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      檢測(cè)丙肝病毒的方法和試劑的制作方法

      文檔序號(hào):452169閱讀:761來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):檢測(cè)丙肝病毒的方法和試劑的制作方法
      本申請(qǐng)為中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?2111071,5、申請(qǐng)日為1992年8月26日發(fā)明名稱(chēng)為《檢測(cè)丙肝病毒的方法和試劑》的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
      本發(fā)明提供了用于檢測(cè)丙肝病毒,即一種非甲、非乙肝炎的病原體的試劑和方法。該試劑特別包括用于病毒RNA基因組反轉(zhuǎn)錄以及隨后的通過(guò)由此產(chǎn)生的cDNA的聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行放大的低核苷酸引子。特定序列的低核苷酸探針被提供用來(lái)檢測(cè)放大后的HCV核酸序列。引子和探針可用于檢測(cè)HCV感染的診斷試驗(yàn)中。這種診斷試驗(yàn)在臨床和流行病學(xué)的環(huán)境中有重要的應(yīng)用。
      丙肝病毒(HCV)是未知的幾種引起非甲,非乙肝炎(NANBH)的因子之一。原型的HCV發(fā)現(xiàn)于從黑猩猩血漿中獲得的以血液為載體的NANBH病毒的cDNA克隆,如在1989年的Science雜志第244期的第359-362頁(yè)上Choo等人的報(bào)道。來(lái)自這種原型HCV基因的核苷酸序列在歐洲專(zhuān)利公開(kāi)第381,216;388,232和398,748中作了描述。HCV基因組的核苷酸序列在1991年美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Pro.Natl.Acad.Sci.)上第88期第2451至2455頁(yè)上由Choo.等人作了報(bào)道并與相關(guān)病毒作了比較。
      在此后對(duì)其它族系的序列已有過(guò)報(bào)道。HCV基因組在分離體之間顯示出很強(qiáng)的核酸序列異種性,從HCVRNA基因組中分離cDNA在1989年的Nuc.Acid Res.第17期第10367-10372頁(yè)上由Kuboet等人報(bào)道。作者們創(chuàng)立了一種基于上述1989年Choo等人報(bào)道的序列的反轉(zhuǎn)錄引子。分離的HCV基因組片段表現(xiàn)出與原型HCV序列有79.8%的同種性。由類(lèi)似的原始記錄得到的,來(lái)自三個(gè)不同區(qū)域的序列在1990年的Gene 91期第287-291頁(yè)上由Takeuchi等人作了報(bào)道。據(jù)報(bào)道,在這三個(gè)區(qū)域之一,與原型序列的序列同種性為73.5%。
      來(lái)自從日本患者中分離出來(lái)的族系的HCV基因序列在1990年的Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A第87期9524-9528頁(yè)上由Kato等人作了報(bào)道。該序列在整個(gè)比較區(qū)域上顯示出與原型HCV基因組77.4%的同種性。在1991年的J.Virol.65期(3)第1105-1113頁(yè)上由Takamizawa等人報(bào)道的HCV基因組的全編碼區(qū)域的序列表現(xiàn)出與原型HCV菌系77%的同種性。
      在日本,兩個(gè)標(biāo)記為K1和K2的主要族系已經(jīng)在基因組的400核苷酸區(qū)域上被觀察到。這些族系具有與原型HCV序列的67%的序列同種性(見(jiàn)1990年Biochem.Biophys.Res.Commun.170(3)期第1021-1025頁(yè)上Enomoto等人的報(bào)道)。K2族還可被進(jìn)一步細(xì)分為兩組,標(biāo)記為Ka和Kb,在兩組之間具有約20%的核苷酸變異和在每一組內(nèi)具有約5%的核苷酸變異。
      與原型HCV序列的近似的同種性水平在1990年的J.Clin.Invest.86期第1764-1767頁(yè)上Kato等人的文章中作了報(bào)道,在15位患者中,cDNA片段被放大并排序。被放大的部分,對(duì)應(yīng)于原型序列中位置3525-3561的37個(gè)核苷酸表現(xiàn)出與原型HCV序列的68-78%的同種性。
      HCV基因組的RNA可以在血清中被檢測(cè)到,通過(guò)從基因RNA中產(chǎn)生cDNA,用聚合酶鏈反應(yīng)放大cDNA,并且隨后用特定序列的低核苷酸檢測(cè)。由于在HCV族系中的序列異種性,引子和探針很可能是族系特異的,除非能夠找到一個(gè)區(qū)域,在該區(qū)域內(nèi)序列通過(guò)不同族系是不變的。一種這樣的不變區(qū)域是在HCV基因組的5′一端。
      HCV基因組的5′-端非編碼序列首先在1990年的JapanJ.Exp.Med.60(3)期的第167-177頁(yè)上由Okamoto等人作了報(bào)道。兩個(gè)族系之間的對(duì)比表明5′-端非編碼序列是不變的。HCV基因組5′-端非編碼序列的這種不變特性還在1991年的Proc.Natl.Sci.U.S.A第88期1711-1715頁(yè)Han等人的文章中作了報(bào)道。比較從來(lái)自五大洲的個(gè)體中收集的11個(gè)HCV分離體中獲得的341核苷酸區(qū)域的部分序列,七個(gè)序列表現(xiàn)出與原型序列完全的同種性;剩下的四個(gè)序列表現(xiàn)出有1至5個(gè)堿基不符合。
      在1990年的Japan J.Exp.Med.60(3)期第215-222頁(yè)的Okamoto等人的文章中,描述了HCV基因組的各個(gè)不同區(qū)域,包括不變的5′非編碼區(qū)域的引子。選自不變區(qū)域的引子成功地放大了來(lái)自受試的大部分族系的核酸;選自異種區(qū)域的引子放大了來(lái)自一個(gè)更小的族系亞組的核酸。然而這些引子的放大效率低。參考文獻(xiàn)描述了一種兩步PCR放大法;第二放大循環(huán)是采用嵌套在由第一組引子放大的區(qū)域中的第二組引子,在前面放大的目標(biāo)區(qū)域上進(jìn)行的。
      一種需要兩個(gè)放大循環(huán),采用兩組引子的PCR放大法在1990年Lancet 335期第1419-1422頁(yè)的Garson等人的文章中也作了報(bào)道。一個(gè)對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(NS5)進(jìn)行編碼的區(qū)域被放大。由于序列的異種性,存在不被這些引子所識(shí)別的HCV序列(見(jiàn)1990年Lancet 336期第878-879頁(yè)Garson等人的文章)。因此,位于不變的5′非編碼區(qū)域內(nèi)的引子被試驗(yàn),但為獲得足夠的靈敏性,采用多組嵌套引子的兩步放大仍是必要的。利用嵌套引子,通過(guò)兩步放大的5′-端區(qū)域放大在1990年Lancet 336期第245頁(yè)上Kanai等人的文章中作了報(bào)道。
      利用嵌套的引子通過(guò)兩次放大循環(huán)的放大方法不僅效率低,而且極大地增加了污染的可能性。污染問(wèn)題在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是盡人皆知的;如果有一點(diǎn)可能性的話,在放大步驟中間最好避免打開(kāi)反應(yīng)試管更換引子和加入試劑,由于在初始的反轉(zhuǎn)錄步驟和隨后的PCR放大中間需要改變反應(yīng)條件,這就進(jìn)一步加劇了污染問(wèn)題。
      仍然需要引子低核苷酸來(lái)放大HCV序列,每個(gè)引子選自一個(gè)不變區(qū)域,以使所有的,或幾乎所有的族系能夠被放大,而且放大作用足夠有效以使得采用一組引子的放大就足夠了。還需要探針低核苷酸來(lái)檢測(cè)放大的cDNA,cDNA選自與引子雜合的兩不變區(qū)域之間的一個(gè)不變區(qū)域。需要反應(yīng)原始記錄和試劑以便采用相同試劑即可發(fā)生反轉(zhuǎn)錄和PCR,從而在放大過(guò)程中不再需要打開(kāi)反應(yīng)試管。
      而且,百分之十的NANBH病例與原型殼體和被膜抗原是不反應(yīng)的,見(jiàn)1991年J.Clinical Microbiology 29期第2329-2330頁(yè)中Chaudhary等人和1991年DNAS8期第3647-3651頁(yè)中Hosein等人的文章。因此,研制基于PCR的診斷及由新的分離體編碼的抗原將會(huì)改進(jìn)血清診斷試驗(yàn)的可靠性。本發(fā)明通過(guò)提供檢測(cè)HCV的引子、探針及方法來(lái)滿(mǎn)足這些要求。
      所提供的專(zhuān)門(mén)的引子和特定序列的低核苷酸探針可以用于同種的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以便能夠放大和檢測(cè)病毒RNA基因組的序列。利用本發(fā)明的引子和方法進(jìn)行放大的效率消除了用嵌套的引子進(jìn)行的第二個(gè)PCR放大循環(huán)的需要,而且,結(jié)果試驗(yàn)的高靈敏性提供了可靠的核酸檢測(cè)。
      本發(fā)明的一個(gè)方面涉及特定的低核苷酸引子。本發(fā)明提供了一個(gè)組合,其中包括用來(lái)放大一種HCV核酸的低核苷酸引子,其中所說(shuō)的引子適于放大來(lái)自一種HCV族系或選自含有日本,美國(guó)和C9菌族組的同型體的核酸子序列。這些引子在病毒RNA基因組的反轉(zhuǎn)錄中和隨后的利用聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)所產(chǎn)生的cDNA放大中起作用。引子與來(lái)自HCV基因組的不變區(qū)域的序列雜合,從而與各種族系鍵聯(lián)。利用所提供的引子進(jìn)行放大的效率足以不再需要采用嵌套引子的第二個(gè)PCR放大循環(huán)。
      本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及能夠檢測(cè)HCV基因組核酸的存在,而與族系無(wú)關(guān)的探針。該探針與對(duì)不同族系不變的區(qū)域是互補(bǔ)的。利用本發(fā)明的探針進(jìn)行的診斷試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)大量的HCV族系而不會(huì)損害其特異性。所以本發(fā)明提供的組合包括一種用于檢測(cè)丙肝病毒核酸存在的低核苷酸探針,其中探針適于檢測(cè)HCV族系的核酸或者選自含有日本、美國(guó)和C9原型族系的各種不同族系的核酸。
      本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及試劑盒。這些試劑盒呈各種形式并包含一種或多種反轉(zhuǎn)錄,放大或檢測(cè)試劑,例如引子、探針、聚合酶、糖酶、綬沖劑以及核苷三磷酸鹽。
      在一個(gè)實(shí)施例中,本發(fā)明提供了一套專(zhuān)門(mén)用于肝炎病毒的C9分離體的核酸檢測(cè)的試劑,該套試劑包括一個(gè)箱子,其中含有本質(zhì)上與HCV-C9病毒的核酸子序列鍵聯(lián)的核酸探針。
      本發(fā)明的另一方面涉及放大和檢測(cè)HCV RNA的方法。
      此外,本發(fā)明涉及一種組合,包括本質(zhì)上與SEQ ID.NO.29同種的病毒核酸序列。含有這樣一種病毒序列、這里被稱(chēng)為C9分離體的cDNA克隆,pHCV-C9,pHCV-C9被存放在American Type Culture Collection中,而且存放號(hào)為NO.75265。
      本發(fā)明還提供了用于專(zhuān)門(mén)檢測(cè)C9分離體及相關(guān)的變異體的核酸序列的探針和引子。本發(fā)明的探針最好包括選自下列小組的子序列SEQ ID NO.345′-TTGCCGGAAAGACTGGGTCCTTTC-3′(nt 174-197)SEQ ID NO.355′-CAAAAGAAACACAAACCGCCGCCC-3′(nt 374-397)SEQ ID NO.365′-CCAGCCCATCCCGAAAGATCGGCG-3′(nt 527-550)SEQ ID NO.37(MY160)5′-TGTCCGGTCATTTGGGCG-3′(nt 216-233)本發(fā)明還提供了專(zhuān)門(mén)放大C9分離體的核酸序列的低核苷酸引子。專(zhuān)門(mén)用于放大C9變異體及相關(guān)的分離體的本發(fā)明的引子最好包括選自下列一組上端引子的核酸序列SEQ ID NO.385′-AAACCCACTCTATGTCCGGTC-3′(nt 204-224);SEQ ID NO.395′-GTACGCCGGAATTGCCGGAAA-3′(nt 163-183);及SEQ ID NO.405′-CCTCAAAGAAAAACCAAAAGA-3′(nt 360-380);并與下列下端引子一起使用SEQ ID NO.415′-TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG-3′(nt 509-529);及SEQ ID NO.425′-CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT-3′(nt 555-575).
