專利名稱：沙蠶激酶及其提取方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)和多齒圍沙蠶(Perinereis nuntia)體內(nèi)提取出能降解纖維蛋白的可用于治療血栓性疾病的溶血栓纖溶酶------沙蠶激酶。
心腦血管疾病如腦血栓、心肌梗塞在我國(guó)發(fā)病率和死亡率僅次于癌癥。目前臨床上治療多采用尿激酶、鏈激酶等溶栓藥物來(lái)進(jìn)行治療。但是由于尿激酶等藥物尚存在一些弊端如只能靜注，不能口服；易降解血液中纖維蛋白原引起出血；不可長(zhǎng)期連續(xù)使用等。而且尿激酶需要從尿液中提取，其原材料的收集隨著城市化速度的加快愈加困難，質(zhì)量不能保證，運(yùn)輸過(guò)程中容易污染。新近研制出來(lái)的蚓激酶雖然有一定的治療效果，且口服有效，但是，蚓激酶所用的原材料蚯蚓必須通過(guò)人工養(yǎng)殖，甚至必須添加一些特殊的營(yíng)養(yǎng)成分，這就大大提高了藥物的生產(chǎn)成本。因而尋找其他更有效、副作用小、價(jià)格低的溶栓抗凝藥物成為當(dāng)務(wù)之急。
本發(fā)明的目的在于提供一種原材料豐富、價(jià)格低廉、安全無(wú)毒、口服有效的溶栓藥物，以彌補(bǔ)尿激酶等藥物在生產(chǎn)和治療方面的不足。
沙蠶系多毛綱環(huán)節(jié)動(dòng)物，在我國(guó)沿海灘涂地帶分布很廣，資源十分豐富，絕大多數(shù)未得到充分利用，處于自生自滅狀態(tài)，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。我們首次從沙蠶體內(nèi)得到能降解纖維蛋白的纖溶酶，并對(duì)纖溶酶的性質(zhì)做了初步研究，發(fā)現(xiàn)沙蠶纖溶酶很有可能成為新一代抗血栓藥物，并且由于其原料來(lái)源豐富、價(jià)格低廉，有希望發(fā)展成為一種常規(guī)治療藥物。同時(shí)，利用沙蠶來(lái)生產(chǎn)溶栓藥還能夠充分利用我國(guó)的自然資源，促進(jìn)沿海地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。
我們從我國(guó)豐產(chǎn)的兩種沙蠶中獲得纖溶酶，并命名為沙蠶激酶。并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其溶栓活性不低于尿激酶。它既有直接降解纖維蛋白的作用，又能激活纖溶酶原，間接降解纖維蛋白。其分子量在25000-55000之間，等電點(diǎn)在3-7之間，最適反應(yīng)條件是37℃、pH8.0左右。
與尿激酶相比，沙蠶激酶具有較好的熱穩(wěn)定性，尿激酶在37℃很快失活，故尿激酶不適宜制成口服制劑，只能靜脈注射。而沙蠶激酶則有可能研制成適宜口服的新型溶栓藥物，沙蠶激酶經(jīng)60℃一小時(shí)后仍然保持90％以上的活性其穩(wěn)定性甚至超過(guò)新近研制的蚓激酶。蚓激酶在50℃時(shí)就很快喪失活性。此外，沙蠶激酶在37℃其活性最高，這說(shuō)明沙蠶激酶非常適合于制成口服藥。
沙蠶激酶的制備可分為以下幾個(gè)步驟(一)預(yù)處理和組織的破碎沙蠶盡可能以活的狀態(tài)應(yīng)用，否則就應(yīng)該將其立即冰凍起來(lái)。將沙蠶用清水浸泡洗凈，用高速組織搗碎機(jī)搗碎。
(二)抽提加入0.02mo1/L磷酸鹽緩沖液(含0.1mol/L NaCl)抽提液，4℃抽提6小時(shí)以上，然后離心，收集上清液。
(三)酶的提純1．鹽析法將研細(xì)的硫酸銨固體加入上述上清液中鹽析，取20-70％沉淀。再以0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解沉淀。
2．凝膠過(guò)濾用Sephadex G-25柱層析或透析法脫鹽，G-75或G-100等柱層析進(jìn)行層析分離，層析柱體積大小為2.6×100cm，洗脫液皆為0.02mol/L磷酸鹽(PBS)。用紫外分光光度計(jì)測(cè)280nm吸光值。收集活性峰，得較純品。
3．離子交換柱層析選用CM-纖維素和DEAE-纖維素柱將較純品再進(jìn)行層析，以0-1mol/LNaCl/PBS梯度洗脫，280nm紫外檢測(cè)。收集活性峰，透析后冷凍干燥。
4．超濾可將鹽析法所得沉淀溶解后直接以超濾方式收集10000-60000之間的蛋白質(zhì)，然后再進(jìn)行下一步分離。
