專利名稱：人翻譯起始因子亞基的編碼序列、其編碼的多肽及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人蛋白質(zhì)翻譯起始因子2B的δ亞基以及編碼該蛋白的cDNA序列。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法，以及這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用。
在哺乳動物細胞中，翻譯起始因子2B(eIF-2B，又稱為鳥苷酸交換因子(GEF))對多肽鏈的合成起始有關(guān)鍵性的調(diào)控作用。在蛋白質(zhì)的翻譯過程中，首先形成一個由起始tRNA、GTP和eIF-2組成的三元復合物，然后轉(zhuǎn)移到40S核糖體亞基上。隨著80S起始復合物的形成，GTP被水解，eIF-2以eIF-2-GDP二元復合物的形式被釋放。這個二元復合物在生理條件下是穩(wěn)定的，而且無功能活性。翻譯起始的新一輪循環(huán)要求eIF-2B的參與，因為eIF-2與GDP的親合性比與GTP的親和性高100-400倍，所以需要eIF-2B催化與eIF-2結(jié)合的GDP與GTP進行交換，以便重新生成eIF-2-GTP并參與新一輪的翻譯起始(J.Biol.Chem.268(1993)，7603-7606；Annu.Rev.Biochem.60(1991)，717-755)。因此，eIF-2B在蛋白質(zhì)的翻譯起始的調(diào)控過程中起著重要作用。
哺乳動物的eIF-2B由五個亞基α、β、γ、δ、ε組成，其分子量分別為29、39、54、66、84kDa左右。鼠和兔中各亞基的cDNA序列已經(jīng)相繼被報道。1994年，Nigel等人根據(jù)eIF-2B的δ亞基肽順序設(shè)計冗余寡核苷酸進行PCR，從兔肝臟得到RNA，再進一步指導從網(wǎng)織細胞cDNA庫中分離得到eIF-2B的δ亞基全長cDNA序列(Biochim.Biophy.Acta.(1994)121(2)，207-210)。Henderson等人隨后分離并克隆到鼠的eIF-2B的δ亞基cDNA順序(J.Biol.Chem.(1994)269(48)，30517-30532)。然而在本發(fā)明之前，沒有公開過本申請中涉及的人類翻譯起始因子2B的δ亞基。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼翻譯起始因子2B家族一個新成員的δ亞基，本發(fā)明的翻譯起始因子2B的δ亞基命名為HeIF-2Bd。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的人翻譯起始因子2B的δ亞基，該蛋白被命名為HeIF-2Bd。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人翻譯起始因子2B的δ亞基的方法。
本發(fā)明還涉及這種人翻譯起始因子2B的δ亞基基因和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人HeIF-2Bd蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.10所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的HeIF-2Bd蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.10氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.10序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有HeIF-2Bd蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有HeIF-2Bd蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成HeIF-2Bd蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成HeIF-2Bd蛋白的重組細胞；(c)在適合表達HeIF-2Bd蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有HeIF-2Bd蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為1196個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.9，其中開放讀框位于20-1582位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HeIF-2Bd蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有HeIF-2Bd蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.9中20-1582位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.9序列的編碼框20-1582位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.9中20-1582位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.10所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位的核苷酸序列同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人HeIF-2Bd相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.9序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HeIF-2Bd蛋白多肽”指具有HeIF-2Bd蛋白活性的、SEQID NO.10序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人翻譯起始因子2B的δ亞基相同功能的、SEQ ID NO.10序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括HeIF-2Bd蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與HeIF-2Bd DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗HeIF-2Bd多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含HeIF-2Bd多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了HeIF-2Bd多肽的可溶性片段。