      本發(fā)明還提供了本質(zhì)上與C9分離體及前面被視為丙肝分離體的序列鍵聯(lián)的探針。這種類(lèi)型的優(yōu)選探針包括SEQ ID NO.43 KY150 5′-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT-3′.本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)非-C9HCV序列的探針。
      本發(fā)明提供了用于檢測(cè)丙肝基因組的核酸存在的方法,其中所說(shuō)的丙肝基因組的核酸選自由日本、美國(guó)及C9原型族系組成的小組,該方法包括(a)放大核酸子序列;(b)在探針與子序列鍵聯(lián)形成一個(gè)穩(wěn)定的雜合復(fù)合體的條件下將放大的核酸與專(zhuān)門(mén)用于該子序列的低核苷酸探針混合;及(c)檢測(cè)形成于子序列和探針之間的雜合體。
      在另一個(gè)實(shí)施例中,本發(fā)明提供了一個(gè)用于檢測(cè)肝炎病毒的C9分離體的方法,該方法包括以下步驟(a)讓?xiě)岩珊蠬CV-C9核酸序列的樣品與具有一個(gè)和HCV-C9核酸序列互補(bǔ)的子序列的探針接觸;及(b)檢測(cè)探針與該序列的雜合。
      該方法可以在步驟(a)之前進(jìn)一步包括一個(gè)對(duì)病毒特定序列的子序列的放大步驟。放大最好通過(guò)采用聚合酶鏈反應(yīng)法獲得。上述引子和探針最好用在本發(fā)明的方法中。
      本發(fā)明還提供了檢測(cè)肝炎病毒的C9分離體特有的核酸的試劑盒。該試劑盒包括一個(gè)箱子,其中含有一個(gè)核酸探針,該探針本質(zhì)上與核酸序列的一個(gè)核酸子序列鍵聯(lián)。該探針最好選自上列小組。
      另一種測(cè)定方法是基于免疫學(xué)反應(yīng)的,如血清抗體與蛋白或C9分離體的病毒溶樣產(chǎn)物的反應(yīng),或培養(yǎng)用來(lái)抗病毒抗體的免疫球蛋白與含病毒的生物樣品的反應(yīng)。因此,本發(fā)明提供了培養(yǎng)用來(lái)抗C9分離體的生物純的免疫球蛋白。
      為了理解本發(fā)明,下面定義幾個(gè)術(shù)語(yǔ)。
      “放大反應(yīng)混合液”是指含有用于放大目標(biāo)核酸的各種試劑的含水溶液。這些試劑包括酶,含水緩沖劑,鹽,目標(biāo)核酸,及脫氧核苷三磷酸鹽。按照上下文,混合液既可以是完全的也可以是非完全的放大反應(yīng)混合液。
      “放大反應(yīng)系統(tǒng)”是指任何放大目標(biāo)核酸序列復(fù)制品的體外方法。這些方法包括,但不局限于此,聚合酶鏈反應(yīng)放大(PCR),DNA連接酶,QB RNA復(fù)制酶,及基于RNA轉(zhuǎn)錄的放大系統(tǒng)。這些包括多種放大試劑并在下面更充分地描述。
      “放大反應(yīng)試管”是指適于盛放放大試劑的容器。通常試管由惰性成分構(gòu)成以使其不抑制或干擾所采用的放大系統(tǒng)。由于系統(tǒng)需要反復(fù)加熱和冷卻的熱循環(huán),故試管必須能夠耐受這個(gè)循環(huán)過(guò)程,且一般與熱循環(huán)控制裝置的套管準(zhǔn)確地配合。
      “放大試劑”是指各種緩沖劑,酶,引子,脫氧核苷三磷酸鹽(既有傳統(tǒng)的也有非傳統(tǒng)的),和用于進(jìn)行所選擇的放大步驟的引子。
      “放大”或“放大過(guò)程”一般是指目標(biāo)核酸的“指數(shù)”增長(zhǎng),在此被用來(lái)描述在選擇的目標(biāo)核酸序列數(shù)量上線性的和指數(shù)的增長(zhǎng)。
      “實(shí)質(zhì)上的鍵聯(lián)”是指一種低核苷酸和一個(gè)目標(biāo)序列的互補(bǔ)雜合并且含有少量的不雜合部分,這些少量的不雜合能夠通過(guò)降低對(duì)雜合劑的嚴(yán)格性要求以獲得所希望的對(duì)PCR聚合酶或雜合信息檢測(cè)的引發(fā)作用而被接受。
      “生物純”一詞是指實(shí)質(zhì)上或本質(zhì)上從在其自然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)時(shí)通常伴隨它的成分中游離出來(lái)的物質(zhì),例如,親合力純化的抗體或以一種生物純化狀態(tài)存在的單克隆抗體。
      “雜合”是指兩個(gè)單股核酸通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)鍵聯(lián)。
      “核酸”是指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物,并且除非另外限定,包括能夠以一種與天然產(chǎn)生的核苷酸類(lèi)似的方式起作用的已知的天然核苷酸的類(lèi)似物。
      “核苷酸聚合酶”是指能夠催化由核苷三磷酸鹽前體合成DNA或RNA的酶。在本發(fā)明的放大反應(yīng)中,聚合酶是依賴(lài)于模板的,并且一般在所形成的聚合物3′一端加入核苷酸。最優(yōu)選的聚合酶是熱穩(wěn)定的,如美國(guó)專(zhuān)利4,889,818和5,079,352中所述。
      術(shù)語(yǔ)“低核苷酸”是指一個(gè)分子,它包括兩個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,如引子,探針,待檢測(cè)的核酸片段,及核酸控制子。低核苷酸的準(zhǔn)確大小依賴(lài)于多種因素及低核苷酸最終的作用或應(yīng)用。低核苷酸可采用任何合適的方法制備,包括,例如克隆繁殖和對(duì)適當(dāng)序列的限定及采用一種方法直接進(jìn)行化學(xué)合成,如在1979年的Meth.Enzymol.68期第90-99頁(yè)上Narang等人的文章中所述的磷酸三酯化方法;1979年Meth.Enzymol 68期第109-151頁(yè)上Brown等人的磷酸二酯化方法;1981年TetrahedronLett.22期第1859-1862頁(yè)上Beaucage等人的二乙磷酰胺化方法;以及美國(guó)專(zhuān)利4,458,066中的固體支持物方法。
      術(shù)語(yǔ)“引子”是指一種天然或合成的低核苷酸,在導(dǎo)致與一個(gè)核酸鏈互補(bǔ)的引子擴(kuò)展產(chǎn)物的合成條件下,即存在四種不同的核苷三磷酸鹽和一種處于適當(dāng)?shù)木彌_劑中的聚合劑(即DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶)的條件下以及在適當(dāng)?shù)臏囟认?,引子能夠起到DNA合成的引發(fā)點(diǎn)的作用。引子最好是單股低脫氧核糖核苷酸。合適的引子長(zhǎng)度依賴(lài)于引子的使用用途,但一般在15至25個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。短的引子分子通常需要較低的溫度以便用模板形成充分穩(wěn)定的雜合的復(fù)合物。引子不需要反映準(zhǔn)確的模板序列,但必須充分地互補(bǔ)以便與模板雜合。
      在本發(fā)明的一個(gè)公開(kāi)的實(shí)施例中,提供了特定序列的引子和探針。對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是,有了那些實(shí)施例,可以制備其它的特定序列的引子和探針,例如通過(guò)在5′或3′端加入核苷酸,其中核苷酸與目標(biāo)序列互補(bǔ)或非互補(bǔ)。只要引子制品對(duì)于在目標(biāo)序列上的擴(kuò)展能夠起到的作用,并且只要引子和探針包括至少14個(gè)包含在所列舉的實(shí)施例中的連續(xù)的核苷酸,則這樣的制品就在本發(fā)明的范疇內(nèi)。
      術(shù)語(yǔ)“引子”可指多于一個(gè)引子,特別是在關(guān)于被放大的目標(biāo)區(qū)域的一端或兩端方面的信息存在模糊的情況下。例如,如果一個(gè)區(qū)域表現(xiàn)出在總體中具有較高水平的多態(tài)性,則引子混合物可被制備來(lái)放大不同的序列。如果希望的話,引子可通過(guò)包括一個(gè)能夠用分光、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)到的標(biāo)記物而被標(biāo)記。例如,可使用的標(biāo)記物包括32P熒光染料,電子密度試劑,酶(如在ELISA中普遍采用的),生物素,或可獲得抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白質(zhì)。標(biāo)記物還可以被用于“捕獲”引子,以便于將引子或引子擴(kuò)展產(chǎn)物,如放大的DNA固定在固體支持物上。
      “探針”是指通過(guò)與目標(biāo)核酸子序列互補(bǔ)堿基配對(duì)進(jìn)行鍵聯(lián)的一種低核苷酸。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)可以理解的是,探針一般可根據(jù)雜合狀態(tài)的嚴(yán)格性和與探針序列缺乏完全的互補(bǔ)性的目標(biāo)序列實(shí)質(zhì)上地鍵聯(lián)合。探針最好用同位素直接標(biāo)記或如采用鏈霉抗生物素蛋白過(guò)后可與之鍵聯(lián)的生物素間接標(biāo)記。通過(guò)測(cè)定探針的存在與否,人們可以檢測(cè)到目標(biāo)存在與否。
      “重組體”當(dāng)指一個(gè)核酸探針時(shí),意思是從通常與由細(xì)胞分離出來(lái)的探針相關(guān)的天然蛋白質(zhì)和核酸中游離出來(lái)的低核苷酸,其中自然包含作為其天然基因組的一部分的探針序列。重組體探針包括通過(guò)放大方式制成的那些物質(zhì),這個(gè)放大方式如PCR法和基因的克隆繁殖方法,在后一種方法中,細(xì)菌被重組體探針?biāo)淖儭?br> 術(shù)語(yǔ)“反轉(zhuǎn)錄酶”是指一種酶,它催化脫氧核糖核苷三磷酸鹽的聚合作用以形成與核糖核酸模板互補(bǔ)的引子擴(kuò)展產(chǎn)物。這種酶誘發(fā)在引子3′端進(jìn)行的合成反應(yīng),并繼續(xù)向模板的5′端進(jìn)行直到合成終止。將RNA目標(biāo)序列轉(zhuǎn)化為一個(gè)互補(bǔ)的,復(fù)制-DNA(cDNA)序列的合適的聚合劑的例子是鳥(niǎo)類(lèi)成髓細(xì)胞白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶和Thermus嗜熱菌DNA聚合酶,一種具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。
      術(shù)語(yǔ)“特定序列的低核苷酸”和“SSO”是指具有一個(gè)稱(chēng)為“雜合區(qū)域”的序列的低核苷酸,該序列與待檢測(cè)序列精確地互補(bǔ),一般具有特殊的等位基因或變異體的序列在“特定序列的,嚴(yán)格的雜合狀態(tài)”下,只與那個(gè)嚴(yán)格互補(bǔ)的目標(biāo)序列雜合。放松雜合狀態(tài)的嚴(yán)格性,將允許有序列的不符合;允許的不符合度可通過(guò)適當(dāng)調(diào)整雜合狀態(tài)來(lái)控制。根據(jù)待分析的序列的不同,可以選用一種或多種特定序列的低核苷酸。術(shù)語(yǔ)“探針”及“SSO探針”可相互替換地與SSO一起使用。
      一個(gè)特殊分離體“特有的序列”是該分離體特有的序列,即前面說(shuō)明的其它分離體沒(méi)有的。一個(gè)含有與一種分離體特效的序列互補(bǔ)的子序列的探針在嚴(yán)格條件下(例如在70℃用2×SSC,0.1%的SDS沖洗固體支持物)通常不與其它分離體基因組的相應(yīng)部分雜合。
      特殊分離體特有的抗原或抗原決定簇是該分離體特有的,且是前面說(shuō)明的其它分離體所不具備的。培養(yǎng)用來(lái)抗該抗原或抗原決定簇的免疫球蛋白在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定,如ELISA中,不與前面描述的分離體上的抗原進(jìn)行交叉反應(yīng)。
      術(shù)語(yǔ)“本質(zhì)上等同”表示兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列,其大部分序列是共同的。通常至少為其序列的約90%,優(yōu)選地為其序列的約95%。另外還表示,如果在嚴(yán)格的條件下(參見(jiàn)例如Sambrook等人的,Molecular Cloning-A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1985年),與相同的核苷酸序列雜合的話,該序列是本質(zhì)上等同的。嚴(yán)格的條件是依賴(lài)于序列的,在不同的情況下是不同的。通常,嚴(yán)格的條件被選為低于特定序列的熱焙點(diǎn)(Tm)5℃,并在規(guī)定的離子濃度和pH值下。Tm是指(在規(guī)定的離子深度和pH值下),50%的目標(biāo)序列與完全符合的探針雜合時(shí)的溫度。一般地,嚴(yán)格的條件是指在pH值為7時(shí)鹽濃縮度至少約為0.2摩爾且溫度至少約為60℃情況下的那些條件。
      “子序列”是指包括一個(gè)更長(zhǎng)的核酸序列的一部分的核酸序列。
      術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)區(qū)域”是指待分析的核酸區(qū)域并可以包括多態(tài)區(qū)域。
      術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定聚合酶”是指一種對(duì)熱相對(duì)穩(wěn)定,并能夠催化核苷三磷酸鹽的聚合作用以形成與目標(biāo)序列的一個(gè)核酸鏈互補(bǔ)的引子擴(kuò)展產(chǎn)物的酶。該酶引發(fā)在引子3′端的合成反應(yīng),并繼續(xù)向模板的5′端進(jìn)行直到合成終止。一種純化了的熱穩(wěn)定聚合酶在美國(guó)專(zhuān)利4,889,818中作了更充分的描述。


      圖1提供了新穎的變異的HCV序列C9,四種相關(guān)的變型體及原型日本、美國(guó)HCV分離體的排列表。
      丙肝病毒是一種很小的RNA病毒,它包含一個(gè)長(zhǎng)度為10,000個(gè)核苷酸的單個(gè)的正向的RNA分子。基因組含有一個(gè)據(jù)信可被轉(zhuǎn)化成單個(gè)的,大聚合蛋白并隨后進(jìn)行處理的單個(gè)的長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀架。這個(gè)開(kāi)放閱讀架始于一個(gè)非轉(zhuǎn)化區(qū)域(UTR)之后的核苷酸343(采用原型病毒編號(hào)系統(tǒng))。5′UTR序列是相對(duì)不變的,并且在病毒的復(fù)制和調(diào)節(jié)方面是很重要的。編碼區(qū)域的5′端也是不變的。本發(fā)明的某些引子和探針在HCV基因組的5′端與不變區(qū)域雜合。
      下面將給出本發(fā)明的引子和探針的雜合區(qū)域的低核苷酸序列,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)明白,用于引子雜合區(qū)域的低核苷酸序列也可以用作探針的雜合區(qū)域。引子序列用于探針的適用性依賴(lài)于引子的雜合特性。同樣,用于探針的低核苷酸可用于引子。
      表1所示的低核苷酸是正向的(上端)引子或探針。表是按照與基因組核酸雜合的低核苷酸的3′端的位置順序列出的。與最靠近基因組5′端雜合的低核苷酸被列在前面。
      表1低核苷酸 序列表 序列 位置(末端數(shù))KY65 SEQ ID NO1 5’-CCAAGCTTCACCATAGATCACT16-29KY79 SEQ ID NO2 5’-GGCGACACTCCACCATAGATCACT 6-29KY98 SEQ ID NO3 5’-CCAAGCTTAGATCACTCCCCTGTGAGGAACT 21-44KY96 SEQ ID NO4 5’-CCAAGCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCAT50-74KY80 SEQ ID NO5 5’-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT 56-79KY144 SEQ ID NO6 5’-ACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGT54-79KY83 SEQ ID NO7 5’-CCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCA99-128KY84 SEQ ID NO8 5’-GAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACC 149-175KY85 SEQ ID NO9 5’-ACCCGCTCAATGCCTGGAGAT 194-214KY67 SEQ ID NO10 5’-CGAAGCTTGCTAGCCGAGTAGT236-250KY81 SEQ ID NO11 5’-CCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGT 227-250KY88 SEQ ID NO12 5’-GTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGT 251-275KY86 SEQ ID NO13 5’-GGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGT288-317KY87 SEQ ID NO14 5’-GACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCG 482-505表2列出了作為反向(下端)引子或探針的低核苷酸,采用與表1相同的內(nèi)部排序。
