月23日 優(yōu)先權日1996年10月23日
發(fā)明者C·帕丘克, K·赫羅爾德 申請人:美國家庭用品有限公司