專利名稱：重組腺病毒的一種生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥工藝領(lǐng)域，特別是重組腺病毒的生產(chǎn)工藝。
自1996年以來，基因治療已日趨成熟，基因產(chǎn)品制備的實(shí)驗(yàn)室模式已不能滿足基因藥物商業(yè)化的需要，迫切需要開發(fā)基因藥物的規(guī)?；a(chǎn)工藝。鑒于腺病毒本身的可操作性，而成為各公司進(jìn)行基因藥物開發(fā)的首選藥物之一。目前，國(guó)內(nèi)外開發(fā)重組腺病毒的生產(chǎn)工藝，主要分為兩大類有血清貼壁培養(yǎng)和無血清懸浮培養(yǎng)，但這些方法均處在實(shí)驗(yàn)室階段，距離工業(yè)化生產(chǎn)還有很大差距。
本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)現(xiàn)重組腺病毒工業(yè)化生產(chǎn)的工藝，為重組腺病毒成為商業(yè)化基因藥物提供前提。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下生產(chǎn)工藝，包括(1)細(xì)胞種植取1×108-10×108個(gè)重組腺病毒包裝細(xì)胞工作細(xì)胞庫(kù)的接種細(xì)胞，接種于細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)(CellCube)，種植的密度為0.5×104-2.0×104/厘米2，先接種該系統(tǒng)的第一面，32℃-37℃孵育柜靜置4-8小時(shí)后，再種植第二面，然后32℃-37℃孵育過夜，當(dāng)細(xì)胞粘附好后，即可進(jìn)入循環(huán)培養(yǎng)；(2．)病毒感染在32℃-37℃循環(huán)培養(yǎng)幾天后，當(dāng)葡萄糖濃度下降至300毫克/升-100毫克/升，PH值下降至7.3-7.0，細(xì)胞鋪滿生長(zhǎng)良好時(shí)，即可進(jìn)行感染，從感染口注入來自病毒母液庫(kù)的重組腺病毒；(3．)介質(zhì)更新在感染2-4小時(shí)后，通過介質(zhì)泵，進(jìn)行新鮮介質(zhì)補(bǔ)充，一般在10-12小時(shí)內(nèi)補(bǔ)充2升新鮮介質(zhì)，新鮮介質(zhì)中的葡萄糖濃度測(cè)定值應(yīng)保持在300-350毫克/升；(4．)細(xì)胞收集當(dāng)在顯微鏡下觀察已有90％以上的細(xì)胞達(dá)到“細(xì)胞病理改變”時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞收集，將細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)直立，打擊其邊緣，直至所有的粘附細(xì)胞均脫離細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)表面，然后離心細(xì)胞懸液，沉淀細(xì)胞；(5．)凍融和純化將制備的沉淀細(xì)胞置于干冰-乙醇中，待完全冰凍后5分鐘，移該冰凍的細(xì)胞懸液入37℃水浴，待完全化凍后5分鐘，為一次凍融，如此重復(fù)三次，然后離心除去碎片，將待純化的病毒液進(jìn)行氯化銫梯度離心，收集純化的重組病毒，將該病毒液轉(zhuǎn)移入透析袋，在4℃下透析，即得到所需產(chǎn)品。
本發(fā)明由于采取以上設(shè)計(jì)，其具有以下優(yōu)點(diǎn)1、可以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，滿足商業(yè)化需要；2、該工藝具有可控性和可操作性；3、充分保證了產(chǎn)品的生物活性；4、具有較高的生產(chǎn)效率，并且生產(chǎn)成本較低；5、減少了環(huán)境污染下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。


圖1是本發(fā)明的工藝流程框圖。