      表2低核苷酸 序列表序列位置(末端數(shù))KY153 SEQ ID NO155’-CCCAACACTACTCGGCTAGCAGTCT 232-256KY149 SEQ ID NO165’-AAGGCCTTTCGCGACCCAACACTACT 245-278KY148 SEQ ID NO175’-CACAAGGCCTTTCGCGACCCAACACT 248-273KY78 SEQ ID NO185’-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT276-299KY145 SEQ ID NO195’-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT 276-301KY95 SEQ ID NO205′-GGGAATTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT 276-298KY100 SEQ ID NO215’-CGAGGTTGCGACCGCTCGGAAGT 483-505KY110 SEQ ID NO225’-AGGTTGCGACCGCTCGGAAGT 483-503KY112 SEQ ID NO235’-AGGTTGCGACCGCTCGGAAGT 483-503KY109 SEQ ID NO245’-AATGCCATAGAGGGGCCAAGG 573-593KY111 SEQ ID NO255’-ATTGCCATAGAGGGGCCAAGG 573-594KY99 SEQ ID NO265’-CAGAATTCATTGCCATAGAGGGGCCAAGGAT 570-592KY68 SEQ ID NO275’-CAGAATTCGCCCTCATTGCCAT 586-599KY82 SEQ ID NO285’-CCCACCCCAAGCCCTCATTGCCAT586-610
      有幾個(gè)低核苷酸具有被修改成包括一個(gè)向著分子的5′端的限定部位的雜合區(qū)域。當(dāng)這些低核苷酸之一被用作引子時(shí),該限定部位被引入到放大后的產(chǎn)物中。初始雜合條件被選擇以使得限定部位周?chē)膲A基對(duì)不符合率能被接受。一個(gè)引子的5′端附近的不符合率比引子3′端附近的不符合率被更好地接受。低核苷酸KY 65(SEQ ID NO.1),KY 98(SEQ ID NO.3),KY 96(SEQ ID NO.4),以及KY 67(SEQ ID NO.10)是上端的引子并含有一個(gè)Hind III部位,低核苷酸KY 95(SEQ ID NO.20),KY 99(SEQ ID NO.26)及KY 68(SEQ ID NO.27)是下端的引子并含有一個(gè)EcoRI部位。將這種限定部位包括到放大的產(chǎn)物中便于放大產(chǎn)物的克隆繁殖。
      本發(fā)明還提供了一種新的HCV分離體。大多數(shù)分離體與HCV的兩個(gè)族系之一有關(guān)。第一個(gè)是在歐州專(zhuān)利318,216,388,232,和398,748中描述的美國(guó)原型族系。第二個(gè)是由上述Kato等人描述的日本原型族系。兩個(gè)族系在假定的非結(jié)構(gòu)基因區(qū)域上存在最高至30%差別,但在5′非轉(zhuǎn)化區(qū)域上表現(xiàn)出大于98%的同種性,和在殼體或核基因的5′部分92%的同種性。
      本發(fā)明的分離體,在此被稱(chēng)為C9,與兩個(gè)族系的相關(guān)度更低。這種新的分離體與同樣的5′非轉(zhuǎn)化區(qū)域具有93%的相似性。與原型或日本族系在核基因區(qū)域的5′部分僅存在約85%的同種性(見(jiàn)下面表3)C9(SEQ ID NO.29)分離體及有關(guān)的同型體,R 45(SEQ IDNO.31),R 43(SEQ ID NO.33),R 110(SEQ ID NO.32),及R 116(SEQ ID NO.30)(見(jiàn)圖1)在從上述Stratagene購(gòu)得的pBS(+)上被克隆繁殖成RI/HindIII限定部位。采用如在美國(guó)專(zhuān)利4,800,159中所述的純化病毒DNA目標(biāo)和PCR克隆繁殖方法對(duì)不同的病毒進(jìn)行克隆繁殖。結(jié)果得到的質(zhì)粒被送到E.ColiStrain DG101(ATCC存放號(hào)為47043)。
      5′端非轉(zhuǎn)化序列的核苷酸序列和原型C9分離體的5′端殼體基因以及四種相關(guān)的分離體被公開(kāi)為C9(SEQ ID NO.29),R 116(SEQ ID NO.30),R 45(SEQ ID NO.31),R 110(SEQ ID NO.32),以及R 43(SEQ ID NO.33)并表示于下。所表示的序列不包括用來(lái)便于克隆繁殖病毒序列的引子KY 96(SEQ ID NO.4)和KY 99(SEQ ID NO.26)。C9-SEQ ID NO.291 ACTGTCTTCA CGCAGAAAGC GTCTAGCCAT GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT51 ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA GCCATAGTGG TCTGCGGAAC101 CGGTGAGTAC ACCGGAATTA CCGGAAAGAC TGGGTCCTTT CTTGGATAAA151 CCCACTCTGT GTCCGGTCAT TTGGGCGTGC CCCCGCAAGA CTGCTAGCCG201 AGTAGCGTTG GGTTGCGAAA GGCCTTGTGG TACTGCCTGA TAGGGTGCTT251 GCGAGTGCCC CGGGAGGTCT CGTAGACCGT GCATCATGAG CACAAATCCT301 AAACCTCAAA GAAAAACCAA AAGAAACACA AACCGCCGCC CACAGGACGT351 TAAGTTTCCG GGTGGCGGCC AGATCGTTGG CGGAGTTTAC TTGCTGCCGC401 GCAGGGGCCC CAGGTTGGGT GTGCGCGCGA CAAGAAAGAC TTCCGAGCGA451 TCCCAGCCGC GTGGGAGACG CCAGCCCATC CCAAAAGATC GGCGCTCCAC501 CGGCAAGTCC TGGGGAAAGC CAGGATR116-SEQ ID NO.301 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC GCCGAATTAC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATAAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCGAG TAGCGTTGGG TTGCGAAAGG CCTTGTGGTA
      201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCCG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAGATCCTAA ACCTCAAAGA AAAACCAAAA GAAATACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTCA AGTTCCCGGG TGGCGGCCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GCTGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCACAACA401 AGGAAGACTT CCGAGCGATC CCAGCCGCGT GGAAGACGCC AGCCCATCCC451 GAAAGATCGG CGCTCCACCG GTAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGATR45-SEQ ID NO.311 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC GCCGAATTGC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATAAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCGAG TAGCGTTGGG TTGCGAAAGG CCTTGTGGTA201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCAG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAAATCCTAA ACCCCAAAGA AAAACCAAAA GAAACACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTTA AGTTCCCGGG TGGCGGCCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GATGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCGCGACG401 AGGAAGACTT CCGAGCGATC CCAGCCGCGT GGGAGACGCC AGCCCATCCC451 GAAAGATCGG CGTTCCACCG GCAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGATR110-SEQ ID NO.321 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC GCCGAATTGC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATTAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCTAG TAGCGTTGGG TTGCGAACGG CCTTGTGGTA201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCCG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAAATCCTAA ACCTCAAAGA AAAACCAAAA GAAACACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTCA AGTTCCCGGG AGGCGGTCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GCTGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCGCGACA401 AGGAAGACTT CCGAGCGATC CCAGCCGCGT GGGAGACGCC AGCCCATCCC451 GAAAGATCGG CGCTCCACCG GCAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGATR43-SEQ ID NO.331 GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT ACAGCCTCCA GGCCCCCCCC TCCCGGGAGA51 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAG ACCGAATTAC CGGAAAGACT101 GGGTCCTTTC TTGGATAAAC CCACTCTATG TCCGGTCATT TGGGCGTCCC151 CCGCAAGACT GCTAGCCTAG TAGCGTTGGG TTGCGAACGG CCTTGTGGTA201 CTGCCTGATA GGGTGCTTGC GAGTGCCCCG GGAGGTCTCG TAGACCGTGC251 ATCATGAGCA CAAATCCTAA ACCTCAAAGA AAAACCAAAA GAAACACAAA301 CCGCCGCCCA CAGGACGTCA AGTTCCCGGG TGGCGGCCAG ATCGTTGGCG351 GAGTTTACTT GCTGCCGCGC AGGGGCCCCA GGTTGGGTGT GCGCGCGACA401 AGGAAGACTT CCGAACGGTC CCAGCCGCGT GGGAGGCGCC AGCCCATCCC451 AAAAGATCGG CGCTCCACCG GCAAGTCCTG GGGAAAGCCA GGAT含病毒序列的克隆體以下列方式被存放在American Type CultureCollection,Baltimore,Maryland分離體SEQ ID NO.質(zhì)粒標(biāo)號(hào)ATCC存放號(hào) 存放日期C929pHCV-C975265 1992年7月2日R110 30pHCV-R110 75266 1992年7月2日質(zhì)粒pHCV-C9含有一種新的變異的C9序列。四種與C9序列相關(guān)的變異體表示于圖1中。已知分離體的序列信息來(lái)源如下HCV-J1,HCV-J4(1990年的Japan J.Exp.Med.6(3)期第167-177頁(yè)Okamoto等人的文章);HCV-J(1990年的Mol.Biol.Med.7期第495-501頁(yè)Kato等人的文章);HCV-BK(1991年的J.Virol.65期第1105-1113頁(yè)Takamizawa等人的文章);以及HCV-1 US-PT(1991年的Proc.Natl.Acad.Sci.USA88期第1711-1715頁(yè)Han等人的文章)。編號(hào)是根據(jù)1990年的Proc.Natl.Acad,Sci USA87期第9524-9528頁(yè)Kato等人的文章。
      表3C9分離體與原型美國(guó)(PT-HCV)和日本分離體(J-HCV)的核苷酸和氨基酸序列同種性的確定。<
      >因此,本發(fā)明提供了專(zhuān)門(mén)測(cè)定C9分離體以及區(qū)分該分離體與其它肝炎分離體的物質(zhì)和方法。在一些實(shí)施例中,本發(fā)明的方法是基于采用或不采用PCR來(lái)放大目標(biāo)序列的核酸的雜合。在另一些實(shí)施例中,本發(fā)明的方法采用了專(zhuān)門(mén)用于C9分離體的免疫球蛋白。
      專(zhuān)用于C9的引子及探針的低核苷酸序列表示于下面的表4中。
      表4探針SEQ ID NO.37MY 160 5′-TGTCCGGTCATTTGGGCG-3′ (nt216-233)SEQ ID NO.34(1)5′-TTGCCGGAAAGACTGGGTCCTTTC-3′(nt174-197)SEQ ID NO.35(2)5′-CAAAAGAAACACAAACCGCCGCCC-3′(nt374-397)SEQ ID NO.36(3)5′-CCAGCCCATCCCGAAAGATCGGCG-3′(nt527-550)正向引子SEQ ID NO.38(1)5′-AAACCCACTCTATGTCCGGTC-3′ (nt204-224)SEQ ID NO.39(2)5′-GTACGCCGGAATTGCCGGAAA-3′ (nt163-183)SEQ ID NO.40(3)5′-CCTCAAAGAAAAACCAAAAGA-3′ (nt360-380)反向引子SEQ ID NO.41(4)5′-TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG-3′ (nt509-529)SEQ ID NO.42(5)5′-CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT-3′ (nt555-575)用于識(shí)別核苷酸的編號(hào)系統(tǒng)取自上述1990年的Proc.Natl.Acad.Sci.上Kato等人的文章。
      一種低核苷酸KY 150(SEQ ID NO.43)可用于檢測(cè)C9分離體及前面已知的HCV原型分離體。該低核苷酸具有以下序列5′-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT-3′.
