專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)β－胡蘿卜素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是用孢子接種在氣升式發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)絲狀真菌制備β-胡蘿卜素的工藝。β-胡蘿卜素是維生素類藥物，它是維生素A的前體，在人體內(nèi)通過氧化酶的作用游離出二分子維生素A，起維生素A的作用。它對(duì)日光照射原卟啉所產(chǎn)生的過氧化基有清除作用，因此在醫(yī)藥和食品業(yè)有廣泛的用途。
在此發(fā)明以前發(fā)酵制備β-胡蘿卜素多采用搖瓶菌絲的進(jìn)種子罐方法培養(yǎng)種子，即菌種通過斜面培養(yǎng)或搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再接入種子罐繁殖產(chǎn)生大量菌絲作發(fā)酵用種，此種子制備工藝操作步驟多，周期長，增加雜菌污染的機(jī)會(huì)。另外，在本發(fā)明以前種子培養(yǎng)的發(fā)酵采用帶有機(jī)械攪拌裝置的通用式發(fā)酵罐。機(jī)械攪拌易將絲狀真菌的菌絲打斷，造成菌絲損傷，生物量減少，使發(fā)酵β-胡蘿卜素的產(chǎn)量降低，而且發(fā)酵要求通風(fēng)量高，能耗大，成本高。
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡單，發(fā)酵β胡蘿卜素產(chǎn)量高，制造成本低的發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法。
本發(fā)明通過下列方案實(shí)現(xiàn)。
該方法包括a、一級(jí)種培養(yǎng)；b、二級(jí)種培養(yǎng)；c、發(fā)酵；其中二級(jí)種培養(yǎng)及發(fā)酵工序所采用的生物反應(yīng)器均為氣升式發(fā)酵罐，該氣升式發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)為內(nèi)循環(huán)式或外循環(huán)式。一級(jí)種培養(yǎng)工序中、將保藏的能代謝產(chǎn)生β-胡蘿卜素的斜面菌種或砂土管保藏的菌種孢子接入PDA培養(yǎng)基上，在溫度24-30℃條件下培養(yǎng)48-72小時(shí)，待大量長出孢子后用無菌生理鹽水洗脫孢子成懸浮液，懸浮液中含孢子的量應(yīng)為7-9×105個(gè)/毫升。PDA培養(yǎng)基是馬鈴薯、葡萄糖與瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯、葡萄糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)孢子的器皿可以用玻璃三角燒瓶或茄子瓶及培養(yǎng)皿。產(chǎn)生β-胡蘿卜素的菌種是一種絲狀真菌，Blakeslea frispora，分“+”、“-”兩種菌株，保藏于江蘇省微生物研究所菌種保藏處，菌號(hào)為9203(正株)，9204(負(fù)株)。在二級(jí)種培養(yǎng)工序中，新鮮孢子懸浮中的孢子在種子罐內(nèi)萌發(fā)繁殖成大量菌絲體作為發(fā)酵用種子，孢子懸浮液中孢子的含量為7-9×105個(gè)/毫升。二級(jí)種培養(yǎng)和發(fā)酵工序采用氣升式發(fā)酵罐，罐體的高徑比為10∶1-20∶1，罐體與循環(huán)管的直徑比為1∶0.3-1∶0.5，壓縮空氣從裝置在培養(yǎng)液循環(huán)管中的噴嘴高速噴入培養(yǎng)液中呈氣液混合狀態(tài)，造成培養(yǎng)液重度降低，并獲得高速氣流的動(dòng)力而沿循環(huán)管上升進(jìn)入罐體，產(chǎn)生持續(xù)不斷的循環(huán)。在二級(jí)種培養(yǎng)工序中，培養(yǎng)基為葡萄糖1-2％，淀粉2-4％，玉米漿3-7％，磷酸二氫鉀0.1-0.3％，硫酸鎂0.01-0.05％，鹽酸硫胺素0.001-0.003，PH6.0-6.5，培養(yǎng)溫度24-30℃，通風(fēng)量1∶0.8-1∶1.5，培養(yǎng)時(shí)間24-48小時(shí)。在發(fā)酵工藝中，培養(yǎng)基為淀粉2-4％；粕餅粉3-5％；植物油3-5％；玉米漿3-5％；磷酸氫二鉀0.1-0.3％；硫酸鎂0.01-0.05％；鹽酸硫胺素0.001-0.003％，PH7.0-8.0，培養(yǎng)溫度24-30℃，通風(fēng)量1∶1.0-1∶20，罐壓0.04-0.08MPa，培養(yǎng)時(shí)間90-120小時(shí)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、由于利有氣升式發(fā)酵罐，因而避免了原來使用普通發(fā)酵罐時(shí)，因攪拌葉造成較大的剪切力，使菌絲體受傷，生物量下降，從而降低β-胡蘿卜素的產(chǎn)量的問題，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表一。
表一
