專利名稱：煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙酰胺(nicotianamine)轉(zhuǎn)氨酶、其基因及其利用。
在干燥地面的鈣化土壤、鹽沉積土壤約占世界土壤的30％，包括中國、中東及近東國家、中部及北部非洲、中部及西部美洲等。在該土壤中，由于高PH值，土壤中的鐵是不溶解的。植物不能在該土壤中生長，由于缺鐵而形成缺綠病，除非其可通過任何方法從根部吸收可溶形式的鐵。當(dāng)需要農(nóng)業(yè)及環(huán)境綠化時，對付土壤中可溶性鐵的缺乏的措施將是一個重要的問題。
作為通過農(nóng)業(yè)技術(shù)解決植物缺鐵的措施，可考慮(1)通過加入硫而校正堿性土壤的PH至中性或微酸性，(2)應(yīng)用含有螯合鐵的物質(zhì)或(3)通過增強(qiáng)土壤微生物活性而增加土壤中可溶性鐵，例如，通過應(yīng)用無機(jī)物質(zhì)的方法，因而增加微生物的含鐵細(xì)胞(鐵運(yùn)輸體)。
然而，用于通過土壤處理而提供鐵的這些方法不總是令人滿意的，因?yàn)榇嬖谶@樣的問題，例如，需要大量的應(yīng)用材料，其效果依據(jù)應(yīng)用的方法很不穩(wěn)定，該方法包括應(yīng)用時間、應(yīng)用地點(diǎn)、濃度、擴(kuò)散劑(spreader)種類等以及天氣條件。因此，已要求開發(fā)新的技術(shù)。
在這些條件下，本發(fā)明者進(jìn)行了深入的研究并發(fā)現(xiàn)了一種新基因，其適用于增強(qiáng)對土壤中不溶性鐵的吸收能力并提高對鐵缺乏的抗性且因此完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供(1)一種蛋白，其包括由SEQ ID NO1或2所代表的氨基酸序列或具有單個或多個氨基酸缺失、替代或添加的氨基酸序列并具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的氨基酸序列(以下稱為本發(fā)明蛋白)，(2)編碼在前面第1項(xiàng)中定義蛋白的基因(以下稱為本發(fā)明基因)，
(3)具有編碼SEQ ID NO1或2所代表的氨基酸序列的核苷酸序列根據(jù)前面第2項(xiàng)的基因，(4)具有由SEQ ID NO3或4所代表的核苷酸序列根據(jù)前面第3項(xiàng)的基因，(5)包括根據(jù)前面第2項(xiàng)基因的質(zhì)粒(以下稱為本發(fā)明質(zhì)粒)，(6)一種表達(dá)質(zhì)粒，包括(1)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子，(2)根據(jù)前面第2項(xiàng)的基因和(3)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子，以上述的順序可操作地(operably)連接(以下稱為本發(fā)明表達(dá)質(zhì)粒)，(7)用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的方法，其包括結(jié)合(1)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子，(2)根據(jù)前面第2項(xiàng)的基因和(3)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子，以上述順序可操作地連接(以下稱為本發(fā)明構(gòu)建方法)，(8)包括帶有在前面第5項(xiàng)或第6項(xiàng)中定義質(zhì)粒的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化子，(9)根據(jù)前面第8次的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主是微生物。
(10)根據(jù)前面第8項(xiàng)的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞，(11)用于增強(qiáng)宿主細(xì)胞鐵吸收能力的方法，其包括向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入通過結(jié)合以下內(nèi)容而形成的表達(dá)質(zhì)粒(1)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子，(2)煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因和(3)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子，以上述順序可操作地連接和轉(zhuǎn)化和所述的宿主細(xì)胞，(12)根據(jù)前面第11項(xiàng)的方法，其中的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞；(13)根據(jù)前面第12項(xiàng)的方法，其中的煙酰轉(zhuǎn)氨酶基因?yàn)榍懊娴?項(xiàng)中定義的基因。
(14)具有根據(jù)前面第2、3或4項(xiàng)基因部分序列的基因片段(以下稱為本發(fā)明基因片段)，(15)根據(jù)前面第14項(xiàng)的基因片段，其中的堿基數(shù)目為15或更多和50或更少，(16)根據(jù)前面第14項(xiàng)的基因片段，具有由SEQ ID NO5所代表的核苷酸序列。