      對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是表4中所示的任何正向/反向的引子對(duì)都適用于專(zhuān)門(mén)放大C9分離體及相關(guān)的同型體。還顯而易見(jiàn)的是選擇一個(gè)適于雜合體為表4中所給的核苷酸位置的導(dǎo)引的放大了的核酸子序列的C9-專(zhuān)用的引子。
      在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中,本發(fā)明的引子與目標(biāo)核酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)放大一起使用。由于HCV是一種RNA病毒,在放大過(guò)程的第一步是待放大區(qū)域的DNA復(fù)制體(cDNA)的合成。反轉(zhuǎn)錄可以作為一個(gè)獨(dú)立的步驟進(jìn)行,或如下面所述,在一個(gè)同型的反轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)(PT-PCR),即用于放大RNA的聚合酶 鏈反應(yīng)的一種變型中進(jìn)行。
      盡管PCR方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,683,195;4,683,202及4,965,188號(hào)),但是為了明確起見(jiàn),并且為了那些對(duì)PCR方法不熟悉的人充分理解本發(fā)明,下面給出了一些PCR的一般性知識(shí)。
      為了采用PCR方法放大樣品中的目標(biāo)核酸序列,該序列對(duì)于放大系統(tǒng)的組成來(lái)說(shuō)必須是可以得到的。通常這種可得性是通過(guò)將核酸從樣品中分離出來(lái)而保證的。從生物樣品中提取核糖核酸的多種技術(shù)已在本領(lǐng)域內(nèi)已知。例如,參見(jiàn)1989年的PCR Technology(Erliched.,Stockton Press,New York)中Rotbart等人的文章及1987年的Biochemistry 26期第1617-1625頁(yè)上Han等人的文章中所描述的那些技術(shù)。另外,如果樣品相當(dāng)容易分解,則在采用PCR技術(shù)進(jìn)行放大之前,不需要對(duì)核酸進(jìn)行純化,即,如果樣品中包括細(xì)胞,特別是外周血液淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞,則細(xì)胞內(nèi)成分的溶胞和分散只能通過(guò)讓細(xì)胞懸浮在低滲的緩沖液中來(lái)完成。
      每個(gè)PCR循環(huán)的第一個(gè)步驟包括核酸復(fù)合體的分離。當(dāng)然,如果目標(biāo)核酸是單股的,即單股RNA,則在第一個(gè)特循環(huán)中不需要初始分離步驟。一旦兩股被分開(kāi),則PCR的下一步包括將分離開(kāi)的股與位于目標(biāo)序列兩側(cè)的引子雜合,則引子被擴(kuò)展成與目標(biāo)股互補(bǔ)的復(fù)制體。為成功進(jìn)行PCR放大,引子被設(shè)計(jì)以便每個(gè)引子沿著復(fù)式序列雜合的位置就是使得一個(gè)引子合成得到的擴(kuò)展產(chǎn)物,當(dāng)從模板(補(bǔ)體)上分離出來(lái)時(shí),起到另一個(gè)引子擴(kuò)展的模板作用。變性、雜合及擴(kuò)展循環(huán)可按需要重復(fù)多次以獲得所希望數(shù)量的放大的核酸。
      在PCR方法的優(yōu)選實(shí)施例中,股分離是通過(guò)將反應(yīng)加熱到足夠高的溫度并持續(xù)足夠長(zhǎng)時(shí)間以引起復(fù)合體的變性但不引起聚合酶的不可逆變性來(lái)獲得的(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,965,188號(hào))。典型的熱變性包括約80℃至105℃的溫度持續(xù)幾秒至幾分鐘的時(shí)間。然而,股分離可采用任何包括物理的,化學(xué)的或酶的方式進(jìn)行??梢圆捎寐菪福缁蛞环N顯示出螺旋活性的酶來(lái)誘發(fā)股分離。例如,在存在ATP的情況下,RecA酶就具有螺旋活性。適于采用螺旋酶進(jìn)行股分離的反應(yīng)條件是本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的。(參見(jiàn)1978年的CSH-Quantative Biology 43期第63-67頁(yè)上Kuhn Hoffman-Berling的文章;和1982年的Ann.Rev.Genetics 16期第405-436頁(yè)上Radding的文章)。
      在包括適當(dāng)?shù)柠}、金屬陽(yáng)離子及pH緩沖液系統(tǒng)的反應(yīng)介質(zhì)中存在適量的四種脫氧核苷三磷酸鹽(一般為dATP,dGTP,dCTP,以及dTTP),的情況下,PCR中的引子依賴(lài)于模板的擴(kuò)展被一種聚合劑催化。適當(dāng)?shù)木酆蟿┦且阎脕?lái)催化依賴(lài)模板的DNA合成的酶。由于丙肝是一種RNA病毒,因此,作為引子擴(kuò)展的初始模板是RNA。適合于由RNA模板合成互補(bǔ)的復(fù)制-DNA(cDNA)序列的聚合劑是反轉(zhuǎn)錄酶(RT),如鳥(niǎo)成髓細(xì)胞性白血病病毒RT,Moloney(莫洛尼)鼠白血病病毒RT,或Thermus嗜熱菌(Tth)DNA聚合酶,一種由Perkin Elmer銷(xiāo)售的具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。一般在初始反轉(zhuǎn)錄步驟留下DNA鏈作為放大模板之后的第一個(gè)變性步驟中,基因RNA/cDNA復(fù)式模板被加熱變性。與一個(gè)DNA模板一起使用的適當(dāng)?shù)木酆厦赴?,例如,E.coli DNA聚合酶I或其Klenow片段,T4DNA聚合酶,Tth聚合酶及Tag聚合酶,從一種由Hoffmann-LaRoche研制和生產(chǎn)的,并由Perkin Elmer銷(xiāo)售的Thermus水生動(dòng)植物中分離出來(lái)的一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。后一種酶被廣泛用于核酸的放大和排序。采用Taq聚合酶的反應(yīng)條件在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且在上述1989年P(guān)CR Technology上Gelfand的文章中作了描述。
      當(dāng)RNA被放大時(shí),進(jìn)行一個(gè)初始反轉(zhuǎn)錄(RT)步驟以產(chǎn)生RNA的一個(gè)DNA復(fù)制體(cDNA)。1991年7月11日出版的國(guó)際專(zhuān)利第WO91/09944號(hào)中描述了采用一種在PCR放大中也起作用的熱穩(wěn)定聚合酶進(jìn)行高溫反轉(zhuǎn)錄。高溫RT得到了更強(qiáng)的引子特異性并改進(jìn)了效率。在“同種的RT-PCR”中,相同的引子和聚合酶足以滿(mǎn)足反轉(zhuǎn)錄和PCR放大步驟兩者的要求,并且優(yōu)選反應(yīng)條件以使得不需改變?cè)噭┘纯砂l(fā)生兩種反應(yīng)。Thermus嗜熱菌DNA聚合酶,一種可以起到反轉(zhuǎn)錄酶作用的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶被用于所有的引子擴(kuò)展步驟中,而無(wú)論模板如何。兩個(gè)過(guò)程無(wú)需打開(kāi)試管更換或加入試劑即可完成;只有溫度模式在第一個(gè)循環(huán)(RNA模板)和其余的放大循環(huán)(DNA模板)之間要進(jìn)行調(diào)整。
      預(yù)計(jì)HCV基因組的5′終端具有重要的二級(jí)結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可能通過(guò)干擾與引子的雜合,利用反轉(zhuǎn)錄酶,如Moloney鼠白血病病毒RT,來(lái)阻止反轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。不幸的是,提高反應(yīng)溫度使二級(jí)結(jié)構(gòu)變性的方法同時(shí)也使得大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶失去活性。而利用重組的Thermus嗜熱菌(rTth)DNA聚合酶的反轉(zhuǎn)錄活性則允許cDNA合成在高溫下進(jìn)行而不會(huì)使酶滅活。本發(fā)明的引子在這種高反轉(zhuǎn)錄溫度下保持與RNA模板雜合。
      PCR方法可以一種在每個(gè)步驟之后加入新的試劑的分段方式進(jìn)行,或以一種所有試劑都同時(shí)加入的方式,或以一種在給定數(shù)目的步驟之后加入新鮮的或不同試劑的部分分段方式進(jìn)行。例如,如果通過(guò)加熱誘發(fā)股分離,且聚合酶是對(duì)熱敏感的,則必須在每一個(gè)股分離循環(huán)之后加入聚合酶。但如果,例如,采用螺旋酶來(lái)變性,或如果采用一種熱穩(wěn)定聚合酶來(lái)擴(kuò)展,則所有試劑都可以在一開(kāi)始時(shí)加入,或可替換地,如果試劑的克分子比對(duì)于反應(yīng)很重要的話,則由于合成反應(yīng)的消耗,需周期性地補(bǔ)充試劑。
      對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的是,PCR過(guò)程極普遍的是采用熱穩(wěn)定酶以自動(dòng)操作過(guò)程的方式進(jìn)行的。在該過(guò)程中,反應(yīng)混合物的溫度通過(guò)變性區(qū)域,引子緩冷區(qū)域,及擴(kuò)展反應(yīng)區(qū)域進(jìn)行循環(huán)?;蛘呔徖浜蛿U(kuò)展溫度可以是相同的。在實(shí)例中所述RT-PCR采用了這種兩步溫度循環(huán)。專(zhuān)門(mén)適于與熱穩(wěn)定酶一起使用的設(shè)備可以買(mǎi)到。
      對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)還應(yīng)知道,由前述反應(yīng)和非特定的放大作用而產(chǎn)生的放大后的核酸導(dǎo)致的PCR的污染問(wèn)題。一個(gè)減少這些問(wèn)題的方法就是允許由前述反應(yīng)產(chǎn)生的任何放大后的DNA的酶的降解并減少非特定放大。PCR放大是在替代dTTP的dUTP存在的情況下進(jìn)行的。所產(chǎn)生的雙股的含尿嘧啶的產(chǎn)物將被尿嘧啶N-糖基酶(UNG)降解,而正常的含胸腺嘧啶的DNA不會(huì)被UNG降解。在放大作用開(kāi)始之前向放大反應(yīng)混合物中加入U(xiǎn)NG,降解了所有可能作為目標(biāo)的含尿嘧啶的DNA。由于前面反應(yīng)中的放大了的產(chǎn)物是含尿嘧啶DNA的唯一來(lái)源,則這一方法有效地對(duì)反應(yīng)混合物作了消毒,消除了來(lái)自前面反應(yīng)的污染問(wèn)題(攜帶)。UNG本身由于加熱而暫時(shí)不起作用,這樣,在放大過(guò)程中變性步驟也用作使UNG失活。因此,盡管包含尿嘧啶,新的放大產(chǎn)物是在有效的,無(wú)UNG環(huán)境下形成的,并不會(huì)被降解。
      本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例使用了一種包含一個(gè)消毒步驟的同種RT/PCR方法。這種一個(gè)試管不添加反應(yīng)起到了消毒RT/PCR反應(yīng),防止攜帶污染的作用并提供了放大了的,可從含RNA目標(biāo)的樣品中檢測(cè)到的PCR產(chǎn)物。該方法在實(shí)施例6中舉例說(shuō)明。
      雖然優(yōu)選的實(shí)施例包括有RT-PCR放大作用,但樣品中目標(biāo)序列的放大可采用任何已知的方法來(lái)完成,如連接酶鏈反應(yīng)(LCR),轉(zhuǎn)錄放大,和自持序列復(fù)制,其中每一種方法都提供了充分的放大以使得目標(biāo)序列可通過(guò)核酸與一個(gè)SSO探針的雜合被檢測(cè)到?;蛘撸軌?qū)⑻结樂(lè)糯蟮娇蓹z測(cè)水平的多種方法都可被采用,例如,Qβ-復(fù)制酶放大方法。術(shù)語(yǔ)“探針”包含了用于上述過(guò)程中的特定序列的低核苷酸;例如,用于LCR的兩個(gè)或多個(gè)低核苷酸就是為本發(fā)明目的而采用的“探針”,盡管某些LCR實(shí)施例僅需用探針的連接來(lái)表示等位基因的存在。
      特定序列探針的雜合是成功地完成本發(fā)明的一個(gè)重要步驟。本發(fā)明的特定序列的低核苷酸探針專(zhuān)門(mén)與HCV基因組的特定片段雜合,并具有與來(lái)自其它生物體的序列的不穩(wěn)定失配。在充分嚴(yán)格的雜合條件下,探針只是專(zhuān)門(mén)與精確互補(bǔ)的序列雜合。雜合條件的嚴(yán)格性可被放松,從而允許不同數(shù)量的序列不符合。放大后的產(chǎn)物的檢測(cè)使用了這種特定序列的雜合以確保檢測(cè)到唯一準(zhǔn)確放大的目標(biāo),因此,減少了由于來(lái)自相關(guān)生物體的同種序列的存在而引起的假陽(yáng)性的機(jī)會(huì)。