實(shí)施例1采用本發(fā)明工藝生產(chǎn)SBN-1(重組腺病毒抗癌注射液)，如圖1所示(一)建立重組腺病毒包裝細(xì)胞(SBN-PC1)種子細(xì)胞庫(kù)(SBN-1·M)及工作細(xì)胞庫(kù)(SBN-1·W)用美國(guó)產(chǎn)FACStarplus細(xì)胞篩選儀篩選出SBN-1·M細(xì)胞均一性好、生長(zhǎng)速度快以及產(chǎn)病毒顆粒多的單克隆293細(xì)胞。SBN-1·M再經(jīng)過三代次的培養(yǎng)建成SBN-PC1·W。
(二)獲得單克隆重組病毒在用細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)(CellCube系統(tǒng))進(jìn)行第一次SBN-1大規(guī)模制備前，首先須用空斑形成實(shí)驗(yàn)方法，獲得高滴度的單克隆重組病毒，經(jīng)進(jìn)一步純化、配制和分裝，制成“SBN-1感染病毒母液庫(kù)”。
(三)細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)(CellCube系統(tǒng))的建立細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)(CellCube系統(tǒng))由四個(gè)主要部份構(gòu)成，包括系統(tǒng)控制器，介質(zhì)氧化瓶，循環(huán)泵和介質(zhì)泵。系統(tǒng)控制器用于調(diào)控該系統(tǒng)的工作狀態(tài)，維持pH、CO2濃度。從CellCube內(nèi)出來的培養(yǎng)介質(zhì)流入介質(zhì)瓶，在瓶?jī)?nèi)通過系統(tǒng)控制器將氣體與介質(zhì)充分混合，使舊介質(zhì)達(dá)到新生。循環(huán)泵主要是保持整個(gè)系統(tǒng)中培養(yǎng)介質(zhì)的循環(huán)流動(dòng)。介質(zhì)泵為一雙頭泵，用于連續(xù)地輸入和排出培養(yǎng)介質(zhì)。CellCube含有一個(gè)較大的表面積，以利粘附細(xì)胞生長(zhǎng)。
1、在接種細(xì)胞于CellCube系統(tǒng)前1-2天，用75％的乙醇和水徹底清洗介質(zhì)氧化瓶及其附件和管道。
2、將所有的連接處用聚丙烯鎖條固定，用鋁鉑紙包裹所有的游離末端。
3、在氧敏探頭-Ⅱ的二端各連接50cm長(zhǎng)的硅膠管。(1/2″ID×3/4″0D)，并將膠管的一個(gè)游離端連接于CellCube的出口上。
4、在連接管道前，加5ml的消毒水進(jìn)入循環(huán)泵盒內(nèi)。在該泵盒的入口處接50cm長(zhǎng)的硅膠管(1/2″ID×3/4″0D)，膠管的另一端與介質(zhì)再生瓶的入口處連接。
5、在循環(huán)泵的出口處，通過1/2″接頭/接口/雙接口(m/m/df)接頭，連接25cm長(zhǎng)的硅膠管(1/2″ID×3/4″0D)。在m/m/df的另一游離端，連接15cm長(zhǎng)的硅膠管(1/2″ID×3/4″0D)和四通道連接器。該連接器的二個(gè)通道用于種植細(xì)胞和收獲細(xì)胞用；另二個(gè)通道分別連接于CellCube的入口和循環(huán)泵盒。
6、將Y形連接管雙頭端連接到介質(zhì)氧化瓶的液體回流管外口，Y形管的單頭碳連接于氧探頭-Ⅱ。
7、用一夾子夾住Y形管雙頭碳的一條管道。在介質(zhì)再生瓶的側(cè)臂介質(zhì)回流管的末端連接2cm長(zhǎng)的硅膠管，并將硅膠管的游離未端切成45℃，以防止氣泡產(chǎn)生。
8、安裝氧探頭-Ⅰ和PH電極到介質(zhì)再生瓶?jī)?nèi)。
9、在使用前24hr，擰松瓶蓋，高壓消毒(120℃、30分鐘)整個(gè)介質(zhì)再生瓶，介質(zhì)泵盒和氧探頭-Ⅱ。
10、冷卻介質(zhì)再生瓶至室溫，將氧探頭Ⅰ和Ⅱ連接于系統(tǒng)控制儀，并調(diào)至100％。待在美國(guó)產(chǎn)Roll-In孵育箱(34℃)過夜后，再調(diào)至100％。
11、在細(xì)胞接腫瓶上，在其中的一個(gè)入口處連接10cm長(zhǎng)的硅管(3/16″ID×3/8″0D)和0.2μm的濾膜，在另一入口處，連接30cm長(zhǎng)的一條硅膠管在接種時(shí)用。
12、在介質(zhì)輸入瓶的吸管末端連接3-4cm長(zhǎng)的一段管子。
