專利名稱：直接分離表型相關基因的開關區(qū)和開關分子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從有某種確定表型的人或高等動植物的復雜基因組中可直接準確地分離出該表型相關基因的開關區(qū)，并可進一步篩出能促使細胞改變其表型(相關基因表達狀態(tài))的基因開關分子，進而建立一種按自然程序或模擬自然程序控制靶基因表達的方法。特別涉及一種能高效、精確地滅活人類致病基因等有害基因，激活人類疾病控制基因及經(jīng)濟動、植物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等有益基因的方法。
本發(fā)明的現(xiàn)有技術中，從復雜基因組中分離表型相關基因片段面臨兩個困難(1)表型相關基因片段包含多種類型生理性轉(zhuǎn)變片段，如啟動片段和修飾片段，又如遺傳系中血親同一型片段；或病理性突變片段，如等基因系(高等生物同一個體的體細胞系，植物的單克隆品系和動植物細胞單克隆系)中突變片段；重排型突變(基因的缺失、插入、倒位等)、點突變(堿基置換和小的缺失、插入)或去甲基化突變片段；單基因型突變或多基因型突變片段。然而目前還沒有一種可分離出上述所有類型突變片段的方法。(2)人或高等動植物的基因龐大復雜，如人的基因組包含60億核苷酸對，它可被限制酶切成107種易于雜交識別的小片段。然而無論是雜交識別還是劑量比較都達不到10-7的分辨率(即分辨出兩個基因組間107分之一的差異)。任何分離基因方法首先必須把基因組的復雜度降至102以下，才能進行分辨和分離?，F(xiàn)有技術或者以降低靈敏度(減少被檢基因組范圍)為代價降低復雜度，或者不能把復雜度降低到可分辨的程度，因而缺乏較高的靈敏度和分辨率。在現(xiàn)有技術中，依據(jù)分離的突變類型不同，分離基因方法可分為三類(1)功能克隆法提純某種已知功能蛋白質(zhì)，測其氨基酸順序，進而推斷出其相關基因結構。由于細胞中往往含有上萬種蛋白質(zhì)，大多數(shù)種含量極微，難以提純和分析，這類方法僅適用于極少數(shù)蛋白質(zhì)表達量高的基因的分離。(2)定位克隆法通過某種表型在遺傳家系中與一些位點標記間連鎖分析把表型相關基因定位在染色體某區(qū)域中。這類方法僅適用于容易找到遺傳家系的植物基因或者人類單基因遺傳病相關基因的分離。(3)表型克隆法通過有相同表型的遺傳家系中不同個體基因組間雜交分離遺傳性血親同一片段(IBDF,idendical-by-desend-fragment)，或者通過有不同表型的同一個體細胞基因組間雜交或帶型比較分離重排型突變片段。近年來，大量的研究表明，人類大多數(shù)致命性疾病，例如惡性腫瘤、腦血管病、心臟病、Ⅱ型糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、老年癡呆癥等，甚至人類的衰老都是由多位點、體細胞性點突變或點修飾所引起的。而現(xiàn)有技術均不適用分離這一類突變片段。(R.Nowak,Science,2701995,P368-371；P.Aldhous,Science,265 1994,P2008-2010；J.J.Jonssonet al.,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,92(1995),P83-95)。在現(xiàn)有技術中依據(jù)減少基因組的復雜度方式不同，分離基因方法可分為二類；(1)通過特異探針標記(雜交)或特異引物PCR擴增選擇性分離基因組中部分區(qū)域中基因。這類方法以減少被篩查基因組區(qū)域為代價來減少基因組復雜度，因而勢必降低其靈敏度(N.Lisitsyn,et al.,Scicnce,259(1993),P946-951；P.Liang,et al.,Nucl.Acid.Res.21(1993),P3269-3275)。(2)在雜交前把基因組DNA片段單向電泳或帶型比較前把基因組雙向電泳，使DNA片段分散到103-104位點上，從而把每個位點上片段種類減少到104以下。這類方法雖然沒有減少其靈敏度，但也沒有將基因組復雜度減少至102以下可分辨的程度(L.c.Au,et al.,86(1989),Proc.Natl.Acad,Sci.USA,P5507-5511；H.Yodota,et al.219(1994),Analy,Biochem.,P131-138；H.Nakashime.227(1995),Analy.Biochem.,P319-327)。
近年來，也發(fā)展了一些通過基因表達文庫(cDNA文庫)間雜交或帶型比較來分離表型相關基因的方法(P.Liang,et al.,Nucl Acid.Res.21(1993),P3265-3275；M.Lovett,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),P9628-9632；N.S.Kim.,et al.,And Biochen.217(1994),P20-24；M.Yang,et al.,And Biochen.237(1996),PL09-114)。人類cDNA文庫的復雜度約為104，遠比基因組DNA復雜度107低。而且，表達的基因都是與表型相關的。因此，篩基因組表達差異的策略要比篩基因組DNA突變差異要容易。但是，這種策略是建立在mRNA反轉(zhuǎn)錄建立的cDNA文庫之穩(wěn)定性上。由于mRNA不穩(wěn)定，半衰期很短，mRNA提取到cDNA克隆過程都難免有低拷貝基因的丟失，所以事實上難以建立一個穩(wěn)定、完整(包含有所有表達基因cDNA)的cDNA文庫；其次，不同種類基因表達的mRNA量差異很大，可相差到10萬倍。低拷貝的cDNA會被同電泳位點的高拷貝cDNA所稀釋，而使之難以被篩出。再次，不同表型基因組間差異表達基因成百上千，其中包含許多非目標表型相關成員。因此，cDNA雜交或比較減法的策略難以達到篩出單個表型相關基因的精確度。
本發(fā)明的目的是改進現(xiàn)有表型克隆法存在的上述缺陷，建立一種可直接準確地分離出表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法。以用細胞核內(nèi)特異結合蛋白(開關分子)吸附保留處于(或曾處于)表達狀態(tài)的基因開關區(qū)片段(啟動/修飾片段)，去除其他DNA片段后再進行單向電泳或差異雙向電泳取代現(xiàn)有的DNA或cDNA片段的單向電泳，從而把參與雜交或比較減法的DNA片段數(shù)目降至100，甚至10以下，達到了可直接分辨單種片段的程度；以基因開關區(qū)片段間加減法取代現(xiàn)有的DNA或cDNA片段間減法雜交和帶型比較，從而實現(xiàn)了對表型相關基因群的同一序列(motif)一開關區(qū)的直接分離，這比分離成百上千個的基因群差異序列一表達區(qū)要更為精確和有效；以從具有相同生理或病理表型的不同細胞中分離到的開關區(qū)片段和其他片段探針的Southern/Western/Northern印跡分析和對流雜交取代現(xiàn)有的突變/cDNA片段的Southern印跡分析，從而實現(xiàn)了取少量樣品就可以從眾多非相關基因片段中分離出目標表型相關基因的開關區(qū)，而用可能分布在成百上千個表型相關基因的突變/cDNA片段來篩，就可能需要取成百上千個樣品才能篩到；用表型相關基因群的同一片段，開關區(qū)片段吸附相應表達區(qū)片段和用開關分子誘導細胞合成相應表達區(qū)片段取代現(xiàn)有的分離和分析基因表達蛋白的方法，從而實現(xiàn)了簡便篩查全部表型相關基因的目標；用若干個表型相關基因開關區(qū)片段間或開關分子間橫向比較分析取代現(xiàn)有的從下游基因(表達區(qū)→開關區(qū)→開關分子)到上游基因(表達區(qū)→開關區(qū)→開關分子)的縱向篩查法，從而實現(xiàn)了簡便快速地分離出可使細胞發(fā)生表型改變的表型開關基因的開關區(qū)和開關分子，而無論是從基因表達區(qū)到開關區(qū)之步移，還是從開關區(qū)到開關分子的篩查和從下游基因開關分子到上游基因表達區(qū)的蛋白質(zhì)測序，都是十分困難的。
因此，本發(fā)明涉及一種直接分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法，其包括下列步驟第一步，提純具有目標表型的樣本和不具有目標表型的對照本細胞DNA和細胞核內(nèi)特異性DNA結合蛋白(開關分子)，并使二者結合在一起。用同樣的限制酶切割后，去除所有未能結合的蛋白和DNA片段；第二步，把樣本和對照本的開關區(qū)DNA片段/開關分子結合體(RF/BP結合體)混合后單向或差異雙向電泳，使104種RF/BP結合體分散到凝膠中，減少同一位置重疊在一起的片段的種數(shù)；第三步，將上述凝膠中片段盡快縱向(與凝膠垂直)轉(zhuǎn)入一空心膠中，并使樣本/對照本片段或者樣本片段/對照本結合蛋白在電泳原位相互雜交或劑量比較；第四步，通過樣本/對照本片段原位加減法特異地切割、固定或標記靶片段或非靶片段而分離出二者間差異的開關區(qū)片段(啟動/修飾片段)；第五步，把分離到的差異片段加上雙接頭或載體，通過PCR擴增為探針；第六步，用從具有相同生理或病理表型的不同細胞中分離到的開關區(qū)探針與樣本和對照本細胞的核內(nèi)蛋白western印跡雜交，或者再與從相同表型細胞分離到的突變片段和cDNA片段一起和標準人類基因組的DNA Southern印跡或樣本細胞的mRNA Northern印跡雜交，等位顯示點即包含有目標表型相關基因的開關區(qū)和開關分子；第七步，用分離到的表型相關基因開關區(qū)片段或開關分子(結合蛋白)為配體，通過對流親和層析吸附、純化所有表型相關基因的大限制片段，并進一步吸附純化所有表型相關基因的cDNA片段。第八步，通過對不同發(fā)育階段之細胞核蛋白Western印跡上雜交上的基因開關區(qū)片段(RF)的比較和細胞mRNA Northern印跡上雜交上的表達區(qū)片段(cDNA片段)的比較等方法，分析出表型相關基因開關區(qū)的開關時序和篩查出最上游的表型開關基因；第九步，用分離到的表達區(qū)片段(cDNA/mRNA)體外合成表型相關基因的表達蛋白，以此為探針對激活的表型細胞的全蛋白Western印跡分析，以確定表型相關基因表達區(qū)的開關位序和篩查最前端的激素開關基因；第十步，用表型開關基因的開關區(qū)motif片段吸附純化相應的開關分子，測其氨基酸順序而確定之，或者用表型開關基因的開關區(qū)motif聯(lián)體探針以及激素開關基因的表達蛋白質(zhì)探針在隨機/非隨機(胚胎cDNA)噬菌體表位文庫中篩查表達相應開關分子的DNA序列，并將它測序。通過上述方法確定的表型/激素開關基因的開關分子可用作治療大多數(shù)常見致命性疾病的藥物。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有下面六個優(yōu)點1．通過兩個基因組DNA間同源排序和去除非開關區(qū)DNA片段，可把雜交雙方DNA的復雜度從107種降至102種以下，降到了可分辨兩個基因組單種限制片段差異的程度。
2．限制片段/結合蛋白原位加減法可用來檢索到任何形式的基因活動(突變、修飾、啟動和激活)所造成的基因組間的差異。
3．樣本和對照本基因組DNA間混合雙向電泳和互交/自交片段間減法可避免大部分錯位和錯交造成的假陰性或假陽性結果。
