專利名稱：蓖麻蠶細(xì)胞核骨架結(jié)合元件的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子細(xì)胞生物學(xué)，真核基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)研究領(lǐng)域。具體涉及蓖麻蠶rRNA基因的一個(gè)新型的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件-細(xì)胞核骨架結(jié)合元件(SAR)，該SAR元件應(yīng)用于基因表達(dá)載體的構(gòu)建，能提高外源基因在真核細(xì)胞中的高效、穩(wěn)定表達(dá)。
真核生物的細(xì)胞核經(jīng)核酸酶消化后除去游離DNA、組蛋白和其它可溶性蛋白后，殘留一個(gè)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，稱為核骨架或核基質(zhì)。核骨架維持細(xì)胞核的形態(tài)，并形成三維空間將細(xì)胞核內(nèi)成千上萬(wàn)個(gè)基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、加工和運(yùn)輸?shù)壬顒?dòng)組織在一定的空間內(nèi)。染色質(zhì)上一些特定的DNA區(qū)域能與核骨架特異結(jié)合，稱為核骨架結(jié)合區(qū)(SAR)或核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)。SAR/MAR通常位于染色質(zhì)環(huán)的基部，決定染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，并對(duì)基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。
國(guó)外最早由Mirkovitch J等報(bào)道了組蛋白基因簇SAR的檢測(cè)及其特性(Mirkovitch J,et al.,Cell,1984,39:223～232)，發(fā)現(xiàn)SAR是富含A、T的DNA序列(A+T＞70％)，長(zhǎng)約400～1000bp，能特異地與核骨架蛋白結(jié)合。接著Cockerill和Garrard報(bào)道了免疫球蛋白κ基因的MAR(Cell,1986,44:273-282)，發(fā)現(xiàn)該MAR含有拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的識(shí)別位點(diǎn)；隨著對(duì)SAR/MAR的基礎(chǔ)研究不斷深入，越來(lái)越多的基因的SAR/MAR被檢測(cè)，SAR/MAR的功能引起人們廣泛的興趣，Phi-VanL等在90年報(bào)道了雞溶菌酶基因5’MAR能增強(qiáng)異源啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。我們實(shí)驗(yàn)室最近報(bào)道了蓖麻蠶rRNA基因簇的SAR元件(趙慕鈞等，中國(guó)科學(xué)(C輯)，1998,28(1):42～49)，該元件是由我們克隆、測(cè)序并鑒定的。本發(fā)明是將該SAR元件應(yīng)用于基因表達(dá)載體的構(gòu)建，以提高外源基因在真核細(xì)胞中穩(wěn)定高效表達(dá)。
為此，本發(fā)明的目的是通過(guò)克隆蓖麻蠶的SAR元件，將SAR元件應(yīng)用在體外組建成真核基因表達(dá)載體，由該載體攜帶外源基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，增強(qiáng)外源基因的穩(wěn)定高效表達(dá)。
關(guān)于蓖麻蠶SAR元件克隆的構(gòu)建方法是通過(guò)首先檢測(cè)并鑒定蓖麻蠶rRNA基因的核骨架結(jié)合區(qū)(SAR)，然后將該SAR插入pBluescript(pSK+)質(zhì)粒的EcoRⅠ-SacⅡ位點(diǎn)，構(gòu)建成pSK(+)-SAR克隆(見(jiàn)圖1)。該SAR是長(zhǎng)約1,000bp的DNA片段，經(jīng)DNA序列分析后表明，該SAR富含A、T堿基(A+T＞70％)，含有topⅡ位點(diǎn)和酵母的自主復(fù)制序列(ACS)等其它重復(fù)序列和結(jié)構(gòu)花式，DNA的序列組成表明該SAR是一個(gè)重要的功能元件(見(jiàn)圖2)。
本發(fā)明以SAR元件組建成真核基因表達(dá)載體pLu-SAR為例，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。該載體含有SAR和報(bào)告基因蟲(chóng)螢光素酶(Luciferase)基因以及一些篩選標(biāo)記。該載體的構(gòu)建方法是用EcoRⅠ和SacⅡ雙酶切pSK-SAR質(zhì)粒(見(jiàn)圖1)，將SAR片段分離出來(lái)，然后用Klenow酶補(bǔ)平，接上BamHⅠ接頭，插入pLu質(zhì)粒的BamHⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建成pLu-SAR表達(dá)載體(圖3)。pLu質(zhì)粒含有SV40啟動(dòng)子和蟲(chóng)螢光素酶基因(Luc)，含有氰霉素抗性基因(AmpR)和新霉素抗性基因(NeoR)篩選標(biāo)記。蟲(chóng)熒光素酶基因是插入在質(zhì)粒載體上的外源基因，將其導(dǎo)入真核細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)蟲(chóng)螢光素酶的活力，來(lái)確定外源基因的表達(dá)高低。