(17)用于檢測煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的方法，其包括用根據(jù)前面第14、15或16項(xiàng)的基因片段通過應(yīng)用雜交方法從植物基因片段中檢測煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因，其具有編碼有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性酶氨基酸序列的核苷酸序列，或者該轉(zhuǎn)氨酶的基因片段(以下稱為用于本發(fā)明的檢測方法)，(18)用于擴(kuò)增煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的方法，其包括用在前面第14、15或16項(xiàng)中定義的基因片段作為引物從植物基因片段中通過應(yīng)用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增具有編碼有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性酶氨基酸序列的核苷酸序列的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因或其基因片段(以下稱為用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法)，(19)用于獲得煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的方法，其包括通過在前面第17項(xiàng)或18項(xiàng)中定義的方法鑒定煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因或其基因片段，并且分離和純化鑒定的基因或其基因片段，和(20)通過在前面第19項(xiàng)中定義的方法而獲得的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因。發(fā)明詳述本發(fā)明將在下面加以更為詳細(xì)的描述。
本發(fā)明蛋白包括由SEQ ID NO1或2所代表的氨基酸序列或這樣的氨基酸序列，即含有具有單個或多個氨基酸缺失、替代或添加的氨基酸序列并具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性。
這樣蛋白可通過例如，下述的方法從禾本科(Gramineae)植物，例如，大麥(Hordeum vulgare)中制備。
本發(fā)明蛋白的實(shí)例包括SEQ ID NO1或2的氨基酸序列或具有47KDa分子量包括從SEQ ID NO1的NO33氨基酸開始的429個氨基酸的氨基酸序列。
煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性以下指從煙酰胺轉(zhuǎn)移氨基至2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)上的能力。
煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性可通過，例如，在kanazawa，K等，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志，45，1903-1906(1994)及其文獻(xiàn)中描述的方法加以測定。具體地，將底物煙酰胺、2-酮戊二酸(2-oxoglutaric acid)和作為輔酶的磷酸吡哆醛加入到酶溶液中且混和物在250℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)以后，通過加入NaBH3還原反應(yīng)產(chǎn)物且通過HPLC測定deoxymugineic acid。
為了從禾本科(Gramineae)植物如大麥(Hordeum Vulgare)等制備本發(fā)明蛋白，例如，將被處理用于鐵缺乏的禾本科(Gramineae)植物如大麥的整個根進(jìn)行粉碎并且通過將獲得的提取物進(jìn)行疏水相互作用層析、吸附層析、陰離子交換層析、凝膠過濾及第二次吸附層以該順序用活性作為指標(biāo)部分純化本發(fā)明蛋白。將從第二次吸收層析獲得的單個蛋白餾份進(jìn)行雙向電泳并且按每個餾份的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的強(qiáng)度進(jìn)行取舍而檢測出蛋白點(diǎn)。該檢測出的蛋白點(diǎn)表示本發(fā)明的蛋白。本發(fā)明蛋白可通過從雙向電泳膠中分離加以純化。
通過由本發(fā)明蛋白催化的反應(yīng)及隨后的反應(yīng)制備的mugineic acid類似物如deoxymugineic acid，通過進(jìn)一步隨后的羥化反應(yīng)等而制備3’-hydroxymugineic acid通過與土壤中不溶性鐵形成螯合復(fù)合物而溶解鐵。有些種類的植物可生物合成所述的mugineic acid類似物，它們從根部分泌至生根區(qū)(rooting zone)的土壤中，從而以mugineic acid復(fù)合物的形式溶解不溶性鐵并經(jīng)根部直接吸收鐵復(fù)合物。因此，通過在所述植物中適當(dāng)表達(dá)大量本發(fā)明的蛋白增強(qiáng)mugineic acid類似物產(chǎn)量并增加吸收不溶性鐵的能力是可能的。
本發(fā)明的基因編碼包括由SEQ ID NO1或2所代表的氨基酸序列或含有具單個或多個氨基酸缺失、替代或添加并具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性所述氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白。
這種基因可以禾本科(Gramineae)植物，例如，大麥(Hordeum vulgare)等通過，例如，下述的方法加以制備。