13、在舊液回收瓶的入口處，連接2m長(zhǎng)的膠管(3/16″ID×3/8″0D)一條，其長(zhǎng)度可連接到介質(zhì)再生瓶的舊液出口處。
14、消毒12個(gè)250ml的離心瓶。
(四)細(xì)胞接種1、接種第一面用1600ml準(zhǔn)備好的重組腺病毒包裝細(xì)胞懸液(3×108細(xì)胞)接種。接種的密度為1×104/cm2。
(1)將SBN-PC1懸液倒入一個(gè)4L的接種瓶。
(2)將已預(yù)溫的CellCube移入工作臺(tái)。
(3)從CellCube的入口管處取下封口紙。
(4)將CellCube放在支架上，并保持其出口位置在上。
(5)通過聚丙烯連接頭將CellCube的入口處與上述盛有細(xì)胞懸液的接種瓶的吸液管外口相連，并連接好空氣泵。
(6)用血管鉗夾住CellCube的出口，接通空氣泵。打開血管鉗，使細(xì)胞懸液灌流入CellCube。
(7)當(dāng)CellCube充滿后，用血管鉗夾住CellCube入口和出口的膠管，移入34℃孵育柜，然后將CellCube水平放在支架上，靜置6小時(shí)，并將朝向上的一面標(biāo)記為“第二面”。
2、接種第二面(1)加SBN-PC1懸液3×108細(xì)胞/200ml到4L的接種瓶?jī)?nèi)。
(2)將該接種瓶放在低于CellCube的位置處。
(3)松開CellCube入口和出口膠管上的夾子。
(4)使第一次接種的細(xì)胞懸液從CellCube流出，進(jìn)入上述(1)的接種瓶?jī)?nèi)。
(5)混合上述(4)接種瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞懸液。
(6)接通空氣泵，使接種瓶?jī)?nèi)混勻的細(xì)胞懸液灌流入CellCube。
(7)當(dāng)灌流滿后，在離CellCube入口3″處夾往膠管。
(8)夾住CellCube出口處膠管。
(9)水平放該CellCube在支架上，并標(biāo)記朝上的一面為“第一面”。
(10)置整個(gè)CellCube和支架車于34℃美國(guó)Bellco Biotechnologg公司產(chǎn)的Roll-IN孵育柜內(nèi)過夜。
(11)用手電筒斜照CellCube進(jìn)行觀察，當(dāng)細(xì)胞粘附好后，即可進(jìn)入循環(huán)培養(yǎng)。
(五)建立循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)1、將系統(tǒng)控制儀、循環(huán)泵、介質(zhì)泵放入Roll-IN孵育柜內(nèi)。
2、將pH濃度導(dǎo)線、O2和CO2濃度敏感導(dǎo)線連接到系統(tǒng)控制儀的后部。接通系統(tǒng)控制儀，循環(huán)泵電源，并確保黃色導(dǎo)線與介質(zhì)泵連接。
3、連接pH探測(cè)棒，氧和CO2濃度敏感導(dǎo)線于介質(zhì)氧化瓶上。
4、將循環(huán)盒插入循環(huán)泵上。
5、打開CellCube入口處和出口處膠管上的鉗子。
6、使用二個(gè)串連的空氣過濾膜。接通空氣泵，壓入2-3PSI的混合氣體。
7、松開所有的夾子。
8、調(diào)節(jié)循環(huán)泵速率為0.4升/分，溫度為34℃。
9、關(guān)閉Roll-IN孵育柜門。
(六)感染過程1、在34℃循環(huán)培養(yǎng)幾天后，當(dāng)葡萄糖濃度下降至200mg/L,pH值下降至7.1，經(jīng)觀察證明細(xì)胞鋪滿生長(zhǎng)和生長(zhǎng)良好時(shí)，即為感染之良機(jī)。
2、調(diào)整循環(huán)泵速度為0.4升/分。
3、預(yù)備無菌的3支10ml注射器和71/2#針頭，并用乙醇消毒紙消毒感染嘴。
4、分三次，按一定速率從感染口注入感染病毒母液庫(kù)病毒。
5、第三次注入完成后，關(guān)閉循環(huán)泵，中止循環(huán)數(shù)十分鐘，以有效感染CellCube內(nèi)細(xì)胞。
6、重新啟動(dòng)循環(huán)泵，調(diào)節(jié)循環(huán)泵速率為0.4升/分。
