專利名稱：一種新的人基因編碼序列、其編碼的多肽及制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人HnudC的cDNA序列，該序列的編碼蛋白是大鼠RnudC的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
nudC、nudA、nudF、RnudC和DnudC是在構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)大鼠及果蠅中發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)基因，它們被認(rèn)為與細(xì)胞器正確定位、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)等作用有關(guān)。在高等生物體內(nèi)，催乳素(PRL)調(diào)節(jié)著淋巴細(xì)胞的增殖、活化及衰亡。而PRL對淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用主要是從激活大量T淋巴細(xì)胞的早期表達(dá)基因開始的。這些基因包括干擾素調(diào)節(jié)因子-1、PRL-受體、鳥氨酸脫羧酶、c-myc、nud等。研究發(fā)現(xiàn)，nudC、RnudC和DnudC在結(jié)構(gòu)和功能上都高度保守，nudC調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的小泡轉(zhuǎn)運(yùn)對于細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌與運(yùn)輸，細(xì)胞的分化生長起著重要的作用。nudC在生物體內(nèi)與動(dòng)力蛋白及動(dòng)力蛋白激活蛋白復(fù)合物相互作用，從而使得細(xì)胞核與微管系統(tǒng)偶聯(lián)，產(chǎn)生正常的細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)(MolecularEndocrinology，1995，9(3)，312-318)nudC基因在各種不同的細(xì)胞類型與種群中都廣泛存在，如在纖維細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中。nudC最早是從構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因。它是由Osmani A.H.等人于1990年從構(gòu)巢曲霉cDNA文庫中克隆得到的一個(gè)基因(J Cell Biol.1990，111543-551)，它與以后在大鼠及果蠅中分別發(fā)現(xiàn)的基因RnudC和DnudC具有較高的同源性并具有相似的功能。DnudC是于1997年由Cunniff J.等人從果蠅中克隆的(Mech De 1997，66(1-2)55-68)。其后不久，Shelli M等人從大鼠中分離得到了RnudC基因(Exp.Cell.Res 1998，238，23-32)。研究發(fā)現(xiàn)，這些基因不僅在結(jié)構(gòu)上高度保守，而且在功能上也高度保守。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼人的一種與大鼠RnudC同源的蛋白，本發(fā)明的與大鼠RnudC同源的人基因被命名為HnudC。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的蛋白，該蛋白被命名為HnudC蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人HnudC蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種人HnudC核苷酸序列和蛋白的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中43-1038位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的HnudC蛋白多肽，它包括具有SEQ IDNO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有HnudC蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成HnudC蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成HnudC蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)HnudC蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有HnudC蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為1091個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于43-1038位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HnudC蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中43-1038位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框43-1038位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中43-1038位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人HnudC相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“HnudC蛋白多肽”指具有HnudC蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與HnudC相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括HnudC蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與HnudC DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗HnudC多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含HnudC多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括HnudC多肽的可溶性片段。通常，該片段具有HnudC多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供HnudC蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然HnudC多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括HnudC多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)HnudC的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核苷酸分子，該分子通常具有HnudC核苷酸序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼HnudC的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測HnudC核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于HnudC多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對HnudC DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人HnudC基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與HnudC基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制HnudC蛋白的分子，也包括那些并不影響HnudC蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的HnudC基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的HnudC基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)HnudC或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷HnudC功能的抗體以及不影響HnudC功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用HnudC基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與HnudC基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人HnudC核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，人HnudC的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人睪丸λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15′-ACTAGAGTGCAGAGCTCCGGGAC-3′和反向引物A25′-AAGTTGGGTGGTTGCAGCTCAGC-3′，進(jìn)行PCR，獲得1100bp(A1/A2)的目的片段。測序后得到SEQ ID NO.3的全長cDNA序列。
nudC、nudA、nudF、RnudC和DnudC被認(rèn)為與細(xì)胞器定位、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)是真核生物中普遍存在的現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)對于細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌，細(xì)胞的分化生長起著重要的作用。而在淋巴細(xì)胞中，細(xì)胞核的正確地運(yùn)動(dòng)與定位可能在淋巴細(xì)胞的增殖、活化及衰亡過程中起著關(guān)鍵的作用。本發(fā)明的HnudC與大鼠的RnudC高度同源，同時(shí)與nudC、DnudC的同源性也較高，因而我們認(rèn)為它是RnudC在人中的一個(gè)同源基因，并且與RnudC(以及nudC、DnudC)有著相似的生物學(xué)功能，這些功能包括細(xì)胞器定位、物質(zhì)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)等方面。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人HnudC與大鼠RnudC的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“|”標(biāo)出。
圖2為本發(fā)明的人HnudC蛋白與大鼠RnudC蛋白的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”標(biāo)出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1HnudC的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以人睪丸λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-ACTAGAGTGCAGAGCTCCGGGAC-3′(SEQ ID NO1)正向引物，寡核苷酸A25′-AAGTTGGGTGGTTGCAGCTCAGC-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A1、A2引物對的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、70℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘；電泳檢測得到的PCR片斷，以A1、A2為引物對擴(kuò)增出的目的片段長約1100bp。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QLAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiThermEXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1091bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于43-1038位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出HnudC的氨基酸序列，共331個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.4。
實(shí)施例2同源比較和結(jié)構(gòu)分析用HnudC的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們與大鼠RnudC基因及其編碼蛋白具有極高同源性，在核酸水平上的同一性(identity，又稱為相同性)都達(dá)到了84％，蛋白水平上的同一性達(dá)到95％、相似性達(dá)到了97％。所以，可以確定HnudC是RnudC在人中的同系物。
特別是實(shí)驗(yàn)證明DnudC、nudC和RnudC的開放閱讀框中都含有一個(gè)潛在的核定位信號(hào)區(qū)域，這一區(qū)域?yàn)樗嵝詤^(qū)域，有著保守的氨基酸序列，本發(fā)明的HnudC蛋白也含有這一保守的氨基酸序列，具體為SEQ ID NO.4的67-75位氨基酸，即LQNFLLHGT。
另外，DnudC、nudC和RnudC這些蛋白的C末端94個(gè)氨基酸的相似性和同源性都很高，RnudC與nudC相應(yīng)區(qū)域的同源度達(dá)68％(Shelli M.A.等人，MolecularEndocrinology，9(3)312-8，1995)。這一區(qū)域在進(jìn)化上都是高度保守的，本發(fā)明HnudC蛋白的這一區(qū)域，具體為SEQ ID NO.4的237-330位氨基酸，即序列AVFLWNMDKYTMIRKLEGHHHDVVACDFSPDGALLATASYDTRVYIWDPHNGDILMEFGHLFPPPTPIFAGGANDRWVRSVSFSHDGLHVASL，而且，就這一保守區(qū)域而言，本發(fā)明HnudC與RnudC僅相差2個(gè)氨基酸，而且其中一個(gè)氨基酸是相似氨基酸替換(圖2)。如此高的保守性進(jìn)一步暗示，這些基因可能構(gòu)成一個(gè)家族。并且根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能，結(jié)構(gòu)相似功能相似的原理，本發(fā)明的HnudC應(yīng)具有與這些基因相同或相似的功能。
nudC是生物體內(nèi)依賴于PRL(催乳素，一種多肽激素)的T淋巴細(xì)胞因子早期表達(dá)的基因。DnudC、nudC和RnudC與生物體內(nèi)的細(xì)胞器定位、小泡物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白分泌及細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)等作用有關(guān)。
眾所周知，細(xì)胞內(nèi)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)及核運(yùn)動(dòng)在細(xì)胞分化、生長及衰亡的過程中起著重要的作用。因此本發(fā)明的HnudC在生物體內(nèi)起著重要作用。
