專利名稱：：轉(zhuǎn)基因病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包含昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒。尤其是，本發(fā)明涉及包含涉及蛻皮和變態(tài)的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒。該轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒可用作生物農(nóng)藥。傳統(tǒng)害蟲防治以使用化學(xué)殺蟲劑與主導(dǎo)。雖然它們起作用迅速，但這些化學(xué)品有時是在環(huán)境方面不具有吸引力的。此外，用于害蟲防治的許多化學(xué)品是非種特異性的，并且可能影響非靶脊椎動物和無脊椎動物以及靶害蟲。這些化學(xué)品或它們的副產(chǎn)物有時可在環(huán)境中長時間繼續(xù)存留。開發(fā)和使用害蟲生物學(xué)，種群動力學(xué)，造林培植應(yīng)用，天然防治劑(即寄生物，病原體)，和改進(jìn)的可實用的森林害蟲管理實踐是進(jìn)行森林管理的新的工具。作為成功防治害蟲的方法，生物防治，使用活生物防治昆蟲害蟲已變得日益更為人接受。例如，生物殺蟲劑芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)(Bt)，被用于防治云杉食心蟲和卷葉蛾幼蟲。然而，最近一些對Bt特異性的關(guān)注導(dǎo)致形成它不應(yīng)該應(yīng)用于對鱗翅目造成危害的地區(qū)這一建議。生態(tài)學(xué)關(guān)注導(dǎo)致重點轉(zhuǎn)移至試驗和開發(fā)其它微生物產(chǎn)品，包括昆蟲病毒。昆蟲病毒為被認(rèn)為是宿主特異性和環(huán)境安全的自然產(chǎn)生的昆蟲病原體。它們可持續(xù)數(shù)年對幾代昆蟲野生影響。存在多于1200種可能對昆蟲防治具有潛力的昆蟲病毒(核多角體病毒，顆粒體病毒，病毒痘病毒，cypovirus和其它)。與一些天然昆蟲病毒相關(guān)的一個問題是在病毒進(jìn)入昆蟲體內(nèi)和致死感染之間存在一段時間延遲。昆蟲病毒必須被幼蟲攝取以使得能夠感染，含有污染葉片的昆蟲顆粒的包藏體被攝取并被昆蟲中腸液體溶解，釋放病毒顆粒。這些顆粒通過腸細(xì)胞，感染宿主幼蟲的氣管和其它身體組織。通常在15天后，病毒在敏感組織中復(fù)制，最終導(dǎo)致死亡。在此期間感染的幼蟲仍然進(jìn)食；然而，在病毒進(jìn)入和昆蟲死亡之間的時間間隔仍可發(fā)生植物的明顯脫葉。這一進(jìn)食的損害是使用天然昆蟲病毒的內(nèi)在問題。與天然昆蟲病毒相關(guān)的其它問題是缺乏毒性，例如，廣泛的大田試驗表明云杉食心蟲多角體病毒(CfMNPV)感染云杉食心蟲群體，但并沒有產(chǎn)生導(dǎo)致大規(guī)模死亡和種群減少的動物流行病(Cunningham和House，1984，樅色卷蛾(clemens)，云杉食心蟲(鱗翅目卷葉蛾科)；B.病毒應(yīng)用和評價。加拿大針對昆蟲和雜草的生物防治工程1969-1980，Kelleher，J.S.和Hulme，M.A.編，公共健康農(nóng)業(yè)局，Slough，英國)。已采取許多策略來降低由感染昆蟲導(dǎo)致的飼養(yǎng)危害。一種策略是應(yīng)用包含“病毒增強(qiáng)劑”的針對早期蛻期幼蟲的病毒制劑以加快感染，從而防止嚴(yán)重的脫葉。不幸的是，如果昆蟲是可避免的，或如果不能獲得大量的昆蟲病毒，則不能使用這種方法。對于用多角體的UGMW毒防治云杉食心蟲(樅色卷蛾)(Clem)則是這種情況。生物技術(shù)的發(fā)展提供了用于遺傳改造昆蟲病毒以增加它們的效果的工具。編碼毒素(蝎/蝎毒素)，酶(保幼激素(JH)酶酯)，神經(jīng)肽(促前胸腺激素)和蛻殼激素的基因被各種研究小組導(dǎo)入病毒基因組中(Bonning等，昆蟲學(xué)年鑒85437-446)。這些基因編碼在病毒感染的細(xì)胞之外發(fā)揮它們功能的分泌蛋白和肽。將JH酯酶基因插入到苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)導(dǎo)致酶JH酯酶分泌到血淋巴中，從而改善了作為防治劑的病毒。蝎毒素和螨毒素也被插入到AcMNPV中。這些蛋白為分泌到血淋巴中，并對神經(jīng)系統(tǒng)起作用的神經(jīng)毒素。這些轉(zhuǎn)基因病毒的主要缺陷是外源基因編碼不得不在感染細(xì)胞外，例如在血淋巴中起作用的分泌產(chǎn)物。這些基因產(chǎn)物存在被昆蟲解毒系統(tǒng)降解或消除的危險。仍然需要開發(fā)作為生物農(nóng)藥的新的轉(zhuǎn)基因病毒。尤其是需要通過將新類型的外源基因?qū)氩《净蚪M來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因病毒。本發(fā)明提供可用作于生物農(nóng)藥的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒。本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，該病毒與未改造的病毒相比，能迅速發(fā)揮作用并具有增強(qiáng)的毒性。