此外，本發(fā)明基因包括編碼包括由SEQ ID NO1或2所代表的氨基酸序列或含有具有單個或多個氨基酸缺失、替代或添加并具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性所述氨基酸序列的氨基酸序列蛋白的基因并且包括，例如，在嚴(yán)格條件下與所述基因序列雜交的基因。這里嚴(yán)格的條件指，例如，在篩選實(shí)施例4中所述的cDNA文庫中所用的條件。
該基因核苷酸序列的具體實(shí)施包括由SEQ ID NO3(CDS位置為62-1444)或SEQ ID NO4(CDS位置為76-1731)所代表的核苷酸序列。
通過將本發(fā)明基因?qū)肜胢ugineic acid化合物吸收鐵的植物中而增強(qiáng)獲得的轉(zhuǎn)化子植物中mugineic acid化合物的生物合成能力從而增加吸收生根區(qū)土壤中不溶性鐵的能力并增強(qiáng)對缺鐵的抵抗力是可能的。
為了制備本發(fā)明基因，例如，通過蛋白測序儀測定通過部分水解本發(fā)明蛋白而獲得肽段的氨基酸序列和本發(fā)明蛋白的N-末端氨基酸序列。合成包括從這些氨基酸序列中推斷的DNA序列的兩條或更多條引物。用從被處理用于鐵缺乏的禾本科(Gramineae)植物如大麥的根部制備的mRNA通過反轉(zhuǎn)錄酶方法而合成的cDNA作為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出本發(fā)明基因的cDNA片段。用擴(kuò)增的該cDNA片段作為探針，完成下述cDNA文庫的篩選。從被處理用于鐵缺乏的禾本科(Gramineae)植物如大麥的根部制備的mRNA通過反轉(zhuǎn)錄酶方法合成cDNA且將其整合到噬菌體載體如λZAPII等或質(zhì)粒載體如pUC等中以制備cDNA文庫。用上面提到的探針篩選該文庫且篩選出煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的cDNA?？赏ㄟ^測定篩選出cDNA的序列來證實(shí)該篩選出的cDNA就是煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的cDNA(本發(fā)明基因的cDNA)。
為了用篩選出的cDNA用這種方式獲得基因組DNA并測定其序列，例如，將植物組織如葉、莖、根等立即冰凍并以杵臼或Waring混合器充分粉碎。根據(jù)Itaru Watanase(主持(supervisor))、Masahiro Sugiura(編)，在“克隆和測序(植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊)”，Nosonbunka-sha，東京(1989)等中描述的常規(guī)方法從獲得的粉碎產(chǎn)物中提取基因組DNA。將獲得的基因組DNA以適當(dāng)?shù)南拗泼赶@得的基因組DNA片段通過已知的方法如蔗糖密度梯度離心或氯化銫平衡離心等進(jìn)行分離。將每種基因組DNA片段部分用篩選出的cDNA(本發(fā)明基因的cDNA)作為探針進(jìn)行常規(guī)的southern雜交以測定含有所需基因的基因組DNA片段部分。
通過將該基因組DNA片段部分連接到商業(yè)上可得到的載體如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒等上而制備基因組DNA文庫。用本發(fā)明基因的cDNA作為探針通過雜交將文庫進(jìn)行常規(guī)的篩選以獲得含有編碼本發(fā)明蛋白氨基酸序列核苷酸序列的基因組DNA克隆?？蓪@得的DNA克隆亞克隆到適于用于基因序列分析的載體，例如，質(zhì)粒等上并根據(jù)常規(guī)方法分析該序列以測定含有編碼本發(fā)明蛋白氨基酸序列的序列的基因組DNA序列。
可通過在Bina-Stem，Met等.，美國自然科學(xué)院院報，76，731(1979)，Sollner-Webb和Reader，R.H.，細(xì)胞，18，485(1979)，等中描述的引物延伸方法或在Berk，A.J.和sharp，P.A.，美國自然科學(xué)院院報，75，1274(1978)中描述的S1作圖法測定本發(fā)明基因的基因組DNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。用該方式測定出轉(zhuǎn)錄起始所必需的TATA序列位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游?？刂苹虮磉_(dá)的啟動子序列存在于通常該轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的1kb到約10kb處。本發(fā)明基因啟動子區(qū)域可最終通過，例如，以下方法加以測定，包括將具有不同長度啟動子區(qū)域的基因片段與報告基因如GUS等連接，制備將連接產(chǎn)物導(dǎo)入其中的轉(zhuǎn)基因植物，并研究在制備植物的不同組織中報告基因的表達(dá)與否。
另一方面，終止子序列存在于相應(yīng)于polyA序列的基因組DNA區(qū)域，通常位于poly(A)額外信號(連續(xù)序列為AATAAA)的下游，存在于終止子下游的末端3’-非翻譯區(qū)，且具有有效的翻譯終止功能。
本發(fā)明的質(zhì)粒含有編碼包括以下氨基酸序列蛋白的基因，即由SEQ IDNO1或2所代表的氨基酸序列或含有具有單個或多個氨基酸缺失、替代或添加的氨基酸序列并具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的氨基酸序列。
質(zhì)粒優(yōu)選的具體實(shí)例包括通過將具有編碼由SEQ ID NO1所代表的氨基酸序列核苷酸序列的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因克隆λpSK-(strategene)而制備的質(zhì)粒。該質(zhì)粒具有其載體部分小的特征，在大腸桿菌中有很多拷貝，因此其適于用于DNA制備或DNA結(jié)構(gòu)分析。
