專利名稱：酯酶及其編碼dna和摻入此dna的載體和宿主細胞的制作方法
背景技術：
本發(fā)明涉及新的酯水解酶、編碼此酶的新遺傳物質和從其產生的酯水解蛋白。本發(fā)明特別提供來自曲霉屬的酯酶、編碼此酯酶的DNA，含此DNA的載體、用此DNA轉化的宿主細胞和此宿主細胞產生的蛋白產物。
木聚糖是自然界中僅次于纖維素的最豐富的可更新多糖。它是植物中主要的半纖維素成分并主要位于被子植物和裸子植物的次生細胞壁中。木聚糖的成分和結構比纖維素更復雜并且在不同的木本植物種類、草類和谷類中數(shù)量和質量不同。木聚糖是雜聚合物，其中各成分不僅通過糖苷鍵連接而且通過酯鍵連接。阿魏酸是在植物中發(fā)現(xiàn)的最豐富的羥基桂皮酸并已知在小麥麥麩、小麥粉、大麥桿、玉米、甘蔗渣、稻草和其它單子葉植物中酯化成阿拉伯糖，并也發(fā)現(xiàn)在甜菜、菠菜和其它雙子葉植物的果膠中酯化成半乳糖殘基。在單子葉植物中p-香豆酸也以相似方式連接。已表明這些酚酸可以減少細胞壁的生物降解并在細胞壁延伸及通過植物過氧化酶形成酚二聚體和/或通過陽光啟動光二聚化作用來穩(wěn)定交叉連接的雜木聚糖鏈中起重要作用。此外，已表明酚酸作用為細胞壁多糖和苯丙酸木質素多聚體間的交叉連接。木質素與壁多糖的共價連接及半纖維素內木聚糖鏈的交叉連接限制了多糖的總生物利用率，導致動物飼料中大量的未消化纖維、農業(yè)廢物向有用產品的生物轉化低及谷物的不完全加工。
將木聚糖酶水解成單體需要幾種不同功能的酶參與。根據(jù)酶切割連接鍵的性質可將這些酶分為兩類。第一類酶是參與木聚糖糖苷鍵水解作用的水解酶(EC 3.2.1)。這些酶包括將木聚糖主鏈隨機切割成短木寡糖的內木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；以外方式切割木寡糖產生木糖的木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；α-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；以及從木聚糖主鏈中分別去除阿拉伯糖和4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基的α-glucoronidase(EC 3.2.1.1)。第二類酶包括水解木聚糖多聚體的木糖單位之間的酯鍵(酯酶EC 3.1.1)和?；?酰基木聚糖酯酶EC3.1.1.6)或阿拉伯糖基和諸如阿魏酸(阿魏酸酯酶)和p-香豆酸(香豆酸酯酶)的酚基之間的酯鍵的酶。
Faulds等報道了從黑曲霉分離的兩種形式的阿魏酸酯酶。根據(jù)分子量和底物特異性來辨別這些不同的酯酶[Faulds等，生物技術和應用生物化學，第17卷，第349-359頁(1993)]。Brezillon等公開了認為不同于現(xiàn)有技術證明的阿魏酸酯酶的至少兩種肉桂酸酯酶[Brezillon等，應用微生物生物技術，第45卷，第371-376頁(1996)]。從黑曲霉CBS 120.49中分離出稱為FAE-III的阿魏酸酯酶并表明此酶與木聚糖酶一起作用以除去小麥麥麩制品中幾乎所有的阿魏酸和低分子量木寡糖；在不加木聚糖酶時也可除去阿魏酸，但是低水平的。Faulds等進一步從在燕麥斯卑爾脫小麥木聚糖上生長的黑曲霉CBS 120.49分離并部分鑒定了FAE-III[Faulds等，微生物，第140卷，第779-787頁(1994)]并表明FAE-III的pI為3.3，分子量為36kD(SDS-PAGE)和14.5kD(凝膠過濾法)，最適pH值為5，最適溫度是55至60℃；也觀察到微晶體纖維素結合。作者推理FAE-II可能是經蛋白水解修飾的FAE-III。最近，根據(jù)阿魏酸酯酶的不同底物特異性來辨別來自黑曲霉的各種已知的阿魏酸酯酶并注意到FAE-II和FAE-III不能從甜菜果漿釋放阿魏酸(Brezillon等，同上)。