本發(fā)明制備一種轉(zhuǎn)基因病毒，該病毒編碼代替在感染細(xì)胞外，而在感染細(xì)胞內(nèi)起作用的蛋白因子。最后，本發(fā)明提供一種殺蟲組合物，該組合物包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，并可被用于防治昆蟲種群。本發(fā)明的這些以及其它目的由下面描述的一個或多個具體實施方案來提供。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供了一種轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，該病毒含有可操作性地與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)相接的編碼發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的外源DNA。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子與蛻皮和變態(tài)相關(guān)。本發(fā)明的具體實施方案還設(shè)計了包含這些轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒的殺蟲劑和它們用于防治昆蟲種群的應(yīng)用。本發(fā)明的這些和其它具體實施方案提供了新類型的轉(zhuǎn)基因病毒。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因病毒能使蛋白產(chǎn)物在病毒感染的細(xì)胞內(nèi)起作用，并且從而克服了與其它轉(zhuǎn)基因病毒的分泌蛋白相關(guān)的問題。這一特性也使得轉(zhuǎn)基因病毒能迅速起作用并能有效地作為生物農(nóng)藥。圖1表明CfMNPV轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建。圖2表明CHR3DNA在CfMNPV的預(yù)期區(qū)域被插入。圖3表明在用重組病毒感染的細(xì)胞中的CHR3表達(dá)的時間過程。圖4表明在生物分析中AcMHR3的作用。AcMNPV(●)表示未修飾病毒，AcGFP(▲)表示AcMNPV重組表達(dá)綠色熒光的蛋白，和AcMHR3(■)表示AcMNPV重組表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子MHR3。本發(fā)明涉及含有發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的昆蟲病毒和其對昆蟲的防治。在一個優(yōu)選具體實施方案中，本發(fā)明涉及編碼涉及蛻皮和變態(tài)的編碼昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的外源DNA的昆蟲病毒。根據(jù)本發(fā)明，廣范圍的鱗翅目昆蟲可被防治。具體的實例包括下面任何對病毒感染的敏感的昆蟲均可作為用于本發(fā)明的靶。昆蟲病毒為天然發(fā)生的昆蟲病原體。它們可為DNA病毒或RNA病毒?，F(xiàn)有技術(shù)中已知許多昆蟲病毒和它們的宿主范圍?，F(xiàn)有技術(shù)中任何昆蟲病毒可用于本發(fā)明的目的。采用的昆蟲病毒優(yōu)選為宿主特異性和環(huán)境安全的。較優(yōu)選的昆蟲病毒為已被一般性地用作昆蟲害蟲生物防治劑的DNA病毒，例如桿狀病毒(核多角體病毒和顆粒體病毒)和寄生昆蟲痘病毒。適用于本發(fā)明的RNA病毒包括但不局限于cypovirus。任何發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子適用于本發(fā)明。發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子為昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的五型。這些昆蟲轉(zhuǎn)錄因子為調(diào)節(jié)蛋白。它們通常具有內(nèi)含的核定位信號，該信號指導(dǎo)它們進(jìn)入細(xì)胞核，在那里它們與DNA相互作用并發(fā)揮它們的作用。它們還具有特異性的DNA結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)與基因的調(diào)節(jié)區(qū)中的特定序列結(jié)合。發(fā)育調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子在昆蟲中通常以少量產(chǎn)生并暫時和在空間上被調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生通常依賴于各種激素，例如由于昆蟲激素，如蛻皮激素，保幼激素和其它激素的作用，它們被表達(dá)，活化，和/或失活。它們還可可能具有類似于激素受體或?qū)儆谑荏w超家族的結(jié)構(gòu)。現(xiàn)有技術(shù)業(yè)已知發(fā)育調(diào)節(jié)的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子。