(七)補(bǔ)充新鮮介質(zhì)1、在感染3小時(shí)以后開始用新鮮介質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)充，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒繁殖對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要。
2、倒入2L新鮮介質(zhì)進(jìn)入一無菌瓶?jī)?nèi)。
3、用1.5m長(zhǎng)、1/16″規(guī)格的膠管，通過接頭將介質(zhì)瓶與新鮮介質(zhì)輸入口連接起來。
4、用1.5m長(zhǎng)、3/8″的膠管，通過接頭將介質(zhì)再生瓶的出口與收集舊液瓶連接起來。
5、調(diào)節(jié)介質(zhì)泵速度為0.46升/分。
6、放新鮮介質(zhì)瓶在Roll-In孵育柜內(nèi)，將舊液收集瓶置于柜外。
7、用鎖扣環(huán)和鎖扣槍栓緊所有連接處。
(八)細(xì)胞收集當(dāng)在顯微鏡下觀察已有90％以上的細(xì)胞達(dá)到“細(xì)胞病理改變”(CPE)時(shí)，方可進(jìn)行細(xì)胞收集。
1、斷離CellCube系統(tǒng)與Roll-In孵育柜的所有連線。
2、關(guān)閉系統(tǒng)控制儀的電源。
3、從介質(zhì)泵上拆除新鮮介質(zhì)補(bǔ)充膠管。
4、用止血鉗夾住CellCube的入口和出口。
5、將CellCube直立，用橡膠錘打擊CellCube的四個(gè)邊，每打擊8捶后，換一個(gè)捶打面，直到所有的粘附的細(xì)胞均脫離CellCube的表面。
6、將CellCube出口通過一膠管與細(xì)胞收集瓶相連接，并將收集瓶置于清潔工作臺(tái)內(nèi)。
7、松開止血鉗利用高差和重力使CellCube內(nèi)細(xì)胞懸液引流入收集瓶，在引流過程中，需不斷用力搖晃CellCube，以保持細(xì)胞懸浮狀態(tài)。
8、將空氣泵接在收集瓶上，將瓶?jī)?nèi)細(xì)胞懸液分裝在6個(gè)250ml的離心瓶?jī)?nèi)。
9、離心沉淀細(xì)胞，25000pm,15分鐘。
10、將離心瓶?jī)?nèi)上清傾倒入一廢液收集瓶，但在每離心管內(nèi)存留5-10ml上清，以便再懸浮細(xì)胞。
11、向廢液收集瓶加入5％(V/V)漂白消毒液，混勻后放置1小時(shí)。
12、懸浮離心管內(nèi)細(xì)胞，并將所有細(xì)胞懸液收集于一瓶?jī)?nèi)。同時(shí)用5-10ml洗滌離心心瓶壁，以盡量收獲細(xì)胞。
13、取出50ml細(xì)胞懸液，加5ml PBS(磷酸緩沖液，pH7.0)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞CPE情況和進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
14、將該細(xì)胞懸液置于干沖-乙醇中，開始凍融和純化過程。
(九)凍融和純化
1、貯存CPE細(xì)胞懸液在-80℃或立即凍融破細(xì)胞，即先將細(xì)胞懸液放入干冰-乙醇，待完全冰凍后5分鐘，然后移該冰凍的細(xì)胞懸液入37℃水浴，待完全化凍后5分鐘，為一次凍融。共重復(fù)上述冰凍/化凍過程三次。在每次凍融后，溫和搖動(dòng)混勻。
2、離心3000rpm10分鐘，除去碎片。
3、制備CsCl溶液。
①1.5/ml CsCl溶液稱33.5g CsCl，加41.0ml PBS。
②1.35g/ml CsCl溶液取15ml 1.5g/ml的CsCl液，加6ml PBS。
③1.25g/ml CsCl溶液取11ml 1.5g/ml的CsCl液，加PBS 9ml。
4、制備CsCl密度梯度取聚乙烯離心管(12ml)6支。首先加入2.5ml1.35g/ml的CsCl液，然后取0.5ml 1.5g/ml的CsCl液輕注于管底，再取1.25g/mlCsCl液2.5ml輕輕平鋪在上層。故從管底向上CsCl的濃度梯度依次為1.5g/ml、1.35g/ml和1.25g/ml。
5、加6ml待純化的病毒液(經(jīng)過3次凍融后的病毒液)于CsCl液的上面。
6、離心35,000rpm(150,000×g)60分鐘，10℃。重組病毒在1.25g/ml和1.35g/ml CsCl液之間形成一霧狀白色區(qū)帶。另外，在重組病毒區(qū)帶的上面可看到3條雜帶和蛋白層。