通常，該片段具有HeIF-2Bd多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供HeIF-2Bd蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然HEIF-2BD多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括HeIF-2Bd多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)HeIF-2Bd的表達。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有HeIF-2Bd多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼HEIF-2BD的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測HeIF-2Bd核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應(yīng)于HeIF-2Bd多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的各種載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對HEIF-2BD DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于HeIF-2Bd基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與HEIF-2BD基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制HeIF-2Bd蛋白的分子，也包括那些并不影響HeIF-2Bd蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的HeIF-2Bd基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利NO.10,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的HeIF-2Bd基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達HeIf-2Bd或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷HeIF-2Bd功能的抗體，也包括不影響HeIF-2Bd功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用HeIF-2Bd基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與HeIF-2Bd基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體，可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
在本發(fā)明中，HeIF-2Bd的cDNA核苷酸序列是如此獲得的以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物——A15′-GAGCCTAGGACTGAGGGCGATGG-3′(SEQ ID NO.1)和A25′-TGCCTTGCAGCAGGTGATTCAGG-3′(SEQ ID NO.2)為正向引物，寡核苷酸B15′-CTGCAGGAATCAGCAGGTAGGAG-3’(SEQ ID NO.3)和B25′-TCACTGGTCACTGCTCTTGACTCG-3′(SEQ ID NO.4)為反向引物，進行PCR，分別獲得1180bp(A1/B1)和920bp(A2/B2)的目的片段。測序后用計算機分析，拼接得到全長為1582bp的cDNA序列(SEQ ID NO.9)。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的HeIF-2Bd的cDNA序列與其他物種(如兔、鼠)中已知翻譯起始因子2B的δ亞基基因序列高度同源，并且本發(fā)明的新多肽具有與翻譯起始因子2B的δ亞基家族高度同源的氨基酸序列。與已知的屬于翻譯起始因子2B的δ亞基家族的兔和鼠eIF-2B的δ亞基一樣，本發(fā)明的HeIF-2Bd基因也屬于eIF-2B家族并且具有相似的功能。
已知eIF-2B(又稱為鳥苷酸交換因子)參與蛋白質(zhì)翻譯起始，并且調(diào)控翻譯過程，該蛋白的失常會導致蛋白質(zhì)翻譯及調(diào)控不正常。eIF-2B由五個亞基α、β、γ、δ、ε組成，本發(fā)明的HeIF-2Bd是δ亞基的同系物。因此本發(fā)明分離到的HeIF-2Bd的cDNA可以特異地用于檢測與本發(fā)明的eIF-2B同系物的失活導致的蛋白質(zhì)翻譯及調(diào)控失常。此外，本發(fā)明的HeIF-2Bd為蛋白質(zhì)翻譯及調(diào)控失常的治療提供一種途徑。
實施例1HeIF-2Bd的cDNA的克隆和測序1.PCR擴增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物——A15′-GAGCCTAGGACTGAGGGCGATGG-3′(SEQ ID NO.1)和A25′-TGCCTTGCAGCAGGTGATTCAGG-3′(SEQ ID NO.2)為正向引物，寡核苷酸B15′-CTGCAGGAATCAGCAGGTAGGAG-3’(SEQ ID NO.3)和B25′-TCACTGGTCACTGCTCTTGACTCG-3′(SEQ ID NO.4)為反向引物，進行PCR。A1、B1引物對的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、70℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘；A2、B2引物對的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、69℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷，用A1、B1進行PCR得到的目的片段為1180bp，用A1、B1進行PCR得到的目的片段為920bp。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑦@兩段PCR擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(pHarmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1582bp，詳細序列見SEQ ID NO9，其中開放讀框位于20-1582位核苷酸。
根據(jù)得到的全長基因組序列推導出HeIF-2Bd的氨基酸序列，共520個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO10。
實施例2HeIF-2Bd同源比較本發(fā)明的全長cDNA順序進行Basic BLAST同源比較，采用的數(shù)據(jù)庫是非冗余的GenBank+EMBL+DDBJ+PDB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與鼠的鳥苷酸交換因子的δ亞基(數(shù)據(jù)庫編號及名稱gb|M98036|MUSJGR1AX)同源度最高，有四段核苷酸順序與對應(yīng)的MUSJGR1AX相似，它們的相似度分別是81％(1-75位)、81％(193-252位)、87％(458-1586位)、85％(263-467位)。