盡管這些鑒定工作已涉及黑曲霉酯酶，但是本領域仍然需要用作各種用途的其它酯酶。此外，本領域技術人員至令未發(fā)現(xiàn)用于更有效生產能以適于工業(yè)生產的量表達酯酶的遺傳工程生物的核苷酸序列。無論如何，迫切需要開發(fā)憑借遺傳工程的酯酶表達系統(tǒng)以確保酶的純化和有效量的相對純的酶的利用。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供新的酯酶蛋白和編碼這種蛋白的DNA。
本發(fā)明的目的是提供從許多不同物種分離編碼具有酯酶活性的蛋白的DNA的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供由用編碼酯酶活性的DNA轉化的適當宿主細胞產生的酯酶。
本發(fā)明提供源自黑曲霉的純化的38kD酯酶。此外，提供包括如圖5(SEQ ID No27)所示DNA的編碼38kD酯酶的DNA序列；編碼圖5所示氨基酸序列(SEQ ID No28)的DNA；編碼含有不同于圖5中序列的氨基酸片段的酯酶的DNA，只要此DNA編碼此處具體描述的38kD酯酶的衍生物；編碼含有不同于圖5中序列的氨基酸片段的酯酶的DNA，只要此DNA在如下定義的低嚴格條件和/或標準嚴格條件下與含有圖5中全部或部分DNA的DNA雜交。本發(fā)明也包括含有上述DNA序列的載體，用這樣的DNA或載體轉化的宿主細胞，含有這樣的宿主細胞的發(fā)酵培養(yǎng)基和宿主細胞表達的由這樣的DNA編碼的酯酶蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的DNA基本上是純化形式并用于制備能合成其編碼蛋白產物的轉化宿主細胞。此外，上述DNA序列的表達產物多肽也在本發(fā)明范圍內。
本發(fā)明的酶已用作動物飼料添加劑；用于處理紡織品的方法；用于改進生面團的機械特性和食品烤制終產品；用于改進多糖以產生新特性如口香糖；以及用于加工谷物。此外，此酶也用于加工植物材料使之釋放自由酚基以用作人體護理產品如化妝品中的抗氧化劑、光保護劑、抗炎和/或抗微生物劑并用作化學飼料原料向有用的特殊化學制劑、食品添加劑和調味品轉化的輔助劑。
本發(fā)明的益處是分離出為分離編碼具有酯水解活性的蛋白的其它DNA提供可能性的DNA。
本發(fā)明的另一益處是由于提供了編碼具有酯水解活性的蛋白的DNA，所以可以通過重組方式形成能合成相對大量的具有酯水解活性蛋白的宿主細胞。
本發(fā)明的另一益處是使具有酯水解活性的蛋白的商業(yè)應用變得可行。
附圖簡述

圖1表示SDS-PAGE凝膠后的蛋白印跡，表明變性條件下FAE的破碎。
圖2表示含有推測的內含子和氨基酸序列(SEQ ID No26)的650堿基對片段的DNA序列(SEQ ID No25)，對應于從黑曲霉分離的編碼38kD酯酶的基因。
圖3表示純化后對應于38kD酯酶的條帶。
圖4表示含有編碼38kD酯酶基因的DNA片段的限制性圖譜。
圖5表示完整的DNA(SEQ ID No27)，突出指出信號序列、內含子、各種限制性內切酶位點，和對應于編碼從黑曲霉分離的編碼38kD酯酶的基因的氨基酸序列(SEQ ID No28)。
圖6表示編碼38kD酯酶的基因的DNA序列(SEQ ID No29)。
圖7表示由本發(fā)明的38kD酯酶衍生的DNA探針與幾種其它絲狀真菌雜交的DNA印跡凝膠(“凝膠1”)。
圖8表示由本發(fā)明的38kD酯酶衍生的DNA探針與幾種其它絲狀真菌雜交的DNA印跡凝膠(“凝膠2”)。