它們包括，但不局限于果蠅BR-C，E74，E75，超氣孔(Ultraspiracle)E78，Sevenup，Kni/Knrl/egon，F(xiàn)TZ-Fl，DHR38，E93，Relish-抗菌轉(zhuǎn)錄因子，Col-頭模式轉(zhuǎn)錄因子，Escargot和蝸牛轉(zhuǎn)錄因子，例如胚胎翼盤，Dorsal轉(zhuǎn)錄因子，例如對UV發(fā)生應(yīng)答的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，DSX-M和DSX-F轉(zhuǎn)錄因子，分別如卵黃蛋白的阻遏和活化，Dif反式激活殺菌肽基因，無眼(Eyeless)轉(zhuǎn)錄因子，Gap基因Kni轉(zhuǎn)錄因子，類似于KappaE樣免疫基因的活化轉(zhuǎn)錄因子，由調(diào)節(jié)前和后末端(termini)的胚胎發(fā)育的Zygotic基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，和DHR78，DHR96，ManducaMHR3-蛻皮激素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，卷蛾激素受體2(CHR2)，卷蛾激素受體3(CHR3)，樅色卷蛾蛻皮激素受體(CfEcR)，Choristonerafumiferana超氣孔蛋白(CfUSP)，活化轉(zhuǎn)錄因子的Spodoptera病毒gp64，以及Egr-1主開關(guān)基因，及BombyxMori絲蛋白轉(zhuǎn)錄因子。最優(yōu)選的受發(fā)育調(diào)控的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子是那些與昆蟲的蛻皮，再生，變態(tài)及發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。受發(fā)育調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子可以引發(fā)定基因組的表達(dá)，所述基因可以依次開啟和關(guān)閉涉及蛻皮及變態(tài)等生理現(xiàn)象的基因。許多這樣的調(diào)節(jié)蛻皮及變態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，例如，卷蛾激素受體2(CHR2)，卷蛾激素受體3(CHR3)，樅色卷蛾蛻皮激素受體(CfEcR)，樅色卷蛾超氣孔蛋白(CfUSP)，Manduca激素受體3(MHR3)，及果蠅激素受體38(DHR38)。轉(zhuǎn)基因或重組昆蟲病毒可以通過將編碼受發(fā)育調(diào)控的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的基因片斷或連續(xù)異源DNA引入病毒基因組內(nèi)而構(gòu)建。如現(xiàn)有技術(shù)中已知的，異源DNA可以一種順式構(gòu)型操作連接或共價連接于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，從而昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)由通常位于基因的5′端上游的調(diào)節(jié)區(qū)域驅(qū)使。另外，DNA片斷可以編碼融合蛋白及一種可分析產(chǎn)品，所述蛋白包含受發(fā)育調(diào)控的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子。編碼可分析產(chǎn)物的受體基因可在現(xiàn)有技術(shù)中方便地獲得?？煞治霎a(chǎn)物可以是一種便于分析的酶，例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)化酶，β-半乳糖苷酶，綠熒光蛋白，或熒光系酶。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域或啟動子可以是早期或晚期病毒啟動子或用于細(xì)胞中的組成啟動子。這樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域是已知的再在現(xiàn)有技術(shù)中可方便獲得。它們包括但不限于晚期啟動子，例如，多角體蛋白啟動子及p10啟動子，早期至晚期啟動子，例如，ETL啟動子，早期啟動子，例如，速發(fā)早期基因1(IE1)，蛻皮類固醇葡糖基轉(zhuǎn)移酶(egt)啟動子，及p35啟動子，及組成啟動子，例如，肌動蛋白啟動子。啟動子可與編碼轉(zhuǎn)錄因子的一份或多份DNA相連接?？梢允褂门c不同啟動子相連接的多份轉(zhuǎn)錄因子。另外也可以使用與多種啟動子相連接的不同的轉(zhuǎn)錄因子。這些啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的組合可用于提高轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和對修飾病毒的控制。在一優(yōu)選實施方案中，將異源DNA引入病毒基因組位點或基因中所述基因與病毒宿主特性無關(guān)，其功能對于病毒不是必需的。有許多這樣的基因，例如，蛻皮類固醇UDP葡糖基轉(zhuǎn)移基因(egt)，p10基因，p48基因，多角體蛋白基因，這些基因可進(jìn)行分離并可用作異源DNA的引入位點。