將本發(fā)明的全長cDNA順序翻譯成蛋白質(zhì)順序，發(fā)現(xiàn)ORF位于20-1582位核苷酸，編碼一段長520個氨基酸的多肽。然后將得到的氨基酸順序進行Basic BLAST同源比較，采用的數(shù)據(jù)庫是非冗余的GenBank翻譯CDS+PDB+SwissPort+更新SP+PIR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與兔、鼠的eIF-2B的δ亞基(數(shù)據(jù)庫編號及名稱sp|P41111|E2BD_RABIT sp|Q61749|E2BD_MOUSE)同源度最高，其中與兔的eIF-2Bd氨基端19個氨基酸殘基100％相似，94％相同，羧基端的四分之三順序也有91％相似，87％相同。因此，該多肽被確定為人翻譯起始因子的δ亞基。
目前已經(jīng)知道，在蛋白質(zhì)的翻譯過程中，首先形成一個由起始tRNA、GTP、eIF-2組成的三元復合物，然后轉(zhuǎn)移到40S核糖體亞基上。隨著80S起始復合物的形成，GTP被水解，從而使eIF-2以eIF-2-GDP二元復合物的形式釋放出來。這個二元復合物在生理條件下是穩(wěn)定的，而且無功能活性。翻譯起始的新一輪循環(huán)要求eIF-2B的參與。因為eIF-2與GDP的親合性比與GTP的親和性高100-400倍，所以需要eIF-2B催化與eIF-2結(jié)合的GDP與GTP進行交換，重新生成eIF-2-GTP，以參與新一輪的翻譯起始(J.Biol.Chem.268(1993)，7603-7606；Annu.Rev.Biochem.60(1991)，717-755)。因為eIF-2B參與蛋白質(zhì)翻譯起始，并且調(diào)控翻譯過程，所以具有重要功能。該蛋白的失常會導致蛋白質(zhì)翻譯及調(diào)控不正常。
eIF-2B由五個亞基α、β、γ、δ、ε組成，本發(fā)明的HeIF-2Bd是δ亞基的同系物。因此本發(fā)明分離到的HeIF-2Bd參與蛋白質(zhì)翻譯及調(diào)控，并且為蛋白質(zhì)翻譯及調(diào)控失常的治療提供一種途徑。
此外，在真核細胞中，已知蛋白質(zhì)激酶可催化起始因子eIF-2的磷酸化，當細胞內(nèi)缺乏血紅素時，蛋白激酶被激活，使eIF-2的α亞基發(fā)生磷酸化。磷酸化了的eIF-2-GDP與eIF-2B具有極大的親和力，所以一旦結(jié)合以后就難以解離，從而使eIF-2不能再投入新的起始過程。這一現(xiàn)象具有重要的生理意義，因為當血紅素含量降低時，血紅蛋白的合成會停止，從而防止了合成無血紅素的血紅蛋白(這種血紅蛋白很易變性)。eIF-2B與磷酸化的eIF-2-GDP結(jié)合，從而實現(xiàn)對eIF-2的起始作用抑制。含有本發(fā)明HeIF-2Bd亞基的eIF-2B也具有相似的功能，它在防止合成無血紅素的血紅蛋白的方面起作用。
實施例3HeIF-2Bd在大腸桿菌中的表達在該實施例中，將在實施例1中獲得的兩個片段分別用EcoRI酶切，混合并加入連接酶連接，連接完成后進行電泳，鑒定并回收正確連接的全長片段。將編碼HeIF-2Bd的DNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，以或得HeIF-2Bd作為插入片段。
PCR反應(yīng)5′寡核苷酸引物序列為5′-AGGAGTCGAC ATGGCTGCTG TGGCCGTGG-3′(SEQ ID NO.5)該引物含有SalI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點，該酶切位點之后是由起始密碼子開始的HeIF-2Bd編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5’-CTCTAAGCTT TCACTGGTCA CTGCTCTTG-3’(SEQ ID NO.6)該引物含有HindIII限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和的HeIF-2Bd編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用BamHI酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗證HeIF-2Bd的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的HeIF-2Bd。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫HeIF-2Bd。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘呤褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對含PBS進行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
實施例4HeIF-2Bd在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將在實施例1中獲得的兩個片段分別用EcoRI酶切，混合并加入連接酶連接，連接完成后走電泳，鑒定并回收正確連接的全長片段。編碼HEIF-2BD的DNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得HEIF-2BDC cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5′-TAGGAAGCTT ATGGCTGCTG TGGCCGTGG-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有HindIII限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的HEIF-2BD編碼序列的19個核苷酸；3’端引物序列為5’-GGAAGATATC TCACTGGTCA CTGCTCTTG-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有EcoRV限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和HEIF-2BD的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于CHO細胞表達載體pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(f1 ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII和EcoRV消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用ApaI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗證HeIF-2Bd的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞是用Lipofectin試劑盒(GiBcolife)進行，轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小為57kD。