專利名稱：人磷脂酰乙醇胺－n－甲基轉(zhuǎn)移酶、其編碼序列及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人的磷脂酰乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphotidylethanolamine N-methyltransferase homolog，簡稱為“PEMTH”)以及編碼該酶的cDNA序列。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法，以及這些多核苷酸和多肽的應用。
磷脂酰膽堿(又稱卵磷脂，簡稱PC)是真核細胞中最豐富的磷脂類，它不僅作為膜的組成成分而且是第二信使的一個來源。在生物體內(nèi)卵磷脂是經(jīng)過兩個途徑進行合成的。第一是從無到有的途徑，即從磷脂酰乙醇胺(簡稱PE)經(jīng)甲基化而來，其中是S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體；第二是補救途徑，即膽堿經(jīng)CDP-膽堿而合成卵磷脂。生物體內(nèi)卵磷脂的主要來源是第二條途徑而來的，第一條途徑大部分都限制在了肝臟內(nèi)部，其中磷脂酰乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PEMT)的作用就是催化PE-PC的甲基化。
在生物體內(nèi)，磷脂酰乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphotidylethanolamine N-methyltransferase，簡稱為“PEMT”)大部分存在與肝臟中，它以兩種形式存在。1PEMT1主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，2PEMT1的異構形式PEMT2只在線粒體連接的膜上存在。在肝中PE-PC的甲基化轉(zhuǎn)變至少要求這兩種酶的存在。近年來隨著大鼠cDNA、人的有關PEMT基因、小鼠基因的相繼克隆，推進了對其重要生物學功能的深入研究。
現(xiàn)在知道，PEMT存在于Rhodibacter sphacroides、酵母、雞肝、嚙齒類動物肝臟、人類肝臟，這一事實說明了PE甲基化途徑是十分重要，而且在進化上是保守的(Cui，Z.et al.Biochem.Biophys.Acta.1997，1346(1997)，10-16.)1993年，加拿大Alberta大學的脂類和脂蛋白研究室首先在大鼠肝cDNA文庫中篩選到PEMT的cDNA，Northern結果顯示其mRNA長1Kb(Zheng Cui et al.J.Biology.Chem.1993，268(22)，16655-16663)。之后這個小組以大鼠cDNA為探針找到了第一個人類的PEMT2的cDNA克隆。同時發(fā)現(xiàn)每個cDNA克隆都有不同的5′端的非翻譯區(qū)，這個區(qū)域可能與組織的特異性有關(Dennis E.Vance etc BBA 1348(1997)142-150)。1996年，這個研究小組又克隆到了小鼠的PEMT2基因(Christopher J.walkey etcJournal of lipid Research V37 1996，2341-2350)。
眾所周知，CDP-膽堿途徑在動物細胞中起著重要的作用。體外實驗及以大鼠為對象的研究證明，磷脂酰膽堿合成的PE甲基化途徑與CDP-膽堿途徑之間有著緊密的聯(lián)系，兩者之間似乎存在著負調(diào)節(jié)的關系，然而，PE甲基化途徑似乎并不能取代CDP-膽堿途徑(J.Biol.Chem.1995，270，16277-16282)。那么，PEMT在生物體內(nèi)究竟扮演了一個什么樣的角色呢？目前的研究結果表明PEMT與肝細胞的增生、抑制，以及神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉淀癥(neuronal ceroid lipofuscinosis，又稱為Batten氏癥)等諸多方面都有著密切的關系。
給大鼠喂以缺乏膽堿的食物。約三星期后PEMT2開始大量增加，直到12個星期后增加到約為先前的5倍。這暗示了PEMT在維持短期膽堿缺乏的大鼠生長方面的作用。當膽堿缺乏維持一個足夠長的時間會使大鼠對癌癥更加敏感，這是否與PEMT間有所聯(lián)系還有待研究(Cui，Z.et al.J.Biol.Chem.1996，271，2839-2843)。
基因剔除實驗對于了解基因的功能來說是具有很強說服力的。在剛斷奶的PEMT剔除的小鼠中實施缺乏膽堿的飲食會造成小鼠的死亡，說明PEMT在膽堿缺乏的動物中確實起著維持動物正常生長和肝臟正常功能的作用。但令人費解的是，缺乏PEMT的小鼠直到10個月大都沒有明顯的病理性表型，進一步的研究正在進行(Proc.Natl.Acad.Sci.1997，94，12880-12885)。
一系列的研究模型表明了PEMT2在控制肝細胞生長方面的重要作用，這些模型包括對圍生期鼠肝變化的研究(Cui，Z.et al.Biochem.Biophys.Acta.1997，1346，10-16.)；大鼠肝的部分切除后的再生(Biochem.Biophys.Acta.1997，1346，1-9)；注入硝酸鉛引起肝血漿過多(Biochem.Biophys.Acta.1997，1346(1997)，10-16；Biochem.Biophys.Acta.1997，1348，142-150)。這些研究表明PEMT2的表達起著抑制肝細胞分裂的作用。這很自然使人聯(lián)想起PEMT在肝癌中的作用。事實上確實際上現(xiàn)了PEMT2在肝癌組織中有異常表達。另一個有趣的事實是，小鼠的PEMT2基因位于11號染色體，該區(qū)域?qū)谌巳旧w5q或17p，而這兩個區(qū)域都被認為是突變的熱點，它們在原發(fā)性(primary)肝癌中都被刪除。PEMT2與肝癌的關系確是有趣的問題(J.Lipid.Res.1996，37，2341-2350)。
然而，在本發(fā)明之前，沒有公開過本申請中涉及的人類磷脂酰乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼磷脂酰乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶家族的一個新成員，本發(fā)明的磷脂酰乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶被命名為人PEMTH(GenBank Accession No.AF044214)(因申請保密一段時間，故在本申請之前該序列沒有對公眾公開)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的人磷脂酰乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員，該酶被命名為人PEMTH蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產(chǎn)所述的新的人磷脂酰乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶的方法。