4．具有相同生理或病理表型的不同基因組的差異開關區(qū)片段的原位或異位加法可用來檢索到該生理或病理表型相關基因的共同片段，并篩查到所有的該表型相關基因的開關區(qū)和表達區(qū)片段。
5．已知生理或病理表型相關基因的開關區(qū)和表達區(qū)片段可用來檢索到基因開關區(qū)的開關時序和表達區(qū)的開關位序以及表型/激素開關基因的開關區(qū)。
6．表型/激素開關基因的開關區(qū)可用來篩查相應的開關分子。通過開關分子滅致病基因和激活抑病基因可有效的控制和抑制大多數(shù)常見致命性疾病。
附圖的簡要說明附

圖1是基因的三個開關區(qū)的結構和功能示意圖。
附圖2是對流雜交儀示意圖。
附圖3是分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法流程圖。
圖1中1．甲基化的不表達基因；2．在S期被去甲基化的基因；3．被啟動的表達基因；4．被封閉的停止表達的基因；MR.修飾區(qū)；PR.啟動區(qū)；ER.表達區(qū)；MeCP.甲基化序列親和蛋白；M.甲基；Mo.修飾因子；Me.甲基化酶；Tf.轉(zhuǎn)錄因子；Rp.RNA聚合酶Ⅱ；Tr.轉(zhuǎn)錄抑制因子；Ac.激活因子；P.磷酸基。
圖2中1．負極電液槽；2．正極電液槽；3.4.RF/BP阻抑膜；5．電泳膠；6．負極加樣孔；7．正極加樣孔；8．電泳槽。
圖3中1．樣本和對照本RF/BP結合體的混合物；2．二維電泳和原位雜交；3．原位加減法；4．分離到B膠的差異片段；5．樣本/對照本自交片段；6．樣本/對照本互交片段；7．減法去除假陽性片段；8.9.10．從具相同表型不同細胞中分離到的差異(突變、cDNA和開關區(qū))片段；11．標記為探針并雜交到C膠上；12．DNA/mRNA/BP印跡；13．等位顯示帶；14．非等位顯示帶；15．分離到的同一片段擴增后加接生物素化接頭；16．表型細胞的cDNA；17．固定化的開關區(qū)片段/開關分子；18．表型相關基因的cDNA；19．克隆表型相關基因的開關區(qū)/表達區(qū)片段和表達蛋白；20．BP/mRNA印跡；21．雜交雙帶者；22．雜交單帶者；23．克隆表型/激素開關基因的開關區(qū)片段，并標記為探針雜交到培養(yǎng)l；24．胚胎細胞cDNA的噬菌體表位文庫；25．開關分子的陽性克??；26．開關分子的DNA序列測定。
下面結合附圖，對本發(fā)明，開關區(qū)片段原位加減法(RF/BPASIS)作進一步詳細的敘述。
基因最初是作為遺傳因子被認識的，這種概念至今仍吸引了很多的研究者從遺傳過程中研究基因。但遺傳的保守性抑制了基因的變異，也就沒有給研究者留下很多信息。與其在遺傳過程中不同，基因在體細胞傳代過程中的活動是多細胞生命復雜性的基礎。這些嚴謹有序的活動為研究者留下豐富的足跡細胞的組織分化在基因修飾區(qū)留下了足跡；細胞的發(fā)育(細胞周期變化從幼稚到衰老的變化)在基因啟動區(qū)留下了足跡；細胞的活動在基因表達區(qū)留下了足跡；細胞的病變則在相關基因區(qū)域留下了突變。因此，用RFASIS技術對體細胞基因活動的足跡分析(差異或同一序列的檢索)可以篩查到任何細胞任何生理或病理表型相關基因。另一方面，不同表型的體細胞都有相同完整的基因組，它們之間的差異不過是有不同的基因群被啟動而已。有證據(jù)表明，某些基因的生理性關閉導致的體細胞增殖缺陷是人類衰老和死亡的根本原因。因此，用RFASIS技術檢索到啟動或關閉這些基因的天然生理分子也就可直接用于治療衰老性致命性疾病。
人類基因組十分龐大復雜，包括6×109核苷酸對和10萬個基因。直接把這樣復雜的兩個基因組加以雜交或帶型比較，雜交效率低，錯交幾率高，就達不到從中檢索到微小點突變或點修飾的目標，另一方面，人類基因組又是高度嚴謹有序的巨形長鏈分子。一個個體中所有的體細胞都是從一個受精卵細胞分裂而來，高度精密的DNA復制機制使它們有基本相同的基因組及其限制圖譜，只在少數(shù)區(qū)域發(fā)生了突變或轉(zhuǎn)變(修飾或啟動)而需要檢索?；蚪M的嚴謹結構和限制片段長度多態(tài)性(RFLP)使我們可通過混合二次酶切或一次酶切差異雙向電泳的方法把兩種基因組DNA進行同源排序(同源片段電泳到相同位置，不同源片段電泳到不同位置)，然后在10萬個位點同時通過原位加法檢索雜交上同序片段。通過原位減法檢索未能雜交的差異片段。本發(fā)明這種限制片段原位加減法(RFASIS)變通常的基因組間無序雜交為有序雜交，并在一塊凝膠上同時進行了109次雜交、檢索。因此極大的提高了檢索效率和降低了錯誤幾率。從而實現(xiàn)了從人類復雜基因組中檢索微小差異的目標。
上述電泳分散法可使雜交片段的復雜度降至105分之一，而且同時篩查了基因組DNA全部區(qū)域。但實際上，在一種組織細胞中，僅有大約10分之一的基因在活動。如果只篩查這些活動的與表型相關的基因，可用細胞核內(nèi)DNA結合蛋白吸附這些活動基因之開關區(qū)而去除其表達區(qū)及基因內(nèi)含子片段，又可使雜交片段的復雜度降至102分之一。因此這種方法可以把雜交片段的復雜度降至103分之一，只要再經(jīng)過單向電泳或差異雙向電泳就可以把復雜度降至105分之一以下了。這種方法用來篩查開關區(qū)比cDNA加減法更具優(yōu)點1．結合蛋白較穩(wěn)定，量也大。mRNA半衰期短，難以獲得全部活動基因的cDNA。2．不同基因的表達量差異很大，cDNA庫中不同基因間是不均勻的，而基因組中每個基因只有一個啟動區(qū)，基因間是均勻的。3．cDNA的克隆過程難免有某些基因丟失。蛋白與DNA的結合則可以進行一種有序雜交；把DNA電泳固定后，使蛋白電泳通過之，這樣蛋白質(zhì)和DNA均被電泳排序而提高了純度(濃度)，二者在高純度下雜交因而保證了雜交效率。為避免啟動區(qū)被切斷，也可以在DNA和蛋白質(zhì)結合狀態(tài)下進行限制酶切割。4．這種方法可直接篩查到基因開關區(qū)，之后可用它作為探針去篩查開關分子，從而避免了基因cDNA到開關區(qū)的篩查的麻煩。
表型克隆法包括兩種策略一種是差異克隆(Differential cloning)，即分離有確定表型的樣本和無此確定表型的對照本細胞間的差異DNA片段；另一種是同序克隆(Coincident sequence cloning)，即分離有相同表型的不同細胞間的同一片段。在本發(fā)明中，把這兩種策略結合起來使用，以分離某些目標表型相關的基因片段首先用差異克隆的策略分離出有目標表型的樣本和無此表型的對照本細胞間差異片段，然后用同序克隆的策略分離有相同目標表型的若干個不同病人或組織中得到的差異片段之同一片段，這些同一片段即為該目標表型相關基因片段。采用兩種策略相結合的方法是因為一方面，不同表型的細胞間差異片段，既包括與表型相關的片段，也包括與表型無關的片段。比如，不表達基因的突變片段。而且，既包括與目標表型相關的片段，也包括與其他表型相關的片段，比如，從癌/正常細胞間加減法中篩端粒酶相關基因時，也難免篩到癌無控制增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移表型相關基因。另一方面，相同表型的細胞間同一片段，既包括與目標表型相關片段，也包括大量與其他表型相關的片段，比如，管家基因片段。因此，無論我們怎樣選擇樣本和對照本細胞，都難以單獨用一種策略把目標表型相關基因單獨分離出來，而不包含有非目標表型相關的成員。而采用兩種策略相結合的方法就能從根本上解決這一難題。
可分離的表型相關基因片段有三種突變片段(點突變和重排突變片段)、功能片段(cDNA片段)和開關區(qū)片段(啟動和修飾片段)。下面分別加以敘述。
突變可以是自然發(fā)生的，也可以是被射線、化學物或病毒所誘導的。但大多數(shù)突變都是隨機發(fā)生于基因組DNA任何區(qū)域。常見的突變形式是自然發(fā)生的點突變和病毒介入的基因插入，它們是大多數(shù)基因病的主要病因。而在癌癥發(fā)生過程中，一般因端粒過短而引發(fā)的高頻率的基因重排，是造成細胞惡化的主要原因。突變片段中包括有很大比例的表型無關突變，去除這些無關突變片段較為麻煩；而且，多數(shù)表型相關基因突變都會發(fā)生在表達區(qū)或者都會引起細胞基因表達狀態(tài)的某些改變(某些基因從不表達到表達或相反的改變)，分離病變細胞的cDNA或開關區(qū)差異片段可能更為便捷。但是，首先仍有些結構基因上突變并不改變基因表達譜系卻能改變細胞表型。比如，激素受體基因突變會改變細胞表型，使之對該種激素不再敏感，但受體基因仍在表達，是不能用開關區(qū)或cDNA減法篩查到的。其次，表型相關突變僅發(fā)生于少數(shù)基因上，篩出后容易做進一步分析；而所有的可能成百上千個表型相關基因都會在cDNA減法中被篩出，這就難以做進一步分析。因此，分離某些病變組織的突變片段仍有十分重要的價值。本發(fā)明先前曾建立過分離突變片段的有關專利技術，這里就不再贅述。
如前所述，現(xiàn)有技術建立的細胞cDNA文庫的不穩(wěn)定性及不均勻性，以及做為差異序列的任何表型相關的cDNA種類極大的數(shù)目，這都使cDNA減法分離表型相關基因?qū)㈦y以奏效。但是，一方面某些高表達量的基因可以通過功能克隆法分離到其cDNA片段；而且，功能cDNA片段相當保守，可以通過不同物種間同序克隆法分離到它們。因此，現(xiàn)在已通過上述兩種技術分離到許多種表型(功能)相關基因的個別成員之cDNA片段。另一方面，基因的確切的表型相關性，必須由其確切的功能形式－mRNA和蛋白質(zhì)來加以確定。綜上所述，基因相關表型一般還必須由上述兩種技術篩出的cDNA片段來加以鑒定；或者用篩到的開關區(qū)/開關分子片段進一步誘導生成相應的mRNA和蛋白質(zhì)來加以確認。
同分離突變/cDNA片段相比，分離基因開關區(qū)的方法是分離表型相關基因的更為簡便有效的策略一方面，如前所述，作為表型相關基因群的特征同一序列，分離它最為簡便差異克隆時，只要分離出表型相關基因的幾個個別成員，也就分離到了這個特征同一序列；同序可隆時，只要取少數(shù)樣本就可以篩出目標表型相關基因了。另一方面，作為表型相關基因群的表達控制(開關)序列，用它可直接分離到表型開關基因的開關分子，并進一步在體外誘導生成和分離所有表型相關基因的表達區(qū)和全序列(NOR法-nuclear run on和TEA法-transient expression analysisK.Koike,et al.,Gene 186(1997),P45-53；H.G.Ashe.,et al.,Gene.Dev.11(1997),P2494-2509)并通過分析基因開關區(qū)開關的開關時序和表達區(qū)開關的開關位序，建立起表型相關基因的功能關系網(wǎng)絡，甚至可以依據(jù)開關區(qū)/開關分子的印跡分析進一步建立基因組的所有基因的功能關系網(wǎng)絡，從而繪制出基因組完整精確的功能圖譜。當然，更為重要的也許是可直接篩出可改變和塑造細胞表型的基因開關分子而用于人類衰老性致命性疾病的治療和動植物基因工程。因此，把這種策略實施于基因工程研究和應用將更為有效。下面就此作進一步詳細分析。