5．電泳用10-12％聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行制備，可獲純的纖溶酶。
6．親和層析用Benzamidine-Sepharose 4B進(jìn)行親和層析。
7．經(jīng)過(guò)柱層析的樣品，用HPLC純化，可得純酶。
經(jīng)上述各種方法分離純化，沙蠶激酶得率在0.4-0.6‰(占活沙蠶重)之間，500克沙蠶可獲得約4000-50000U沙蠶激酶。
沙蠶激酶可用于生產(chǎn)治療腦血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的口服藥。沙蠶激酶活性的測(cè)定采用平板法及體外血塊溶解法，具體做法如下(一)平板法因平板法靈敏度較高且既可定性又可定量，故本研究多采用平板法。
試劑血纖維蛋白原0.25％(W/V)溶液溶解液為17份生理鹽水、1份0.03mol/L、pH7.8磷酸緩沖液。纖維蛋白原為Sigma公司產(chǎn)品。
牛凝血酶中國(guó)藥品生物制品檢定所出品。用生理鹽水配成每m160NIH單位(2.2NIH單位=1BP單位)。
磷酸鹽緩沖液0.03mol/L、pH7.8。
沙蠶激酶樣品用磷酸鹽緩沖液配成一定濃度。
操作在直徑為10.5cm平皿里，加入17ml纖維蛋白原溶液，再加入0.4ml凝血酶溶液，快速搖勻，靜置30min，凝結(jié)后平板基本透明無(wú)色，用微量注射器點(diǎn)樣20ul(定量檢測(cè)時(shí)，同時(shí)點(diǎn)上稀釋成不同濃度的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品)，復(fù)以玻蓋，于37℃箱中保溫18h后取出，用卡尺測(cè)出溶圈垂直兩直徑，相乘得一積。以溶圈直徑乘積作縱坐標(biāo)，尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)作圖，即可在圖上查出樣品的活力單位。
(二)體外血塊溶解法取人新鮮血液，待其凝固成塊用紙吸去血清，制成相同大小的血凝塊(直徑8mm，高5mm的園柱狀)，放入編號(hào)的試管中，加入纖溶酶提取液，同時(shí)用不加纖溶酶的緩沖液作對(duì)照，置37℃觀察血塊溶解情況。加入沙蠶激酶的試管中的血塊一般在18小時(shí)左右基本溶解，而對(duì)照管無(wú)任何變化。此方法可用來(lái)作定性實(shí)驗(yàn)。
纖溶酶的性質(zhì)研究(一)溫度對(duì)酶的活性的影響用0.02mol/L，pH7.8磷酸鹽緩沖液將沙蠶激酶配成2mg/ml的溶液，分成6份，分別在10℃、20℃、37℃、50℃、60℃、70℃放置1小時(shí)，然后用平板法測(cè)定剩余活性。18小時(shí)后測(cè)定結(jié)果，(見(jiàn)附圖1，溫度對(duì)沙蠶激酶活性的影響)，37℃左右有最大活力。
(二)pH對(duì)酶活性的影響用磷酸鹽配成一系列不同pH的緩沖液，將沙蠶激酶溶于其中(2mg/ml)，然后在不同pH下用平板法測(cè)定酶的活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最適pH在8.0左右。(見(jiàn)附圖2,PH對(duì)沙蠶激酶活性的影響)。
又將酶溶于不同pH的磷酸鹽緩沖液中，37℃保溫1小時(shí)，然后調(diào)pH至8.0，測(cè)定剩余活力，結(jié)果(見(jiàn)附圖3，不同PH對(duì)沙蠶激酶穩(wěn)定性的影響)。沙蠶激酶在pH8.0左右穩(wěn)定性最好。(三)纖維蛋白溶酶原激活活性測(cè)定分別從幾份不同的沙蠶激酶樣品中取出15ul，再分別加入15ul濃度為10單位/ml的纖維蛋白溶酶原，使最終濃度為含5mg/ml樣品，5單位/ml纖溶酶原，對(duì)照用15ul緩沖液代替纖溶酶原，然后用平板法測(cè)定活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入纖溶酶原的樣品在平板上的溶圈明顯大于對(duì)照。由此說(shuō)明沙蠶激酶既有直接纖溶作用，又有間接激活作用。


圖1，溫度對(duì)沙蠶激酶活性的影響。
圖2，PH對(duì)沙蠶激酶活性的影響。
圖3，不同PH對(duì)沙蠶激酶穩(wěn)定性的影響。