本發(fā)明表達(dá)質(zhì)?？赏ㄟ^結(jié)合以下部分加以構(gòu)建，包括(1)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子，(2)編碼包括由SEQ ID NO1或2所代表的氨基酸序列或含有具有單個或多個氨基酸缺失、替代或添加的所述氨基酸序列，并具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的氨基酸序列蛋白的基因和(3)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子，以上述的順序可操作地連接。
這里以下所用的術(shù)語“可操作地連接”意思為，當(dāng)將構(gòu)建的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞以將其轉(zhuǎn)化時，本發(fā)明的基因在啟動子的控制下加以整合從而使該基因在所述的宿主細(xì)胞中具有表達(dá)本發(fā)明蛋白的功能。
能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子包括，例如，大腸桿菌乳糖操縱子啟動子、酵母乙醇脫氫酶(ADH)啟動子、腺病毒主要晚期(Ad.ML)啟動子、SV40早期啟動子、桿狀病毒啟動子等。當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時，啟動子包括，例如，源自T-DNA的組成型啟動子如胭脂氨酸(nopaline)合酶基因(NOS)啟動了、章魚堿合酶基因(OCS)啟動子等，源自植物病毒的啟動子如源自花椰菜花葉病毒(CaMV)的19S和35S啟動子等，以及可誘導(dǎo)型啟動子如苯丙氨酸脫氨酶(ammonialyas)(PAL)基因啟動子、查耳酮合酶(CHS)基因啟動子，病原體相關(guān)(PR)基因啟動子等。此外，還包括不限于它們當(dāng)中的已知植物啟動子。
能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子包括，例如，酵母HIS終止子序列、ADH1終止子、SV40早期剪切區(qū)等。當(dāng)宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞時，終止子包括，例如，源自T-DNA的組成型啟動子如胭脂氨酸合酶基因(NOS)終止子等，源自植物病毒的終止子如大蒜病毒GV1、GV2終止子等。此外，還包括不限于它們當(dāng)中的已知植物終止子。
通過將這種質(zhì)粒(本發(fā)明(表達(dá))質(zhì)粒)導(dǎo)入所述的宿主細(xì)胞而轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。當(dāng)宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞時，通過任何一種常規(guī)方法如農(nóng)桿菌(Agrobacterium)感染方法(JP-B-2-58917和JP-A-60-70080)、向原生質(zhì)球的電穿孔方法(JP-A-60-251887和JP-A-5-68575)、粒子槍方法(JP-A-508316和JP-A-63-258525)等將本發(fā)明的(表達(dá))質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可篩選其中導(dǎo)入有本發(fā)明基因的植物細(xì)胞而獲得。根據(jù)常規(guī)的植物細(xì)胞培養(yǎng)方法，例如，在Hirohumi Utimiya，植物基因操作手冊(制備轉(zhuǎn)基因植物方法)，Kodansha Scientific出版(ISBN4-06-153515-7C3045)，1990，27-55頁中描述的方法，通過再生植物體而獲得轉(zhuǎn)化的植物體。
通過將本發(fā)明質(zhì)粒導(dǎo)入是任何一種如大腸桿菌等微生物的宿主細(xì)胞并允許在所述的宿主細(xì)胞中高度表達(dá)，大量本發(fā)明的蛋白可容易地從宿主細(xì)胞中得到分離。通過利用大批量制備的本發(fā)明蛋白而建立煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶抑制劑的篩選系統(tǒng)。例如，根據(jù)上述的用于測定煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的方法，加入底物煙酰胺、2-酮戊二酸和作為輔酶的磷酸吡哆醛以及該選抑制劑化合物以制備酶溶液，并將混合物在25℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后，通過以加入NaBH3和deoxymugineic acid的還原反應(yīng)應(yīng)用HPLC篩選出沒有表現(xiàn)出煙酰轉(zhuǎn)氨酶活性的化合物。
在利用mugineic acid化合物吸收鐵的植物中，煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)在鐵缺乏條件下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。由于普通的土壤(地表土壤)處于氧化的條件下且土壤溶液中的鐵濃度僅為高度低于植物所需104-10-8M的水平，煙酰胺轉(zhuǎn)氯酶基因和mugineic acid生物合成基因總是被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)。換句話說，植物通過常規(guī)地生物合成muginerc acid化合物并從根部將它們分泌至生根區(qū)中的土壤里而主動地吸收不溶性鐵。
通過篩選系統(tǒng)篩選出的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性抑制劑可以是用作抗通過利用類似于mugineic acid的化物吸收鐵植物選擇性除草劑的化合物。