7、通過真空，抽吸取區(qū)帶上層液(應(yīng)盡量去除上層蛋白層和雜帶，但絕對(duì)防止損失樣品區(qū)帶。
8、用吸管仔細(xì)吸取樣品區(qū)帶(盡量取干凈，但應(yīng)防止吸取下層CsCl液過多)，并放入-100ml瓶?jī)?nèi)。
9、用1.35g/ml CsCl液加入收集的樣品液中，終體積達(dá)到70ml(或者是11.6ml的偶數(shù)倍數(shù)體積)，混勻后，將其分裝入6支(或者8、10、12支)超離心管中。在10℃,35,000rpm離心18小時(shí)。離心完畢后，在下層的較寬大的區(qū)帶為純化的重組病毒區(qū)帶，亦可見到其它2條纖細(xì)雜帶。
10、收集重組病毒區(qū)帶進(jìn)入-15ml帶蓋管子。
11、用1-2個(gè)體積的透析液稀釋該病毒液。
12、轉(zhuǎn)移病毒液進(jìn)入透析袋(28mm、50,000MWCO、Spectrum、XX)，在4℃透析，2L透析液/次，共透析3次，每將2小時(shí)。
13、收集經(jīng)過透析的純化的重組病毒液，測(cè)定濃度、純度和活性等，并貯存在-80℃。
(十)純化、檢定、分裝和貯存每經(jīng)一個(gè)該發(fā)明的生產(chǎn)工藝過程(為期2周)，可收獲2×1015病毒顆粒(VP)，約10,000只SBN-1成品。
實(shí)施例2工藝步驟與實(shí)施例1相同，其差別為
1、在所述的(三)細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)的建立過程中，其中第10步在美國(guó)產(chǎn)Roll-In孵育箱中過夜的溫度為32℃。
2、在所述的(四)細(xì)胞接種過程中，接種細(xì)胞孵育系統(tǒng)第1面時(shí)，其中第1步的細(xì)胞接種密度為1×108/cm2；第8步的孵育溫度為32℃，靜置4小時(shí)；第10步的孵育溫度為32℃。
接種細(xì)胞孵育系統(tǒng)第2面時(shí)，其中第1步加SBN-PC1生產(chǎn)細(xì)胞懸液1×108細(xì)胞/200ml。
3、在所述的(五)建立循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)過程中，其中第8步的循環(huán)泵速率為0.3升/分，溫度為32℃。
4、在所述的(六)感染過程中，第1步的培養(yǎng)溫度為32℃，葡萄糖濃度下降至300mg/l,pH值下降至7.3；第2步的循環(huán)泵速度為0.3升/分，第6步的循環(huán)泵速度為0.3升/分。
5、在所述的(七)補(bǔ)充新鮮介質(zhì)過程中，第1步的感染時(shí)間為2小時(shí)。
6、在所述的(十)純化、檢定、分裝和貯存中，可收獲的病毒顆粒為8×1013。
實(shí)施例3工藝步驟與實(shí)施例1相同，其差別為1、在細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)的建立過程中，第10步在美國(guó)產(chǎn)Roll-In孵育箱中過夜的溫度為37℃。
2、在細(xì)胞接種過程中，接種細(xì)胞孵育系統(tǒng)第1面時(shí)，第1步的細(xì)胞接種密度為5×108/cm2。第8步的孵育溫度為37℃，靜置8小時(shí)。
接種細(xì)胞孵育系統(tǒng)第2面時(shí)，第1步加SBN-PC1生產(chǎn)細(xì)胞懸液5×108細(xì)胞/200ml。
3、在建立循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)過程中，第8步的循環(huán)泵速率為0.5升/分，溫度為37℃。
4、在感染過程中，第1步的培養(yǎng)溫度為37℃3葡萄糖濃度下降至100mg/l,pH值下降至7.0；第2步的循環(huán)泵速度為0.5升/分，第6步的循環(huán)泵速度為0.5升/分。
5、在補(bǔ)充新鮮介質(zhì)過程中，第1步的感染時(shí)間為4小時(shí)。
6、在第10步的純化、檢定、分裝和貯存中，可收獲的病毒顆粒為5×1014。