實(shí)施例11．取500克活沙蠶，用清水浸泡，洗去泥沙污物，然后將水瀝干，用組織搗碎機(jī)搗碎。2．加入1000ml 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.1mol/L NaCl)抽提液，4℃抽提6小時(shí)以上，pH值控制在7-8。然后8000rpm，4℃離心15min，收集上清液。3．將硫酸銨充分研細(xì)，稱取硫酸銨加入上述上清液中使成20％飽和度。靜置2小時(shí)左右，離心收集上清液。再加硫酸銨至70％飽和度，靜置，離心收集沉淀。再用0.02mol/LPBS溶解沉淀。4．以Sephadex G-25柱層析脫鹽(柱體積大小為2.6×100cm)，加樣量為100ml左右，洗脫液為0.02mol/L磷酸鹽(PBS)。將去鹽后的粗提物冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?．稱取50mg上述凍干品，以0.02mol/L PBS溶解，用Sephadex G-100柱層析(柱大小為2.6×100cm)進(jìn)行初步分離，用紫外分光光度計(jì)測(cè)280nm吸光值，收集活性峰，得較純品。6．將上述較純品用DEAE-Sephadex A柱(2.6×30cm)進(jìn)一步分離，以0-1MNaCl/PBS梯度洗脫，280nm紫外檢測(cè)，收集活性峰。透析后冷凍干燥。7．最后用10-12％聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行制備，獲得純的纖溶酶。得率為0.4‰，每500克沙蠶可得8000-40000U沙蠶激酶。實(shí)施例21．同實(shí)施例1。2．同實(shí)施例1。3．同實(shí)施例1。4．透析脫鹽，冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?．取上述凍干品50mg，以0.02mol/L PBS溶解，用Sephadex G-75柱層析(2.6×100cm)進(jìn)行初步分離，收集活性峰。6．將上述活性組分用CM-纖維素進(jìn)行柱層析(2.6×30cm)，梯度洗脫，收集活性峰。透析去鹽。7．再用DEAE-纖維素柱層析(2.6×30cm)進(jìn)一步分離上述活性組分，0-1MNaCl/PBS梯度洗脫，收集活性峰，超濾濃縮。8．最后以HPLC(FPLC)層析獲纖溶酶純品。得率為0.5‰，每500克沙蠶可得4000-35000U沙蠶激酶。實(shí)施例31．同實(shí)施例1。2．同實(shí)施例1。3．同實(shí)施例1。4．用不同截留分子量的超濾膜超濾，收集分子量在10000-60000之間的蛋白質(zhì)。5．將上述組分加入Benzamidine-Sepharose 4B親和柱，先用0.02mol/L pH7.8的PBS洗脫，將非特異性雜蛋白質(zhì)洗下，再用含1mol/L尿素與0.5mol/L精氨酸的PBS洗脫，收集活性峰，超濾濃縮。6．再以HPLC(FPLC)層析獲純的纖溶酶。得率為0.6‰，每500克沙蠶可得30000-50000U沙蠶激酶。
權(quán)利要求
1．一種溶血栓纖溶酶，其特征是從雙齒圍沙蠶和多齒圍沙蠶體內(nèi)提取出的溶血栓纖溶酶一沙蠶激酶，沙蠶激酶的分子量在25000-55000之間，等電點(diǎn)在3-7之間，最適反應(yīng)條件是37℃，pH8.0左右。
2．一種溶血栓沙蠶激酶的生產(chǎn)方法，其特征是將沙蠶用高速組織搗碎機(jī)搗碎成勻漿，并加抽提液抽提，以硫酸銨鹽析，取20-70％沉淀，再以Sephadex G-25、Sephadex G-75或透析或超濾法脫鹽，然后用葡聚糖凝膠、離子交換纖維素或親和層析以及電泳或HPLC等方法進(jìn)一步純化。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的沙蠶激酶，其特征是沙蠶激酶可用于生產(chǎn)治療腦血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明從沙蠶體內(nèi)提取溶血栓纖溶酶—沙蠶激酶,屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。其目的在于提供一種原料豐富、價(jià)格低廉、安全無(wú)毒、口服有效的溶栓藥物。沙蠶激酶的分子量在25000—55000之間,等電點(diǎn)在3—7之間。沙蠶激酶可用于生產(chǎn)治療腦血栓、心肌梗塞等引起的血栓性疾病的口服藥。
文檔編號(hào)C12N9/64GK1234443SQ98111280
公開(kāi)日1999年11月10日 申請(qǐng)日期1998年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月5日
發(fā)明者陳顥, 張偉云, 譚仁祥, 夏仲豪, 汪水娟 申請(qǐng)人:南京大學(xué)