此外，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)鐵吸收能力的方法，包括將通過結(jié)合以下內(nèi)容而形成的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，包括(1)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子，(2)煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因和(3)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子，以上述的順序可操作地連接并轉(zhuǎn)化所述的宿主細(xì)胞。能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子包括上述的啟動子。
煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因包括，例如，源自植物的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因和優(yōu)選為本發(fā)明基因。
能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子包括上述的終止子。
本發(fā)明的基因片段指具有SEQ ID NO’3或4所代表的本發(fā)明基因部分序列的基因片段并且包括具有編碼包括由SEQ ID NO1或2所代表的氨基酸序列或含有具有單個或多個氨基酸缺失、替代或添加的所述氨基酸序列，并具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的氨基酸序列蛋白基因部分序列的基因片段，具體地，例如，由SEQ ID NO5所代表的基因片段。
這些基因片段用作雜交中的探針或PCR中的引物。特別地，作為用于PCR中的引物，具有15個或更多和50個或更少核苷酸的基因片段是優(yōu)選的。
本發(fā)明的檢測方法為這樣的一種方法，即用本發(fā)明基因片段作為探針通過應(yīng)用雜交方法從植物基因片段中檢測具有編碼具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性酶氨基酸序列核苷酸序列的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因或其基因片段。
具體地，例如，該方法可根據(jù)在“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版”(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社或“當(dāng)前分子生物學(xué)方法”(1987)，John wiley & Sons，公司.，ISBN471-50338-X中描述的方法加以完成。用于這里的基因片段可包括，例如，靶植物的cDNA文庫、基因組DNA文庫等。所述的植物基因片段可以是源自植物的那些商業(yè)上可得到的文庫，或也可以是根據(jù)在“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版”(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社或在“當(dāng)前分子生物學(xué)方法”(1987)，John Wiley & Sons，公司，ISBNO-471-50338-X中描述的制備文庫的常規(guī)方法而制備的文庫。
通過根據(jù)本發(fā)明檢測方法鑒定煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因或其基因片段并且分離/純化鑒定的基因或基因片段來獲得煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因也是可能的。
本發(fā)明檢測方法可用于植物分析中。具體地，根據(jù)在Itaru Watanabe(主編)，Masahiro Sugiura(編)，“克隆和測序(植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南)”，Nosonbunka-sha，東京(1989)等中描述的常規(guī)方法而用于本發(fā)明的檢測方法從特異植物種類的不同栽培品種中制備植物基因組DNA。然后以至少幾種合適的限制酶將其切割，電泳并通過常規(guī)方法通過印跡而用于制備濾膜。
用通過常規(guī)方法制備的探針且利用基于DNA片段長度差異的不同栽培品種之間伴隨以mugineic acid生物合成的表型特征差異在濾膜上進(jìn)行雜交。此外，當(dāng)特定的植物與非重組植物相比時如果該植物較非重組基因植物具有更多檢測到的雜交帶，則判定該植物為重組基因植物。此方法優(yōu)選根據(jù)在koshimamoto和Takuji sasaki(主編)，“植物PCR實(shí)驗(yàn)方法，”shujunsha，東京(1995)，ISBN4-87962-144-7，90-94頁中描述的PFLP(限制性片段長度多態(tài)性)方法完成。
用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法為這樣的方法，即用本發(fā)明基因片段作為引物通過應(yīng)用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))從植物基因片段中擴(kuò)增具有編碼具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性酶氨基酸序列的核苷酸序列的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因或其基因片段。具體地，例如，該方法可根據(jù)在ko shimamoto和Takuji sasaki(主編)，“植物PCR實(shí)驗(yàn)方法”，shujunsha，東京(1995)，ISBN4-87962-144-7等中描述的方法加以完成。