2、普通發(fā)酵罐通過提高通風(fēng)量來滿足發(fā)酵過程耗氧量高的問題。因而能耗大，氧的利用率也低。而采用氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵就能解決這一問題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表二。
表二
3、本發(fā)明用孢子懸浮液代替搖瓶種子作為一級(jí)種種子接種子罐的工藝，可以縮短罐種子培養(yǎng)時(shí)間，提高種子的活力，使β-胡蘿卜素產(chǎn)量大大提高。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表三。
表三
實(shí)例11、一級(jí)種培養(yǎng)PDA培養(yǎng)基配制如下150克去皮馬鈴薯切成碎塊，置于100毫升水中煮沸30分鐘，經(jīng)紗布過濾，濾液中加入20克葡萄糖，20克瓊脂，加火定容至1000ml，PH自然，裝入1000毫升的三角燒瓶中，每瓶裝80毫升培養(yǎng)基，120℃滅菌20分鐘。
將保藏于江蘇省微生物研究所菌種保藏處，菌號(hào)為9203(正株)、9204(負(fù)株)的BLakeslea frispora“+”、“-”菌株砂土管孢子分別接種至4只三角瓶中，每個(gè)菌株各接兩只。26℃培養(yǎng)48小時(shí)，待培養(yǎng)基表面生長大量黑色孢子后，每只三角瓶中加入無菌生理鹽水200ml，將孢子洗脫成每毫升中含有7×105個(gè)孢子的孢子懸浮液。
2、二級(jí)種培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基按以下配方制備淀粉2％；葡萄糖2％；玉米漿5％；硫酸鎂0.01％；磷酸二氫鉀0.1％；鹽酸硫胺素0.001％，用氫氧化鈉溶液調(diào)整至PH6.2。
種子罐為容積6立升的內(nèi)循環(huán)氣升式玻璃發(fā)酵罐2只，每只裝種子培養(yǎng)基2升。培養(yǎng)基經(jīng)120℃滅菌30分鐘。分別接入培養(yǎng)基量1％的上述“+”、“-”菌珠的孢子懸浮液，26℃培養(yǎng)32小時(shí)，風(fēng)量1∶1，罐壓0.05MPa。
3、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為淀粉4％；棉籽餅粉4％；玉米漿3％豆油3％；磷酸二氫鉀0.1％；硫酸鎂0.01％，鹽酸硫胺素0.001％，用氫氧化鈉溶液調(diào)PH至8.0。
發(fā)酵罐為容積30毫升的外循環(huán)氣升式玻璃發(fā)酵罐，高徑比15∶1，循環(huán)管與罐直徑比為0.4∶1，裝發(fā)酵培養(yǎng)基18立升，120℃滅菌40分鐘，將培養(yǎng)好的“+”、“-”兩菌株的種子全部接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為20％，“+”、“-”菌株各10％，發(fā)酵溫度27℃±1℃，通風(fēng)量1∶2，罐壓0.08MPa。發(fā)酵48小時(shí)流加入β-紫羅蘭酮0.1％，發(fā)酵90小時(shí)，得β-胡蘿卜素含量1751.24毫克/立升的發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心收集菌體，烘干，粉碎得干菌粉606.2克，每克干菌粉含β-胡蘿卜素52.0毫克。干菌粉用工業(yè)已烷提取，提取液經(jīng)減壓濃縮后，加無水乙醇低溫結(jié)晶，結(jié)晶用少量無水乙醇洗滌，并真空干燥得β-胡蘿卜素晶體19.3g，晶體純度為95.6％。
實(shí)例21、一級(jí)種培養(yǎng)除不加瓊脂外，PDA培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件同實(shí)例1，3000毫升的三角瓶，每瓶裝培養(yǎng)基150毫升。前述“+”、“-”兩個(gè)菌株各接8瓶，每毫升中含有9×105個(gè)孢子。
2、二級(jí)種培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基同實(shí)例1，種子罐采用300立升外循環(huán)氣升式不銹鋼罐兩只。罐的高徑比為20∶1，循環(huán)管與罐的直徑比為0.36∶1，兩只罐各裝培養(yǎng)基240立升，滅菌后分別接入培養(yǎng)基量0.5％的“+”、“-”菌珠孢子懸浮液，27℃培養(yǎng)30小時(shí)、通風(fēng)量1∶0.8。