一個人或高等動植物的個體細胞一般有相同的基因組，卻可表現(xiàn)出千差萬別但卻協(xié)調(diào)一致的組織表型。這些千差萬別的表型是通過細胞發(fā)育過程(胚胎干細胞/組織干細胞/幼稚細胞/成熟細胞/終末細胞/凋亡細胞)，周期活動過程(GO期/G1期/S期/G2期/M期)，激活過程(激素或抗原/細胞膜受體/細胞質(zhì)通訊因子/細胞核轉(zhuǎn)錄因子/蛋白質(zhì)或酶修飾因子/蛋白質(zhì)釋放因子)和細胞突變過程(如癌變過程正常組織/良性瘤/原位癌/浸潤癌/轉(zhuǎn)移癌)等生理或病理活動所形成的。這些活動的本質(zhì)是基因群的級聯(lián)式(cascade)開關造成基因群在時間和空間上精確的差次表達。而對于一個表達某種正常表型的基因群(包括上游調(diào)控基因和下游功能基因，中游管家基因不參予這個過程)一般要經(jīng)過三道開關才會最后使細胞形成這種功能表型。這三道開關是基因修飾區(qū)、啟動區(qū)和表達區(qū)開關。在細胞分化前，管家基因、DNA合成基因和細胞分裂基因的修飾區(qū)都已被去甲基化，它們的啟動區(qū)分別在細胞G0、G1和G2期被啟動(與轉(zhuǎn)錄因子結合)而表達，從而形成了細胞生命的基礎結構。在細胞分化過程中，組織特異基因的修飾區(qū)被去甲基化，從而形成了細胞的組織表型。這些基因(包括細胞增殖控制基因、多種功能調(diào)控和表達基因、細胞凋亡基因等)的啟動區(qū)會在細胞增殖周期和發(fā)育過程被分別啟動而表達，或被封閉而停止表達，從而形成了細胞的發(fā)育表型(詳見圖1)。但是，一個功能基因群的表達只是產(chǎn)生了一個靜止的功能蛋白信息鏈。這個鏈的上游基因蛋白會在細胞外源或內(nèi)源分子作用下被激活(變構或被磷酸化/去磷酸化)，并反過來激活信息鏈下游基因。以此下傳，使整個功能鏈活動起來。最后啟動或激活了功能基因，表達了這種功能表型。這里上、下游基因的相互作用是通過基因表達區(qū)進行的?；虮磉_區(qū)應有一個上游基因識別區(qū)(調(diào)節(jié)亞基)和一個下游基因識別區(qū)(催化亞基)，它們級聯(lián)式(Cascade)開、關才使細胞最終表現(xiàn)了功能。
至今為止，對于細胞發(fā)育、分化、周期性、生理性激活或病理性突變活動過程中基因的開關形式還不十分清楚。細胞發(fā)育和分化過程基本上是一個基因差次表達過程不但由轉(zhuǎn)錄因子和封閉因子對基因啟動區(qū)的開關控制，也有修飾因子對修飾區(qū)的修飾。而細胞發(fā)育、分化也同時是一種周期性活動，不乏存在一些如CDK(周期性依賴性激酶)激活因子對基因表達區(qū)的激活。細胞的生理性和周期性的激活活動則明顯地包括了啟動區(qū)和表達區(qū)開關的兩種方式。這兩種方式一般發(fā)生于同一基因相互銜接的不同階段，比如，DNA合成酶基因在G1期被啟動，合成的DNA合成酶在S期被激活，在G2期又被滅活。也可能同時發(fā)生于不同的基因。比如，端粒酶基因可能與普通DNA合成酶不同，它僅在胚胎干細胞中被啟動，在體細胞中，儲存的酶原只是在S期被激活，而酶量和其活性則隨細胞分裂而減少。因而造成端粒的進行性縮短。細胞病理性突變過程中，多數(shù)突變可能并不影響該突變基因的表達。但是，如前所述，大多數(shù)基因都是調(diào)控基因，它們都是復雜基因調(diào)控鏈的中間環(huán)節(jié)，當它們因突變而失活，或者不表達時，就會引發(fā)整個調(diào)控鏈失活而造成基因的差異表達。比如，體細胞癌化過程中，基因突變就造成了許多已關閉的胚胎基因的再次表達，包括細胞增殖激素基因、細胞浸潤性基因、細胞移行和誘導血管生成基因等。當然，基因突變有時也會造成突變基因本身差異表達。比如，病毒增強子插入或基因重排造成其他啟動區(qū)的插入，或修飾區(qū)/啟動區(qū)的突變都可能造成休眠基因的啟動；基因缺失和移碼突變都可能造成活躍的基因不再表達。有些證據(jù)表明病毒基因插入造成原癌基因啟動是許多種白血病的病因；而基因重排造成原癌基因去抑制而表達和腫瘤抑制基因的失活是大多數(shù)實體癌的病因。而點突變造成基因失活則是大多數(shù)其他基因病的病因?？傊缟纤?，大多數(shù)表型相關突變都會引發(fā)差異表達，而可用開關區(qū)加減法分離。
現(xiàn)已知道，至少在哺乳類動物中，發(fā)育過程的基因活動會在基因組DNA留下足跡。主要方式有點修飾，即開關區(qū)中CpG序列的去甲基化，及重排性修飾，即某些基因的增強子插入和局部基因的擴增。這些基因修飾可采用基因組限制片段減法分離；點修飾改變了開關區(qū)與結合蛋白的親和活性，也可以用開關區(qū)加減法分離。而有證據(jù)表明，點修飾是較普遍的基因修飾形式。與修飾區(qū)不同，基因啟動區(qū)和表達區(qū)的開關活動并不會在基因組留下足跡，但它們會引發(fā)基因表達的差異，即cDNA和結合蛋白的差異，可用cDNA減法和開關區(qū)片段/結合蛋白結合體減法分離。這是因為，處于不同表達狀態(tài)的基因開關區(qū)會結合上不同的DNA結合蛋白不表達者處于甲基化狀態(tài)而結合親甲基化蛋白(MeCP 1/2)；表達者結合轉(zhuǎn)錄因子，停止表達者結合封閉因子，或不結合任何因子。因此，它們會在電泳中發(fā)生錯位而用減法分離。如前所述，表達區(qū)作為表型相關基因的差異序列，不宜直接用表達區(qū)減法分離。但可以用開關區(qū)/開關分子減法分離到的開關分子通過NRO法或TER法誘導生成所屬表型相關基因的表達區(qū)(mRNA或cDNA)。
現(xiàn)在的問題是還需要弄清這一群基因的不同成員間功能關系。而這種關系的本質(zhì)是一個蛋白質(zhì)/DNA和蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)組成的級聯(lián)式開關鏈。所以，可以通過表型相關基因的開關區(qū)和表達區(qū)(cDNA/表達蛋白)的異位加法分析之。雜交者為相鄰基因，有二個雜交帶者，為位于開關鏈中間的基因，僅有一個雜交帶者，為始或終末端的基因。用這種方法可以確定由同一表型相關基因組成的功能開關鏈及其始端的本級開關基因和終端的下一級開關基因或終末結構基因。總之，上述方法可用來分析表型相關基因開關區(qū)的開關時序和表達區(qū)的開關位序。
綜上所述，一個細胞發(fā)育，首先通過表型相關基因的若干個開關區(qū)的級聯(lián)式開關活動，形成了若干個不同的發(fā)育階段表型(胚干/組干/幼稚/成熟/終末/凋亡)；而在每個發(fā)育階段，基因的表達區(qū)的級聯(lián)式開關活動又形成了細胞周期性和生理性活動的表型。與表達區(qū)的級聯(lián)式開關鏈一樣，開關區(qū)的級聯(lián)式開關鏈也會有一個始端和終端。前者的始端開關基因可能是某種激素、抗原或生理代謝物受體，它們一旦被特異生理物質(zhì)啟動，就會發(fā)生聯(lián)動式開關而形成周期性和生理性活動表型。后者的始端開關基因則可能是兩種發(fā)育基因一種可能是稱為成形素(Morphogens)基因，表達于個體發(fā)育早期，啟動細胞增殖相關基因，并隨著細胞增殖而逐漸稀釋，最后使細胞增殖至一定數(shù)量即停止分裂。它在胚胎不同部位呈精確的非隨機的分布，每個部位的濃度即決定了該部位細胞數(shù)目，而濃度的精確分布決定了個體形態(tài)；另一種可稱為成型素(Phenogens)基因，表達于個體發(fā)育晚期，啟動(并修飾)了細胞組織表型相關基因。這個成型素基因可能被修飾(去甲基化)了，可隨著細胞增殖仍在干細胞中不間斷地表達，從而不斷地啟動形成組織表型的基因級聯(lián)式開關活動?？傊@些表型開關基因是造成表型形成的真正鑰匙，它一經(jīng)啟動，就會引發(fā)一系列基因級聯(lián)式開關而形成細胞確定的表型。從分離到的多級表型相關基因中分離出這個基因開關鏈始端的開關基因是十分重要的。分離開關基因有兩種策略一種是通常的縱向篩查的策略。首先通過功能克隆/同序克隆法分離到表達量大的表型相關基因開關鏈的末端基因表達區(qū)，然后按下游基因表達區(qū)→開關區(qū)→開關分子→上游基因表達區(qū)→開關區(qū)→開關分子→最上游表型開關基因開關區(qū)和開關分子的縱向順序去篩查。這里無論是步移，雜交，還是測序篩查都十分麻煩，而且發(fā)育之終、始端基因可能會經(jīng)過多級開關過程。因此，縱向篩查策略缺乏實際應用所要求的效率。另一種是本發(fā)明建立的橫向篩查策略。這種策略是首先用已分離到的若干個表型相關基因的開關區(qū)探針和表達區(qū)探針分別與不同發(fā)育階段細胞之核蛋白印跡和mRNA印跡雜交，從而確定各個基因開啟或關閉之確切時序，從而確定最早發(fā)生開關活動的基因，即為表型開關基因。這種策略的依據(jù)是表型相關基因，也即有該表型/無表型基因組間表達差異的基因(管家基因雖然也是任何表型相關的基因，但與組織表型相關基因有不同調(diào)控過程而不在研究之列)總會結合有不同的結合蛋白(不表達者結合有甲基化親合蛋白；表達者結合有轉(zhuǎn)錄因子；表達后又停止者結合有封閉因子或未結合任何因子)而會在電泳中錯位而在減法中被篩出。這種策略可避免基因步移、雜交和測序的麻煩，又可一步到位，無須經(jīng)過多級篩查的過程，因而有較大的實用價值。
分離到表型開關基因的開關區(qū)的下一步，就是要篩查其開關分子。一般而論，基因的開關分子和被其開關的基因是異位或異時表達的只有異位表達，才能保證身體各部位不同細胞活動在空間上的協(xié)調(diào)。比如，激素、抗原、神經(jīng)介質(zhì)及代謝物等的異位表達所形成體細胞間聯(lián)系就保證了身體各部位組織和器官生理活動的協(xié)調(diào)性；同樣，只有異時表達，才能保證細胞活動在時間上的協(xié)調(diào)性和有精確的節(jié)奏。比如，組織周期活動中的開關分子CDK和細胞發(fā)育活動中的開關分子-成型素，它們與被啟動或關閉的基因的異時表達，才保證細胞生理和發(fā)育，形成有節(jié)奏的活動。因此，開關分子雖然可能以蛋白質(zhì)形式存在于有目標表型的細胞之中，但它可能是異時或異位表達的，要篩到其mRNA(cDNA)或開關區(qū)片段，還要到異時或異位的組織中去篩查。比如，這個表型開關分子，可能是修飾基因的修飾分子，啟動/封閉基因的啟動/封閉因子，或者是激活基因表達區(qū)的激活因子。不同組織中，會有不同情況，篩這個開關分子時，應考慮到各種可能性。
現(xiàn)已知道，基因修飾區(qū)位于基因表達序列5端上游啟動區(qū)內(nèi)，包括有若干個CpC序列，CpG雙核苷酸中胞嘧啶環(huán)上第5位碳原子被甲基化(m5CpG)，就會與親甲基化序列蛋白(MeCP1/2)結合而封閉了啟動區(qū)。而啟動區(qū)包括了TATA,CAAT和GC等一致序列。這些一致序列使我們可以確定修飾區(qū)和啟動區(qū)大致位置。此外，如前所述，同一功能群中成員應有相同的修飾區(qū)或啟動區(qū)，因此，對同一功能群中不同基因的上述區(qū)域?qū)Ρ确治觯湍苷业介_關的精確的識別位置(基序)?，F(xiàn)在也知道，真核細胞中存在一種維修持基因組原來甲基化狀態(tài)的酶(maintenance methylase),DNA復制時，這個酶可識別新合成的半甲基化雙鏈，并把甲基加到非甲基化胞嘧啶上。當某種修飾分子與這個半甲基化鏈識別而結合時，就會抑制了維持甲基化酶的甲基化作用而使之去甲基化了；當某種啟動分子與啟動區(qū)識別而結合時，就會再結合上RNA聚合酶Ⅱ而開始轉(zhuǎn)錄；當某種封閉因子與啟動區(qū)識別而結合時，就會阻止RNA聚合酶Ⅱ的結合而抑制轉(zhuǎn)錄；當某種激活分子與基因(蛋白質(zhì))表達區(qū)結合時，就會使某種功能基因群活動起來，最終表達了這種功能。這些開關分子都是酶的識別亞基，它們識別的序列都不長(20bP的RNA鏈或10個氨基酸的短肽足以達到識別的特異性)。因此，這些分子鑰匙是一些小分子而易于配制。