通過根據(jù)用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法鑒定煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因或其基因片段并且分離/純化鑒定出的基因或基因片段來獲得煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因也是可能的。
此外，用于本發(fā)明的擴(kuò)增方法可用于植物分析中。具體地，例如，用從特定植物中制備的植物基因組DNA作為模板且用本發(fā)明的基因片段作為引物通過進(jìn)行PCR而擴(kuò)增本發(fā)明部分或全部的基因。將獲得的PCR產(chǎn)物與甲醛溶液混合并通過于850℃加熱5分鐘將混合物變性，接著于冰上迅速冷卻。將此樣品于，例如，含0％或10％濃度甘油的6％丙烯酰胺凝上電泳。電泳用用于SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)的商業(yè)上可得到的電泳儀上進(jìn)行，維持凝膠溫度在，例如，5℃，25℃，37℃等。將遷移的凝膠用商業(yè)上可得到的試劑進(jìn)行溴化乙錠染色等以檢測DNA。
根據(jù)檢測到DNA片段遷移的差異分析基于本發(fā)明基因突變不同栽培品種(cultivars)之間伴隨muginelc acid生物合成的表型特征差異。此方法優(yōu)選根據(jù)在ko shimamoto和Takuji sasaki(主編)，“植物PCR實(shí)驗(yàn)方法”，shujunsha，東京(1995)，ISBN4-87962-144-7，141-146頁中所述的方法完成。
實(shí)施例本發(fā)明現(xiàn)將根據(jù)實(shí)施例加以更為詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例不應(yīng)該成為對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1(分離本發(fā)明蛋白的方法)
在提取緩沖液(0.2M Tris-HCl，10mM EDTA，0.1mM p-APMSF，10mMDTT，5％甘油，5％聚乙烯吡咯烷酮PH8)中有150g被處理用于鐵缺乏的粉碎大麥根。將粉碎產(chǎn)物于8,000×g離心30分鐘并且分離上清。向獲得的上清中加入硫酸銨直至達(dá)到30％的飽和度。將制備的樣品應(yīng)用于以30％飽和硫酸銨緩沖液(50mM Tris-HCl(PH8.0)，5mM EDTA，10mM DTT)平衡的ButylToyopearl(TOSO生產(chǎn))，并且經(jīng)前面的緩沖液沖洗后以15％飽和度的硫酸銨緩沖液洗脫。向洗脫的餾份中加入p-APMSF至終濃度0.1mM并將混合物于0.1mM KCl，50mM KH2PO4/K2HPO4(PH6.8)，10mM DTT中透析過夜，接著應(yīng)用于以所述緩沖液平衡的羥磷灰石(100-350網(wǎng)眼，Nakarai生產(chǎn))。然后將其以相同的緩沖液沖洗并以0.5M KH2PO4/K2HPO4(PH6.8)，10mM DTT洗脫。為了以20mM Tris-HCl(PH8.0)10mM KCl，10mM DTT交換緩沖液將洗脫餾份以Molecut(Miuipore，區(qū)別分子量10,000)處理并應(yīng)用于以相同緩沖液平衡的DEAE Sephasel(發(fā)瑪西亞生產(chǎn))。以相同的緩沖液沖洗以后，將其以10mM-500mMKCl的濃度梯度洗脫。為了以20mM Tris-HCl(PH8.0)、10mMKCl、5mME DTA、1mM DTT改變緩沖液，將未被DEAE Sephasel吸附的餾份以Molcut處理并應(yīng)用于NA-Sepharose 4B，它是具有結(jié)合煙酰胺(NA)的EAH-Sepharose 4B(發(fā)瑪西亞生產(chǎn))。以相同的緩沖液沖洗后，將其以1mM NA、10mM KCl、20mM Tris-HCl(PH6.0)洗脫。將洗脫的餾份進(jìn)行雙向電泳，與應(yīng)用于NA-Sepharose 4B柱之前的樣品相比得到了很濃的位點(diǎn)。該位點(diǎn)表示通過分離所述位點(diǎn)而分離的本發(fā)明蛋白。
通過蛋白測序儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)生產(chǎn))分析這樣分離的本發(fā)明蛋白的N-末端氨基酸序列。顯示的結(jié)果表示由SEQ ID NO1中NO33到47氨基酸所示的氨基酸序列。此外，用相同的方式分析通過以含1％溴化氰(bromocyan)的70％甲酸溶液處理而形成的3肽段N-末端氨基酸序列。