      檢測(cè)在SSO探針和核酸序列之間形成的雜合體的測(cè)定方法是需要的,因?yàn)槌s合區(qū)域以外探針還具有其它特征。例如,如果探針首先被固定,如以下面所述的“反”點(diǎn)斑式固定,則探針還包含較長(zhǎng)范圍的,能夠采用擴(kuò)散法,一種在國(guó)際專(zhuān)利第89/11548號(hào)中更詳細(xì)描述的技術(shù),被固定在一個(gè)尼龍支持物上的多-dT。在點(diǎn)斑格式中,固定的目標(biāo)與含有用于檢測(cè)過(guò)程的化合物的探針雜合,如下所述。
      本發(fā)明的探針可以利用上述合成低核苷酸的技術(shù)合成和標(biāo)記。通過(guò)用32P-ATP和激酶培養(yǎng)探針的方法將探針在5′端用32P標(biāo)記。一種合適SSO探針的非放射性標(biāo)記是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)。制備和檢測(cè)含有該標(biāo)記的探針的方法在下面的實(shí)施例中以及美國(guó)專(zhuān)利4,914,210和4,962,029中作了描述。關(guān)于這種被標(biāo)記探針的使用方面的其它信息參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,789,630號(hào);1988年度N.Eng.J.Med.319其第537-541頁(yè)Saiki等人的文章;以及1988年的Bio/Technology 6期第943-947頁(yè)上Bugawan等人的文章。有用的色原包括紅的褪色染料和3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
      通過(guò)測(cè)定SSO探針是否與存在于樣品中的病毒序列鍵聯(lián),本發(fā)明的探針可被用于確定樣品中是否存在病毒序列。為本發(fā)明目的而檢測(cè)在SSO探針和樣品中的核酸序列之間形成的雜合體的檢測(cè)方法已為本領(lǐng)域公知。例如,可采用點(diǎn)斑方式來(lái)完成檢測(cè),如在實(shí)施例中所描述的。在點(diǎn)斑方式中,未標(biāo)記的放大了的樣品被鍵聯(lián)在一個(gè)固體支持物上,如一種薄膜上,在適當(dāng)?shù)碾s合條件下,用標(biāo)記的探針對(duì)膜進(jìn)行培養(yǎng),通過(guò)沖洗除去未雜合探針,并用過(guò)濾器監(jiān)測(cè)鍵聯(lián)的探針的存在。當(dāng)用一個(gè)探針?lè)治龆喾N樣品時(shí),點(diǎn)斑方式是十分有用的。多種樣品被固定在同一膜的分散位置上,并通過(guò)將膜滲入探針溶液使它們同時(shí)雜合。
      當(dāng)使用多種不同的探針時(shí),另一種十分有用的方法是“反”點(diǎn)斑方式,其中放大了的序列含有標(biāo)記,且探針被鍵聯(lián)在固體支持物上。如果本發(fā)明的試驗(yàn)被用作同步進(jìn)行的一組試驗(yàn)之一的話,這種方式將是有用的。在該方式中,未標(biāo)記的SSO探針被鍵聯(lián)在膜上并在適當(dāng)嚴(yán)格的雜合條件下暴露給標(biāo)記的樣品。然后通過(guò)在適當(dāng)嚴(yán)格條件下沖洗除去未雜合的標(biāo)記樣品,過(guò)濾器則監(jiān)測(cè)鍵聯(lián)序列的存在。
      正向和反向的點(diǎn)斑測(cè)定方法都可以在微量滴定盤(pán)中方便地進(jìn)行。例如,探針可與粘接在微量滴定盤(pán)中的牛血清白蛋白(BSA)相連合,從而固定探針。
      在另一種適合的測(cè)定系統(tǒng)中,在PCR放大過(guò)程中加入標(biāo)記的探針。在每一個(gè)合成步驟中與目標(biāo)DNA雜合的任何SSO探針都被聚合酶如Taq聚合酯,5′至3′端的核酸外切酶活性所降解,然后檢測(cè)由探針得到的降解產(chǎn)物。因此,分解產(chǎn)物的存在表示在SSO探針和目標(biāo)DNA之間產(chǎn)生了雜合。
      上面給出的核苷酸序列是本發(fā)明的一個(gè)重要方面。盡管只表示出序列的一股,但對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)應(yīng)認(rèn)識(shí)到序列的另一股可從上述信息中推斷出來(lái)。這些信息能夠構(gòu)成本發(fā)明的其它探針和引子。
      本發(fā)明還涉及試劑盒,包含對(duì)于實(shí)施本發(fā)明方法有用的組分的多容器裝置。一種有用的試劑盒含有用來(lái)檢測(cè)丙肝病毒核酸的SSO探針。在某些情況下,SSO探針可被固定在一個(gè)適當(dāng)?shù)闹С帜ど稀T噭┖羞€可包含用于RT-PCR的引子,如在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中有用的引子。試劑盒其它優(yōu)選組分包括,例如,反轉(zhuǎn)錄酶或聚合酶,核苷三磷酸鹽的酶解物,用于標(biāo)記的裝置(例如,如果標(biāo)記物是生物素的話,抗生物素蛋白-酶結(jié)合物,酶解物及色原),及用于反轉(zhuǎn)錄,PCR或雜合反應(yīng)的適當(dāng)?shù)木彌_劑。除上述組分外,試劑盒還可包含實(shí)施本發(fā)明方法的教導(dǎo)。
      除PCR和核酸探針的使用外,本發(fā)明還提供了用來(lái)培養(yǎng)對(duì)特殊的HCV分離體特效的免疫球蛋白的方法。該方法的完成通常是首先表達(dá)病毒核酸序列,然后用被表達(dá)的蛋白質(zhì)培養(yǎng)對(duì)所需分離體特效的抗體。
      肝炎分離體的核苷酸序列可用于各種重組表達(dá)系統(tǒng)。在該方式中,所需基因,如殼體基因可被表達(dá)。原核或真核生物宿主中的核苷酸序列的重組表達(dá)在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(見(jiàn)上述Sambrook等人文章)。被表達(dá)的蛋白質(zhì)可被用于培養(yǎng)對(duì)分離體特效的免疫球蛋白。然后將免疫球蛋白用于檢測(cè)病毒存在的測(cè)定方法中,如下面所述。蛋白質(zhì)也可用于檢測(cè)感染病毒的患者體內(nèi)抗體的存在。
      所希望的病毒序列在采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化為用來(lái)表達(dá)的哺乳動(dòng)物、酵母菌或昆蟲(chóng)細(xì)胞系之前方便地插入到一種媒介物中。原核生物被優(yōu)選用于中間的克隆繁殖步驟。
      為表達(dá)病毒序列而用于將轉(zhuǎn)化的基因物質(zhì)引入到宿主細(xì)胞中的特殊方法不是要求特別嚴(yán)格的??梢圆捎檬熘模瑢⑼鈦?lái)核苷酸序列引入到宿主細(xì)胞中的任何方法。這些方法包括采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染,聚凝胺(Polybrene),原生質(zhì)體融合,electroporation,脂質(zhì)體,微量注射,質(zhì)粒媒介物,病毒媒介物,以及任何其它的將克隆繁殖的基因DNA,cDNA,合成DNA或其它外來(lái)基因物質(zhì)引入到宿主細(xì)胞的熟知的方法(見(jiàn)上述Sambrook等人的文章)。唯一必要的是所采用的特殊基因工程方法能夠成功地將至少一個(gè)能夠表達(dá)所需的病毒蛋白質(zhì)的基因引入到宿主細(xì)胞中。
      用來(lái)將基因信息傳輸?shù)郊?xì)胞中的特殊的媒介物也不是特別嚴(yán)格的??梢圆捎萌魏伪磉_(dá)真核細(xì)胞中重組蛋白質(zhì)的適宜的媒介物。
      表達(dá)媒介物包含一個(gè)真核生物轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒,其中含有表達(dá)真核細(xì)胞中的病毒核酸序列所需的全部要素。一個(gè)典型的表達(dá)盒包含一個(gè)可操縱地與DNA序列相連對(duì)病毒蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的啟動(dòng)基因及轉(zhuǎn)錄體有效地進(jìn)行多腺苷酸化所需的信息。
      媒介物通常包括可選擇的標(biāo)記,如鈉,鉀ATP酶,胸苷激酶,氨基苷磷酸轉(zhuǎn)移酶,潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶,黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌哈磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,CAD(氨基甲酰磷酸合成酶,天冬氨酸鹽氨甲?;D(zhuǎn)移酶和二氫乳清酶),腺嘌呤脫氨酶,DHFR,及天冬酰胺合成酶和烏本苷選擇。
      本發(fā)明的表達(dá)媒介物一般含有便于細(xì)菌中的媒介物克隆繁殖的原核生物序列和一種或多種僅在真核生物細(xì)胞,如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被表達(dá)的真核生物轉(zhuǎn)錄單元。媒介物可包含或不包含一個(gè)真核生物復(fù)制子。如果存在一個(gè)真核生物復(fù)制子,則媒介物通過(guò)適當(dāng)?shù)目蛇x擇標(biāo)記在真核生物細(xì)胞中是可放大的。如果媒介物不包括真核生物復(fù)制子,則不可能產(chǎn)生附著放大。取而代之的是,轉(zhuǎn)染的DNA并入轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因中,而啟動(dòng)基因引導(dǎo)所需基因的表達(dá)。表達(dá)媒介物一般是由取自不同的,充分特性化的病毒或哺乳動(dòng)物基因的成分構(gòu)成的。對(duì)于在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中克隆繁殖的基因的表達(dá)的一般性討論參見(jiàn)上述Sambrook等人Ch.16。
      表達(dá)之后,媒介物被引入到細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在有利于病毒蛋白表達(dá)的條件下被培養(yǎng),并利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將蛋白從培養(yǎng)物中復(fù)原。可以采用提純蛋白的多種標(biāo)準(zhǔn)方法,例如,硫酸銨沉淀反應(yīng),凝膠電泳,離子交換色譜法,大小排斥色譜法或親合色譜法??偟膮⒁?jiàn)ProteinPurification,Springer-Verlag,N.Y.(1982)上Scopes,R.的文章。
      除采用被所希望的病毒基因組編碼的蛋白質(zhì)外,還可以采用復(fù)制對(duì)病毒特效的抗原決定簇的肽來(lái)培養(yǎng)專(zhuān)門(mén)對(duì)于該病毒的抗體。該技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的,并在,例如,Geysen等人Multipin Peptide Synthesis-A Review,Coselco Mimotypes,PTY Ltd。中作了描述。
      上面討論的多肽則被用于采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培養(yǎng)抗體當(dāng)中。免疫球蛋白可用于多種用途。例如,它們可被用來(lái)測(cè)定在一種生物樣品中病毒的存在或者提純病毒抗原,例如采用親合色譜法。它們也可被用來(lái)使相應(yīng)的蛋白無(wú)效,包括抑制全部病毒的傳染性。因此對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)可獲得的大量有關(guān)生產(chǎn)和制造各種免疫球蛋白分子的技術(shù)可以很容易地被用于產(chǎn)生對(duì)于特殊分離體的診斷和檢測(cè)有用的分子。
      如在此使用的術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”,是指由一種或多種實(shí)質(zhì)上被免疫球蛋白基因編碼的一個(gè)或多個(gè)多肽構(gòu)成的蛋白質(zhì)。已知的免疫球蛋白基因包括K,λ,α,γ,δ,ε和μ不變區(qū)域基因,還有無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)域基因。免疫球蛋白可以以除抗體之外的任何形式存在,包括例如Fv,F(xiàn)ab,和F(ab)2,還有以單鏈形式存在(例如,1988年的Proc.Natl.Acad.Sci.USA85期第5879-5883頁(yè)上Huston等人的文章;1988年的Science 242期第423-426頁(yè)上Bird等人的文章;和1986年Nature 323期第15-16頁(yè)上Hunkapiller和Hood的文章)。對(duì)于免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的一般性評(píng)述參見(jiàn)Fundamental Immunology,2d Ed;W.E.Pauled.,Ravens Press,U.Y.,(1989)。
