專利名稱：水稻轉(zhuǎn)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種水稻轉(zhuǎn)基因的方法，尤其適合外緣基因(DNA)轉(zhuǎn)移到水稻中。
目前植物的遺傳轉(zhuǎn)化主要采用以根癌農(nóng)桿菌的T1質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌的R1質(zhì)粒為載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，由于水稻等單子葉植物對(duì)根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌不敏感，難以通過該系統(tǒng)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。而目前在水稻上應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化方法，一是以原生質(zhì)體為受體的轉(zhuǎn)化方法，其原理是將原生質(zhì)體懸浮在含有DNA的PEG或高鈣溶液中，使DNA滲透到原生質(zhì)體中，然后將原生質(zhì)體培養(yǎng)成植株。該方法存在的主要問題是水稻原生質(zhì)體的制備和培養(yǎng)難度大、再生成植株頻率低。另一種方法是基因槍法，其原理是將DNA包被在微小的金粉或鎢粉表面，在高壓的作用下高速穿透細(xì)胞壁進(jìn)入受體細(xì)胞中。該方法存在的主要問題是易出現(xiàn)嵌和體(即同一株組織、器官或植物的一部分細(xì)胞被轉(zhuǎn)化，另一部分細(xì)胞未被轉(zhuǎn)化)，必須經(jīng)過嚴(yán)格的篩選才能獲得真正的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；并且儀器及實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴。以上兩種方法因都是以二倍體細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體，因此還存在后代分離的問題。
本發(fā)明的目的是提供了一種水稻轉(zhuǎn)基因的方法，方法易行，提高了轉(zhuǎn)化頻率，解決了轉(zhuǎn)化后代分離、快速穩(wěn)定(固定)轉(zhuǎn)化后代的問題。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)。本發(fā)明采用以下技術(shù)措施；為達(dá)到快速穩(wěn)定(固定)轉(zhuǎn)化后代目的，以花粉細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，在活體植株條件注射DNA和離體條件下真空負(fù)壓強(qiáng)吸收DNA兩道程序使DNA進(jìn)入受體細(xì)胞(花粉)內(nèi)。經(jīng)花藥(花粉)培養(yǎng)成單倍體花粉植株，經(jīng)自然加倍成純合的二倍體植株，使轉(zhuǎn)化后代得以迅速穩(wěn)定。單倍體細(xì)胞只有一套染色體，如果DNA整合到受體細(xì)胞染色體上，經(jīng)自然或誘導(dǎo)加倍后成為純合的二倍體，即細(xì)胞中的兩套染色體具有同樣的DNA結(jié)構(gòu)，在以后的世代中不會(huì)發(fā)生性狀分離。而以前的轉(zhuǎn)化方法均以二倍體細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體，二倍體細(xì)胞有兩套染色體，如果DNA進(jìn)入受體細(xì)胞中，很可能整合到受體細(xì)胞染色體中的一套染色體上，而另一套染色體的對(duì)應(yīng)位置沒有外源的DNA，即成為雜合體，后代不可避免會(huì)發(fā)生分離。只有DNA整合到兩套染色體的同一位置上才成為純合體。而這種情況發(fā)生的頻率是非常低的、幾乎不可能發(fā)生。為提高轉(zhuǎn)化頻率，即增加外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的頻率，通過活體和離體兩道程序?qū)NA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(花粉)中。第一道程序是在水稻活體植株減數(shù)分裂時(shí)(即葉枕距為-1cm至+1cm時(shí))，將DNA溶液注入到穗莖節(jié)或穗莖節(jié)下部的莖腔中。因?yàn)樗驹跍p數(shù)分裂時(shí)期生理活動(dòng)中心是在穎花內(nèi)部，這時(shí)莖輸導(dǎo)組織主要是向上運(yùn)輸，注射到穗莖中DNA隨著輸導(dǎo)組織向上運(yùn)輸?shù)椒f花內(nèi)的小孢子細(xì)胞(單核花粉細(xì)胞)。第二道程序是將離體的花藥放在DNA溶液中，用抽真空的辦法使花藥吸收DNA。