實(shí)施例2(用于克隆本發(fā)明蛋白cDNA探針的制備)根據(jù)在Itaru Watanabe(主編)、Masahiro Sugiura(編)、“克隆和測序(植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊)”，Nosonbunka-sha，東京(1989)，34-40頁中描述的SDS-酚方法從6g被處理用于鐵缺乏的大麥根中回收255μg總RNA。從回收的總RNA中，取出75μg部分并且用于用Dynabeads mRNA純化試劑盒(由Dynal生產(chǎn))制備poly(A)+RNA。用dT17銜接子引物(5’-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)反轉(zhuǎn)錄制備的poly(A)+RNA以制備cDNA。將部分制備的cDNA用于通過兩步PCR擴(kuò)增本發(fā)明基因的cDNA片段。在第一步反應(yīng)中，用根據(jù)本發(fā)明蛋白的N-末端氨基酸序列合成的引物1(5’GCIGTIGARTGGAAYTTYGCIMG-3’)和上述的dT17銜接子引物且用獲得的cDNA為模板于94℃(40秒)、40℃(1分鐘)、及72℃(2分鐘)重復(fù)25個循環(huán)，并且在94℃(40秒)、45℃(1分鐘)及72℃(2分鐘)重復(fù)25個循環(huán)進(jìn)行PCR。用此PCR反應(yīng)溶液作為模板，用根據(jù)通過以上述的含1％溴化氰(bromocyan)的70％甲酸(formic acid)溶液處理形成的肽段N-末端氨基酸而合成的引物2(5’-GCDATRTGICCRAAIACICC-3’)和引物1于94℃(40秒)、45℃(1分鐘)、及72℃(2分鐘)重復(fù)40個循環(huán)進(jìn)行第二步PCR。通過從0.8％的瓊脂糖電泳凝膠中切除而純化通過第二步PCR而擴(kuò)增的約600bp的DNA片段并用作篩選cDNA文庫的探針。
實(shí)施例3(從被處理用于鐵缺乏的大麥根中制備cDNA文庫)用商業(yè)上可得到的cDNA合成試劑盒(由Gibco BRL生產(chǎn)的用于cDNA合成和質(zhì)?？寺〉腟uper Script(商標(biāo))質(zhì)粒系統(tǒng))，從5μg從實(shí)施例2中描述的被處理用于鐵缺乏的大麥根中制備的poly(A)+RNA中合成cDNA。將該產(chǎn)物與SalI銜接子連接并以NOtI切割以回收cDNA.
通過在R.Daniel Gietz和Akco Sugino，基因，74(1988)，527-534頁中描述的酵母多拷貝質(zhì)粒YEplac181中添加一些修飾制備用于cDNA文庫的載體(以后稱為pYH23)。具體地，去除了YEplac181多克隆位點(diǎn)中HindIII和BamHI到EcoRI位點(diǎn)。此外，將源自pTV-100乙醇脫氫酶的啟動子和終止子序列亞克隆于SphI位點(diǎn)，并將NotI接頭插入此片段的BamHI位點(diǎn)。
將以這種方式制備的pYH23以NotI和XhOI消化，插入按上面制備的cDNA以后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLI-Blue菌株以提供獲自300,000個獨(dú)立菌落的cDNA文庫。
實(shí)施例4(本發(fā)明cDNA克隆的篩選)以商業(yè)上可得到的放射性標(biāo)記試劑盒(隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑2版，TaKaRa)放射性標(biāo)記在實(shí)施例3中制備的探針而制備用于本發(fā)明蛋白cDNA克隆的探針DNA。將具有在實(shí)施例3中制備的源自被處理用于鐵缺乏大麥根部cDNA文庫質(zhì)粒DNA的大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基，于37℃孵育10小時，且然后轉(zhuǎn)移到商業(yè)上可得到的尼龍膜(Hybond(商標(biāo))-N+，Amersham生命科學(xué))。將此膜以10％的SDS處理3分鐘，堿變性溶性(0.5M NaOH，1.5M NaCl)5分鐘，中和溶液(0.5M Tris-HCl(PH7.0)，1.5M NaCl)3分鐘，2×SSPE(20mM磷酸緩沖液(PH7.4)，0.3M NaCl，5mM EDTA)2次3分鐘，并且以紫外線照射3分鐘以不可逆地將DNA固定于膜上。預(yù)雜交用預(yù)雜交液(5×Denhart’s溶液，5×SSPE，0.1％SDS，100μg/ml變性鮭精DNA)于65℃預(yù)雜交1小時。然后，在具有加入到雜交液(5×Denhart’s溶液，5×SSPE，0.1％SDS)中放射性標(biāo)記的探針的溶液中于65℃雜交12小時。之后，以6×SSP于65℃洗膜10分鐘一次，以2×SSP、0.1％SDS于42℃洗膜10分鐘二次，且暴露于富士醫(yī)學(xué)X-線膠卷以檢測陽性菌落。用相同的方式進(jìn)行第二輪和第三輪篩選并且分離本發(fā)明蛋白的cDNA克隆。
實(shí)施例5(編碼本發(fā)明蛋白cDNA核苷酸序列的測定)根據(jù)在J.Sambrook，E.F.Fritsh，T.Maniatis，“分子克隆，第2版”冷泉港出版社(1989)中描述的常規(guī)方法將在實(shí)施例4中分離的本發(fā)明蛋白的cDNA克隆亞克隆人質(zhì)粒載體pBluescnrpt SK(-)以得到質(zhì)粒cDNA克隆。所述cDNA克隆中插入子的核苷酸序列(SEQ ID NO3和4)通過以下方法加以測定，包括(1)用Tag Dye引物循環(huán)測序試劑盒(應(yīng)用生物系統(tǒng)生產(chǎn))通過應(yīng)用系統(tǒng)生產(chǎn)的373A DNA測序儀，(2)用熱序列熒光標(biāo)記引物循環(huán)試劑盒(Amersham生命科學(xué)生產(chǎn))通過DSQ-1000L DNA測序儀(shimadzu生產(chǎn))，或(3)用BcaBEST(標(biāo)標(biāo))雙脫氧測序試劑盒(TaKaRa生產(chǎn))通過BAS-2000(富士膠卷生產(chǎn))。從該序列(見SEQ ID NO3和4)測定蛋白的總氨基酸序列(見SEQ ID NO1和2)。SEQ ID NO1的蛋白具有461個氨基酸并且其分子量計算為49564.15，并且SEQ ID NO1的蛋白具有551個氨基酸并且其分子量計算為58148.62。根據(jù)本發(fā)明，提供新的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶及其基因等是可能的。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，包括由SEQ ID NO1或2所代表的氨基酸序列或含有具有單個或多個氨基酸缺失、替代或添加的所述氨基酸序列并具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的氨基酸序列。