發(fā)明詳述“酯酶”或“酯水解活性”是指表現(xiàn)酯水解活性的蛋白或肽，例如，如酶分類EC 3.1.1中所定義的有催化活性的那些酶。酯水解活性通過酶或肽切割酯鍵如來自已知存在于初級和次級細胞壁中的有機化合物的阿魏酸、香豆酸或乙酰木聚糖基團的能力來證明。優(yōu)選地，酯酶包含切割酚酯酯鍵如[5-O-((E)-阿魏?；?-α-L-阿拉伯呋喃糖](1→3)-O-β-D-吡喃木糖-(1→4)-吡喃木糖(也稱作FAXX)；[5-O-((E)-阿魏?；?-α-L-阿拉伯呋喃糖](1→3)-O-β-D-吡喃木糖(也稱作FAX)；O-β-D-吡喃木糖-(1→4)-O-[5-O-((E)-阿魏酰基)-α-阿拉伯呋喃糖-(1→3)]-O-β-D-吡喃木糖-(1→4)-D-吡喃木糖(也稱作FAXXX)；[5-O-((E)-P-香豆?；?-α-L-阿拉伯呋喃糖](1→3)-O-β-D-吡喃木糖-(1→4)-D-吡喃木糖(也稱作PAXX)；[5-O-((E)-P-香豆?；?-α-L-阿拉伯呋喃糖](1→3)-O-β-D-吡喃木糖(也稱作PAX)；O-β-D-吡喃木糖-(1→4)-O-[5-O-((E)-P-香豆酸)-α-阿拉伯呋喃糖-(1→3)]-O-β-D-吡喃木糖-(1→4)-D-吡喃木糖(也稱作PAXXX)和其它本領域已知的酯連接的酚寡糖的酯水解活性。這樣的酯酶通常稱為阿魏酸酯酶(FAE)或具有阿魏酸酯酶活性的酶。驚奇地發(fā)現(xiàn)如此處所述的從黑曲霉純化的具有阿魏酸酯酶活性并含有如圖5所示氨基酸序列的酯酶對甜菜果漿也有作用并有蛋白水解和脂解活性。因此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案，提供具有脂解和/或蛋白水解活性的酯酶和/或編碼此酯酶的DNA。因此，本發(fā)明的酯酶對阿魏酸和香豆酸酯有可測定的顯著的酯水解活性，并具有蛋白水解和脂解活性。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的酯酶和/或編碼酯酶的DNA來自真菌，更優(yōu)選地來自厭氧真菌，并且最優(yōu)選地來自曲霉屬種類如黑曲霉。因此，應當理解根據(jù)本發(fā)明所述的酯酶或編碼酯酶的DNA可以來自犁頭霉屬種類，Acremonium屬種類，Actinomycetes屬種類，蘑菇屬種類，Anaeromyces屬種類，曲霉屬種類包括A.auculeatus泡盛曲霉、黃曲霉、臭曲霉、A.Fumaricus、煙曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉和雜色曲霉，Aeurobasidium屬種類，頭孢霉屬種類，毛殼霉屬種類，鬼傘霉屬種類，Dactyllum屬種類，鐮孢霉屬種類包括F.conglomerans、F.decemcellulare、爪哇鐮孢霉、亞麻鐮孢霉、尖鐮孢霉和腐皮鐮孢霉，粘帚霉屬種類，腐質霉屬種類包括H.insolens和H.lanuginosa，毛霉屬種類，脈孢菌屬種類包括粗糙脈孢菌和好食脈孢菌，Neocallimastix屬種類；Orpinomyces屬種類；青霉屬種類，Phanerochaete屬種類，射脈菌屬種類，Piromyces屬種類，Pseudomonas屬種類；根霉屬種類，裂褶菌屬種類；鏈霉菌屬種類，栓菌屬種類，木霉屬種類包括T.Reesei、T.longibrachiatum和綠色木霉和接霉屬種類。相似地，可以預見如此處所述的酯酶和/或編碼酯酶的DNA可以在細菌如鏈霉菌屬種類包括橄欖產色鏈霉菌；具體地降解纖維的反芻細菌如產琥珀酸絲狀桿菌；和酵母包括Candidatorresii、近平滑假絲酵母、清灑假絲酵母、涎沫假絲酵母、Pichiaminuta、紅酵母、膠紅酵母和不對稱擲孢酵母中發(fā)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，酯酶以純化形式，即以比存在于天然存在或野生型的生物更高或更低的濃度存在于特定組合物中或與通常不依賴天然存在或野生型的生物表達而存在的成分結合。