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO10的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3或4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀HeIF-2Bd基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1GAGCCTAGGA CTGAGGGCGA TGG 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TGCCTTGCAG CAGGTGATTC AGG 23(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3CTGCAGGAAT CAGCAGGTAG GAG 23(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4TCACTGGTCA CTGCTCTTGA CTCG 24(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AGGAGTCGAC ATGGCTGCTG TGGCCGTGG 29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CTCTAAGCTT TCACTGGTCA CTGCTCTTG 29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7TAGGAAGCTT ATGGCTGCTG TGGCCGTGG 29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8GGAAGATATC TCACTGGTCA CTGCTCTTG 29(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度1582bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO91 GAGCCTAGGA CTGAGGGCGA TGGCTGCTGT GGCCGTGGCT GTTCGCGAGG ACTCGGGATC61 CGGGATGAAG GCGGATTCCC CCTGGGCCTG GGTGGGGAGG GAAATGACCA AAGAAGAAAA121 GCTGCAGCTT CGGAAGGAAA AGAAACAGCA GAAGAAGAAA CGGAAGGAAG AAAAGGGGGC181 AGAACCAGAG ACTGGCTCTG CTGTATCTGC AGCCCAATGT CAAGGCCCAA CCAGAGAACT241 GCCAGAATCG GGCATTCAGT TGGGCACTCC TCGGGAGAAA GTTCCAGCTG GTCGGAGTAA301 GGCCGAACTT CGGGCTGAGC GTCGAGCCAA GCAGGAGGCC GAGCGGGCCC TGAAACAGGC361 AAGAAAAGGG GAACAAGGAG GACCACCTCC TAAGGCCAGC CCCAGCACAG CTGAAGAAAC421 CCCCTCAGGA GTGAAGCGTC TCCCTGAGTA CCCTCAGGTT GATGACCTAC TTCTGAGAAG481 GCTTGTTAAA AAACCAGAGC GTCAACAGGT TCCTACACGA AAGGATTATG GATCCAAAGT541 CAGTCTCTTC TCTCACCTAC CCCAGTACAG CAGACAAAAC TCTCTGACCC AGTTTATGAG601 CATCCCATCC TCTGTGATCC ACCCAGCCAT GGTGCGACTC GGCCTGCAGT ACTCCCAGGG661 CCTGGTCAGT GGCTCCAATG CCCGGTGTAT TGCCCTGCTT CGTGCCTTGC AGCAGGTGAT721 TCAGGATTAC ACAACACCGC CTAATGAAGA ACTCTCCAGG GATCTAGTGA ATAAACTAAA781 ACCCTACATG AGCTTCCTGA CTCAGTGCCG TCCCCTGTCA GCGAGCATGC ACAACGCCAT841 CAAGTTCCTT AACAAGGAAA TCACCAGTGT GGGCAGTTCC AAGCGGGAAG AGGAGGCCAA901 GTCAGAACTT CGAGCAGCCA TTGATCGGTA TGTGCAAGAG AAGATTGTGC TAGCAGCTCA961 GGCAATTTCA CGCTTTGCTT ACCAGAAGAT CAGTAATGGA GATGTGATCC TGGTATATGG1021 ATGCTCATCT CTGGTATCAC GAATTCTTCA GGAGGCTTGG ACAGAGGGCC GGCGGTTTCG1081 GGTGGTAGTG GTGGACAGCC GGCCATGGCT GGAAGGAAGG CACACACTAC GTTCTCTAGT1141 CCATGCTGGT GTCCCAGCCT CCTACCTGCT GATTCCTGCA GCCTCCTATG TGCTCCCAGA1201 GGTTTCCAAG GTGCTATTGG GAGCTCATGC ACTCTTGGCC AACGGGTCTG TGATGTCACG1261 GGTAGGGACA GCACAGTTAG CCCTGGTGGC TCGAGCCCAT AATGTACCAG TGCTGGTTTG1321 CTGTGAAACA TACAAGTTCT GTGAGCGTGT GCAGACTGAT GCCTTTGTCT CTAATGAGCT1381 AGATGACCCT GATGATCTGC AATGTAAGCG GGGAGAACAT GTTGCGCTGG CTAACTGGCA1441 GAACCACGCA TCCCTACGGT TGTTGAATCT AGTCTATGAT GTGACTCCCC CAGAGCTTGT1501 GGATCTGGTG ATCACGGAGC TGGGGATGAT CCCTTGCAGT TCTGTACCTG TTGTTCTACG1561 AGTCAAGAGC AGTGACCAGT GA(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征
