專利名稱：抑制端粒酶活性反義寡核苷酸結(jié)構(gòu)及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物，具體地說涉及抑制人端粒酶的反義寡核苷酸藥物的制備及用于抑制惡性腫瘤生長的用途。
癌癥是威脅人類生命的重大疾病，對癌癥的治療一直是科學(xué)界關(guān)注的問題。由于目前廣泛使用的放療和化療等手段不僅缺少對癌細(xì)胞良好的特異性殺傷力，而且有較大的毒副作用，在很大程度上使治療的范圍和效果都受到了限制。因此，尋找一種特異性高、毒副作用小的新型癌癥治療藥物對癌癥的治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近來研究表明端粒酶與癌癥有著極為密切的關(guān)系。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的DNA序列，其功能是保持染色體的穩(wěn)定性。端粒DNA的長短和穩(wěn)定性決定了細(xì)胞的壽命，并與細(xì)胞的衰老和癌變密切相關(guān)。端粒是由端粒酶合成的。研究發(fā)現(xiàn)在永生細(xì)胞和85％的人惡性腫瘤細(xì)胞中均有端粒酶的活性，而在絕大多數(shù)正常人體細(xì)胞中卻沒有端粒酶的表達(dá)，因而端粒酶就有望成為癌癥診斷的標(biāo)志物和癌癥治療的靶點(diǎn)(Shay J W et al.Curr Opinoncol，1996，8(1)66-71)。端粒酶是一種由RNA和蛋白質(zhì)組成的核蛋白復(fù)合體構(gòu)成的酶，在端粒合成時(shí)由自身的RNA組分提供染色體末端端粒合成的模板。其中具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的hEST2蛋白亞基的表達(dá)是細(xì)胞調(diào)節(jié)端粒酶活性的主要限速步驟(Meyerson S et al.Cell，1997，90785-788)。由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，可以通過針對編碼人端粒酶hEST2蛋白質(zhì)亞基基因結(jié)構(gòu)的反義寡核苷酸抑制端粒酶的活性，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的。
反義寡核苷酸(Antisense Oligonucleotide，ASON)是指同一個(gè)基因的有意義鏈或由它轉(zhuǎn)錄的RNA特異性互補(bǔ)并能雜交的核苷酸寡聚物，是治療腫瘤和病毒性傳染病的潛在新型藥物(Stein et al.Science 1993，262(60)1004-1012)。國內(nèi)外已嘗試采用反義寡核苷酸治療惡性腫瘤。
本發(fā)明的目的是根據(jù)編碼人端粒酶hEST2蛋白質(zhì)亞基基因序列設(shè)計(jì)并制備寡核苷酸，以此可做為抑制表達(dá)端粒酶活性的惡性腫瘤細(xì)胞生長的癌癥治療藥物。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是根據(jù)Morin等(Morin GB，et al.Science1997，277(5328)955-959)測定的編碼人端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性蛋白質(zhì)亞基(hEST2)基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了二十條反義寡核苷酸序列。這類寡核苷酸的目的是與所述部分序列雜交后會阻止hEST2蛋白質(zhì)亞基合成，從而抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長。該寡核苷酸由分子式為-O-P(＝O)(Y)-O-的磷酸酯鍵連接，其中Y可以是氧、或硫、或甲氧基等。該寡核苷酸及其硫代物可以抑制腫瘤細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)的生長和接種腫瘤細(xì)胞裸鼠惡性腫瘤的生長。故此發(fā)現(xiàn)該寡核苷酸在抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長中有良好的作用，是一種用于抑制表達(dá)端粒酶活性的惡性腫瘤細(xì)胞生長的新型生物工程藥物。
本發(fā)明的反義寡核苷酸可以包含10～30個(gè)核苷酸長度的反義寡核苷酸，可以包括以下序列硫代反義寡核苷酸序列及性質(zhì)
A反義本發(fā)明的寡核苷酸當(dāng)依照已知的技術(shù)方法固定在固體支持物上時(shí)，可用于核酸的分離及其自身對端粒酶hEST2 RNA組分或編碼端粒酶hEST2 DNA的檢測。本發(fā)明用于診斷的寡核苷酸可根據(jù)已知的技術(shù)方法用一個(gè)做為信號的部分標(biāo)記，如放射性同位素、酶、熒光化合物等。
抑制端粒酶活性的反義寡核苷酸可以通過修飾來增加其穩(wěn)定性。組成寡核苷酸的磷酸酯基團(tuán)可以在天然磷酸二酯鍵部分的自由單鍵氧位置進(jìn)行修飾，其中可以是氧、或是甲基、或是硫。
本發(fā)明的再一目的是提供一種藥物組合物，它含有至少一種本發(fā)明的寡核苷酸或其修飾物，如果適當(dāng)?shù)脑?，還含有治療上可接受的載體材料。