“表達載體”是指含有與能在適當宿主中有效表達DNA的適當調控序列操縱連接的DNA序列的DNA構建體。這些調控序列可以包括啟動轉錄的啟動子，任選的調控這樣的轉錄的操縱子序列，編碼mRNA上適當?shù)暮颂墙Y合位點的序列，及調控轉錄和翻譯終止的序列。不同細胞類型優(yōu)選使用不同的表達載體。枯草芽孢桿菌中所用載體的優(yōu)選啟動子是AprE啟動子；大腸桿菌中所用的優(yōu)選啟動子是Lac啟動子，而黑曲霉中所用的優(yōu)選啟動子是glaA。載體可以是質粒，噬菌體顆?；蚝唵蔚乜赡艿幕蚪M插入。一旦轉化入適當宿主，載體可獨立于宿主基因組復制和作用，或在適當條件下整合入宿主基因組本身。在本說明書中，質粒和載體有時可互換使用。然而，本發(fā)明打算包括本領域已知的起相同作用的其它形式的表達載體。于是，多種宿主/表達載體結合可以用于表達本發(fā)明的DNA序列。例如，有用的表達載體可以包括染色體、非染色體和合成的DNA序列片段如各種已知的SV40衍生物和已知的細菌質粒，例如來自大腸桿菌的質粒包括colE1、pCR1、pBR322、pMb9、pUC19及其衍生物，宿主范圍較大的質粒如RP4，噬菌體DNA如諸如NM989的入噬菌體和諸如M13的其它DNA噬菌體及絲狀單鏈DNA噬菌體的多種衍生物酵母質粒如2μ質粒或其衍生物，真核細胞中有用的載體如動物細胞中有用的載體和從質粒和噬菌體DNA的結合衍生的載體，例如已經修飾使用噬菌體DNA或其它表達調控序列的質粒。使用本發(fā)明表達載體的表達技術為本領域所知并常見于如Sambrook等，分子克隆實驗指南，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)。通常，包含本發(fā)明DNA序列的表達載體通過直接插入特定品種的基因組經整合過程轉化入單細胞宿主(見例如Bennett和Lasure，真菌的多基因操作，學院出版社，San Diego第70-76頁(1991)并且此處引用的描述真菌宿主中目的基因組插入的文章在此引作參考)。
“宿主菌株”或“宿主細胞”是指含有根據(jù)本發(fā)明DNA所述的表達載體的適當宿主。在本發(fā)明中有用的宿主細胞通常是原核或真核宿主，包括任何可轉化的其中能獲得表達的微生物。特別地，宿主菌株可以是枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、Trichoderma longibrachialum、釀酒酵母或黑曲霉，并且優(yōu)選的是黑曲霉。通過重組DNA技術用構建的載體轉化或轉染宿主細胞。這種轉化的宿主細胞能復制編碼酯酶和其變體(突變體)的載體或表達目的肽產物。
“衍生物”是指通過在C-和N-末端或任一末端添加1個或多個氨基酸，在氨基酸序列的1個或多個不同位點替換1個或多個氨基酸，在蛋白兩個末端或任一末端或氨基酸序列的1個或多個位點刪除1個或多個氨基酸，或在氨基酸序列的1個或多個位點插入1個或多個氨基酸從前體蛋白(例如天然蛋白)衍生的蛋白。酶衍生物的制備優(yōu)選通過修飾編碼天然蛋白的DNA序列，將此DNA序列轉化入適當宿主，并表達修飾的DNA序列以形成衍生酶來完成。本發(fā)明的衍生物包括與前體酶氨基酸序列(例如野生型或天然狀態(tài)酶)相比含有變化的氨基酸序列的肽，此肽保留了前體酶的典型酶特征但在一些特定方面有已改變的特征。此定義范圍內的“衍生物”通常保留在天然或親本形式中觀察到的典型的的酯水解活性特征使得衍生物如天然或親本形式有相似用途。然而，應該理解這種衍生物可能有已變化的底物特異性如對諸如阿魏酰、肉桂酰或香豆?；奶禺惖孜镉懈鼜娀蚋跤H合性，或變化的pH、溫度或氧化穩(wěn)定性。通過化學修飾前體酶改變其特征可以進一步產生本發(fā)明的衍生物。
此處用雜交來分析所給片段或基因是否對應此處所述的酯酶并屬于本發(fā)明范圍。雜交檢測基本如下根據(jù)生產商的說明書通過用如EcoRI、HindIII、PinAI、MluI、SpeI、BglII、Ppu10I、MfeI、NcoI、BinI、EagI和XmaI(由新英格生物實驗室公司，Beverly，MA和Boehringer Mannheim提供)的限制性酶消化將特定靶來源的基因組DNA切成片段。樣品經瓊脂糖凝膠(例如0.7％瓊脂糖)電泳以便按大小觀察DNA片段的分離。凝膠在蒸餾水中簡單沖洗并在輕微振蕩變性30分鐘(在例如0.4M NaOH中)后在適當溶液中輕微振蕩脫嘌呤30分鐘(例如0.25M HCl)。