本發(fā)明還提供了這種人PEMTH基因序列和多肽的應用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人PEMTH蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人PEMTH蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人PEMTH蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成人PEMTH蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人PEMTH蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人PEMTH蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為828個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于84-683位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術語“人PEMTH蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO3中84-683位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO3序列的編碼框84-683位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO3中84-683位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人PEMTH相同功能的蛋白的、SEQ ID NO3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術語“人PEMTH蛋白多肽”指具有人PEMTH蛋白活性的SEQ IDNO4序列的多肽。該術語還包括具有與人高效淋巴細胞趨化因子相同功能的、SEQ ID NO4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括人PEMTH蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與人PEMTH DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人PEMTH多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人PEMTH多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還提供了人PEMTH多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人PEMTH多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人PEMTH蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人PEMTH多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括人PEMTH多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)人PEMTH的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人PEMTH多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人PEMTH的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人PEMTH核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應于人PEMTH多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人PEMTH DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人PEMTH基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人PEMTH基因產(chǎn)物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制人PEMTH蛋白的分子，也包括那些并不影響人PEMTH蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人PEMTH基因產(chǎn)物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的人PEMTH基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人PEMTH或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人PEMTH功能的抗體以及不影響人PEMTH功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人PEMTH基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人PEMTH基因產(chǎn)物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人PEMTH核苷酸序列全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。當然，通過先合成多個小片段，然后再進行連接而獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明中，人PEMTH的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15′-GAGGTAACGAACAGCTCGGTGGC-3′(SEQ ID NO1)，和反向引物A25′-CAAGGCAGCAGGTTCCAAGGCAC-3′(SEQ ID NO2)，進行PCR，獲得828bp的目的片段。測序后得到SEQ ID NO3的全長cDNA序列。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，上述序列與大鼠的PEMT基因在核酸水平上高度同源，而在蛋白水平上則與小鼠、大鼠的PEMT都有高度同源性。
已知PEMT與肝細胞的分裂增殖相關，在個體發(fā)育的過程中其表達水平有明顯的變化，而且這種成長發(fā)生在基因表達的水平上。同時發(fā)現(xiàn)肝癌衍生細胞系中，PEMT的活性幾乎查不到，并且PE甲基化水平也比正常肝明顯降低，而且沒有PEMT2蛋白，在非致瘤性生長中PEMT2表達也極大的降低。這些現(xiàn)象表明PEMT的活動可能與肝癌的發(fā)生關系密切。因此本發(fā)明分離到的人類PEMT的cDNA及多肽(酶)為研究肝癌提供了一條途徑。
另外，PEMT2蛋白的低表達與帶有mnd(motor Neuron Degeneration)基因的生物體的表型有關，其表型為神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉淀癥(其特征是在神經(jīng)元中發(fā)生缺陷性的脂類沉積)。因此本發(fā)明分離到的人類PEMT的cDNA及多肽(酶)為治療此類疾病提供了一條途徑。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人PEMTH與大鼠PEMT的核酸序列的同源比較圖。其中，相同的核苷酸用“|”標出。
圖2為本發(fā)明的人PEMTH與大鼠及小鼠PEMT蛋白的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在三個序列下方用“*”標出，在3個序列中相似性較好的氨基酸用“·”標出。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1人PEMTH的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-GAGGTAACGAACAGCTCGGTGGC-3′(SEQ ID NO1)，寡核苷酸A25′-CAAGGCAGCAGGTTCCAAGGCAC-3′(SEQ ID NO2)為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、74℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷，其長度為828bp。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑷缟汐@得的這段PCR擴增產(chǎn)物A1/A2與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共828bp，詳細序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于84-683位核苷酸。