現(xiàn)有還不能肯定，開關分子是RNA還是蛋白質(zhì)。但有證據(jù)表明，蛋白質(zhì)的可能性更大。在細胞核內(nèi)，單鏈DNA一般都被單鏈親合蛋白所包裹，修飾區(qū)或啟動區(qū)都是以雙鏈的形式被識別。所以，它們不大可能被單鏈RNA所識別。但是，顯然也不能完全排除RNA識別的可能性。此外，有些基因在胚胎細胞里有表達，而在成體細胞中已無表達，比如，端粒酶基因就是如此。現(xiàn)在還不能肯定，這些基因的不表達是由于基因未曾去甲基化，還是由于沒有被啟動或者被激活。在檢索開關分子時，應當考慮各種可能性1．基因未曾去甲基化。比如，在生命第8周內(nèi)，卵黃中細胞胚胎珠蛋白基因去甲基化而表達了胚胎珠蛋白。之后，這些細胞凋亡，而肝細胞胎兒珠蛋白基因去甲基化而表達了胎兒珠蛋白。在出生后，骨髓細胞成人珠蛋白基因去甲基化而表達了成人珠蛋白，而胎兒珠蛋白血紅細胞僅占1％。因此，胚胎，胎兒珠蛋白在成體中不表達是由于表達的細胞已經(jīng)凋亡，在不表達的細胞里這些基因并未去甲基化。實際上，人的胚胎、松果體和胸腺中許多表達了發(fā)育激素的細胞都會隨人的出生、成熟而凋亡，表達這些發(fā)育激素的基因在成體細胞中仍處于甲基化狀態(tài)。2．基因未被啟動，或者啟動區(qū)被封閉。一個功能基因群在被去甲基化后，還需要外源或內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子啟動下才會表達。細胞從分裂、分化到凋亡三個時態(tài)的變化都是通過啟動區(qū)未被啟動或被封閉這種方式把前一時態(tài)表達基因加以關閉的。比如，PAS-2基因在早期腎干細胞中被啟動，在成熟細胞中被WT1因子(由腫瘤抑制基因WT1所表達)封閉了啟動區(qū)而關閉之。實際上，體細胞增殖障礙都是由于增殖調(diào)控基因不被啟動或已被封閉所致。3．基因已表達，但表達的酶或蛋白質(zhì)沒有被激活。如前所述，人的松果體，胸腺和性腺都會隨著衰老而退化，隨著它們所分泌激素的減少和消失，這些激素的靶基因也就不再被激活。比如，老年人因為缺少胸腺而使對抗自身抗原的T細胞不能凋亡，對抗外源抗原的T細胞不能成熟，從而使之自身免疫疾病發(fā)生，細胞免疫力低下。總之，基因表達不論以什么方式被關閉，表達打開它們的鑰匙(開關分子)的基因都是在成體細胞中處于甲基化狀態(tài)。使這個開關基因去甲基化，也就會十分簡便、有效地啟動了靶基因了用從隨機噬菌體肽文庫中篩到的可與基因修飾區(qū)特異性結合的非生理性分子即可封閉修飾區(qū)而去甲基化，而開啟啟動區(qū)或激活表達區(qū)則必須用有復雜的啟動/激活活性的生理性分子。其次，基因去甲基化狀態(tài)會在細胞傳代中保留下去，從而不斷地提供開關分子。
很顯然，某些細胞外或細胞內(nèi)的異時或異位表達的分子修飾、啟動和激活了特異的基因群，才形成了細胞的組織、發(fā)育表型和活動態(tài)。這些開關分子表達量很低?；蛘邅碓从诩毎?由別的細胞所表達)，或者表達于特別時刻，轉(zhuǎn)瞬即逝。篩查它們十分困難。但有一點是肯定的，即表達這些開關分子的基因(包括表達修飾分子的發(fā)育基因，表達啟動分子的調(diào)控基因和表達激活分子的激素基因)會完整地保存在基因組DNA之中，而且它們的表達物(RNA或蛋白質(zhì))與被開關的靶基因的修飾區(qū)，啟動區(qū)或表達區(qū)有特異的親合性，可與之結合而形成穩(wěn)定的結構。因此我們可用已確定的開關區(qū)(鎖)基序探針直接或通過隨機或非隨機的噬菌體肽文庫到基因組DNA中去篩查這些表達開關分子的基因，然后把篩到的DNA或蛋白質(zhì)測序確定。
用天然、生理分子來開關基因，當然是最好的選擇。但是，檢索那些激活基因的天然分子也并非易事，尤其是修飾分子，表達于某個發(fā)育期，轉(zhuǎn)瞬即逝。此外，現(xiàn)在還不能肯定是否存在滅活基因的天然分子。因此，有時也必需尋找替代的開關分子用與基因修飾區(qū)親合的多肽或RNA分子封閉修飾區(qū)而抑制甲基化維持酶，可使基因去甲基化；用識別基因修飾區(qū)的微生物來源的甲基化酶可使基因甲基化。用與基因啟動區(qū)或表達區(qū)親合的多肽或反義蛋白質(zhì)封閉啟動區(qū)或表達區(qū)，就可以阻止基因被啟動或被激活?？傊Y合使用和模擬天然、生理開關分子這兩種方式，我們就可以隨心所欲地開關靶基因，實現(xiàn)治療基因病的目的。
雖然開關基因的策略可應用于基因工程的許多領域，但顯然最為重要的將是醫(yī)學領域。當大多數(shù)外源性傳染病被征服以來，內(nèi)源性基因病就成為人類死亡的主要原因。大約80％的人都死于動脈硬化、癌癥和老年呼吸道疾病等十幾種體細胞基因病。至今為止，仍缺乏有效的方法根治這些常見的絕癥改變病變細胞基因型的效率很低(基因轉(zhuǎn)導及實現(xiàn)原位整合的效率分別是10-1和10-6)；用化學物、反義RNA或激素激活或滅活靶基因表達產(chǎn)物的方法又不能改變細胞表型，使之從病態(tài)轉(zhuǎn)為健康態(tài)，達到根治目的。因此，有必要采取一種新的折中策略一開關基因把細胞從病態(tài)表型轉(zhuǎn)為健康表型的方法只要把開關分子(短肽)與靶基因開關區(qū)特異結合，就可啟動或關閉一個功能基因群。這遠比轉(zhuǎn)導基因更精確和有效開關基因可以永久地改變細胞表型(修飾基因可以改變細胞組織型，啟動基因可以改變細胞發(fā)育型)以根治基因病，這是反義RNA或激素難以做到的；而且，像癌、糖尿病這樣一些多基因病，可能需要多個基因的反義RNA或蛋白質(zhì)來治療，而只要一種該疾病相關基因的公用鑰匙，開關分子即可。總之，啟動抑病基因，關閉致病基因可以預防和治療大多數(shù)常見絕癥。因為，從根本的意義上講，這些絕癥都可歸因于體細胞衰老，即體細胞更新障礙。而近年來生命科學的最重要發(fā)現(xiàn)之一是，這種細胞更新障礙是由于某些基因不恰當開關造成的。把這種不恰當?shù)拈_關再扳回來，就可在很大程度上預防和治療衰老。
細胞衰老從基因?qū)W角度可歸于三個層次的變化1．基因表達的衰變。衰老細胞中常會顯示明顯的細胞器衰變，包括細胞核變小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體變形和減少，及脂褐質(zhì)等不溶物堆積。細胞可能還沒有進化到可自我更新和修復的“永生”生命體水平，基因表達物一細胞器就會隨著成活年齡的增加而衰變。但這顯然不是衰老的主要原因。因為大多數(shù)人不是死于神經(jīng)、肌肉組織這些不更新的高齡細胞的衰變，而是死于血管內(nèi)皮、血組織這些更新快的低齡細胞的衰變。而細胞更新是可以篩除一切衰變細胞器的。2．基因病理性突變。有證據(jù)表明，癌癥和白血病都是由若干個基因突變引發(fā)的，其他一些常見致命疾病，如糖尿病、早老癡呆癥等也與基因突變相關。也有證據(jù)表明，癌癥的突變病因也許是個特例，其他疾病與它有所不同。常見致命性疾病都是些造成細胞嚴重缺陷的病，一般需要多個基因損傷才會致病。比如有人估算過，癌癥至少需要9個基因突變才會引發(fā)。而細胞在身體里一生中也積累不了這么多有害突變。癌細胞中能積累較多突變是由于它的增殖紊亂有利于細胞生存而在細胞更新中優(yōu)先保留下來。其次，它迅速增殖使端粒縮短而引發(fā)染色體紊亂，加速了突變。對于其他疾病來說，突變遠沒有積累得這么快。細胞的一種功能可能與細胞中上萬個表達基因相關，這些基因的突變都可能影響功能而致病。但實際上致病基因并不多首先，90％的表達基因是細胞存活必需的管家基因。它們的有害突變會在細胞更新中被篩除掉。其次，余下的奢侈基因中也僅有少數(shù)包含有重要功能序列(3％)成員會因突變而致病。造成細胞嚴重缺陷的突變又會因為功能補償性增殖而在細胞更新中被篩除，或激發(fā)細胞凋亡而被篩除。因此，只有少數(shù)奢侈基因上有害突變或管家基因上有利突變才會積累下來。有人估算細胞在身體里一生只能積累大約(28×10％×3％=)0.084個有害突變，這不足以引發(fā)病變。3．基因生理性轉(zhuǎn)變(開關)。有證據(jù)表明，體細胞與種系細胞不同，它們不能無限增殖，僅能分裂有限次數(shù)，50至60次。而神經(jīng)、肌肉細胞在成體中不再分裂?，F(xiàn)已知道，某些基因(包括端粒酶基因)的生理性關閉(修飾或不啟動)導致了體細胞增殖障礙。這種基因轉(zhuǎn)變是衰老的根本原因如上所述，除了癌癥以外。其他動脈硬化、免疫力缺陷、骨質(zhì)疏松癥、早老癡呆癥、帕金森氏癥等疾病都缺乏與基因突變相關的確切證據(jù)。這些疾病發(fā)生在易損傷、更新快而形成了增殖障礙的組織部位，如動脈血管內(nèi)皮、血組織及肺、肝、心、腸、胃等部位；也發(fā)生在不增殖的組織如神經(jīng)、肌肉。而且都有細胞數(shù)目減少的明顯癥狀。另外，細胞增殖障礙還會激發(fā)突變的發(fā)生。比如，端粒的進行性縮短限制了細胞增殖，當它縮短到一定程度就會誘發(fā)有絲分裂紊亂而導致癌癥。細胞增殖障礙也會促進余下細胞的代謝速度而加快細胞器的衰變。總之，細胞更新可以篩除大多數(shù)基因突變或表達衰變細胞，而細胞更新障礙是引發(fā)人類衰老和死亡的根本原因。
開關基因的方法可以治療和預防大多數(shù)常見致命性疾病。1．基因轉(zhuǎn)變病。由基因生理性轉(zhuǎn)變(開關)引發(fā)的病，包括體細胞增殖障礙、神經(jīng)細胞對缺氧的低耐受性及某些干細胞和幼稚細胞缺乏凋亡基因活性等等。人類是當今生命進化最高級的形式，但顯然還有許多不盡人意之處。端粒酶的失活可以使端粒進行性縮短而優(yōu)先篩除那些分裂次數(shù)過多而積累了較多突變的細胞。但它確實又誘發(fā)了動脈硬化和癌癥。對生命中存在的缺陷加以修飾是必要的。對這一類病的治療，只要把被錯誤地啟動或關閉的基因再重新關閉和啟動就行了。這種方法能夠延緩衰老，預防治療各種衰老性疾病。2．基因突變病?；蛲蛔兛赡芤l(fā)兩類病。(1)突變滅活了正在表達的基因。修復和更換突變的基因是困難的。但是，許多重要的功能基因都是多拷貝的，包括同源染色體上等位基因及在同一個染色體上成簇排列的家族基因。它們一般有相似的序列和功能，而有不同的開關區(qū)。不同的家族基因會在不同的個體發(fā)育期被激活，等位基因也常常有一個拷貝處于休眠狀態(tài)(稱為基因組印跡和×染色體失活)。比如，珠蛋白基因族就包括8個拷貝，它們分別在胚胎、胎兒和成人期表達。當某個基因的表達拷貝因突變而失活時，可修飾激活休眠中的其它拷貝。這種方法特別適用于某些遺傳性基因病的治療。這些病人仍然可能有休眠的健康拷貝可供使用。此外，任何一種組織特異基因群都在其它組織中保留有休眠的拷貝。當某種組織或器官因損傷、感染或退化(如老年人的胸腺)而使其功能嚴重喪失時，可以啟動其它組織干細胞中休眠的拷貝，使身體恢復已喪失的功能。比如，當胰臟嚴重損傷時，可激活骨髓干細胞中胰島素分泌相關基因群而恢復這方面功能。最后，干細胞中組織功能和凋亡基因尚未啟動，當這些細胞發(fā)生增殖紊亂時，這些基因未能被激活而導致細胞癌化，啟動這些基因可以有效地抑制癌化。總之，在許多病例中，當基因的表達拷貝被突變滅活后，可以啟動休眠的正?？截惾〈?。(2)突變激活了休眠的基因。癌細胞無控制增殖、無限增殖、浸潤性和轉(zhuǎn)移性(誘導血管生成)等特征都是某些休眠基因拷貝因突變而被激活之故。關閉其中一、二個基因就能夠有效地抑制癌癥。肥胖癥患者體內(nèi)促脂肪合成的激素水平可能過高，關閉肝臟、脂肪細胞脂肪合成酶系就可以抑制脂肪的積累。