      可以采用各種方式生成使等位基因?qū)iT(mén)與所希望的分離體鍵聯(lián)的抗體。非人類(lèi)單克隆抗體,例如鼠的,復(fù)齒目的,馬的等抗體的生成是熟知的并可通過(guò)例如用含有病毒或其中的一個(gè)片段的制劑使動(dòng)物免疫的方式完成。由免疫的動(dòng)物體獲得的抗體-生成細(xì)胞被采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使其不滅并進(jìn)行篩選。關(guān)于單克隆抗體生成的一般性方法的討論參見(jiàn)Havlow和Lane的Antibodi es,A Laboratory Manual ColdSpring Harbor Publications,N.Y,(1988)。
      在某些情況下,希望采用重組DNA技術(shù)將非人類(lèi)抗體的抗原鍵聯(lián)區(qū)域,例如F(ab′)2或多可變區(qū)域,轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟?lèi)不變區(qū)域(Fc)或構(gòu)架組織區(qū)域以便從本質(zhì)上生成人類(lèi)分子。這種方法一般為本領(lǐng)域內(nèi)已知并在例如,美國(guó)專(zhuān)利4,816,397,歐洲專(zhuān)利173,494和239,400中作了描述。另外,人們可以采用根據(jù)1986年Science 246期第1275-1281頁(yè)上Huse等人概括的總的原始記錄中的從人類(lèi)B細(xì)胞中篩選DNA集合的方式分離對(duì)于專(zhuān)門(mén)與病毒鍵聯(lián)的人類(lèi)單克隆抗體或其中一部分進(jìn)行編碼的DNA序列,然后克隆繁殖并放大對(duì)具有所希望的特異性的抗體(或鍵聯(lián)片段)編碼的序列。
      然后如上述方式產(chǎn)生的免疫球蛋白被用在許多確定肝炎分離體存在的診斷方法中。例如,對(duì)C9病毒特效的標(biāo)記了的免疫球蛋白可被用于包括讓免疫球蛋白與預(yù)計(jì)含有該病毒的樣品接觸并檢測(cè)復(fù)合體是否形成的測(cè)定方法中。標(biāo)記物可以按照本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法直接或間接地與免疫球蛋白結(jié)合。如上面討論的在標(biāo)記的低核苷酸上下文中,可以采用很多種標(biāo)記物。成分可采用幾種方法中的任何一種被標(biāo)記。一種普遍的檢測(cè)方法是采用3H,125I,35S,14C,或32P標(biāo)記的復(fù)合物或類(lèi)似物的放射自顯影照片。放射性同位素體的選擇依賴(lài)于預(yù)計(jì)研究中便于合成的選擇,變化的穩(wěn)定性以及所選擇的同位素的半壽命。非放射性標(biāo)記物包括與標(biāo)記的抗體鍵聯(lián)的配體,熒光劑,化學(xué)發(fā)光劑和酶。標(biāo)記物的選擇依賴(lài)于所需靈敏性,與復(fù)合物結(jié)合的便利性,穩(wěn)定性要求和可得到的測(cè)試設(shè)備。
      非放射性標(biāo)記物經(jīng)常是采用間接方式連接的。一般地,一個(gè)配體分子(例如生物素)與分子共價(jià)地鍵聯(lián),然后配體與一個(gè)抗配體分子(例如鏈霉抗生物素蛋白)鍵聯(lián),該抗配體分子既是固有地可檢測(cè)的,也是被共價(jià)地鍵聯(lián)在一信號(hào)系統(tǒng),如可檢測(cè)到的酶,熒光復(fù)合物,或化學(xué)發(fā)光復(fù)合物上。配體和抗配體可以在很大范圍內(nèi)變化。由于配體具有天然的抗配體,例如生物索,甲狀腺素,皮質(zhì)醇,則全可被用于與標(biāo)記的天然產(chǎn)生的抗配體的結(jié)合?;蛘?,任何半抗原或抗原復(fù)合物均可被用于與一種抗體結(jié)合。
      分子還可被直接用于信號(hào)發(fā)生復(fù)合物,例如通過(guò)與一種酶或熒光基團(tuán)結(jié)合。具有標(biāo)記物意義的酶基本上是水解酶,特別是磷酸酶,酯酶及糖苷酶,或氧化還原酶,特別是過(guò)氧化物酶。熒光復(fù)合物包括熒光素及其衍生物,若丹明及其衍生物,丹酰,傘形酮等?;瘜W(xué)發(fā)光復(fù)合物包括蟲(chóng)熒光素和2,3-二氫基二氮雜萘二酮,例如,盧米諾。對(duì)于可被采用的各種信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的評(píng)述,見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,391,904號(hào)。
      為了檢測(cè)本發(fā)明的復(fù)合物,一般將混合物與能夠鍵聯(lián)免疫球蛋白Fc區(qū)域的蛋白質(zhì)接觸,如第二抗體,蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G。蛋白質(zhì)最好被固定在一個(gè)固體表面上,且該固體表面被沖洗以除去對(duì)所需病毒特效的非鍵聯(lián)免疫球蛋白。將生物分子固定在固體表面上的許多種方法已為本領(lǐng)域已知。例如,固體表面可以是一種膜(例如,硝化纖維素),一種微滴定盤(pán)(例如PVC或聚苯乙烯)或一個(gè)顆粒。所希望的成分可以共價(jià)鍵聯(lián)或非共價(jià)地通過(guò)非特異性結(jié)合進(jìn)行連接。利用適合于所使用的特殊標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)則可檢測(cè)到標(biāo)記物。
      上面討論的重組表達(dá)的蛋白質(zhì)或病毒溶解產(chǎn)物也可被用在診斷過(guò)程中。這些過(guò)程一般包括讓?xiě)岩珊锌贵w的生物樣品(如血清)與病毒接觸,并檢測(cè)免疫學(xué)反應(yīng)。反應(yīng)的檢測(cè)最好采用上述標(biāo)記的蛋白質(zhì)。適合于這個(gè)過(guò)程的方法在美國(guó)專(zhuān)利第5,055,391號(hào)中作了詳細(xì)描述。
      給出下面列舉的本發(fā)明的實(shí)施例,只是為了說(shuō)明本發(fā)明目的而不是對(duì)本發(fā)明范疇進(jìn)行限定。通過(guò)閱讀前面的內(nèi)容并根據(jù)實(shí)例,對(duì)那些本專(zhuān)業(yè)普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是,在權(quán)利要求范圍內(nèi)包含了本發(fā)明大量的實(shí)施例。
      實(shí)例1在同種RT-PCR中,同一種聚合酶起到了反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶兩者的作用。這就使得HCV基因組的RNA的初始反轉(zhuǎn)錄和其后的cDNA放大在同一試管中進(jìn)行,而不需要在兩個(gè)步驟之間打開(kāi)試管更換試劑。
      利用產(chǎn)自Micro Probe的Iso QuickTM核酸提取試劑盒將核酸從血清或血漿中分離出來(lái)。所有的放大作用都是利用產(chǎn)自PerkinElmer的Tc9600 ThermocyclerTM和Micro AmpTM試管,以20微升的總的反應(yīng)容量進(jìn)行的。每20微升反應(yīng)的試劑列在下面表5中。
      表5RT-PCR反應(yīng)混合液H2O6.3μl10xRT反應(yīng)緩沖劑(100mM Tris-HCl(pH8.3),900mM. HCl)2.0μlMncl2(10mM,0.85mM最后濃度 1.7μldNTP(dATP,dCTP,dGTP和dTTP各2mM在H2O,pH7.0中)2.0μl引子KY78(SEQ ID NO.18)(1.5μm在H2O中,3微克克分子/反應(yīng)最終濃度)2.0μl引子KY80(SEQ ID NO.5)(1.5μm在H2O
      中,3微克克分子/反應(yīng)最終濃度) 2.0μlrTth DNA聚合酶(Perkin Elmer,Norwalk,CT.USA;0.18μM或2.5單位/μl在1X酶貯存緩沖劑(20μm Tris-Hcl(pH7.5),100mM KCl,0.1μM EDTA,1μM DTT0.2%20 Tween 20(Pierce Surfactants),50%甘油[v/v]) 2.0μl模板核酸(在d H2O中總量<250ng) 2.0μl對(duì)TC9600進(jìn)行編程以提供如下分布的反應(yīng)溫度。在70℃下預(yù)熱1分鐘后,程序暫停一段足以插入反應(yīng)試管的時(shí)間,程序重新啟動(dòng)。反應(yīng)維持在70℃,歷時(shí)15分鐘,以便進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后反應(yīng)溫度升至95℃,維持1分鐘,以便使RNA-cDNA復(fù)合體變性。下一步,反應(yīng)溫度要經(jīng)歷兩個(gè)95℃持續(xù)15秒和60℃持續(xù)20秒以循環(huán),接著是38個(gè)90℃持續(xù)15秒的60℃持續(xù)20秒的循環(huán)。最后,反應(yīng)溫度維持在60℃維持4分鐘,以進(jìn)行最后的擴(kuò)展步驟,冷卻到15℃,維持這一溫度直到放大了的樣品分析得以完成。
      實(shí)例2采用點(diǎn)斑式檢測(cè)方法,將一小部分放大了的DNA進(jìn)行變性并用到一個(gè)尼龍過(guò)濾器上,而后,該過(guò)濾器與一個(gè)標(biāo)記的探針雜合。探針雜合區(qū)域是KY88(SEQ ID NO.12),并用32P進(jìn)行放射標(biāo)記?;蛘?,探針可共價(jià)地結(jié)合到辣根過(guò)氧化物酶(HRP)上,以便在有色原或化學(xué)發(fā)光基底物存在的情況下,提供一種非同位素的檢測(cè)手段。
      放大反應(yīng)通常按照實(shí)例1所述的方法進(jìn)行。而后PCR放大的產(chǎn)物經(jīng)堿處理予以變性。5μl的PCR產(chǎn)物加入5μl,0.5M的EDTA,pH8.0,8μl 5N的NaOH,和82μl的H2O。混合物在室溫下維持10分鐘以完成變性。
      Bio DyneTMB尼龍過(guò)濾器(Pall Corp,Glen Cove,NY,USA)的制備是采用在H2O中浸泡5到10分鐘,在點(diǎn)斑復(fù)制(Bio-DotTMfrom Bio Rad,Richmond,CA,USA)已經(jīng)形成之后,用200μl的H2O進(jìn)一步漂洗。變性之后,在真空條件下,利用點(diǎn)斑裝置,將100μl的樣品混合液施于尼龍薄膜上,而后,每個(gè)凹室均用200μl 0.4N的NaOH漂洗,而整個(gè)過(guò)濾器則簡(jiǎn)單地用2×SSC漂洗,并進(jìn)行空氣干燥,直至無(wú)積水留在上面。DNA被固定并交聯(lián)在尼龍過(guò)濾器上,這是利用StratalinkerTM(Stratagene,La Jolla,CA,USA)UV光箱(“自動(dòng)交聯(lián)”裝置),通過(guò)1200mJ/cm2的光通量的紫外線照射來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
      過(guò)濾器的“預(yù)雜合”是通過(guò)將其浸泡在隔熱袋中的雜合緩沖液內(nèi)(5XSSPE,5XDenhardt的溶液,0.1%SDS,50μg/ml鯡魚(yú)精液DNA),在50℃(空氣振蕩器)下保持至少30分鐘。而后,緩沖劑用同樣數(shù)量的含有1-2×105cpm/ml探針的相同溶液置換,過(guò)濾器可以在2小時(shí)至一整夜的時(shí)間內(nèi)在50℃下進(jìn)行雜合。
      雜合后,將過(guò)濾器在2XSSPE/0.1%SDS中沖洗三遍;兩次是在室溫下持續(xù)20分鐘,另一次是在嚴(yán)格的60℃高溫下沖洗20分鐘。而后將過(guò)濾器吸干,包以塑料包皮,用一或二個(gè)增光屏,在-70℃下對(duì)X-光底片暴光。
      一個(gè)替換的目視觀測(cè)方法是將過(guò)濾器與結(jié)合有低核苷酸探針的辣根過(guò)氧化物酶雜合,其配制方法如Levenson和Chang 1989年在PCR Protocols中的A Guide to Method and Application(Innis等eds.Academic Press,San Diego)第92-112頁(yè)上和Saiki等人1988年的N.Eng.J.Med.319期第537-541頁(yè)上所描述的,每篇文獻(xiàn)都收編于此作為參考。雜合作用是采用每5ml雜合溶液2pmoles的HRP-SSO探針來(lái)進(jìn)行的。
      清洗后,有待用色原染色基底顯影的過(guò)濾器應(yīng)在pH5.0的100μM檸檬酸鈉中漂洗,然后放入含有每毫升(Fluka)0.1mg/ml的3,3′5,5′-四甲基聯(lián)苯胺和百分之0.0015的過(guò)氧化氫的pH5.0的100μM檸檬酸鈉中,在室溫下輕輕攪動(dòng)培養(yǎng)10到30分鐘。在水中漂洗顯影后的過(guò)濾器,并立即被拍照。準(zhǔn)備好TMB檢測(cè)系統(tǒng),并基本上按照Perkin Elmer銷(xiāo)售的AmpliTypeTMDQα DNA定型試劑盒中所描述的方法使用。在另一個(gè)實(shí)施例中,過(guò)濾器是采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(ECL;Amersham ArlingtonHeights,IL,USA)進(jìn)行顯影的。過(guò)濾器在PBS中漂洗5分鐘,并置入ECL溶液,輕輕攪動(dòng)持續(xù)1分鐘。而后過(guò)濾器在室溫下在X-線底片上暴光1至5分鐘。