任何足以引起早熟及不完全蛻皮或異常昆蟲進(jìn)化的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平在本發(fā)明中都進(jìn)行了研究。當(dāng)轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒感染昆蟲時，昆蟲轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)在可探測水平得到表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選地在高于受感染昆蟲生理所需量的水平進(jìn)行表達(dá)或超表達(dá)。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄因了可以在幾乎所有引入轉(zhuǎn)基因病毒的昆蟲組織內(nèi)得到表達(dá)。通常，為了得到轉(zhuǎn)基因病毒要建立重組轉(zhuǎn)錄載體。例如，編碼昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的DNA片斷可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，例如限制消化，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以及連接與病毒啟動子或組成細(xì)胞啟動子，例如p10啟動子，進(jìn)行共價連接。隨后，將含有啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的DNA片斷插入病毒基因座，例如，由可方便獲得的載體，例如pUC18攜帶的egt基因。通過現(xiàn)有技術(shù)中所用的方法例如脂轉(zhuǎn)染法可將重組轉(zhuǎn)移載體與昆蟲病毒共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞線中。由重組轉(zhuǎn)移基因載體所攜帶的含有啟動子和轉(zhuǎn)錄因子的重組昆蟲病毒可通過探測可分析產(chǎn)物，昆蟲轉(zhuǎn)錄因子，標(biāo)記基因或啟動子進(jìn)行確定。探測可用南方印跡法，北方印跡法，PCR，西方印跡法，酶分析法，限制消化法，或現(xiàn)有技術(shù)中得到的任何其它方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒的建立和測定只需現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因或重組病毒可用于生物殺蟲劑。轉(zhuǎn)基因病毒的宿主范圍由未修飾的野生型病毒的天然宿主范圍決定。轉(zhuǎn)基因病毒的毒性要高于野生型病毒，至少要高于5倍并且通常高于10倍。昆蟲病毒的毒性可用現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法方便測定。如果將插入病毒的轉(zhuǎn)錄因子從同一宿主昆蟲中分離或者保持其在同一宿主昆蟲中的天然狀態(tài)，轉(zhuǎn)基因病毒的效果最佳?？梢允褂脕碜耘c宿主昆蟲具有相同順序的昆蟲的轉(zhuǎn)錄因子，或者來自使用類似轉(zhuǎn)錄因子的昆蟲的轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子的作用可由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便確定。一旦病毒侵染了宿主昆蟲，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因病毒可在宿主昆蟲中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。通過常規(guī)方法，包括消化，吸入以及將轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒與昆蟲或昆蟲幼蟲進(jìn)行直接接觸，將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒侵染昆蟲。在一優(yōu)選實施方案中，通過使用帶有轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒的內(nèi)含體由經(jīng)途徑給藥轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒。一般地，喂給昆蟲幼蟲或昆蟲的內(nèi)含體的量相當(dāng)于約0.2至0.001LD50的那類未修飾昆蟲病毒和昆蟲宿主。LD50依昆蟲的種類和幼蟲的年齡而異，并且LD50可由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便測得。典型地，所用內(nèi)含體的數(shù)量與存在于某區(qū)域要處理的昆蟲的數(shù)量有關(guān)。通常該數(shù)量的變化范圍為每英畝約103至約1012內(nèi)含子。優(yōu)選地，該數(shù)量為每英畝從約106至約109個內(nèi)含子并且更優(yōu)選為每英畝從103至106個內(nèi)含子。