開關基因的方法并不能治療所有的基因病。某些遺傳性、單拷貝基因病就必須導入一個健康的基因而不是啟動一個體內(nèi)已有的休眠基因。但是，現(xiàn)有的基因轉(zhuǎn)導技術(同源重組)的效率太低(10-8)。這可能因為大多數(shù)體細胞中缺乏重組基因之表達。而在某些特殊細胞中確實存在高效的基因特異或非特異同源重組，比如，在減數(shù)分裂細胞中。RFASIS法可用來檢索這些同源重組基因及其啟動區(qū)。在基因轉(zhuǎn)導時啟動這些基因，就可實現(xiàn)擬自然程序的高效高源重組。同此，開關基因法可用來向細胞高效、精確地導入一個健康基因。
開關基因面臨的另一問題是基因修飾發(fā)生在DNA復制之時，這就限制了修飾只能對分裂的細胞進行，而體內(nèi)只有少數(shù)細胞處于分裂狀態(tài)，這就限制了基因修飾的效率。但是，這種限制并非全是缺陷，而且又可以加以彌補和改善1．這種限制可用來對靶細胞(致病或抑病細胞)進行選擇性修飾。首先，對靶組織表型的選擇修飾的同時配合以靶組織專一性增殖激素，比如，修飾血管內(nèi)皮細胞時用ECGF，修飾紅細胞時用EPO等，促進靶組織細胞分裂而被修飾，其它組織細胞處于靜止狀態(tài)而不被修飾。其次，對靶部位的選擇。體內(nèi)受損部位常會因應激反應而有較多細胞進行分裂而被修飾。最后，對靶細胞的選擇。治療細胞增殖和功能缺陷病時，大多數(shù)幼稚的健康干細胞會分裂而被修飾和增殖起來。大多數(shù)積累了較多突變或衰變的衰老細胞則會處于靜止態(tài)而不被修飾，逐漸在細胞更新中被篩除；在治療細胞增殖紊亂病時，大多數(shù)惡性細胞會因分裂過快而被修飾而凋亡，大多數(shù)良性細胞則會不分裂而得以留存。這種對靶細胞的選擇性修飾可用來對靶細胞進行體內(nèi)修飾。藥物只修飾靶細胞而不影響非靶細胞，保證了治療的簡便、安全和有效。2．被限制的效率可以得到彌補。對于同時有增殖和功能缺陷的細胞，可同時修飾這兩種缺陷。雖然只有少數(shù)(比如，1％)的細胞被修飾，但修飾的細胞因為恢復了增殖力而可能在短時間里(7個世代，就可使細胞增殖到27=128倍)更新全部組織。對于增殖紊亂的細胞，可以對靶基因修飾區(qū)和啟動區(qū)同時用藥。比如，修飾其增殖調(diào)控基因以使之停止分裂，啟動其凋亡基因以促其凋亡。3、對不分裂的神經(jīng)、肌肉細胞，可以先啟動其分裂，再修飾之改型。有證據(jù)表明，神經(jīng)、肌肉細胞在某些病理條件下也會發(fā)生分裂，它們的不分裂并非是修飾區(qū)被關閉，而是其細胞增殖調(diào)控基因沒有被啟動?；蛘邲]有被激活。用RFASIS法檢索到這些啟動分子或激活分子，用它們先啟動細胞分裂，再對其進行修飾改型，就可以對這種細胞增殖缺陷病進行治療。
綜上所述，依照自然生理程序開關基因的方法，不但能夠延緩衰老，預防和治療各種常見的體細胞基因病，而且能夠提高基因轉(zhuǎn)導方法的效率，治療各種罕見的遺傳性基因病。我們已能用一個體細胞來克隆出“多利”羊那樣一個完美的生命體，為什么不能用它來克隆一塊組織或一個器官呢？根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案，本發(fā)明分離表型相關基因的開關區(qū)和開關分子的方法可詳見圖2和圖3，包括1．限制片段的同源排序。
(1)原位排序。把同一個體細胞來源的樣本和對照本基因組DNA混合，加法時先用粗切酶(識別6－8核苷酸對的限制酶)把它們充份酶解為平均大于100kb長片段，電泳至凝膠條中，再用細切酶(識別4個苷核酸酶)把它們切成平均1kb長片段，橫向電泳至凝膠片中。減法時，進行差異雙相電泳，先是低PH值緩沖液中瓊脂糖電泳，然后在變性丙烯酰胺凝膠中電泳。這一步驟可把兩個基因組DNA的107種同一片段電泳至相同位置，不同片段電泳至105個以上不同位置。使雜交雙方復雜度降至105分之一。
(2)異位排序。把不同個體細胞來源的樣本和對照本DNA片段(RF)或DNA片段/結合蛋白(BP)之一的樣本先進行電泳，使不同種類的DNA片段或結合蛋白分離而排序，同一種類者則集中于同一位置而濃縮；然后把對照本也電泳排序，并使它們電泳通過上述樣本的電泳膠。同源的樣本和對照本將會在電泳中相遇而雜交。這種方法同樣可以降低雜交雙方的復雜度。
(3)去除非開關區(qū)片段。把同一個體或不同個體細胞來源的樣本和對照本的DNA結合蛋白吸附保留各自的或標準的DNA開關區(qū)片段，去除未能結合的限制片段和結合蛋白。然后把樣本/對照本的開關區(qū)片段/結合蛋白的雜交體混合單向電泳或差異雙向電泳。這種方法可把雜交雙方的復雜度降至105或106分之一。
2．限制片段和結合蛋白的原位雜交(4)原位雜交是把上述含限制片段和結合蛋白的凝膠先置于解離液中處理使RF雙鏈或RF/BP解離，再置于雜交液中使之充分雜交。DNA單鏈間用高溫/堿性液解離和低溫/中性液雜交；DNA雙鏈RF/BP或BP/BP間用濃鹽液解離和稀鹽液雜交。
(5)電泳后應迅速把限制片段轉(zhuǎn)入空心膠中以保證它們既限制于電泳原位而不擴散，又有自由活動空間而充分雜交。
(6)樣本和對照本的同一片段間錯位造成減法中假陽性，加法中假陰性。把它們混合電泳可避免大多數(shù)錯位；點突變和重排突變相互造成的錯位幾率很低，還可通過使用不同限制酶而減少之。
(7)樣本和對照本的不同片段間錯交造成加法中假陽性，減法中假陰性。只要把第一次酶切片段切得足夠大，容納較多的限制片段多態(tài)性(RFLP)，就可以避免等位基因、家族基因間錯交；只要把第二次酶切的片段切得足夠小，小于外顯子，就可以把單拷貝序列與鄰接的散在性重復序列分開，以避免不同片段的重復序列間錯交。此外，加法中假陽性片段可通過樣本/對照本二者雜交的片段和二者各自自交的片段間減法去除之。加法中錯交形成的假陽性片段因不能形成靶片段的特異性末端(如點突變片段的平末端，重排突變片段的粘性末端)，可用加特異性接頭進行PCR方法把靶片段單獨擴增出來。減法中假陰性片段可通過使用不同限制酶把它們篩回來。
3．檢索差異片段。差異片段是僅存在于有表型的樣本和無表型的對照本之中一種細胞的片段。因此，他們可能是表型相關基因的片段，包括突變差異(點突變/重排突變)片段和表達差異(啟動/修飾/cDNA)片段。減法是把未能雜交的靶片段分離出來的方法；加法則是把雜交形成的雙鏈錯配區(qū)，半甲基化區(qū)或去甲基化區(qū)的靶片段分離出來的方法。加減法可通過DNA片段間或DNA片段/結合蛋白間雜交來進行，也可以通過它們間劑量比較來進行。
(8)減法分離重排突變/修飾片段。當樣本和對照本片段混合電泳前，把對照本片段末端脫磷酸化和生物素化，在它們充份雜交后，用生物素親合蛋白把對照本和雜交片段固定，而把不雜交的樣本突變片段分離出來。
(9)減法分離啟動/修飾片段。分離點修飾片段的簡單方法是樣本和對照本片段混合雙向電泳后，用切非甲基化CpG的限制酶切下非甲基化片段，縱向(與膠面垂直)電泳至另一膠膜上，再經(jīng)過減法分離出點修飾片段；另一方法是用樣本和對照本DNA分別與各自細胞核蛋白溫育結合，然后限制酶切和差異雙向電泳，修飾片段因結合了轉(zhuǎn)錄因子而與結合了親甲基化蛋白的非修飾片段發(fā)生錯位，而用減法分離之；分離啟動片段的方法是用樣本DNA分別與樣本和對照本的細胞核蛋白溫育結合，然后進行限制酶酶切和差異雙向電泳，啟動片段因為結合了轉(zhuǎn)錄因子而與非啟動片段錯位，而用減法分離之；還有一種方法是用樣本和對照本DNA分別與親甲基化序列蛋白溫育結合，然后用限制酶切和差異雙向電泳，修飾/啟動片段因不與親甲基化序列蛋白結合而與非修飾片段間錯位，而可用減法分離之。
(10)加法分離點突變/修飾片段。當樣本和對照本片段充份雜交后，用化學物(鹽酸羥胺，四氧化鋨和六氫吡啶)或者酶(T4內(nèi)切酶Ⅶ或S1核酸酶)切割DNA雜交雙鏈錯配處，然后把切短的片段縱向(與膠面垂直)電泳到另一膜上，切短的片段電泳在前面而單獨分離出來?；蛘哂妹?DNA修復酶mutHLS/DNA聚合酶Ⅰ)把生物素核苷酸標記在雜交雙鏈錯配處，然后用生物素親合蛋白把這個點突變片段固定下來。分離點修飾片段，可用酶(mutHLS/S1核酸酶)切下雜交DNA雙鏈的半甲基化處而分離之；或者用酶(mutHLS/DNA聚合酶Ⅰ)把生物素核苷酸標記在雜交雙鏈半甲基化處固定而分離之。點突變片段可以從基因組DNA或cDNA中分離；點修飾片段可以從基因組DNA或開關區(qū)DNA中分離。
(11)加法分離重排突變/修飾片段和啟動片段。當樣本和對照本片段混合電泳前，把對照本片段甲基化，在它們充分雜交后，用識別該甲基化位點的限制酶把因錯位而未能與甲基化的對照本同源片段雜交的樣本自交靶片段切斷而分離之。
(12)把差異片段擴增為探針，上述方法分離到的差異片段都可在雙末端加上20-24bp長接頭或載體，然后用相配合引物通過PCR擴增為探針。在進行PCR擴增之前，可以為切割雜交雙鏈錯配處或半甲基化處形成的點突變/修飾片段的平末端，或者切割特異去甲基化序列處形成的特異粘性末端加接一個生物素接頭，然后用生物素親合蛋白把這些靶片段固定在試管中，去除非靶片段后再進行PCR擴增，從而提高PCR效率。
4．檢索同一片段。
(13)克隆已知的表型相關的cDNA探針。從Genebanks檢索到與目標表型相關的已知cDNA序列。從cDNA 5’始端序列中選擇設計適宜引物，以基因組DNA或者上述已分離到的表型相關基因的大尺寸限制片段為模板，把已知cDNA序列通過PCR擴增為探針。
(14)原位加法。把兩種具相同生理或病理表型的不同細胞中得到的修飾或啟動片段的一種標以生物素，兩種片段混合單向電泳原位雜交后，先用生物素親合蛋白把標記生物素的片段和雜交片段固定，未雜交的另一種片段從凝膠中洗脫。然后變性處理把雜交上的片段分離出來，即為該表型相關的同一片段。
(15)異位加法。Southern印跡法把兩種具相同生理或病理表型的不同細胞中得到的突變片段或突變/開關區(qū)片段，修飾/啟動片段分別標以螢光素。通過與人的全DNA大限制片段平行電泳印跡雜交，等位顯示帶即含有該表型相關的同一片段。Western印跡法把上述標有熒光素的兩種開關區(qū)片段通過與樣本和對照本細胞核蛋白平行電泳印跡雜交，等位顯示帶即含有該表型相關的同一片段。Northern印跡法把上述標有熒光素的開關區(qū)、表達區(qū)和突變區(qū)片段與樣本和對照本細胞的mRNA平行電泳印跡雜交，等位顯示帶即含有該表型相關的同一片段。這些篩出的表型相關片段，及被雜交顯示的大限制片段均可進一步克隆和測序。
5．檢索表型/激素開關基因的開關區(qū)和開關分子。如果檢索到若干個目標表型相關基因，它們在細胞發(fā)育中，必定有一個是最早被修飾、啟動和激活的，而其他基因則是被其表達物所啟動和激活。只有這個最早啟動或關閉的表型相關基因才是真正的表型/激素開關基因。
(16)用分離到的表型相關基因的開關區(qū)或開關分子為配體，通過親和層析吸附與之同源的大限制片段，并進一步吸附、純化該表型細胞的cDNA或mRNA文庫的相關成員，并對所有表型相關基因的開關區(qū)和表達區(qū)測序。