      實(shí)例3在本發(fā)明的這一實(shí)施例中,使用了反點(diǎn)斑方式。探針的雜合區(qū)是KY88(SEQ ID NO.12),KY150(SEQ ID NO.43),或MY160(SEQID NO.37)而且探針是固定在一個(gè)薄膜上的。放大了的目標(biāo)DNA與結(jié)合在薄膜上的探針雜合,如在尚未批準(zhǔn)的序號(hào)為197,000和347,495的申請(qǐng)中;1989年的Proc.Natl.Acad.Sci.86期第6230-6234頁(yè)上Saiki等人的文章中;及由PerkinElmer銷(xiāo)售的Ampli TypcDQα DNA定型試劑盒內(nèi)的產(chǎn)品插頁(yè)中所描述的。每份文獻(xiàn)都收編于此作為參考。放大的引子被生物素基化,如上述Levenson和Chang 1989年所介紹的那樣,因此,與結(jié)合在膜上的探針雜合的任何放大的DNA都可以很容易地被檢測(cè)到。
      在一個(gè)實(shí)施例中,檢測(cè)是靠結(jié)合有鏈霉抗生物素蛋白的辣根過(guò)氧化物酶(SA-HRP)與任一種生物素基化了的,放大的與結(jié)合在膜上的探針雜合的DNA進(jìn)行反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。于是,通過(guò)SA-生物素的相互作用,HRP變成可與放大的DNA結(jié)合,并可被用來(lái)產(chǎn)生一個(gè)信號(hào),這可以采用多種熟知的方式實(shí)現(xiàn),如利用四甲基聯(lián)苯胺的氧化作用生成一種帶色的化合物(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4,789,630號(hào))。
      盡管探針可用任意一種方法固定在薄膜上,一種優(yōu)選的方法是用一個(gè)很長(zhǎng)的多-dT序列接在探針雜合區(qū)域末端。于是,所得到的多-dT“尾巴”可與尼龍薄膜上的胺基基團(tuán)起反應(yīng)。將探針共價(jià)地固定在薄膜上,可以利用UV輻射使這種反應(yīng)變得更加容易。
      末端的脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,Ratliff Biochemicals;為進(jìn)行如下反應(yīng),假定濃度約為120單位/μl,這相當(dāng)于100pmole/μl)可用來(lái)在探針上生成一個(gè)多-dT尾巴,雖然也可以在市場(chǎng)上買(mǎi)得到的DNA合成裝置上合成帶尾巴的探針。當(dāng)采用DNA合成裝置制造帶尾巴的探針時(shí),仍應(yīng)將尾巴置于探針的5′-末端上,因此,在尾巴區(qū),首先發(fā)生不希望的過(guò)早的鏈終止。
      TdT反應(yīng)需在容積約為100μl的含有1XTdT鹽,200pmole低核苷酸,800μMdTT和60單位TdT的溶液中進(jìn)行。10XTdT鹽是1.000mM K-二甲胂酸鹽,10mM CoCl2,2mM-二硫蘇糖醇,250mM的Tris-d,pH7.6,并按收編于此作為參考的Meth.Enzymol 65期第43-62頁(yè)上Roychoudhury和Wu,Meth所述的方法制備的。為方便起見(jiàn),可配制出8 mM dTTP的10X貯備溶液(用NaOH中和到pH7.0)。
      TdT反應(yīng)需在37℃下進(jìn)行2小時(shí),然后,通過(guò)加入100μl10mM的EDTA,pH8予以停止。帶尾巴的低核苷酸的最終濃度為1μM(1pmole/μl),而均聚物尾巴的長(zhǎng)度為400個(gè)殘基??梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)dTTP與低核苷酸的克分子比來(lái)改變尾巴的長(zhǎng)度。加了尾巴的探針可在-20℃下貯存直至使用。
      對(duì)于反點(diǎn)斑式優(yōu)選的薄膜是由Pall制造并由ICN以BioTransTM尼龍薄膜出售的一種BiodyneTMB尼龍薄膜,微孔大小為0.45微米??捎肂io Rad生產(chǎn)的Bio-DotTM點(diǎn)斑裝置很方便地將探針點(diǎn)式固定在薄膜上。每一種探針都被均勻,離散地點(diǎn)式固定于薄膜上。在用于點(diǎn)斑裝置之前,約2到10微微克分子的每一種帶尾巴的探針與50到100μl的TE緩沖劑預(yù)先混合。點(diǎn)斑固定后,將薄膜簡(jiǎn)單地放在吸紙上,吸去過(guò)多的液體。然后將薄膜放入U(xiǎn)V光箱內(nèi),如Stratagene生產(chǎn)的StratalinkerTM光箱,并在光通量為,50到60微焦耳/cm2下用254nm曝光,以使加尾巴的探針固定在尼龍薄膜上。在雜合溶液中簡(jiǎn)單漂洗約15分鐘以除去粘結(jié)的探針之后,準(zhǔn)備將薄膜與生物素基化了的PCR產(chǎn)物雜合。
      通過(guò)加熱至95℃,并保持3到10分鐘,以使放大了的PCR產(chǎn)物變性。將40μl變性后的PCR產(chǎn)物加在探針板上以進(jìn)行雜合。雜合作用是在57℃下在裝有雜合緩沖液的搖動(dòng)的水槽中進(jìn)行的,歷時(shí)20分鐘,雜合緩沖液是由0.5XSSPE,0.25%SDS,和5XDenhardt溶液(20XSSPE,含有0.02MEDTA,0.2MNaH2PO4,3.6MNaCl;0.11MNaOH,調(diào)整到pH7.4)組成的。用3ml的在3.1ml雜合緩沖液中含有25μl的SA-HRP溶液去置換雜合緩沖液,并在57℃下在一個(gè)搖動(dòng)的水槽中持續(xù)培養(yǎng)20分鐘。
      清洗是在2×SSPE和0.1%的SDS清洗緩沖液中進(jìn)行的。薄膜在10ml清洗緩沖液中經(jīng)簡(jiǎn)單漂洗后,歷時(shí)12分鐘的嚴(yán)格的清洗在57℃下在10ml的清洗緩沖液中進(jìn)行。在10ml,0.1M的檸檬酸鈉,pH5.0中清洗5分鐘之后,進(jìn)行室溫下歷時(shí)5分鐘的另一次清洗。
      色原的結(jié)合是在5ml的色原溶液中進(jìn)行的,室溫下歷時(shí)25-30分鐘,該溶液包含5ml 0.1 M的檸檬酸鈉,5μl 3%的過(guò)氧化氫和0.25ml的色原(Perkin Elmer生產(chǎn)的TMB)。在室溫下進(jìn)行三次在蒸溜水中歷時(shí)10分鐘的清洗。用1XPBS在室溫下歷時(shí)30分鐘的后清洗可以提高信號(hào)的質(zhì)量。在這些包括著色的步驟中,薄膜應(yīng)該用鋁箔包裹以避光,顯影后的薄膜應(yīng)被拍照下來(lái)以作為永久性記錄。
      實(shí)例4在本發(fā)明的這一實(shí)施例中采用了微滴定盤(pán)方式。探針被固定在微滴定盤(pán)上的凹室內(nèi)。如上所述,放大了的目標(biāo)DNA與已經(jīng)鍵聯(lián)在上面的探針雜合。如在前述實(shí)施例中所述,起放大作用的引子被生物素基化以使其能檢測(cè)出與鍵聯(lián)的探針雜合的放大的DNA。
      首先,所需的與BSA鍵聯(lián)的探針可以吸附到每個(gè)凹室的塑性表面上,然后,用蛋白質(zhì),如牛血清白蛋白將凹室封閉。優(yōu)選地,采用可由Corning得到的96個(gè)凹室的盤(pán)。
      放大一旦完成,PCR試管被從熱循環(huán)控制器(可由PerkinElmer得到)上取下。在每個(gè)PCR試管中加注100微升變性溶液。在每個(gè)試管上使用一種新的帶吸管的頂端。在一個(gè)實(shí)施例中,檢測(cè)工作不是馬上進(jìn)行的。在那種情況下,PCR試管在2℃至8℃下存放了一晚上。變性放大反應(yīng)劑在2℃至8℃存貯情況下變得粘稠了。試管在打開(kāi)之前在25℃至30℃之間粗略加熱以便于吸出。
      適當(dāng)數(shù)量的8凹室微滴定盤(pán)條帶(最少為2個(gè)條帶)被取出并放于微滴定盤(pán)框架中。微滴定盤(pán)中每一個(gè)凹室吸入100μl的雜合緩沖液。
      變性溶液含有0.4MNaOH;80mM的EDTA和0.005%的麝香草酚蘭。雜合/中和緩沖液含有2.5M的NaSCN;80mM的NaH2PO4;10mM的NaH2PO4;和0.125%的TweenTM20。使用前核實(shí)pH值為5.0+/-0.2。
      使用帶有多通道吸管的堵住的頂端,將25μl的變性放大反應(yīng)劑由支架上的PCR試管中吸到微滴定盤(pán)中相應(yīng)的凹室位置上。該盤(pán)用微滴定盤(pán)蓋覆蓋,并在側(cè)面輕輕敲擊10到15下,在吸入適量試劑后,凹室將變成淺黃色。如果未觀察到改變,或僅僅是單一的改變?yōu)樘m色,加入了過(guò)量的amplicon。試驗(yàn)持續(xù)下去,直到正OD值增加而負(fù)OD值不受影響。將該盤(pán)在37℃下恒溫培養(yǎng)60分鐘。
      在恒溫培養(yǎng)之后,用清洗液將盤(pán)清洗5次,盤(pán)的清洗可以人工方式完成,或采用適當(dāng)編程的自動(dòng)微滴定盤(pán)清洗器完成。為進(jìn)行清洗,采用了一種1XPCR清洗緩沖劑。一種10X濃縮的PCR清洗緩沖液是按如下方法配制的9.94克/升的磷酸二氫鈉;4.41克/升的磷酸鈉(單元基);3.722克/升的EDTA;87.66克/升的氯化鈉;13.7克/升的TweenTM20;和10克/升的ProClin 300(Rohm和Haas,Philadelphia,PA)。溶液用磷酸調(diào)節(jié)的pH值(優(yōu)選的pH值為6.5-7.1)。
      用于手工清洗時(shí),盤(pán)內(nèi)的東西被倒空并拍干。在待試驗(yàn)盤(pán)中的每個(gè)凹室中加入300μl的清洗液,并且讓該盤(pán)干燥15到30秒鐘。將盤(pán)再次倒空并拍干。這種清洗過(guò)程應(yīng)再重復(fù)四次。
      對(duì)于一個(gè)自動(dòng)微滴定盤(pán)清洗器,采用以下方法,凹室中的東西被吸出來(lái),清洗器依程控在即將試驗(yàn)盤(pán)的每一個(gè)凹室內(nèi)加入350微升的正在使用的清洗液,浸泡30秒鐘并吸出,這些步驟應(yīng)再重復(fù)四次,然后將盤(pán)拍干。
      在即將試驗(yàn)的盤(pán)內(nèi)每個(gè)凹室中加入100μl的結(jié)合液,抗生物素蛋白-HRP結(jié)合液是按如下方法配制的。稀釋液含有0.1克分子濃度;0.25%Emulist 25(DKS International,Inc.,Tokyo,Japan),0.1%的Kathon CG(Rohm和Haas,Philadelphia,PA);0.1%的酚;1.0%的牛γ球蛋白。溶液具有達(dá)7.3用濃HCl調(diào)節(jié)的pH值。在該稀釋液中加入10nM的結(jié)合的抗生物素蛋白(Vector Labs,Burlingame,CA)。于是盤(pán)被覆蓋,并在37℃下恒溫培養(yǎng)50分鐘,并按上述方法再次清洗。工作基質(zhì)是采用將2.0ml基質(zhì)A和0.5ml基質(zhì)B混合配制而成的,這是用于兩個(gè)8凹室微滴定盤(pán)條帶(16個(gè)試驗(yàn))的每一聯(lián)的用量。基質(zhì)A含有3mM過(guò)氧化氫;6.5mM的檸檬酸鹽;和0.1%的Kathon CG。基質(zhì)B含有4.2mM的3,3′5,5′-四甲基聯(lián)苯胺和40%的二甲基甲酸鹽。工作基質(zhì)的配制不能超過(guò)使用前三小時(shí),或者在無(wú)陽(yáng)光直射下貯存。
      100μl的工作基質(zhì)(基質(zhì)A和基質(zhì)B混合物)被加入到待試驗(yàn)的盤(pán)內(nèi)的每個(gè)凹室中,而后盤(pán)被覆蓋,并在室溫下(20℃至25℃)在暗處培養(yǎng)10分鐘,將100μl Stop Reagent(5%的H2SO4)加入準(zhǔn)備試驗(yàn)的每個(gè)凹室中。記錄下在450mM每個(gè)的凹室在加入Stop Reagent一小時(shí)內(nèi)的吸收率。吸收率值被記錄下來(lái)作為樣本和對(duì)照。
      實(shí)例5本發(fā)明的低核苷酸提供了大量的引子和探針的組合,它們可用于放大HCV基因組序列和檢測(cè)放大后的產(chǎn)物。試驗(yàn)了大量的低核苷酸為證實(shí)其在RT-PCR放大過(guò)程中作為引子的有效性。
      采用實(shí)例1中所述方法,不同的低核苷酸對(duì)均可進(jìn)行PCR放大反應(yīng)。放大后的產(chǎn)物用瓊脂凝膠電泳分離并著色的標(biāo)準(zhǔn)方法(見(jiàn)上述Sambrook等)進(jìn)行檢測(cè)。在HCV序列的放大過(guò)程中,每一個(gè)上端引子KY 65(SEQ ID NP.1)和KY 98(SEQ ID NO.3)與每一個(gè)下端引子KY 68(SEQ ID NO.27),KY 95(SEQ ID NO.20)和KY99(SEQ ID NO.26)有效地起著作用。KY 67(SEQ ID NO.10)與KY 68(SEQ ID NO.27)和KY 99(SEQ ID NO.26)一起有效地起作用,每一個(gè)上端引子KY 80(SEQ ID NO.5),KY 83(SEQ IDNO.7),KY84(SEQ ID NO.8),KY 85(SEQ ID NO.9)和KY 144(SEQ ID NO.6)與每一個(gè)下端引子KY 78(SEQ ID NO.18),KY95(SEQ ID NO.20),KY 145(SEQ ID NO.19),KY 148(SEQ IDNO.17)和KY 149(SEQ ID NO.16)一起有效地起作用。最后,每一個(gè)上端引子KY 80(SEQ ID NO.5)和KY 81(SEQ ID NO.11)與KY 100(SEQ ID NO.21)一起有效地起作用。