圖4是蟲(chóng)螢光素酶活力的檢測(cè)結(jié)果。將pLu質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳類細(xì)胞NIH3T3，蟲(chóng)螢光素酶基因的表達(dá)很低，將其作為對(duì)照，將pLu-SAR轉(zhuǎn)染哺乳類細(xì)胞NIH3T3，發(fā)現(xiàn)SAR能增強(qiáng)蟲(chóng)螢光素酶基因在真核細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)約十七倍。將pAGLu作為陽(yáng)性對(duì)照(pAGLu和pLu質(zhì)粒由美國(guó)Kohwi-Shigematsu T.實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞后，增強(qiáng)蟲(chóng)螢光素酶基因表達(dá)七倍，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相似(Bode J,et al.,Science,1992,255:195～197)。因此我們克隆的SAR元件應(yīng)用于真核表達(dá)載體，作為一種增強(qiáng)子元件，提高外源基因的表達(dá)約17倍，具有很高的活性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于SAR元件在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)水平調(diào)控基因的表達(dá)，利用SAR元件構(gòu)建的真核表達(dá)載體pLu-SAR，將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞并整合到染色體上，SAR能在染色體上增強(qiáng)啟動(dòng)子活力，使基因表達(dá)增強(qiáng)。由于外源基因整合在染色體上，隨細(xì)胞分裂而分配到后代子細(xì)胞中，不易丟失，因此SAR增強(qiáng)基因表達(dá)的能力具有穩(wěn)定高效的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基因治療，以提高治療基因的表達(dá)。由于SAR/MAR能結(jié)合在核骨架上，有利于提高表達(dá)蛋白的水平及其穩(wěn)定性，適用于真核細(xì)胞生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品，提高質(zhì)量。
本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖1是蓖麻蠶SAR元件的pSK(+)-SAR克隆圖2是蓖麻蠶SAR元件的DNA序列組成圖3是真核基因表達(dá)載體pLu-SAR的圖譜圖4是蓖麻蠶SAR元件增強(qiáng)蟲(chóng)螢光素酶相對(duì)活力的檢測(cè)結(jié)果實(shí)施例1蓖麻蠶SAR元件的檢測(cè)與克隆a．分離和制備蓖麻蠶絲腺體組織細(xì)胞核取5齡1～3天蓖麻蠶絲腺體組織3～5g，勻漿并過(guò)濾，勻漿緩沖液為Al(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0),5mmol/L氯化鎂)，l,500rpm離心10分鐘，收集沉淀并用Al懸浮，加入終濃度為0.5％的Triton X-100，冰浴10分鐘后，1,500rpm離心10分鐘，用Al懸浮沉淀，作2.2mol/L蔗糖密度梯度超離心，超離心條件為20,000rpm,60分鐘，沉淀物為細(xì)胞核。
b．細(xì)胞核骨架的制備經(jīng)超離心分離的細(xì)胞核，用二碘水楊酸鋰鹽(LIS)緩沖液B(5mmol/LTris-HCl pH7.4,20mmol/L氯化鉀，0.125mmol/L亞精胺，0.05mmol/L精胺，0.1％毛地黃皂苷(進(jìn)口分裝，上海試劑供應(yīng)站)，0.1mmol/L PMSF)懸浮，然后參照Mirkovitch(Cell,1984,39:223～232)的方法制備核骨架，即用終濃度為20mmol/L二碘水揚(yáng)酸鋰鹽提取核內(nèi)組蛋白和其它可溶性蛋白，用1,000u/mL限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SacⅡ消化染色質(zhì)，離心沉淀和核骨架結(jié)合的DNA。
c．蓖麻蠶SAR元件的檢測(cè)和pS(+)-SAR克隆的構(gòu)建DNA經(jīng)純化后走1～1.2％瓊脂糖電泳，32P-α-dATP(Amersham產(chǎn)品)標(biāo)記rRNA基因片段作探針，雜交結(jié)果證明蓖麻蠶rRNA基因的5’EcoRⅠ-SacⅡ片段，長(zhǎng)約1,000bp，能與核骨架結(jié)合，定義為蓖麻蠶的SAR元件。將此SAR插入pBluescript(pSK+)的EcoRⅠ-SacⅡ位點(diǎn)，構(gòu)建pSK(+)-SAR克隆(見(jiàn)圖1)，SAR元件的DNA序列組成見(jiàn)圖2。