權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒的生產(chǎn)工藝，其特征在于包括以下各步驟(1)細(xì)胞種植取1×108-10×108個(gè)重組腺病毒包裝細(xì)胞工作細(xì)胞庫(kù)的接種細(xì)胞，接種于細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)(CellCube)，種植的密度為0.5×104-2.0×104/厘米2，先接種該系統(tǒng)的第一面，32℃-37℃孵育柜靜置4-8小時(shí)后，再種植第二面，然后32℃-37℃孵育過夜，當(dāng)細(xì)胞粘附好后，即可進(jìn)入循環(huán)培養(yǎng)；(2)病毒感染和繁殖在32℃-37℃循環(huán)培養(yǎng)幾天后，當(dāng)葡萄糖濃度下降至300毫克/升-100毫克/升，PH值下降至7.3-7.0，細(xì)胞鋪滿生長(zhǎng)良好時(shí)，即可進(jìn)行感染，從感染口注入來自病毒母液庫(kù)的重組腺病毒；(3)介質(zhì)更新在感染2-4小時(shí)后，通過介質(zhì)泵，進(jìn)行新鮮介質(zhì)補(bǔ)充，一般在10-12小時(shí)內(nèi)補(bǔ)充2升新鮮介質(zhì)，新鮮介質(zhì)中的葡萄糖濃度測(cè)定值應(yīng)保持在300-350毫克/升；(4)細(xì)胞收集當(dāng)在顯微鏡下觀察已有90％以上的細(xì)胞達(dá)到“細(xì)胞病理改變”時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞收集，將細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)直立，打擊其邊緣，直至所有的黏附細(xì)胞均脫離細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)表面，然后離心細(xì)胞懸液，沉淀細(xì)胞；(5)凍融和純化將制備的沉淀細(xì)胞置于干冰-乙醇中，待完全冰凍后5分鐘，移該冰凍的細(xì)胞懸液入37℃水浴，待完全化凍后5分鐘，為一次凍融，如此重復(fù)三次，然后離心除去碎片，將待純化的病毒液進(jìn)行氯化銫梯度離心，收集純化的重組病毒，將該病毒液轉(zhuǎn)移入透析袋，在4℃下透析，即得到所需產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的細(xì)胞生長(zhǎng)孵育系統(tǒng)由系統(tǒng)控制器、介質(zhì)氧化瓶、循環(huán)泵和介質(zhì)泵組成。
3.如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的細(xì)胞種植中的接種細(xì)胞為293細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的病毒感染中的重組腺病毒為單克隆病毒。
5.如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的病毒感染和繁殖中，感染注射分三次進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的凍融和純化中，透析共進(jìn)行三次，每次2小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組腺病毒的生產(chǎn)工藝,以解決重組腺病毒工業(yè)化生從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)化生產(chǎn)的飛躍。工藝步驟包括:1、細(xì)胞種植;2、病毒感染;3、介質(zhì)更新;4、細(xì)胞收集;5、凍融和純化。該工藝具有可控性和可操作性,充分保證了產(chǎn)品的生物活性,具有較高的生產(chǎn)效率。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1228474SQ9812334
公開日1999年9月15日 申請(qǐng)日期1998年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月14日
發(fā)明者彭朝暉 申請(qǐng)人:彭朝暉