(17)克隆下述表型開關分子之表達基因，并使之表達相應活性蛋白質(zhì)。用這個開關分子在培養(yǎng)表型前體細胞中啟動表型相關基因，使表達相應mRNA。用管家基因的cDNA隆文庫或其它組織細胞的cDNA文庫吸附其中的非表型相關基因成分(mRNA)，余下者即為該表型相關基因的mRNA。
(18)用這些已篩到的表型相關基因的開關區(qū)和表達區(qū)探針分別與該組織表型的處于各個不同發(fā)育階段之細胞的核蛋白Western印跡和mRNA Northern雜交。從而確定各個基因開關區(qū)的開關時序和最早被啟動或關閉的表型開關基因。
(19)用上述mRNA在兔網(wǎng)織紅細胞提取液中合成相關蛋白質(zhì)，再用這些表型相關基因之蛋白質(zhì)探針和開關區(qū)探針分別與被激活表型細胞的全蛋白Western印跡雜交，然后橫向電泳，確定相互雜交之蛋白質(zhì)的分子量，從而分析出基因表達區(qū)(蛋白)開關鏈上基因之開關位序和始終端。與下級基因之開關區(qū)雜交者為其終端，而只與一個基因雜交者為始端(與之親合的激素分子因異時或異位表達而不在探針之列)。這個始端基因即為激素開關基因，可用它進一步篩查表型開關分子表達區(qū)的最始端之開關分子-激素。
(20)用表型開關基因之開關區(qū)片段為配體，通過親和層析從表型前體細胞核蛋白中吸附、純化表型開關分子，用電噴射質(zhì)譜分析技術測定其氨基酸序列；也可以用表型開關基因開關區(qū)或激素開關基因表達蛋白為探針，篩查非隨機(胚胎cDNA)和隨機噬菌體表位文庫，從中篩查出表達開關分子的DNA序列，再在測序而確定之。
與現(xiàn)有技術相比，本方法--開關區(qū)片段原位加減法(RF/BPASIS)直接分離作為表型相關基因的特征共同序列和功能序列的基因開關區(qū)是十分便利和有效的，下面從四個方面加以說明1．分離表型相關基因開關區(qū)的差異片段。
(1)開關區(qū)片段(啟動片段/修飾片段)也是表達差異片段，都是與表型相關的，而突變片段則包含有很多與表型無關的片段，需要加以篩除。因此，這種方法省略了篩除非表型相關片段的步驟。
(2)RF/BP結合體減法直接從DNA中分離表達差異基因而不必建立cDNA庫，省時省力。
(3)BP遠比mRNA穩(wěn)定。mRNA半衰期很短，用它們難以建立一個完整(包括所有種表達基因的mRNA)的cDNA文庫。
(4)mRNA提取，cDNA克隆過程難免有低拷貝基因丟失，基因組DNA和BP結合不經(jīng)過克隆過程，它們又十分穩(wěn)定，BP量很大，達到4mg/108細胞，每個開關區(qū)對應有105-106個特異結合蛋白。又可通過RF/BP原位結合，或者去除非特異BP(組蛋白和甲基化親合蛋白)及RF/BP對流雜交(有序雜交)方式使大多數(shù)啟動/修飾RF結合上與之特異性親合的BP，而從減法中篩出。
(5)不同基因表達的mRNA量差異很大，含量可差到10萬倍；高拷貝數(shù)的cDNA會稀釋處于同電泳位的低拷貝cDNA而使之難以篩出。而基因的開關區(qū)只有一個，是均勻的。
(6)RF/BP結合后，去除未能結合的RF和BP，可使復雜度降至104分之一，再經(jīng)單向或差異雙向電泳則可使復雜度降至102分之一以下，從而保證了減法效率。而cDNA的長度多態(tài)性比RFLP為小，難以通過單向電泳使復雜度降至102分之一以下。
(7)在多數(shù)情形下，樣本/對照本細胞基因表達差異不在于基因組DNA不同，而在于含有不同之BP，做BP/RFSIS時，不必取同一個體DNA為對照本，而直接用一種標準DNA和它們不同的BP結合后做減法，這使取材更為容易。
(8)這種方法篩的是表型相關基因同一序列(motif)的開關區(qū)，而不是相關基因的個別差異序列表達區(qū)，即使有些基因的開關區(qū)因未能與BP結合而被篩出，也不影響我們篩出其他基因的與之相同的開關區(qū)。漏檢某些基因開關區(qū)不會影響實驗結果。
(9)RF/BP結合體加減法可以通過RF/RF間雜交進行，也可以通過RF/BP間雜交進行。而且RF/BP間雜交的效率遠高于RF/RF間雜交。
2．分離表型相關基因開關區(qū)的同一片段。
(10)一個確定表型的相關基因可能成百上千，相應篩出的差異序列的cDNA種數(shù)也會十分巨大，難以做進一步分析；但是它們共同序列的開關區(qū)可能只有少數(shù)幾個，容易用來做進一步分析。
(11)表型相關基因成百上千，用突變片段(可能分布于任何相關基因的任何區(qū)段)或功能片段(可能分布于任何相關基因的表達區(qū))探針來篩查，取樣量可能需要成百上千，才能保證篩出表型相關基因；而表型相關基因有共同的開關區(qū)，用表型相關基因的共同序列-開關區(qū)片段為探針，只要取少量幾個樣，就可能篩到表型相關基因了。
(12)開關區(qū)(啟動/修飾)片段探針都雜交在基因比較短的啟動區(qū)中，做DNASouhern印跡分析時，只要不把相關基序(motif)序列切斷即可，這可以用先進行RF/BP結合，后切割RF方法來實現(xiàn)；而突變片段可能分布于基因全序列，做DNASouhern印跡分析時，要把RF切成大于基因全長度(平均60kb)的片段，這在技術上是困難的。
(13)開關區(qū)片段探針可通過PCR擴增為較大數(shù)量，再與DNA/mRNA/BP印跡雜交，，即可保證雜交效率；BP在細胞中的數(shù)量較大，再通過對流雜交(異位有序雜交)，也同樣可保證雜交效率。
(14)Souhern印跡和Northern印跡分析中單鏈RF/單鏈RF雜交和Western分析中雙鏈RF/BP雜交都是成熟的技術。
3．分析表型相關基因開關區(qū)的開關時序和表達區(qū)的開關位序。
(15)開關區(qū)(啟動/修飾)片段一般含有鄰接的表達區(qū)序列，可用它直接從cDNA文庫中篩查表達區(qū)片段(cDNA/mRNA)；而且，用開關區(qū)片段探針可直接篩查開關分子，再用開關分子又可在細胞內(nèi)或細胞外直接誘導出所有表型相關基因的mRNA和相應cDNA(NRO法)。因為同一表型相關基因有相同的開關區(qū)。因此，開關區(qū)探針可以篩查到所有的表型相關基因。
(16)用上述分離到的mRNA/cDNA，通過細胞內(nèi)或細胞外基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，可簡便有效地獲得表型相關基因的全部表達蛋白，以此為探針即可確定一個完整的開關鏈。
(17)用所有目標表型相關基因的開關區(qū)和表達區(qū)片段探針分別與處于不同發(fā)育或病變階段細胞的核蛋白Western印跡和mRNA Northern印跡雜交，以確定各個基因開關區(qū)的開關時序。在最早階段，發(fā)育或病變前體細胞階段已開關者可能為表型開關基因。
(18)用上述合成的表型相關基因的表達蛋白為探針，與被激活表型細胞的全蛋白Western印跡雜交，以確定各個基因表達區(qū)的開關位序。
(19)用被激活而形成了表型的細胞蛋白質(zhì)為印跡，保證了這些被激活的印跡蛋白可與未被激活的探針蛋白相雜交，而被分析。
(20)上述印跡分析加法不必對蛋白測序就可通過蛋白分子量和相應mRNA長度比較以及開關區(qū)/表達區(qū)序列比較來確定各個基因結構特征，比較簡便有效。
(21)上述印跡分析法在已篩出的表型相關基因群中進行，其復雜度遠比基因組為低。因此更為簡便有效。
4．分離表型/激素開關基因的開關分子。
(22)通常縱向地通過下游基因表達區(qū)→啟動區(qū)→上游基因啟動分子→表達區(qū)→啟動區(qū)→上游基因啟動分子過程篩查表型開關基因是十分困難的，無論啟動區(qū)/表達區(qū)間步移，還是從提純、分析BP到克隆表達它的DNA表達區(qū)，都很費時費力，而上述橫向地通過多個表型相關基因開關區(qū)/表達區(qū)的印跡比較來篩查表型開關基因開關區(qū)的方法都十分簡單、方便。
(23)在確定了表型相關基因開關區(qū)的開關時序和表達區(qū)的開關位序時，即確定了該時序和位序的始端基因-表型/激素開關基因。
(24)表型/激素開關基因的開關分子和開關區(qū)可相互識別而特異性結合；此外，表達/激素開關分子的基因也編碼在基因組DNA中。因此，可以用該基因的開關區(qū)為探針，從DNA/cDNA文庫中篩查到它們。
應用本發(fā)明的方法可篩查常見致命疾病的相關基因及治療藥物。下面是可以用本發(fā)明方法篩到的活性因子的實例。
1．端粒酶激活因子(TAF)；2．端粒酶抑制因子(TSF)；3．神經(jīng)/肌肉細胞增殖激活因子(NPAF/NPAF)；4．“接觸抑制”激活因子(CIAF)；5．“自主增殖”抑制因子(IPSF)；6．生長激素抑制因子(GHSF)；7細胞凋亡激活因子(CAAF)；8．胚胎珠蛋白激活因子(EGAF)；9．癌浸潤抑制因子(CISF)；10．癌轉(zhuǎn)移抑制因子(CMSF)；11．同源重組激活因子(HRAF)；12．增強子激活因子(EAF)；13．紅細胞生成素激活因子(EPOAF)；14．肝細胞生成素激活因子(HPOAF)；15．胰島素激活因子(INAF)；16．心鈉素激活因子(ANFAF)；17．組織型纖溶酶激活劑(t-PA)激活因子(t-PAAF)；18．胸腺素(thymus)激活因子(THAF)；19．松果體素激活因子(PBAF)；20．下丘腦釋放激素(HRF)激活因子(HRFAF)。
實施例參照以下說明性實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例1開關區(qū)片段(RF)和開關分子(BP)的原位結合從手術取出的肝癌和其周邊組織中分離細胞核，置于轉(zhuǎn)錄液(10mM Tris HCL,PH7.9,0.8M NaCL,5mM MgCL2,1mM DTT,10％甘油)中37℃24小時，12000rpm離心30分鐘去上清后(這個上清液還要用未打斷的魚精DNA吸附后，再電泳去除組蛋白，保留非組蛋白，留做下面使用)再把沉淀物在轉(zhuǎn)錄液中溶解，離心去上清。依上述方法把BP/DNA結合體洗三次。然后用限制酶把樣本和對照本的BP/DNA結合體切割成平均1kb片段，酶解緩沖液中還應加入去除組蛋白的核蛋白。然后用硝酸纖維素膜吸附BP/RF結合體而去除未結合BP的RF。然后把BP/RF凍存起來。
實施例2開關區(qū)片段和開關分子的異位結合分離出細胞核之后，首先置于轉(zhuǎn)錄液中常溫1小時，然后向溶液中慢慢加入4Mol/L硫酸銨，使溶液呈粘調(diào)透明液狀，12000rpm離心30分鐘，沉淀為DNA。上清為核蛋白，每毫升加入0.3克固體硫酸銨溶解，冰浴中過夜。然后12000rpm,0℃離心30分鐘，棄上清。再用透析液(25mM HEPES,PH7.6,40mM KCL,0.1mM EDTA,0.1mM DTT,10％甘油)透析兩次，后12000rpm 4℃離心5分鐘，上清為核蛋白提取液，然后把濃縮的核蛋白溶解于低鹽液(20mM Tris HCL,PH7.5,50mM KCL,0.1mM EDTA,0.1mM DTT,10％甘油)中，加入10mg/cl魚精DNA,30℃,30分鐘溫育后，0℃12000rpm離心30分鐘取上清，即為非組蛋白。把非組蛋白液與樣本或?qū)φ毡綝NA混合常溫過夜，即得到BP/DNA結合體。再按實施例1方法分離RF/BP結合體。在非組蛋白量較低情況下，可以把BP和RF置于對流雜交儀(圖2)中進行雜交。把BP和RF分別置于正、負極加樣孔，調(diào)節(jié)緩沖液的PH值使BP/RF二者對流電泳。當BP和RF都電泳到阻抑膜時，電流降到最低點，這時雜交儀自動改變電壓方向，進行第二輪對流雜交。經(jīng)過數(shù)輪雜交后，BP/RF結合體達到一定量，也會因增加阻力而減少電流，以此判斷雜交程度。最后用硝酸纖維素膜插入加樣孔，電泳使BP/RF回收到膜上。