細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)主要依賴于微管系統(tǒng)(MTs)。有實(shí)驗(yàn)表明，在高等真核生物中，nudC可能是動(dòng)力蛋白及動(dòng)力蛋白激活蛋白復(fù)合物的組成部分，與正確的細(xì)胞器定位，如高爾基體的定位等有關(guān)。nudC與動(dòng)力蛋白及動(dòng)力蛋白激活蛋白作用，使T細(xì)胞中高爾基體正確定位，從而介導(dǎo)細(xì)胞核與微管系統(tǒng)偶聯(lián)，產(chǎn)生正常的核運(yùn)動(dòng)。而在淋巴細(xì)胞中，細(xì)胞核的正常運(yùn)動(dòng)及其定位對其活化、增殖及衰亡起著重要的作用。除此之外，從真核生物體內(nèi)還分離得到了nudA、nudG、nudF等另三個(gè)nud基因，它們的蛋白產(chǎn)物，都與細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。在nudC缺陷型菌株中，細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)將被明顯阻止。這說明nudC對于T細(xì)胞細(xì)胞核的正確運(yùn)動(dòng)與定位有著重要作用(Exp.Cell.Res.1998，238，23-32)，nudC很可能是PRL(催乳素)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的關(guān)鍵中間調(diào)節(jié)物。這暗示，本發(fā)明的人HnudC在人體細(xì)胞細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)和定位中也發(fā)揮著類似的作用。
同時(shí)，RnudC還參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程。小泡運(yùn)輸是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)囊环N方法，nudC就是參與細(xì)胞膜組織產(chǎn)生的小泡與其他蛋白融合，并將這些蛋白運(yùn)送到生物生長點(diǎn)，以促進(jìn)這些組織的生長(Exp.Cell.Res.1998，238，23-32)。這暗示，本發(fā)明的人HnudC也可能參與物質(zhì)小泡的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
本發(fā)明的人HnudC除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人HnudC還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人HnudC的N端與大鼠或果蠅或構(gòu)巢曲霉的HnudC的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人HnudC的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人HnudC核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人HnudC的表達(dá)水平或者抑制人HnudC的過度表達(dá)。由于人HnudC在細(xì)胞中具有重要的功能，因此該基因的缺失或異常表達(dá)會(huì)造成多種病癥。本發(fā)明的人HnudC核苷酸序列和多肽能用于這些相關(guān)疾病的治療。本發(fā)明的人HnudC蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人HnudC缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3HnudC在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼HnudC的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得HnudC cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為
5′-GAACGGATCCATGGGCGGAGAGCAGGAGG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的HnudC編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-GCAGGTCGACCTAGTTGAATTTAGCCTTG-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和HnudC的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI、SalI消化pQE-9載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證HnudC的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞34小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的HnudC。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫HnudC。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘撸褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約40KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例4HnudC在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼HnudC的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得HnudC cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-GAACGGATCCATGGGCGGAGAGCAGGAGG-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的HnudC編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5’-GCAGCGGCCGCTAGTTGAATTTAGCCTTG-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有XmaIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和HnudC的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用BamHI、XmaIII消化pcDNA3載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用EcoRI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗(yàn)證HnudC的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為40KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀HnudC基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人上海新黃浦復(fù)旦基因工程有限公司(ii)發(fā)明名稱(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1ACTAGAGTGC AGAGCTCCGG GAC 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2AAGTTGGGTG GTTGCAGCTC AGC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長度1091bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 ACTAGAGTGCAGAGCTCCGGGACGTGGATCGGAGCCGGCGCGATGGGCGGAGAGCAGGAG61 GAGGAGCGGTTCGACGGCATGTTGCTGGCCATGGCTCAGCAGCACGAGGGCGGCGTGCAG121 GAGCTTGTGAACACCTTCTTCAGCTTCCTTCGACGCAAAACAGACTTTTTCATTGGAGGA181 