然后將使用轉移溶液(例如0.4M NaOH)DNA轉移到適當帶正電的膜如Maximum Strength Nytran Plus膜(Schleicher和Schuell，Keene，N.H.)上。通常轉移完成約2個小時或更多時間后，用沖洗溶液(例如，2×SSC[2×SSC＝300mM NaCl，30mM檸檬酸三鈉])洗膜后于室溫風干。然膜應當在適當?shù)念A雜交溶液(例如，水溶液每100ml含有20-50ml甲酰胺，25ml 20×SSPE(1×SSPE＝0.18M NaCl，1mM EDTA，10mM NaH2PO4，pH7.7)，2.5ml 20％SDS，1ml 10mg/ml切斷的鯡魚精子DNA和21.5ml蒸餾水)預雜交(大約2小時或更多時間)。如本領域技術人員所知的，預雜交溶液中甲酰胺的量依賴反應性質變化根據(jù)常規(guī)方法得到。于是，就鑒定雜交分子來說，更少量甲酰胺可能比同種方法用更大量甲酰胺產生更完整的凝膠。另一方面，用較多的甲酰胺更容易觀察到強雜交條帶。
通過1％瓊脂糖電泳分離由圖5或6中序列衍生的DNA探針，從凝膠中切下此片段并從切下的瓊脂糖回收DNA。然后將此純化的DNA片段隨機加上32P標記[例如，根據(jù)廠商(Amersham International plc.Buckinghamshire，England)說明書使用Megaprime標記系統(tǒng))。通過加熱至95℃ 5分鐘使標記探針變性并立即將其加入含有膜的預雜交溶液中。雜交反應在適當條件下反應適當時間，例如于37℃輕輕振蕩18小時。洗膜(例如，在2×SSC/0.3％SDS中)，然后用適當洗膜溶液并輕輕攪動沖洗。膜(濾膜)沖洗條件反映了所需嚴格性。
具體地，所給反應的嚴格性(即成功雜交所需的同源程度)依賴于雜交后DNA印跡濾膜的沖洗條件。此處所定義的“低嚴格性”條件包括用0.2×SSC/0.1％SDS溶液在20℃沖洗DNA印跡濾膜15分鐘?！皹藴蕠栏裥浴睏l件包括進一步沖洗，包括用0.2×SSC/0.1％SDS在37℃第二次沖洗DNA印跡濾膜30分鐘。
圖5和6說明來自黑曲霉的新酯酶的氨基酸序列和DNA序列。分離的酯酶的分子量約為38kD(如SDS-PAGE上所示)，pI約為2.8(如IEF上所示)，對甲基阿魏酸酯的最適pH約為5.1，最適溫度約為55℃并對香豆酸和阿魏酸酯及甜菜果漿有活性。圖5中所示的FAE基因(SEQ ID No27)是長約為2436個堿基對，包含推測的內含子序列，如果表達編碼此處鑒定的來自黑曲霉的酯酶(此后稱“38kD酯酶”)。對于本發(fā)明的目的，術語“38kD酯酶”是指來自黑曲霉的酯酶，對應于此處具體舉例的酯酶。圖5或6中提供的DNA可用于從其它種類尤其從厭氧真菌中得到編碼具有酯水解活性的酶的DNA的同源片段。
本發(fā)明的DNA序列可以通過與合適表達載體中的表達調控序列可操作地連接并根據(jù)本領域已成熟的技術使其在表達載體中轉化適當?shù)奈⑸锼拗鱽肀磉_。本發(fā)明DNA序列表達所產生的多肽可以從動物細胞培養(yǎng)物的發(fā)酵作用中分離并根據(jù)本領域已成熟技術以各種方法純化。本領域技術人員能夠選擇最合適的分離和純化技術。
根據(jù)本發(fā)明所述的分離的酯酶在需要去除木聚寡糖的酚成分的應用中有用。因為植物細胞壁的消化性看來依賴于植物酚含量，所以酯酶可用于改善動物和人類營養(yǎng)。此外，因為木質素的酚酯連接鍵的水解有利于木質素的溶解并有利于水解木質素/半纖維素連接，所以酯酯可用于果漿和造紙工業(yè)。酯酶在碳水化合物衍生物的合成和農業(yè)殘渣向發(fā)酵糖和可用作食品和個人護理產品中的抗氧化劑、光保護劑和/或抗微生物劑的游離酚酸生物轉化；作為向香料(例如香草醛)生物多聚體和有用的化學品轉化原料中有潛在用途。酯酶也可用于紡織品纖維的處理(見如PCT
發(fā)明者W·S·波恩曼, B·S·鮑爾 申請人:金克克國際有限公司