在內(nèi)含體形成不發(fā)生的情況下(例如當(dāng)多角體基因用作異源基因插入位點時)，昆蟲與轉(zhuǎn)基因和野生型病毒的芽(budded)病毒形態(tài)的共轉(zhuǎn)染提供了含有重組和野生型病毒的內(nèi)含體，并且允許由經(jīng)途徑進(jìn)行的昆蟲幼蟲轉(zhuǎn)染。本發(fā)明的殺蟲組合物包含對適于環(huán)境的載體和轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，該組合物應(yīng)適于農(nóng)業(yè)應(yīng)用，森林應(yīng)用，或其它設(shè)想的特定的使用。一般地，組合物的組成必須是無毒的并且對于內(nèi)含病毒的完整性無害。對葉子的施用不應(yīng)該損傷或傷害植物葉子。除了適宜的固態(tài)的或較優(yōu)選的液態(tài)的載體，組合物應(yīng)包括分散劑，展布粘著劑，UV保護(hù)劑，昆蟲誘導(dǎo)劑，病毒強(qiáng)化因子，粘著和粘合劑，乳化劑，潤濕劑，以及刺激昆蟲食用的試劑，但不包括產(chǎn)生不期望效果，例如阻抑昆蟲食用的組分。用于殺蟲組合物的適定的載體是已知的并在現(xiàn)有技術(shù)中可方便獲得，例如，稀釋劑例如水，粘土等。以下實施例僅用作解釋發(fā)明目的，并非用于限制本發(fā)明范圍。實施例1轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建如圖1所示，通過首先將含有egt基因的6kb的CfMNPV片段克隆進(jìn)pUCuc18中來創(chuàng)建CfMNPV轉(zhuǎn)移載體。然后將含有AcMNPV多角體蛋白和p10啟動子區(qū)以及在p10啟動子下游的β-半乳糖苷酶可讀框插入egt基因的中部。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，用基于CHR3的N-末端和C-末端核苷酸序列的合成引物來擴(kuò)增CHR3cDNA。在所述的引物序列內(nèi)還含有BaglII限制酶位點。在電泳凝膠上檢查PCR產(chǎn)物并發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物的大小與預(yù)期的一致。然后使PCR產(chǎn)物通過Sephadex柱，除去引物、核苷酸和PCR混合物中的其他組份，以此來純該P(yáng)CR產(chǎn)物。然后用BaglII消化該DNA并用Sephadex柱除去被消化BaglII接頭而再次純化之。用T4DNA連接酶在16攝氏度16小時將該經(jīng)消化和純化的DNA與經(jīng)BamHI消化的CfMNPV轉(zhuǎn)移載體連接起來。該連接起來的DNA用BamHI消化以消除自體連接的載體。然后將該連接起來的DNA轉(zhuǎn)化入XLI藍(lán)細(xì)胞中，并用32P標(biāo)記的探針(Feinberg和Vogelstein，1984，分析生物化學(xué)，137，266-267)篩選重組克隆。從陽性克隆中分離DNA并用BamHI消化之。將來源于該重組克隆但未被BamHI線性化的DNA和兩個CHR3引物用于PCR程序，來證實插入片段的大小。采用雙脫氧終止法對來自重組子的DNA測序。在3-和5-端，核苷酸序列與CHR3的3-和5-端的核苷酸序列一致。每一方向選取一個克隆，用于轉(zhuǎn)入CfMNPV。實施例2重組病毒的產(chǎn)生采用脂轉(zhuǎn)染法，將CFMNPVDNA和重組的轉(zhuǎn)移載體DNA(有義和反義方向的CHR3)共轉(zhuǎn)染到CF-124T細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染一周之后，收集培養(yǎng)基并將之用作純化重組病毒的空斑接種物。為了空斑純化，把各種稀釋度的重組芽(budded)病毒(BV)鋪板到CF-203細(xì)胞上。侵染一周后，用X-gal對接種板染色。挑取在最低稀釋度觀察到藍(lán)色的區(qū)域并將之再度空斑化。重復(fù)該步驟4次。得到了在有義方向和反義方向表達(dá)CHR3的兩株病毒。然后將空斑純化的病毒在CF-203細(xì)胞中擴(kuò)增。從BV中分離DNA，用HindIII消化并在瓊脂糖凝膠上分離之。將該凝膠上的DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜上，并用32P標(biāo)記的CHR3探針檢測。如圖2所示，在重組病毒DNA的消化物中觀察到與CHR3探針雜交的一條帶，但在野生型的DNA中卻未觀察到。重組子的HindIII消化圖譜與野生型CFMNPVDNA的相比較表明，CHR3插入到了CFMNPV的預(yù)期區(qū)域內(nèi)。把自重組病毒分離的DNA和CHR3引物用于CPR程序中，以證實該重組病毒中的CHR3插入體的大小。發(fā)現(xiàn)兩株病毒均含有預(yù)期大小的插入體。然后對該P(yáng)CR擴(kuò)增的DNA測序，該核苷酸序列與CHR3的序列相一致。實施例3CHR3表達(dá)的時間過程為了研究CHR3在被重組表達(dá)感染的CF-203細(xì)胞中表達(dá)的時間過程，用以有義方向或反義方向表達(dá)CHR3的重組表達(dá)對CF-203細(xì)胞接種。分別在接種后0、6、12、24、48、96小時時收集細(xì)胞。分離總RNA，并采用CHR3cDNA作探針以Northern雜交法分析之。如圖3所示，無論用兩株病毒的那一株接種，在接種后24小時時CHR3mRNA開始積累。