GAAGAAGGGATGGCAGAGAAGCTTATCACACAGACTTTCAGCCACCACAATCAGCTGGCA241 CAGAAGACCCGGCGGGAGAAGAGAGCCCGGCAGGAGGCCGAGCGGCGGGAGAAGGCGGAG301 CGGGCGGCCAGACTGGCCAAGGAAGCCAAGTCAGAGACCTCAGGGCCCCAGATCAAGGAG361 CTAACTGATGAAGAGGCAGAGAGGCTGCAGCTAGAGATTGACCAGAAAAAGGATGCAGAG421 AATCATGAGGCCCAGCTCAAGAACGGCAGCCTTGACTCCCCAGGGAAGCAGGATACTGAG481 GAAGATGAGGAGGAAGATGAGAAGGACAAAGGAAAACTGAAGCCCAACCTAGGCAACGGG541 GCAGACCTGCCCAATTACCGCTGGACCCAGACCCTGTCGGAGCTGGACCTGGCGGTCCCT601 TTCTGTGTGAACTTCCGGCTGAAAGGGAAGGACATGGTGGTGGACATCCAGCGGCGGCAC661 CTCCGGGTGGGGCTCAAGGGGCAGCCAGCGATCATTGATGGGGAGCTCTACAATGAAGTG721 AAGGTGGAGGAGAGCTCGTGGCTCATTGAGGACGGCAAGGTGGTGACTGTGCATCTGGAG781 AAGATCAATAAGATGGAGTGGTGGAGCCGCTTGGTGTCCAGTGACCCTGAGATCAACACC841 AAGAAGATTAACCCTGAGAATTCCAAGCTGTCAGACCTGGACAGTGAGACTCGCAGCATG901 GTGGAAAAGATGATGTATGACCAGCGACAGAAGTCCATGGGGCTGCCAACTTCAGACGAA961 CAGAAGAAACAGGAGATTCTGAAGAAGTTCATGGATCAACATCCGGAGATGGATTTTTCC1021 AAGGCTAAATTCAACTAGCCCCTGTTTTTTCCTCCCTGAACTCTTGGGGCTGAGCTGCAA1081 CCACCCAACTT(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度331個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met Gly Gly Glu Gln Glu Glu Glu Arg Phe Asp Gly Met Leu Leu16 Ala Met Ala Gln Gln His Glu Gly Gly Val Gln Glu Leu Val Asn31 Thr Phe Phe Ser Phe Leu Arg Arg Lys Thr Asp Phe Phe Ile Gly46 Gly Glu Glu Gly Met Ala Glu Lys Leu Ile Thr Gln Thr Phe Ser61 His His Asn Gln Leu Ala Gln Lys Thr Arg Arg Glu Lys Arg Ala76 Arg Gln Glu Ala Glu Arg Arg Glu Lys Ala Glu Arg Ala Ala Arg91 Leu Ala Lys Glu Ala Lys Ser Glu Thr Ser Gly Pro Gln Ile Lys106 Glu Leu Thr Asp Glu Glu Ala Glu Arg Leu Gln Leu Glu Ile Asp121 Gln Lys Lys Asp Ala Glu Asn His Glu Ala Gln Leu Lys Asn Gly136 Ser Leu Asp Ser Pro Gly Lys Gln Asp Thr Glu Glu Asp Glu Glu151 Glu Asp Glu Lys Asp Lys Gly Lys Leu Lys Pro Asn Leu Gly Asn166 Gly Ala Asp Leu Pro Asn Tyr Arg Trp Thr Gln Thr Leu Ser Glu181 Leu Asp Leu Ala Val Pro Phe Cys Val Ash Phe Arg Leu Lys Gly196 Lys Asp Met Val Val Asp Ile Gln Arg Arg His Leu Arg Val Gly211 Leu Lys Gly Gln Pro Ala Ile Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Asn Glu226 Val Lys Val Glu Glu Ser Ser Trp Leu Ile Glu Asp Gly Lys Val241 Val Thr Val His Leu Glu Lys Ile Asn Lys Met Glu Trp Trp Ser256 Arg Leu Val Ser Ser Asp Pro Glu Ile Asn Thr Lys Lys Ile Asn271 Pro Glu Asn Ser Lys Leu Ser Asp Leu Asp Ser Glu Thr Arg Ser286 Met Val Glu Lys Met Met Tyr Asp Gln Arg Gln Lys Ser Met Gly301 Leu Pro Thr Ser Asp Glu Gln Lys Lys Gln Glu Ile Leu Lys Lys316 Phe Met Asp Gln His Pro Glu Met Asp Phe Ser Lys Ala Lys Phe331 Asn(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GAACGGATCC ATGGGCGGAG AGCAGGAGG29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6GCAGGTCGAC CTAGTTGAAT TTAGCCTTG29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GAACGGATCC ATGGGCGGAG AGCAGGAGG29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8GCAGCGGCCG CTAGTTGAAT TTAGCCTTG29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ IDNO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中43-1038位的核苷酸序列。
4.一種分離的HnudC蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有HnudC蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有HnudC蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成HnudC蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成HnudC蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)HnudC蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有HnudC蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸43-1038位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的HnudC蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地,本發(fā)明提供了人HnudC的cDNA序列,該序列的編碼蛋白是大鼠RnrdC的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1250097SQ9812092
公開日2000年4月12日 申請日期1998年10月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月5日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 屠強(qiáng), 趙勇, 張宏來 申請人:上海新黃浦復(fù)旦基因工程有限公司