實施例3提純甲基化CpG親合蛋白(MeCP1/2)、組蛋白和非組蛋白按著實施例2方法分離到細胞核蛋白，首先用10000倍未被切斷不含甲基化CpG序列的細菌DNA或合成DNA在低鹽液中充分吸附其中的組蛋白1小時，然后12000rpm,0℃離心1小時，沉淀為吸附有組蛋白之DNA，組蛋白可用濃鹽液解離而提純之；其上清用10000倍富含甲基化CpG序列的小牛胸腺DNA，高等植物DNA或魚精DNA在低鹽液中充分吸附其中的甲基化CpG親合蛋白過夜，然后12000rpm,0℃離心1小時，沉淀為吸附有甲基化CpG親合蛋白之DNA，甲基化親和蛋白可用濃鹽液解離而提純之；其上清即為非組蛋白，可直接用于RF和BP之結合。
實施例4 RF/BP雜交減法分離差異開關區(qū)片段(1)把樣本和對照本的RF/BP結合體等量平行單向聚丙烯酰胺單向電泳，然后濃鹽液(10mM Tris HCL PH6.8,2M KCL,5mM MgCL2,1mM EDTA,10％甘油)常溫1小時使RF和BP解離，然后在低鹽液(20mM Tris HCL,PH7.5,50mM KCL,0.1mM DTT,10％甘油)下把二者分別轉(zhuǎn)印置DEAE濾膜(或包被有魚精蛋白的尼龍膜)和硝酸纖維素膜上。然后把其中一張膜反轉(zhuǎn)，使樣本RF/對照本BP和樣本BP/對照本RF疊合在一起。把它們轉(zhuǎn)入空心膠中，使在低鹽液中過夜，RF/BP間充分結合，之后把未結合的RF電泳至DEAE膜上，回收到試管中，即為差異開關區(qū)片段。
實施例5 RF/BP雜交減法分離差異開關區(qū)片段(2)用活化生物素BNHS和生物素化核苷酸分別標記樣本BP和對照本RF的末端，然后把樣本和對照本各自的RF/BP結合體等量混合雙向等電點聚焦/中性聚丙烯酰胺凝膠差異電泳，把所有RF/BP結合體轉(zhuǎn)入涂有生物素親合蛋白之膜上，溫育30分鐘使標有生物素的樣本BP和對照本RF固定，然后濃鹽液浸膜使BP和RF解離，并迅速轉(zhuǎn)入空心膠中，低鹽液使RF/BP充分雜交1小時，之后把未雜交RF電泳分離出來。上述被固定的樣本BP和對照本RF可用PH4.5,3M的鹽酸胍液洗脫下來，迅速轉(zhuǎn)入空心膠中，進行另一輪雜交。
實施例6 RF/BP雜交減法分離差異開關區(qū)片段(3)分離、提純了樣本RF/BP結合體，用鹽酸胍把BP變性去除，余下的RF可經(jīng)PCR擴增后與純化的對照本非組蛋白結合，然后通過電泳阻抑法把未結合的RF分離出來。實施例7 RF/BP雜交減法分離差異啟動區(qū)片段用同一種基因組的RF(標準、樣本或?qū)φ毡綝NA)分別與樣本和對照本BP結合，然后按實施例4-6方法分離差異片段，即為啟動區(qū)片段。
實施例8 RF/BP雜交減法分離差異修飾區(qū)片段用按實施例3方法提純的甲基化CpG親合蛋白(MeCP1/2)分別與樣本和對照本RF結合，去除未結合之RF，然后按實施例4和5方法分離差異片段，即為修飾區(qū)片段。
實施例9 RF/BP和RF/RF二步雜交減法分離開關區(qū)片段首先把樣本BP和對照本RF的末端分別加以生物素標記和去磷酸化，然后把樣本和10倍對照本的RF/BP結合體混合低PH值瓊脂糖/中性聚丙烯酰胺差異雙向電泳。電泳后把全部RF/BP轉(zhuǎn)入空心膠，濃鹽/低鹽液處理使BP和RF間充分雜交，然后把RF/BP轉(zhuǎn)入涂有生物素親合素(Avidin)的試管中，溫育使生物素標記的BP固定在試管中，把未固定的BP和RF洗脫。再把固定的RF/BP用PH4.5,3M/L鹽酸胍液洗下，單向電泳后用濃鹽液處理使RF/BP解離后，迅速把解離下來的RF轉(zhuǎn)入空心膠中，堿性液(0.5M NaOH,0.6M NaCL 10％聚乙二醇6000)處理1小時使變性，中性液(0.1M磷酸鈉，PH7.8,50％甲酰胺，1M NaCL,5mM EDTA,10％聚乙二醇6000)處理20至40小時，使充分雜交。最后把全部RF回收到試管中，先加生物素化接頭或載體后轉(zhuǎn)入另一涂有Avidin之聚丙烯管，固定加上接頭之靶RF而洗脫其余RF，然后把靶RF擴增為探針。
實施例10 BP比較減法分離差異開關區(qū)片段把樣本和對照本的RF/BP結合體用DNaseⅠ充分酶解其末與BP結合的RF區(qū)段，在樣本和對照本的RF和BP末端分別標記不同顏色的螢光素(例如,FITC和TRITC)，然后把二者混合進行瓊脂糖/聚丙烯酰胺差異雙向電泳，在激光掃描儀下檢出呈現(xiàn)單色的位點，即為開關區(qū)片段所在位點。
實施例11 cDNA雜交減法分離差異表達區(qū)片段由反轉(zhuǎn)錄載體克隆法和動力雜交法分別建立均勻的樣本和對照本cDNA文庫。提純二者的cDNA并用同樣限制酶切割成限制片段。把樣本和100倍的末端去磷酸化的對照本RF混合中性瓊脂糖/堿性聚丙烯酰胺差異雙向電泳和原位雜交，把全部RF回收到試管中，用生物素化接頭或載體連接樣本自交的靶片段，然后轉(zhuǎn)入涂有Avidin的聚丙烯試管固定之，洗脫非靶片段。
實施例12 mRNA比較減法分離差異表達區(qū)片段用細菌T4連接酶把標有不同顏色螢光素的寡聚核苷酸分別連接到樣本和對照本mRNA 3’末端，然后把它們混合通過堿性瓊脂糖/中性聚丙烯酰胺差異雙向電泳，在激光掃描儀下檢出呈現(xiàn)單色光的點，即為含差異mRNA的點，取出其中mRNA可通過RT-PCR法克隆為探針。
實施例13 RF雜交加法分離重排型突變/修飾片段把對照本DNA用細菌DNA甲基化酶處理后，把樣本和對照本DNA以1∶100比例混合，用與甲基化酶有不同識別序列的限制酶充分酶解DNA，然后進行中性瓊脂糖/堿性聚丙烯酰胺差異雙向電泳，然后用堿性液/中性液處理使樣本/對照本RF間充分雜交20-40小時，用與甲基化酶有相同識別序列而對甲基化敏感的限制酶充分酶解RF，最后回收全部RF至試管中，用生物素化的與后一種限制酶識別序列吻合之接頭連接靶片段，再轉(zhuǎn)入涂有Avidin的聚丙烯試管中固定之。
實施例14 RF雜交加法分離點突變/修飾片段把樣本和對照本DNA等量混合后先用粗切酶把DNA充分酶解為平均100Kb以上片段，電泳至凝膠條中，再用細切酶把DNA充分酶解為平均1Kb長片段，橫向電泳至凝膠片中。用堿性液/中性液處理RF在電泳原位充分雜交，把全部RF回收到試管中，然后用T4內(nèi)切酶Ⅶ和細菌DNA修復蛋白mut H,L,S把DNA雙鏈錯配處或半甲基化處之單鏈切斷,用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ把生物素化核苷酸摻入有切口之靶RF，最后把RF轉(zhuǎn)入涂有Avidin的聚丙烯試管中，靶RF被固定而擴增之，非靶RF被洗脫。
實施例15 用載體克隆和PCR方法擴增差異片段從上述實施例中分離到的差異限制片段，都可連接上與它們末端相吻合的20-24bp接頭(Adaptors)或載體(Vectors)，然后通過PCR法或者載體克隆法把它們擴增為探針。
實施例16 RF雜交加法分離共同表型相關基因的開關區(qū)片段以從具有某種目標表型的同一個體兩種組織中分離到的差異開關區(qū)片段分別為樣本和對照本。首先把對照本RF末端生物素化和去磷酸化，然后把樣本和對照本二者混合單向電泳和原位雜交。雜交后把全部RF轉(zhuǎn)入涂有Avidin的聚丙烯試管中。過夜使生物素化RF固定后，用中性液把未固定的RF洗脫，然后用堿性液把雜交上RF洗下，移入另管加中性液使充分復性，即為該目標表型相關基因的開關片片段。當以從不同個體得到的差異片段為樣本和對照本時，可以把樣本/對照本二者置于對流雜交儀中進行電泳和雜交，參照實施例2方法使樣本/對照本二者間充份雜交，然后回收靶片段。
實施例17 Southern印跡法分離共同表型相關基因的開關區(qū)/表達區(qū)片段把標準的DNA用限制酶切成較長片段后平行電泳成若干條，轉(zhuǎn)移為Southern印跡，用從具有同一種目標表型的不同細胞中分離到的若干群不同的差異開關區(qū)、cDNA或突變片段探針與Southern印跡雜交，等位顯示的帶，即含有該目標表型相關基因的片段。
實施例18 Western印跡法分離共同表型相關基因的開關區(qū)片段把從具有某種目標表型的細胞中提純的非組蛋白平行電泳成若干條，轉(zhuǎn)移為Western印跡。用具有該種表型的不同細胞中分離到的若干群不同的差異開關區(qū)片段探針與Western印跡雜交，等位顯示的帶即含有該目標表型相關基因的開關區(qū)片段。
實施例19 Northern印跡法分離共同表型相關基因的表達區(qū)/開關區(qū)片段把從具有某種目標表型細胞中提純的mRNA平行電泳成若干條，轉(zhuǎn)移為Northern印跡。用具有該種表型的不同細胞中分離到若干群差異cDNA、開關區(qū)或突變片段探針與Northern印跡雜交，等位顯示的帶即含有該表型相關基因的片段。
實施例20 用表型相關基因開關區(qū)片段/開關分子吸附純化相關表達區(qū)首先把人標準DNA大片段電泳至瓊脂糖凝膠柱中，堿性液處理使DNA變性，然后使各種生物素標記的表型相關基因的開關區(qū)片段/開關分子電泳通過上述凝膠柱，并置于中性液/低鹽液中使與標準DNA雜交，然后把全部RF/BP轉(zhuǎn)入涂有Avidin的聚丙烯試管中固定，保留這些雜交上大片段，然后克隆這些大片段，并用之制各親和層析柱從該表型細胞的cDNA文庫中吸附其中同源片段，即為表型相關基因的表達區(qū)片段。
實施例21 用表型相關基因表達區(qū)/開關區(qū)探針分離表型開關基因首先制備目標表型形成之不同階段細胞的非組蛋白Western印跡和mRNANorthern印跡。然后用上述表型相關基因之開關區(qū)探針和cDNA探針分別與上述兩個印跡雜交，確定各個基因開關的時序和方式(是開還是關)，并篩出最早表達之表型開關基因。
實施例22 用表型開關基因的開關區(qū)為配體分離表型開關分子開關區(qū)片段可以加生物素化引物擴增為末端標有生物素的RF，然后加入到生物素親合素/生物素化纖維素層析柱中。使提純的可能有開分子表達之細胞(胚胎細胞)之核蛋白通過層析柱，用低鹽液洗脫未結合的蛋白，最后用濃鹽把特異結合的BP洗脫下來，經(jīng)過若干次層析柱純化的BP可以用電噴射質(zhì)譜分析法加以測序。
實施例23 用表型開關基因的開關區(qū)為探針分離表達開關分子的DNA序列首先制備已知開關區(qū)基序聯(lián)體探針和隨機或非隨機(胚胎cDNA)的表位文庫(比如λgt11文庫)，然后把上述探針與文庫(培養(yǎng)皿)雜交，選出陽性克隆后，再稀釋培養(yǎng)，做第二輪雜交，再篩出陽性噬菌載體克隆，貯存并對其DNA中表達序列進行測定。
實施例24 Western印跡法分析表型相關基因表達區(qū)的開關位序和激素開關基因首先通過上述方法分離到某種目標表型相關基因的開關區(qū)探針和mRNA，然后用mRNA在免網(wǎng)織紅細胞提取液中合成相應蛋白質(zhì)，并標記為探針，用開關區(qū)探針和這些蛋白質(zhì)探針與激活態(tài)細胞的全蛋白Western印跡雜交，雜交后濃鹽使雜交體解離，并橫向電泳，確定基因之開關之位序，并篩出基因功能鏈始端(激素開關基因)和終端(修飾因子或啟動因子)。