3、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基除3％豆油改成3％棉籽油，棉籽餅粉改為大豆餅粉外，其余同實(shí)例1，發(fā)酵罐為容積3000立升的外循環(huán)氣升式不銹鋼制發(fā)酵罐，罐體高徑比為20∶1，循環(huán)管與罐的直徑比為0.44∶1，罐內(nèi)裝培養(yǎng)基2000立升，120℃滅菌1小時(shí)，冷卻后將培養(yǎng)好的“+”、“-”兩菌株一起接入培養(yǎng)基內(nèi)。發(fā)酵溫度27°±1℃。通風(fēng)量1∶1.4。罐壓0.05MPa。發(fā)酵48小時(shí)，流加β-紫羅蘭酮0.1％，發(fā)酵114小時(shí)結(jié)束，發(fā)酵液中β-胡蘿卜素產(chǎn)量為1328毫克/立升。經(jīng)提取后制得β-胡蘿卜素含量8％的油狀產(chǎn)品29.5公斤。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法，包括a、一級(jí)種培養(yǎng)；b、二級(jí)種培養(yǎng)；c、發(fā)酵；其特征是二級(jí)種培養(yǎng)及發(fā)酵工序所采用的生物反應(yīng)器均為氣升式發(fā)酵罐，該氣升式發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)為內(nèi)循環(huán)式或外循環(huán)式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在一級(jí)種培養(yǎng)工序中，將保藏的能代謝產(chǎn)生β-胡蘿卜素的斜面菌種或砂土管保藏的菌種孢子接入PDA培養(yǎng)基上，在溫度24-30℃條件下培養(yǎng)48-72小時(shí)，待大量長出孢子后用無菌生理鹽水洗脫孢子成懸浮液，懸浮液中含孢子的量應(yīng)為7-9×105個(gè)/毫升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法，其特征是PDA培養(yǎng)基是馬鈴薯、葡萄糖與瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯、葡萄糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)孢子的器皿可以用玻璃三角燒瓶或茄子瓶及培養(yǎng)皿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法，其特征是產(chǎn)生β-胡蘿卜素的菌種是一種絲狀真菌，Blakeslea frispora，分“+”、“-”兩種菌株，保藏于江蘇省微生物研究所菌種保藏處，菌號(hào)為9203(正株)、9204(負(fù)株)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在二級(jí)種培養(yǎng)工序中，新鮮孢子懸浮液中的孢子在種子罐內(nèi)萌發(fā)繁殖成大量菌絲體作為發(fā)酵用種子，孢子懸浮液中孢子的含量為7-9×105個(gè)毫升。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是二級(jí)種培養(yǎng)和發(fā)酵工序采用氣升式發(fā)酵罐，罐體的高徑比為10∶1-20∶1，罐體與循環(huán)管的直徑比為1∶0.3-1∶0.5，壓縮空氣從裝置在培養(yǎng)液循環(huán)管中的噴嘴高速噴入培養(yǎng)液中呈氣液混合狀態(tài)，造成培養(yǎng)液重度降低，并獲得高速氣流的動(dòng)力而沿循環(huán)管上升進(jìn)入罐體，產(chǎn)生持續(xù)不斷的循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在二級(jí)種培養(yǎng)工序中，培養(yǎng)基為葡萄糖1-2％，淀粉2-4％，玉米漿3-7％，磷酸二氫鉀0.1-0.3％，硫酸鎂0.01-0.05％，鹽酸硫胺素0.001-0.003，PH6.0-6.5.培養(yǎng)溫度24-30℃，通風(fēng)量1∶0.8-1∶1.5，培養(yǎng)時(shí)間24-48小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在發(fā)酵工藝中，培養(yǎng)基為淀粉2-4％；粕餅粉3-5％；植物油3-5％；玉米漿3-5％；磷酸氫二鉀0.1-0.3％；硫酸鎂0.01-0.05％；鹽酸硫胺素0.001-0.003％，PH7.0-8.0，培養(yǎng)溫度24-30℃，通風(fēng)量1∶1.0-1∶20，罐壓0.04-0.0 8MPa，培養(yǎng)時(shí)間90-120小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種用孢子接種在氣升式發(fā)酵罐中培養(yǎng)絲狀真菌發(fā)酵制備β－胡蘿卜素的工藝。該工藝包括一級(jí)種培養(yǎng)、二級(jí)種培養(yǎng)及發(fā)酵等工序,其特點(diǎn)是將能代謝產(chǎn)生β－胡蘿卜素的微生物菌種在一定條件下培養(yǎng)形成大量孢子,以氣升式發(fā)酵罐作為培養(yǎng)種子和發(fā)酵的生物反應(yīng)器,在該種類型的罐中,孢子培養(yǎng)繁殖成大量菌絲,并作為種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵產(chǎn)生β－胡蘿卜素。
文檔編號(hào)C12P23/00GK1193048SQ98111199
公開日1998年9月16日 申請(qǐng)日期1998年3月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月23日
發(fā)明者姜文候, 單志萍, 孟妤, 孫冬梅, 陳濤, 陳宗勝, 馬國華, 朱湘民, 童驍, 宋冬林 申請(qǐng)人:江蘇省微生物研究所, 中國科學(xué)院武漢病毒研究所