2.一種基因，編碼在權(quán)利要求1中定義的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的基因，其具有編碼由SEQ ID NO1或2所代表氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的基因，其具有由SEQ ID NO3或4所代表的核苷酸序列。
5.一種質(zhì)粒，包括在權(quán)利要求2中定義的基因。
6.一種表達(dá)質(zhì)粒，包括(1)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子，(2)在權(quán)利要求2中定義的基因和(3)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子，以上述的順序可操作地連接。
7.用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的方法，其包括結(jié)合(1)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子，(2)在權(quán)利要求2中定義的基因和(3)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子，以上述的順序可操作地連接。
8.一種轉(zhuǎn)化子，包括帶有在權(quán)利要求5或6中定義的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主是微生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化子，其中的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
11用于增強(qiáng)宿主細(xì)胞鐵吸收能力的方法，其包括將通過結(jié)合以下成份而形成的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞(1)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子，(2)煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因和(3)能夠在宿主細(xì)胞中起作用的終止子，按上述的順序可操作地連接并轉(zhuǎn)化所述的宿主細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因?yàn)樵跈?quán)利要求2中定義的基因。
14.一種基因片段，具有在權(quán)利要求2、3或4中定義基因的部分序列的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的基因片段，其中的堿基數(shù)目為15或更多和50或更少。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的基因片段，其具有由SEQ ID NO5所代表的核苷酸序列。
17.用于檢測煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的方法，包括從植物基因片段中檢測含有編碼具有煙胺轉(zhuǎn)氨酶活性酶氨基酸序列核苷酸序列的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因或通過用在權(quán)利要求14、15或16中定義的基因片段應(yīng)用雜交方法檢測其基因片段。
18.用于擴(kuò)增煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的方法，包括用在權(quán)利要求14、15或16中定義的基因片段作為引物，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))從植物基因片段中，擴(kuò)增含有編碼具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性酶氨基酸序列核苷酸序列的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因或其基因片段。
19.用于獲得煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的方法，包括通過在權(quán)利要求17或18中定義的方法鑒定煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因或其基因片段，并且分離和純化鑒定的基因或其基因片段。
20.通過在權(quán)利要求19中定義的方法獲得的煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因。
全文摘要
提供了一種蛋白,其具有由SEQIDNO:1或2所代表的氨基酸序列或含有具有單個或多個氨基酸缺失、替代或添加的所述氨基酸序列并具有煙酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的氨基酸序列,一種編碼所述蛋白的基因以及其用于增強(qiáng)吸收土壤中不溶性鐵的能力和用于提高對鐵缺乏的抗性。
文檔編號C12N1/21GK1195700SQ98107070
公開日1998年10月14日 申請日期1998年2月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月21日
發(fā)明者森敏, 中西啟仁, 高橋美智子 申請人:住友化學(xué)工業(yè)株式會社