本發(fā)明的技術(shù)路線植株→注射DNA→花藥(花粉)→DNA真空滲入花藥(花粉)→誘導(dǎo)培養(yǎng)→愈傷組織→分化培養(yǎng)→花粉再生苗→染色體加倍→雙倍體植株→轉(zhuǎn)化后代鑒定→轉(zhuǎn)化植株。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、花粉細(xì)胞是單倍體細(xì)胞，將DNA轉(zhuǎn)移到花粉細(xì)胞中，然后進(jìn)行組織培養(yǎng)成單倍體植株，經(jīng)自然加倍后變成純合的雙倍體植株，這樣避免了以雙倍體細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體的方法中存在的后代分離問題；2、將花粉細(xì)胞培養(yǎng)成植株比將原生質(zhì)體培養(yǎng)成植株更容易；3、通過活體和離體兩道程序?qū)NA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(花粉)中，提高了DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的概率；4、轉(zhuǎn)化效率高、后代穩(wěn)定快。
實(shí)施例采用以下步驟1、在水稻植株減數(shù)分裂時(shí)期(即葉枕距為-1cm至+1cm)。將穗莖節(jié)外的苞葉分開，用100ul醫(yī)用微量注射器將DNA溶液注入到穗莖節(jié)或穗莖節(jié)下部的莖腔中，每穗注入DNA溶液100-300ul。然后讓植株自然生長(zhǎng)。
2、待花粉發(fā)育至單核靠邊期時(shí)(即葉枕距為+3至+5cm時(shí))，剪取植株，用水沖洗干凈、70％酒精表面消毒后，用濕紗布包囊放入冰箱(6-8℃)預(yù)處理10天。在無菌條件下剝出幼穗，通過外部特征(穎殼黃色、穎尖微綠色)和顯微鏡觀察核實(shí)，選取處在小孢子單核靠邊期的幼穗，用0.1％升汞消毒15分鐘，無菌水沖洗3-4次。剝出花藥放在已滅菌的5毫升離心管中，然后往離心管中加DNA溶液，抽真空至漂浮在液面的花藥下沉。
3、誘導(dǎo)培養(yǎng)、4、分化培養(yǎng)、5、染色體加倍均同于常規(guī)花藥(花粉)培養(yǎng)、6、轉(zhuǎn)化后代鑒定同其它轉(zhuǎn)化體系。
權(quán)利要求
1.一種水稻轉(zhuǎn)基因的方法，其特征是A、以花粉細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，在活體植株下注射DNA和離體下真空負(fù)壓吸收DNA兩道程序使DNA進(jìn)入受體細(xì)胞(花粉)內(nèi)；B、在水稻植株減數(shù)分裂時(shí)期，將莖節(jié)處的苞葉分開，再將DNA溶液注入到穗莖節(jié)或穗莖節(jié)下部的莖腔中，注入DNA溶液100-300ul；C、待花粉發(fā)育至單核靠邊期時(shí)，剪取植株，用水沖洗干凈，70％酒精表面消毒后，用濕紗布包裹放入冰箱預(yù)處理，選取處在小孢子單核靠邊期的幼穗，用0.1％升汞消毒，無菌水沖洗3-4次，剝出花藥放在滅菌的離心管中，然后往離心管中加DNA溶液，抽真空至漂浮在液面的花藥下沉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻轉(zhuǎn)基因的方法,以花粉細(xì)胞為轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞,在活體植株下注射DNA和在離體下真空負(fù)壓吸收DNA兩道程序使DNA進(jìn)入受體細(xì)胞(花粉)內(nèi),在水稻植株減數(shù)分裂時(shí)期,將莖節(jié)處的苞葉分開,再將DNA溶液注入到穗莖或穗莖節(jié)下部的莖腔中,注入DNA溶液100—300ul,待花粉發(fā)育至單核靠邊期時(shí),剪取植株,用水沖洗干凈,70%酒精表面消毒后,用濕紗布包裹放入冰箱預(yù)處理,選取小孢子單核靠邊期的幼穗,用0.1%升汞消毒,無菌水沖洗3—4次,剝出花藥放在滅菌的離心管中,然后往離心管中加DNA溶液,抽真空至漂浮在液面的花藥下沉,本發(fā)明方法易行,轉(zhuǎn)化效率高、后代穩(wěn)定快,提高了DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的概率。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1258749SQ9812173
公開日2000年7月5日 申請(qǐng)日期1998年12月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月25日
發(fā)明者周建林, 馮雙華, 李陽生 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)沙農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究所