根據(jù)得到的全長基因組序列推導出人PEMTH的氨基酸序列，共199個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實施例2同源比較和結構研究用人PEMTH的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進行核酸和蛋白同源檢索。結果發(fā)現(xiàn)其核酸序列與大鼠的PEMT基因在核酸水平上高度同源(約80％同一性)(圖1)，而在蛋白水平上則與小鼠、大鼠的PEMT都有高度同源性(與小鼠的同一性為約76％，相似性約為86％；與大鼠的同一性為77％，相似性為86％)(圖2)。所以，可以確定人PEMTH與它們構成了一個家族，并且可以從這些基因或蛋白的功能來推測本發(fā)明的人PEMTH的功能。
已知PEMT與肝細胞的分裂增殖相關，在圍產(chǎn)期前后，PEMT的活性會有很大的變化。在胚胎時期肝細胞生長分裂迅速而PEMT的活性很低；出生后，PEMT的活性迅速升高，而肝細胞的生長則慢慢下降，而且這種成長發(fā)生在基因表達的水平上。同時發(fā)現(xiàn)在快速分裂的MCA-RH777和HepG2這些肝癌衍生細胞系中，PEMT的活性幾乎查不到。在肝癌細胞中，PE甲基化水平比正常肝明顯降低，而且沒有PEMT2蛋白，在非致瘤性生長中PEMT2表達也極大的降低。這些現(xiàn)象表明PEMT的活動可能與肝癌的發(fā)生關系密切。因此本發(fā)明分離到的人類PEMT的cDNA及多肽(酶)為研究肝癌提供了一條途徑。
基因剔除實驗同樣提供了有關PEMT功能的信息。在剛斷奶的PEMT剔除的小鼠中實施缺乏膽堿的飲食會造成小鼠的死亡，說明PEMT在膽堿缺乏的動物中確實起著維持動物正常生長和肝臟正常功能的作用。
另外，PEMT2蛋白的低表達與帶有mnd(motor Neuron Degeneration)基因的生物體的表型有關，其表型為神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉淀癥(其特征是在神經(jīng)元中發(fā)生缺陷性的脂類沉積)。因此本發(fā)明分離到的人類PEMT的cDNA及多肽(酶)為治療此類疾病提供了一條途徑。
本發(fā)明的人PEMTH除了可作為該家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人PEMTH還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人PEMTH的N端與大鼠或小鼠PEMT的N端進行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人PEMTH的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
例如，本發(fā)明人PEMTH核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人PEMTH的表達水平或者抑制人PEMTH的過度表達。本發(fā)明的人PEMTH蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人PEMTH缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
實施例3人PEMTH在大腸桿菌中的表達在該實施例中，將編碼人PEMTH的cDNA序列(GenBank Accession No.AF044214)用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人PEMTH cDNA作為插入片段。
PCR反應5′寡核苷酸引物序列為5′-AGAGGTCGACATGACCCGGCTGCTGGGCT-3′(SEQ ID NO.5)該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的人PEMTH編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5′-GAAGAAGCTTTCAGCTCCTCTTGTGGGAC-3′(SEQ ID NO.6)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點，一個終止密碼子和人PEMTH編碼序列的19個核苷酸；引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用HindIII，SalI消化pQE-9載體，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗證人PEMTH的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構建物的克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人PEMTH。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人PEMTH。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小約為22kDa。
此外，用常規(guī)方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO4的序列一致。
實施例4人PEMTH在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼人PEMTH的cDNA序列(GenBank AccessionNOAF044214)用對應于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人PEMTH cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-AGAGAAGCTTATGACCCGGCTGCTGGGCT-3′(SEQ ID NO.7)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的人PEMTH編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5′-GAAGGAGCTCTCAGCTCCTCTTGTGGGAC-3′(SEQ ID NO.8)該引物含有SacI限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人PEMTH的編碼序列。限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(fl ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用HindIII，SacI消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用BstxI酶切鑒定插入片段大小及方向，測序驗證人PEMTH的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑒定表達蛋白的分子量大小約為22kDa。
此外，用常規(guī)方法對達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO4的序列一致。