(A)長度520個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO101 Met Ala Ala Val Ala Val Ala Val Arg Glu Asp Ser Gly Ser Gly16 Met Lys Ala Asp Ser Pro Trp Ala Trp Val Gly Arg Glu Met Thr31 Lys Glu Glu Lys Leu Gln Leu Arg Lys Glu Lys Lys Gln Gln Lys46 Lys Lys Arg Lys Glu Glu Lys Gly Ala Glu Pro Glu Thr Gly Ser61 Ala Val Ser Ala Ala Gln Cys Gln Gly Pro Thr Arg Glu Leu Pro76 Glu Ser Gly Ile Gln Leu Gly Thr Pro Arg Glu Lys Val Pro Ala91 Gly Arg Ser Lys Ala Glu Leu Arg Ala Glu Arg Arg Ala Lys Gln106 Glu Ala Glu Arg Ala Leu Lys Gln Ala Arg Lys Gly Glu Gln Gly121 Gly Pro Pro Pro Lys Ala Ser Pro Ser Thr Ala Glu Glu Thr Pro136 Ser Gly Val Lys Arg Leu Pro Glu Tyr Pro Gln Val Asp Asp Leu151 Leu Leu Arg Arg Leu Val Lys Lys Pro Glu Arg Gln Gln Val Pro166 Thr Arg Lys Asp Tyr Gly Ser Lys Val Ser Leu Phe Ser His Leu181 Pro Gln Tyr Ser Arg Gln Asn Ser Leu Thr Gln Phe Met Ser Ile196 Pro Ser Ser Val Ile His Pro Ala Met Val Arg Leu Gly Leu Gln211 Tyr Ser Gln Gly Leu Val Ser Gly Ser Asn Ala Arg Cys Ile Ala226 Leu Leu Arg Ala Leu Gln Gln Val Ile Gln Asp Tyr Thr Thr Pro241 Pro Asn Glu Glu Leu Ser Arg Asp Leu Val Asn Lys Leu Lys Pro256 Tyr Met Ser Phe Leu Thr Gln Cys Arg Pro Leu Ser Ala Ser Met271 His Asn Ala Ile Lys Phe Leu Asn Lys Glu Ile Thr Ser Val Gly286 Ser Ser Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Ser Glu Leu Arg Ala Ala301 Ile Asp Arg Tyr Val Gln Glu Lys Ile Val Leu Ala Ala Gln Ala316 Ile Ser Arg Phe Ala Tyr Gln Lys Ile Ser Asn Gly Asp Val Ile331 Leu Val Tyr Gly Cys Ser Ser Leu Val Ser Arg Ile Leu Gln Glu346 Ala Trp Thr Glu Gly Arg Arg Phe Arg Val Val Val Val Asp Ser361 Arg Pro Trp Leu Glu Gly Arg His Thr Leu Arg Ser Leu Val His376 Ala Gly Val Pro Ala Ser Tyr Leu Leu Ile Pro Ala Ala Ser Tyr391 Val Leu Pro Glu Val Ser Lys Val Leu Leu Gly Ala His Ala Leu406 Leu Ala Asn Gly Ser Val Met Ser Arg Val Gly Thr Ala Gln Leu421 Ala Leu Val Ala Arg Ala His Asn Val Pro Val Leu Val Cys Cys436 Glu Thr Tyr Lys Phe Cys Glu Arg Val Gln Thr Asp Ala Phe Val451 Ser Asn Glu Leu Asp Asp Pro Asp Asp Leu Gln Cys Lys Arg Gly466 Glu His Val Ala Leu Ala Asn Trp Gln Asn His Ala Ser Leu Arg481 Leu Leu Asn Leu Val Tyr Asp Val Thr Pro Pro Glu Leu Val Asp496 Leu Val Ile Thr Glu Leu Gly Met Ile Pro Cys Ser Ser Val Pro511 Val Val Leu Arg Val Lys Ser Ser Asp Gln
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人HeIF-2Bd蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.10所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.9中核苷酸20-1582位的序列。
4.一種分離的HeIF-2Bd蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.10氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.10序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是真核細胞。
10.一種產(chǎn)生具有HeIF-2Bd蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有HeIF-2Bd蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成HeIF-2Bd蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成HeIF-2Bd蛋白的重組細胞；(c)在適合表達HeIF-2Bd蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有HeIF-2Bd蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該核苷酸序列為SEQ ID NO.9中從核苷酸20-1582位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的HeIF-2Bd蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新的人蛋白質(zhì)翻譯起始因子2B的δ亞基HeIF－2Bd。本發(fā)明提供了該新的人蛋白質(zhì)翻譯起始因子2B的δ亞基的cDNA編碼序列、該序列編碼的多鈦,以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人蛋白質(zhì)翻譯起始因子2B的δ亞基的方法。本發(fā)明還提供了這種新的人蛋白質(zhì)翻譯起始因子2B的δ亞基的應(yīng)用。
文檔編號C12N5/10GK1246529SQ9811103
公開日2000年3月8日 申請日期1998年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月31日
發(fā)明者余龍, 張宏來, 屠強, 趙勇, 趙壽元 申請人:上海新黃浦復旦基因工程有限公司