直到接種后96小時時，該mRNA的還保持高水平存在。實施例4重組病毒殺蟲活性的評價在第一組試驗中，將從CF-203細(xì)胞中分離得到的1×105個包涵體(occlusionbodies)(OB)飼喂第5齡的樅色卷蛾幼蟲，所述的CF-203細(xì)胞是用以有義方向或反義方向表達(dá)CHR3的重組病毒接種過的細(xì)胞。在用以有義方向表達(dá)CHR3的重組病毒對該幼蟲飼喂2-3天后，10只幼蟲中的8只表現(xiàn)出頭部被膜滑落(HCS)并保持在半死狀態(tài)，其它兩只以第5齡幼蟲死亡。這些表現(xiàn)出頭部被膜滑落的幼蟲，其頭部被膜不變黑，停止進(jìn)食，保持在半死狀態(tài)并最終死亡。在某些情況下，后腸自肛門伸出。這些癥狀與幼蟲由于對非類固醇蛻皮激素拮抗劑tebufenozide的中毒而表現(xiàn)出的癥狀相似。用以反義方向表達(dá)CHR3的重組病毒飼喂的幼蟲，沒有一只表現(xiàn)出這些癥狀。從表現(xiàn)出部分蛻皮癥狀的昆蟲中分離獲得病毒，并用于第二組和第三組如表1和表2所示的生物試驗。以低至100OB劑量的重組病毒飼喂的幼蟲也表現(xiàn)出不完全蛻皮的典型癥狀。表1</tables>表2</tables>實施例5表達(dá)Manduca激素受體3(MHR3)的苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcMNPV)的產(chǎn)生我們已經(jīng)構(gòu)建了表達(dá)MHR3的重組的AcMNPV。通過限制酶消化(即，以EcoRI和XhoI消化)來分離MHR3Cdna(Palli等人，1992，發(fā)育生物學(xué))，并克隆進(jìn)AcMNPV轉(zhuǎn)移載體pFASTBACI(生命科技公司)的EcoRI和XhoI位點之間。然后按照由生產(chǎn)商(生命科技公司)提供的步驟鑒定表達(dá)MHR3的AcMNPV重組子。采用MHR3cDNA作探針，以Southern印跡法驗證MHR3DNA存在于AcMNPV重組子中。由空斑測驗步驟測定病毒的滴度。用感染復(fù)數(shù)(MOI)為1的AcMNPV重組子對培養(yǎng)在SF-900培養(yǎng)基中的昆蟲細(xì)胞系—草地貪夜蛾9細(xì)胞(ATCCCRL-1711)接種。在接種后12、24、48和96小時時收獲細(xì)胞。從一組細(xì)胞樣品中分離RNA，在1.0％的瓊脂糖甲醛凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜上，并在Northern雜交條件下用MHR3cDNA探測。從另一組細(xì)胞樣品中分離蛋白質(zhì)，并采用MHR3抗體以Western印跡分析該蛋白質(zhì)。在接種12小時后開始在AcMHR3接種的SF-9細(xì)胞中檢測到MHR3RNA，并在接種24小時后開始檢測到MHR3蛋白質(zhì)。然后通過生物測驗法，用粉紋夜蛾幼蟲對該重組的AcMHR3進(jìn)行評價。未經(jīng)修飾的AcMNPV和表達(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的重組AcMNPV(其構(gòu)建方法類似于AcMHR3)被用來在生物測驗中與AcMHR3比較。將含有一定量病毒(空斑形成單位)的溶液1μl注射入倒數(shù)第二齡的T.Ni幼蟲體內(nèi)。注射之后，將幼蟲轉(zhuǎn)移到攝食杯中，并每日對該幼蟲進(jìn)行觀察直至它們飼喂或化蛹。如圖4所示，AcMHR3能殺死昆蟲，并且其效率比AcMNPV高1000倍。AcGFP的效率僅比AcMNPV高15倍。在上述說明書中已對本發(fā)明的原則、優(yōu)選實施方案和操作方式進(jìn)行了描述。然而，不能把意欲在此得到保護(hù)的本發(fā)明看作限制在具體公開的形式之內(nèi)，因為它們僅為了描述而不是限制。在不背離本發(fā)明精神的前提下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可進(jìn)行各種變化和改變。權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，含有異源DNA，所述的DNA編碼發(fā)育調(diào)控的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子并與轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地連接。2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，其中所述的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子與昆蟲的蛻皮和變態(tài)有關(guān)。3.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，其中所述的異源DNA編碼包括受發(fā)育調(diào)控的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子和可測產(chǎn)物的融合蛋白。4.