實施例5制備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組蛋白用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人PEMTH基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人上海新黃浦復旦基因工程有限公司(ii)發(fā)明名稱人磷脂酰乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶、其編碼序列及制備方法(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1GAGGTAACGA ACAGCTCGGT GGC 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2CAAGGCAGCA GGTTCCAAGG CAC 23(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度828bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO31 GAGGTAACGAACAGCTCGGTGGCAGGGCTGACTGCTGCGGAGGCCTCGGCAATATTGATT61 TTAGACAGGCAGACTTCTGCGTTATGACCCGGCTGCTGGGCTACGTGGACCCCCTGGATC121 CCAGCTTTGTGGCTGCCGTCATCACCATCACCTTCAATCCGCTCTACTGGAATGTGGTTG181 CACGATGGGAACACAAGACCCGCAAGCTGAGCAGGGCCTTCGGATCCCCCTACCTGGCCT241 GCTACTCTCTAAGCGTCACCATCCTGCTCCTGAACTTCCTGCGCTCGCACTGCTTCACGC301 AGGCCATGCTGAGCCAGCCCAGGATGGAGAGCCTGGACACCCCCGCGGCCTACAGCCTGG361 GCCTCGCGCTCCTGGGACTGGGCGTCGTGCTCGTGCTCTCCAGCTTCTTTGCACTGGGGT421 TCGCTGGAACTTTCCTAGGTGATTACTTCGGGATCCTCAAGGAGGCGAGAGTGACCGTGT481 TCCCCTTCAACATCCTGGACAACCCCATGTACTGGGGAAGCACAGCCAACTACCTGGGCT541 GGGCCATCATGCACGCCACGCCCACGGGCCTGCTCCTGACGGTGCTGATGGCCCTCACCT601 ACATAGTGGCTCTCCTATACGAAGAGCCCTTCACCGCTGAGATCTACCGGCAGAAAGCCT661 CCGGGTCCCACAAGAGGAGCTGATTGAGCTGCAACAGCTTTGCTGAAGGCCTGGCCAGCC721 TTCTCATCGTCCCCAAGTGGCAGGCCCTGCGCAGGGCGAGAATGGTGCCTGCTGCTCAGG781 GCCTCCCCCGGCGTGGGCTGCCCCAGTGCCTTGGAACCTGCTGCCTTG(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度199個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO41 Met Thr Arg Leu Leu Gly Tyr Val Asp Pro Leu Asp Pro Ser Phe16 Val Ala Ala Val Ile Thr Ile Thr Phe Asn Pro Leu Tyr Trp Asn31 Val Val Ala Arg Trp Glu His Lys Thr Arg Lys Leu Ser Arg Ala46 Phe Gly Ser Pro Tyr Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Ser Val Thr Ile61 Leu Leu Leu Asn Phe Leu Arg Ser His Cys Phe Thr Gln Ala Met76 Leu Ser Gln Pro Arg Met Glu Ser Leu Asp Thr Pro Ala Ala Tyr91 Ser Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Leu Gly Val Val Leu Val Leu106 Ser Ser Phe Phe Ala Leu Gly Phe Ala Gly Thr Phe Leu Gly Asp121 Tyr Phe Gly Ile Leu Lys Glu Ala Arg Val Thr Val Phe Pro Phe136 Asn Ile Leu Asp Asn Pro Met Tyr Trp Gly Ser Thr Ala Asn Tyr151 Leu Gly Trp Ala Ile Met His Ala Thr Pro Thr Gly Leu Leu Leu166 Thr Val Leu Met Ala Leu Thr Tyr Ile Val Ala Leu Leu Tyr Glu181 Glu Pro Phe Thr Ala Glu Ile Tyr Arg Gln Lys Ala Ser Gly Ser196 His Lys Arg Ser(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5AGAGGTCGAC ATGACCCGGC TGCTGGGCT29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6GAAGAAGCTT TCAGCTCCTC TTGTGGGAC29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7AGAGAAGCTT ATGACCCGGC TGCTGGGCT 29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8GAAGGAGCTC TCAGCTCCTC TTGTGGGAC 29
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從84-683位的核苷酸序列。
4.一種分離的人PEMTH蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是真核細胞。
10.一種產(chǎn)生具有人PEMTH蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人PEMTH蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成人PEMTH蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成人PEMTH蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人PEMTH蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人PEMTH蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸84-683位。
12.一種能與權利要求4所述的人PEMTH蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了人的磷脂酰乙醇胺－N－甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphotidy lethanolamine N-methyltransferase homolog,簡稱為“PEMTH”)以及編碼該酶的cDNA序列。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法,以及這些多核苷酸和多肽的應用。
文檔編號C12P21/00GK1249342SQ98121908
公開日2000年4月5日 申請日期1998年9月28日 優(yōu)先權日1998年9月28日
發(fā)明者余龍, 張民, 畢安定, 趙勇, 趙壽元 申請人:上海新黃浦復旦基因工程有限公司