實施例25 用激素開關基因的表達蛋白為探針分離表達激素分子的DNA序列首先制備所有已知表型相關基因的表達蛋白質(zhì)探針和隨機/非隨機DNA的噬菌體表位文庫，然后把上述探針與文庫(培養(yǎng)皿)雜交，選出陽性克隆后，再稀釋培養(yǎng)，做第二輪雜交，再選出陽性噬菌體克隆，貯存并對其DNA中表達序列進行測序。
權利要求
1．一種直接分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法，其特征在于包括下列步驟第一步，提純具有目標表型的樣本和不具有目標表型的對照本細胞DNA和特異性DNA結合蛋白(開關分子)，并使二者結合在一起。用同樣的限制酶切割后，去除所有未能結合的蛋白和DNA片段；第二步，把樣本和對照本的開關區(qū)DNA片段/開關分子結合體(RF/BP結合體)混合后單向或差異雙向電泳，使104種RF/BP結合體分散到凝膠中，減少同一位置重疊在一起片段的種數(shù)；第三步，將上述凝膠中RF/BP結合體盡快縱向(與凝膠垂直)轉(zhuǎn)入一空心膠中，并使樣本RF/對照本RF，或者樣本RF/對照本BP間在電泳原位相互雜交或劑量比較；第四步，把不雜交的差異開關區(qū)片段和表達區(qū)片段，以及雜交形成錯配區(qū)的點突變片段和雜交形成半甲基化區(qū)的點修飾片段單獨分離到試管中，或固定在試管中而把其它片段洗脫；第五步，把分離到的差異片段兩個末端連接上接頭或載體，通過PCR擴增為探針；第六步，用從具有相同生理或病理表型的不同細胞中分離到的開關區(qū)探針與樣本細胞核內(nèi)蛋白的Western印跡雜交，或者再與從相同表型細胞分離到的突變片段和差異表達區(qū)片段(cDNA)探針一起與標準人類基因組DNA的Southern印跡以及樣本細胞的mRNA的Northern印跡雜交，等位顯示點即包含有目標表型相關基因的表達區(qū)、開關區(qū)和開關分子；第七步，用分離到的表型相關基因開關區(qū)片段或開關分子(結合蛋白)為配體，通過對流親合層析法雜交、固定所有表型相關基因之大限制片段，并進一步雜交吸附所有表型相關基因cDNA片段；第八步，用表型相關基因開關區(qū)/cDNA探針分別與形成該目標表型的不同發(fā)育或病變階段之細胞核蛋白Western印跡和mRNA Northern印跡雜交，確定表型相關基因開關區(qū)的開關時序和最早表達的表型開關基因；第九步，用表型相關基因cDNA為配體，通過親和層析吸附純化表型相關的mRNA，并把它們置于兔網(wǎng)織紅細胞提取液中合成相應蛋白質(zhì)，標記為探針，用開關區(qū)探針和這些表達區(qū)探針與處于激活態(tài)的表型細胞全蛋白的Western印跡雜交，從而分析表型相關基因的表達區(qū)開關的位序和最早激活的激素開關基因；第十步，用表型開關基因開關區(qū)的識別基序為配體，通過親和層析吸附、純化相應的開關分子，測其氨基酸順序而確定之，或者用表型開關基因開關區(qū)識別基序聯(lián)體為探針以及激素開關基因表達區(qū)調(diào)節(jié)亞基蛋白為探針在隨機/非隨機(胚胎cDNA)噬菌體表位文庫中篩查表達相應開關分子的DNA序列，并將它測序。
2．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的樣本和對照本DNA和DNA結合蛋白，可以分別取自同一生物個體的細胞；也可以分別取自不同生物個體的細胞。樣本和對照本DNA可以是全部DNA；也可以是被DNA結合蛋白吸附的開關區(qū)DNA。樣本和對照本可以是DNA和DNA結合蛋白；也可以是mRNA或hmRNA或cDNA、mtDNA等?？梢詠碓从谌嘶蚋叩葎游?、植物細胞及其它任何生物的細胞。
3．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的分離開關區(qū)片段/開關分子(RF/BP)結合體的步驟，可以用適宜濃度鹽液(0.2-2.0M/L Nacl)或試劑(0.25M/L HCl，丁酸或?qū)M蛋白乙酰化處理)把與DNA非特異性結合的組蛋白或CpG甲基化序列親合蛋白(MeCP1/2)洗脫而保留與DNA特異性結合的開關分子；也可以用濃鹽液(2.0M/L Nacl或飽和(NH4)2SO4)把BP全部解離到溶液中，再用低鹽液使BP和DNA結合起來；可以用過量的細菌DNA和魚精DNA吸附核蛋白提取液中組蛋白和親甲基化序列蛋白而促進特異性BP和DNA之結合；也可以把RF和BF都電泳而濃縮其中單種成員之濃度，然后使二者對流雜交而促進它們的結合。在BP和DNA結合后，可以離心沉淀DNA/BP結合體而去除上清中的未結合蛋白；也可以在把DNA切割成限制片段(RF)之后，通過凝膠阻抑或膜阻抑(BP/RF結合體)而去除未與BP結合的RF。
4．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的減少樣本/對照本雜交或比較雙方復雜度的步驟，可以對樣本和對照本進行原位排序，即把同一生物個體細胞DNA片段或不同個體cDNA片段或BP混合雙向電泳；也可以對它們進行異位排序，即把不同生物個體細胞DNA片段或cDNA片段/BP二者分別電泳排序，然后使二者相互通過而雜交，還可以用細胞核蛋白吸附基因開關區(qū)片段而去除其它DNA片段。
5．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的原位相互雜交步驟，可以在均勻凝膠中或濕潤的膜表面上進行；也可以在空心膠中空心泡內(nèi)液體或稀膠中進行。RF/RF間可以通過堿性液變性/中性液復性處理進行，也可以通過高溫變性/低溫復性處理進行；RF/BP間則可通過濃鹽液解離/稀鹽液結合處理進行。
6．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的減法分離不雜交的差異片段的步驟，可以把對照本片段末端脫磷酸處理，而在雜交后單獨把樣本自交靶片段加接頭而擴增之；也可以把對照本RF或BP末端生物素化，而在雜交后把沒有生物素化的樣本靶RF或BP單獨分離出來；還可以把樣本和對照本RF或BP分別標以不同顏色的螢光素，而在混合電泳后用螢光自動掃描儀檢出凝膠中呈現(xiàn)色差的靶片段而分離之。重排性突變片段或cDNA差異片段是僅存子樣本和對照本之一中的片段，可以通過樣本/對照本RF間混合雙向電泳而使之與其同源片段錯位而分離之；開關區(qū)差異片段是在樣本和對照本中結合有不同的開關分子(BP)，可以通過樣本和對照本RF/BP結合體間混合雙向電泳而使之與同源片段錯位而分離之。
7．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的加法分離雜交雙鏈錯配區(qū)或半甲基化區(qū)的差異片段的步驟，可以用化學物或酶把差異片段切斷而通過電泳把切斷而較短的靶片段單獨分離出來；也可以用酶(比如mut HLS/DNA聚合酶I)把生物素核苷酸摻入差異片段而固定分離之；還可以用酶把螢光素或放射性核苷酸摻入差異片段而標記分離之。
8．根據(jù)權利要求1和4所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的分離表型相關基因的同一片段的步驟，可以用原位排序的加法，即把同一個體細胞來源的開關區(qū)片段、表達區(qū)片段和開關分子或者不同個體細胞來源的表達區(qū)片段和開關分子間原位排序后雜交或劑量比較的方法；也可以用異位排序的加法，即把不同個體細胞來源的突變片段和開關區(qū)片段或者不同型式(突變片段、開關區(qū)片段、開關分子、表達區(qū)片段)片段間異位排序后雜交或劑量比較的方法。異位排序的加法可以是把樣本和對照本片段分別電泳排序后再相互通過而雜交的方法；也可以是把樣本和對照本片段探針分別與標準DNA或DNA結合蛋白印跡雜交后進行帶型比較的方法。印跡雜交的方法可以是開關區(qū)片段雙鏈探針/細胞核蛋白Western印跡間雜交；也可以是cDNA片段單鏈探針/mRNA Northern印跡間雜交；還可以是開關區(qū)和cDNA片段單鏈探針/DNA Southern印跡間雜交以及表型相關基因的表達蛋白質(zhì)探針/細胞全蛋白Western印跡間雜交。
9．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的分離所有表型相關基因mRNA或cDNA的步驟，可以用開關區(qū)單鏈為配體，通過親和層析吸附與之同源的大尺度限制片段，進而吸附純化相關細胞cDNA文庫和mRNA文庫中表型相關基因之成員；也可以用開關區(qū)雙鏈為配體，通過親和層析吸附與之親和的大限制片段，進而吸附純化相關的cDNA/mRNA成員；還可以用開關分子通過NRO法(Neclear run on)誘導相關細胞核表達表型相關基因的mRNA而純化之；以及可以通過開關區(qū)片段/cDNA片段之核苷酸序列比較以及篩查Genebanks確定每個基因開關區(qū)和表達區(qū)。
10．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法其特征在于所述的分析表型相關基因開關區(qū)的開關時序的步驟，可以用已分離到的表型相關基因開關區(qū)探針與處于該表型細胞的不同發(fā)育或病變階段的細胞的核蛋白Western印跡雜交以確定各個基因開關的時序；也可以用表型相關基因cDNA探針與處于不同階段的細胞mRNA Northern印跡雜交以確定各個基因表達的時序；還可以通過開關分子/mRNA分子大小比較確定開關分子相應的mRNA及其核苷酸序列。
11．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的分析表型相關基因表達區(qū)開關的位序的步驟，可以用表型相關基因之表達蛋白質(zhì)探針與處于周期性或生理性激活態(tài)的表型細胞全蛋白Western印跡雜交以確定各個基因在功能開關鏈上位序；也可以用上述蛋白質(zhì)探針與處于激活態(tài)的表型細胞進行原位雜交以確定各個基因在細胞中的位置。
12．根據(jù)權利要求1所述的分離表型相關基因開關區(qū)和開關分子的方法；其特征在于所述的分離表型/激素開關基因的開關分子的步驟，可以用基因開關區(qū)片段雙鏈為配體，通過親和層析吸附純化開關分子(DNA結合蛋白)而測其氨基酸順序；也可以用基因開關區(qū)片段雙鏈為探針，篩查隨機/非隨機噬菌體表位文庫中陽性克隆的DNA而測其苷核酸順序；還可以用基因的表達蛋白探針，篩查隨機/非隨機噬菌體表位文庫中陽性克隆之DNA而對其測序。
全文摘要
本發(fā)明涉及從有某種確定表型的人或高等動植物的復雜基因組中可直接準確地分離出該表型相關基因的開關區(qū)，并可進一步篩出能促使細胞改變其表型(相關基因表達狀態(tài))的基因開關分子，進而建立一種按自然程序或模擬自然程序控制靶基因表達的方法。特別涉及一種能高效、精確地滅活人類致病基因等有害基因，激活人類疾病控制基因及經(jīng)濟動、植物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等有益基因的方法。
文檔編號C12N15/10GK1238384SQ98113588
公開日1999年12月15日 申請日期1998年6月8日 優(yōu)先權日1998年6月8日
發(fā)明者卞小莊 申請人:卞小莊