實(shí)施例2蓖麻蠶SAR元件應(yīng)用于pLu-SAR真核表達(dá)載體的構(gòu)建用SacⅡ和EcoRⅠ雙酶切，將SAR片段pSK(+)-SAR質(zhì)粒中切下，用Klenow酶補(bǔ)平后，接上BamHⅠ接頭，再用BamHⅠ切出粘性末端后，插入pLu質(zhì)粒的BamHⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建成pLu-SAR真核表達(dá)載體(見(jiàn)圖3)，pLu質(zhì)粒由美國(guó)Kohwi-Shigematsu,T.實(shí)驗(yàn)室提供，是實(shí)驗(yàn)室常用的質(zhì)粒，pLu質(zhì)粒含有青霉素抗性基因(AmpR)和新霉素抗性基因NeoR作為篩選標(biāo)記，含有SV40啟動(dòng)子和作為外源基因的蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告基因(Luc)，通過(guò)測(cè)定蟲(chóng)螢光素酶的活力來(lái)確定外源基因的表達(dá)高低。pLu質(zhì)粒表達(dá)Luc的活力很低，因此可以作為對(duì)照。將蓖麻蠶SAR元件插入pLu質(zhì)粒的BamHl位點(diǎn)，位于SV40啟動(dòng)子的5’上游，如果該SAR元件能夠增強(qiáng)基因的表達(dá)，經(jīng)檢測(cè)蟲(chóng)螢光素酶的活力就提高。
實(shí)施例3蓖麻蠶SAR元件增強(qiáng)外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)活性的檢測(cè)將實(shí)施例2構(gòu)建的真核表達(dá)載體pLu-SAR，以及作為對(duì)照的pLu、作為陽(yáng)性對(duì)照的pAGLu質(zhì)粒各1.5μg，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(GIBCO公司產(chǎn)品)6μl，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按公司提供的操作手冊(cè)進(jìn)行，NIH3T3細(xì)胞數(shù)約為2.5×105/60mm平皿，在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用0.7mg/mL G418進(jìn)行篩選，得到抗G418抗性克隆后，驗(yàn)證質(zhì)粒DNA已整合到染色體DNA上，然后檢測(cè)蟲(chóng)螢光素酶活性。質(zhì)粒DNA整合到染色體DNA上的鑒定方法是用常規(guī)方法提取細(xì)胞基因組DNA，用PCR檢測(cè)標(biāo)記基因NeoR的存在，PCR條件為94℃45秒，55℃45秒，72℃1分30秒，30個(gè)循環(huán)，1％瓊脂糖電泳鑒定，出現(xiàn)790bpDNA擴(kuò)增片段，說(shuō)明質(zhì)粒DNA已整合到細(xì)胞基因組DNA上。蟲(chóng)螢光素酶的活性用蟲(chóng)螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega公司產(chǎn)品)進(jìn)行測(cè)定，方法見(jiàn)Promega公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，LB9507熒光計(jì)數(shù)儀為EG&G Berthold公司產(chǎn)品。測(cè)定結(jié)果如圖4所示，相對(duì)熒光強(qiáng)度讀數(shù)分別為3T3/pLu為2033；3T3/pAGLu為14028；3T3/pLu-SAR為33954。3T3/pAGLu細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度比3T3/pLu細(xì)胞大七倍，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相似(Bode J,et al.,Science,1992,255:195～197),3T3/pLu-SAR細(xì)胞其相對(duì)熒光強(qiáng)度則增強(qiáng)了十七倍，說(shuō)明SAR應(yīng)用于真核細(xì)胞表達(dá)載體有很強(qiáng)的增強(qiáng)外源基因表達(dá)的能力。
權(quán)利要求
1．一種蓖麻蠶細(xì)胞核骨架結(jié)合元件的應(yīng)用，其特征在于該元件應(yīng)用于構(gòu)建真核基因表達(dá)載體，增強(qiáng)外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
2．如權(quán)利要求1所述的蓖麻蠶細(xì)胞核骨架結(jié)合元件的應(yīng)用，其特征在于所述真核基因表達(dá)載體是pLu-SAR,SAR位于SV40啟動(dòng)子的上游。
全文摘要
一種蓖麻蠶SAR元件長(zhǎng)約1,000bp,能特異地與細(xì)胞核骨架結(jié)合。將該SAR元件應(yīng)用于真核基因表達(dá)載體的構(gòu)建,即將該SAR插入質(zhì)粒pLu,構(gòu)建成pLu－SAR真核基因表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,使外源基因蟲(chóng)熒光素酶基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)活性比對(duì)照提高十七倍。SAR是一個(gè)很強(qiáng)的增強(qiáng)子元件,利用SAR組建真核基因表達(dá)載體,具有使外源基因穩(wěn)定高效表達(dá)的優(yōu)點(diǎn),可進(jìn)一步應(yīng)用于基因工程和基因治療的載體構(gòu)建。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1223299SQ9812202
公開(kāi)日1999年7月21日 申請(qǐng)日期1998年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月20日
發(fā)明者趙慕鈞, 吳震宇, 何明亮, 李載平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所