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，其中所述的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子選自果蠅BR-C、E74、E75、超氣孔蛋白、E78、Sevenup、Kni/Knrl/egon、FTZ-F1、DHR38、E93、Relish-抗細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子、Col-頭模式轉(zhuǎn)錄因子、Escargot和蝸牛轉(zhuǎn)錄因子、Dorsal轉(zhuǎn)錄因子、DSX-M和DSX-F轉(zhuǎn)錄因子、Dif、無眼轉(zhuǎn)錄因子、Gap基因kni轉(zhuǎn)錄因子、kB樣免疫基因活化轉(zhuǎn)錄因子、由調(diào)控前/后termini胚胎發(fā)育的合子基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子、DHR78、DHR96、ManducaMHR-3蛻皮激素誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子、卷蛾激素受體2(CHR2)、卷蛾激素受體3(CHR3)樅色卷蛾蛻皮激素受體(CfEcR)、樅色卷蛾超氣孔蛋白(CfUSP)、Spodoptera病毒gp64活化轉(zhuǎn)錄因子、Egr-1主開關(guān)基因、以及BombyxMori絲蛋白轉(zhuǎn)錄因子。5.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，其中所述的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子選自卷蛾激素受體2(CHR2)、卷蛾激素受體3(CHR3)、樅色卷蛾蛻皮激素受體(CfEcR)、樅色卷蛾超氣孔蛋白(CfUSP)、Manduca激素受體3(MHR3)、以及果蠅激素受體38(DHR38)。6.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，其中所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)選自p10啟動子、多角體蛋白啟動子、ETL啟動子、IE1啟動子、egt啟動子、p35啟動子、肌動蛋白啟動子。7.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，其中所述的病毒是DNA病毒。8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，其中所述的DNA病毒選自桿狀病毒、昆蟲痘病毒A、以及昆蟲痘病毒B。9.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，其中所述的異源DNA存在于病毒基因之內(nèi)，所述病毒基因選自多角體蛋白基因、p10基因、p48基因、蛻皮類固醇葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因。10.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒，其中所述的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子在被權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒感染的昆蟲中表達(dá)。11.殺蟲組合物，含有權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒和適于環(huán)境的載體。12.治理害蟲的方法，包括向含有所述害蟲的地區(qū)施用權(quán)利要求11的殺蟲組合物。13權(quán)利要求12的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因病毒含有編碼受發(fā)育調(diào)控的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的異源DNA，所述轉(zhuǎn)錄因子天然存在于所述的昆蟲中。14.使昆蟲異常發(fā)育的方法，包括用權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒侵染昆蟲。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因病毒含有編碼受發(fā)育調(diào)控的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的異源DNA，所述轉(zhuǎn)錄因子天然存在于所述的昆蟲中。全文摘要本發(fā)明描述的是一種含有昆蟲轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因病毒。具體地講,該轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒含有涉及蛻皮和變態(tài)的昆蟲轉(zhuǎn)錄因子。這樣的轉(zhuǎn)基因昆蟲病毒可用作生物殺蟲劑。文檔編號C12N7/00GK1190128SQ98100159公開日1998年8月12日申請日期1998年1月22日優(yōu)先權(quán)日1997年1月22日發(fā)明者蘇巴·雷迪·帕利,巴茲爾·蒙塔茲·阿里夫,薩爾達(dá)·辛格·索黑,阿瑟·雷特納卡蘭申請人:加拿大自然資源部