      用KY 78(SEQ ID NO.18)和KY 80(SEQ ID NO.5)作為引子,經(jīng)過(guò)PCR放大得到的放大產(chǎn)物,利用如上述實(shí)例2中所述方法,以KY88(SEQ ID NO.12),KY 84(SEQ ID NO.8)和KY85(SEQ ID NO.9)中的每一個(gè)作為探針,即可被檢測(cè)出。
      引子KY 153(SEQ ID NO.15),KY 149(SEQ ID NO.16)和KY 148(SEQ ID NO.17)不能和KY 85下端的任何上端引子一起使用。KY 78(SEQ ID NO.18)的3′-端與KY 88(SEQ ID NO.12)的3′-端相鄰,因此,盡管這兩個(gè)引子可以起到一個(gè)引子對(duì)的作用,由于缺少交錯(cuò)序列,使獨(dú)立的探測(cè)成為不可能。引子KY86(SEQID NO.13)只能與KY 100(SEQ ID NO.21),KY 99(SEQ ID NO.26),KY 109(SEQ ID NO.24)和KY 111(SEQ ID NO.25)配對(duì)。引子KY 87(SEQ ID NO.14)只能與KY 99(SEQ ID NO.26),KY109(SEQ ID NO.24)和KY 111(SEQ ID NO.25)配對(duì)。
      以上討論的KY 84(SEQ ID NO.8),KY 85(SEQ ID NO.9),KY87(SEQ ID NO.14)和KY 148(SEQ ID NO.17)對(duì)于檢測(cè)已知的HCV分離體而不是C9分離體是有用的。表4中所列出的探針和引子對(duì)于放大和檢測(cè)HCV-C9和相關(guān)的變異體是特別有效的,而日本、美國(guó)HCV原型體除外。
      KY 84(SEQ ID NO.8),KY 85(SEQ ID NO.9),KY 148(SEQ OD NO.17)和KY 87(SEQ ID NO.14)是對(duì)于放大日本和美國(guó)HCV原型體特別有效,而對(duì)HCV-C9則例外的引子的例證。用于放大日本,美國(guó)和C9HCV原型體的引子包括KY 67(SEQID NO.10),KY 78(SEQ ID NO.18),KY 80(SEQ ID NO.5),KY81(SEQ ID NO.11),KY 83(SEQ ID NO.7),KY 86(SEQ IDNO.13),KY 88(SEQ ID NO.12),KY 95(SEQ ID NO.20),KY100(SEQ ID NO.21),KY 144(SEQ ID NO.6),KY 145(SEQ IDNO.19)和KY 153(SEQ ID NO.15)。引子KY 65(SEQ ID NO.1),KY 68(SEQ ID NO.27),KY 98(SEQ ID NO.3),KY 99(SEQ IDNO.26),KY 109(SEQ ID NO.24),KY 111(SEQ ID NO.25)和KY 149(SEQ ID NO.16)適于放大日本和美國(guó)HCV原型體和相關(guān)的變異分離體并也可適用于檢測(cè)HCV-C9及相關(guān)的同型體。
      KY 67(SEQ ID NO.10),KY 78(SEQ ID NO.18),KY 81(SEQ ID NO.11),KY 86(SEQ ID NO.13),KY 95(SEQ ID NO.20),KY 150(SEQ ID NO.43)和KY 145(SEQ ID NO.19)被證明是檢測(cè)日本、美國(guó)和C9HCV原型體和相關(guān)的變異體的探針。用于檢測(cè)日本和美國(guó)HCV原型體和相關(guān)的變異體而不能檢測(cè)HCV-C9原型體的探針包括KY 83(SEQ ID NO.7),KY 87(SEQ ID NO.14),KY 84(SEQ ID NO.8),KY 88(SEQ ID NO.12),KY 85(SEQ ID NO.9),KY 100(SEQ ID NO.21),KY 148(SEQ ID NO.17)和KY 149(SEQ ID NO.16)。探針KY 65(SEQ ID NO.1),KY 68(SEQ ID NO.27),KY 82(SEQ ID NO.28),KY 99(SEQ IDNO.26),KY 109(SEQ ID NO.24),KY 111(SEQ ID NO.25),KY80(SEQ ID NO.5),KY 144(SEQ ID NO.6)和KY 153(SEQ IDNO.15)適于檢測(cè)日本和美國(guó)HCV原型體和相關(guān)的變異分離體并且可以同時(shí)適用于檢測(cè)HCV-C9和相關(guān)的變異體。
      實(shí)例6在有UNG存在的情況下,HCV RNA的同種RT/PCR放大是一種優(yōu)選的方法。實(shí)例1中所說(shuō)的同質(zhì)RT/PCR放大方法被修改成包括一個(gè)消毒步驟。下述原始記錄表明,RT和PCR反應(yīng)包含了dUTP。消毒是在RT步驟之前,在50℃下進(jìn)行的。在被提高了的RT-PCR反應(yīng)溫度下,UNG是沒(méi)有活性的,且含dU的產(chǎn)物不會(huì)被降解。兩個(gè)單位的UNG(Perkin Elmer)成功地對(duì)100μl用10,000個(gè)HCV RNA復(fù)制體構(gòu)成的放大液中相當(dāng)于0.25μl的攜帶體進(jìn)行了消滅。更高劑量的UNG,例如,達(dá)到每100μl反應(yīng)液6個(gè)單位,仍是適宜的。
      反應(yīng)混合物成分按以下順序加入μl/RX50%甘油16.0016.0010X RT Rxn.緩沖劑(100mM Tris-HCl(pH8.3),900mM HCl) 10.00dGTP(10mM);200μM終值 2.00dATP(10mM);200μM終值 2.00dUTP(20mM);200μM終值 1.00dCTP(10mM);200μM終值 2.00
      KY80(SEQ ID NO.5)在15μM(15pmoles each/rxn終值);(+)生物素基化了的鏈引子 1.00KY78(SEQ ID NO.18)在15μM(15pmoles each/rxn終值;生物素基(-)鏈,RT引子 1.00UNG1單位/μl 2.00rTth DNA聚合酶在1X酶存貯緩沖劑*中2.5U/μl4.00MnCl2(10mM);0.9mM終值 9.00每支試管的Master Mix50.00RNA(連同在H2O中的載體基底**)50.00反應(yīng)劑總體積100.00*1X酶存貯緩沖劑=(20mM Tris-HCl[pH7.5],100 mMHCl,0.1 mM EDTA,1 mN DTT,0.5%TweenTM20[Pierce Surfactamps],50%甘油[v/v]。
      **1毫克來(lái)自Pharmacia的聚rA均聚合RNA(No.27-聚合tA具有平均值8.8(范圍在6-13)的S20,W或在降溫下的一些非特定產(chǎn)物)是在每份反應(yīng)劑低于200ng的輸入值下使用的。牛胸腺DNA,PBLDNA,人胎盤(pán)DNA和來(lái)自細(xì)胞系K562的DNA均已檢測(cè)過(guò)且其效果相同。
      步驟1.打開(kāi)TC9600熱循環(huán)控制器,預(yù)熱表層。
      2.在室溫下制備反應(yīng)混合液。
      3.將試管放入熱循環(huán)控制器,按下“RUN”重新啟動(dòng)熱循環(huán)控制器。
      4.在文件(file)8處啟動(dòng)機(jī)器。
      5.建議的熱循環(huán)控制器條件為文件1保持 2分鐘, 50℃(UNG消毒步驟)文件2保持 15分鐘,70℃(反轉(zhuǎn)錄步驟)文件3保持 1分鐘, 95℃文件4兩種溫度的PCR95℃,15秒和60℃10-30秒兩個(gè)循環(huán)文件5兩種溫度PCR90℃15秒和60℃10-30秒38個(gè)循環(huán)文件6保持 72℃1小時(shí)文件7保持 15℃不限定文件8連接文件1,2,3,4,5,6,和7在第五步文件2中,15分鐘的反應(yīng)時(shí)間可以降低到5分鐘,而不會(huì)降低反應(yīng)效率。在第五步文件5中,對(duì)于高G+C模板,可以?xún)?yōu)選地提高變性溫度到95℃。用微滴定盤(pán)測(cè)定方式分析反應(yīng)產(chǎn)物,通常導(dǎo)致在陽(yáng)性樣品情況下大于0.8的吸收率值,和對(duì)陰性樣品情況下≤0.5的吸收率值。
      權(quán)利要求
      1.一種檢測(cè)在懷疑含有丙型肝炎病毒核酸的樣品中的丙型肝炎病毒核酸存在的方法,該方法包括(a)將在樣品中的核酸與一種寡核苷酸探針相接觸,該寡核苷酸探針包括一個(gè)其長(zhǎng)度至少為14個(gè)核苷酸的核酸苷序列,而且該寡核苷酸探針特異地適合于檢測(cè)C9同型族系的一種HCV,而且其中所說(shuō)的核酸序列包含于選自以下序列及其互補(bǔ)序列的一個(gè)序列中或者由選自以下的序列及其互補(bǔ)序列的一個(gè)序列所組成SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.30,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.32,和SEQID NO.33,以及(b)檢測(cè)在丙型肝炎病毒核酸和該探針之間形成的穩(wěn)定雜種。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中所說(shuō)的核酸序列包含于由下列序列及其互補(bǔ)序列中選出的一個(gè)序列中或者由選自下列序列的及其互補(bǔ)序列的一個(gè)序列所組成SEQ ID NO.38,SEQ ID NO.39,SEQ ID NO.40,SEQ ID NO.41和SEQID NO.42。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法,該方法還包括在步驟(a)之前在能夠放大在樣品中的HCV核酸的條件下處理該樣品的步驟,從而該放大作用是應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)完成的。
      4.一種放大來(lái)自丙型肝炎病毒(HCV)族系的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的方法,該丙型肝炎病毒(HCV)族系來(lái)自在樣品中懷疑含有該病毒核酸的C9同型族系,該方法包括(a)將其長(zhǎng)度至少為14個(gè)核苷酸并適合于放大來(lái)自丙型肝炎病毒(HCV)的一種族系的丙型肝炎病毒(HCV)核酸的寡核苷酸引物與在該樣品中的核酸相接觸,該丙型肝炎病毒(HCV)族系來(lái)自C9同型族系的一種丙型肝炎病毒(HCV)的族系,以及其中所說(shuō)的核酸序列包含于由下列序列及其互補(bǔ)序列中選出的一個(gè)序列中或者由選自下列序列及其互補(bǔ)序列的一個(gè)序列所組成SEQ ID NO.29,SEQ ID NO.30,SEQ ID NO.31,SEQ ID NO.32和SEQID NO.33;(b)用核酸聚合酶延長(zhǎng)該引物;以及(c)重復(fù)步驟(a)和(b)直至得到可檢測(cè)到的數(shù)目的丙型肝炎病毒核酸的復(fù)制品。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其中該寡核苷酸引物適宜于放大來(lái)自C9同型族系的丙型肝炎病毒(HCV)的一種族系的丙型肝炎病毒(HCV)核酸,而所說(shuō)的核酸序列包含于由下列序列及其互補(bǔ)序列中選出的一個(gè)序列中或者由選自下列序列及其互補(bǔ)序列的一個(gè)序列所組成SEQ ID NO.38,SEQ ID NO.39,SEQ ID NO.40,SEQ ID NO.41,和SEQID NO.42。
      6.用于檢測(cè)丙型肝炎病毒核酸的一套試劑盒,其特征在于該試劑盒包括一隔層,在該隔層中包含權(quán)利要求1至3的任一項(xiàng)權(quán)利要求所限定的一種寡核苷酸探針。
      7.用于檢測(cè)丙型肝炎病毒核酸的一套試劑盒,其特征在于該試劑盒包括一隔層,在該隔層中包含權(quán)利要求4至5的任一項(xiàng)權(quán)利要求所限定的一種寡核苷酸引物。
      全文摘要
      本發(fā)明為放大和檢測(cè)HCV-C同型核酸提供了試劑,方法和一套試劑盒,在包括病毒基因組DNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA以及隨后的利用聚合酶鏈反應(yīng)放大cDNA的過(guò)程中。低核苷酸引子可被用來(lái)放大和檢測(cè)丙肝病毒核酸。通過(guò)雜合作用,低核苷酸探針可被用于檢測(cè)放大后的DNA的存在。
      文檔編號(hào)C12N7/00GK1259670SQ9812379
      公開(kāi)日2000年7月12日 申請(qǐng)日期1998年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1991年8月27日
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