本發(fā)明的實(shí)施對嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤的治療具有重大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明用下列實(shí)施例進(jìn)行解釋，這些實(shí)施例的目的只是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。結(jié)合


本發(fā)明的具體實(shí)施方法圖1.端粒酶hEST2硫代反義寡核苷酸對HepG2細(xì)胞生長的抑制圖2.端粒酶hEST2硫代反義寡核苷酸對接種HepG2肝癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制曲線圖3.端粒酶hEST2硫代反義寡核苷酸對接種HepG2肝癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)腫瘤的抑制率圖4.端粒酶hEST2硫代反義寡核苷酸對接種HepG2肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤率的作用圖5.端粒酶hEST2硫代反義寡核苷酸給藥組及對照組裸鼠體重增量圖6.端粒酶hEST2硫代反義寡核苷酸給藥組及對照組裸鼠腫瘤照片實(shí)施例方法1天然和硫代反義寡核苷酸設(shè)計(jì)與合成根據(jù)人端粒酶hEST2蛋白亞基cDNA序列，設(shè)計(jì)二十條反義寡核苷酸。硫代反義寡核苷酸用Applied Biosystems 391 DNA合成儀合成。合成后先用濃氨水55℃脫保護(hù)15小時(shí)，然后用反相柱(購自Solid Phase Sciences公司)層析純化。方法2細(xì)胞培養(yǎng)HepG2采用含10％小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5％二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。實(shí)施例一端粒酶hEST2硫代反義寡核苷酸對HepG2細(xì)胞生長的抑制HepG2細(xì)胞用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種3×103細(xì)胞/0.2ml，培養(yǎng)過夜。在無血清狀態(tài)下，采用Lipofectin(GIBCO，1mg/ml)試劑并參照說明書操作進(jìn)行硫代反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染，每孔細(xì)胞用硫代反義寡核苷酸終濃度為0.5μmol/L，脂質(zhì)體1μg，總體積為100μl，每條硫代反義寡核苷酸設(shè)置3孔，并設(shè)置陰性對照。轉(zhuǎn)染時(shí)，在消毒的1.5ml離心管中，將0.75μl的200μmol/L的硫代反義寡核苷酸與3μg脂質(zhì)體分別用無血清DMEM培養(yǎng)基37.5μl稀釋，室溫放置30分鐘后，將脂質(zhì)體與硫代反義寡核苷酸溶液混勻，室溫下再放置30分鐘，以便形成脂質(zhì)體—反義寡核苷酸復(fù)合物，然后加入無血清DMEM培養(yǎng)基225μl。培養(yǎng)細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)基洗兩次，每孔加入總體積100μl的脂質(zhì)體—反義寡核苷酸復(fù)合物溶液，作用5小時(shí)，換含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)19小時(shí)。然后同上重新?lián)Q液和加入脂質(zhì)體與硫代反義寡核苷酸溶液兩次，于培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加20μl MTS，并繼續(xù)培養(yǎng)90分鐘，于490nm測定光吸收。通過細(xì)胞生長倍增數(shù)量評價(jià)硫代反義寡核苷酸對細(xì)胞生長的影響。
從圖1中可見hEST21～hEST220共二十條硫代反義寡核苷酸對HepG2細(xì)胞生長的抑制率。二十條硫代反義寡核苷酸對HepG2細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，其中hEST21、hEST22和hEST218對HepG2細(xì)胞生長的抑制率分別達(dá)到62.3％、55.4％和53.2％；hEST25、hEST26、hEST28、hEST29、hEST210、hEST214、hEST217和hEST219對HepG2細(xì)胞生長的抑制率均超過30％。結(jié)果表明端粒酶hEST2反義寡核苷酸可以有效地抑制HepG2肝癌細(xì)胞的生長。實(shí)施例二硫代反義寡核苷酸對接種HepG2肝癌細(xì)胞裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制HepG2細(xì)胞用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。收集細(xì)胞，用PBS洗兩次，重懸于生理鹽水中。35只6周齡雌性裸鼠，稱量鼠重，每只鼠后腿腋下注射5×105HepG2細(xì)胞/0.2ml。十天后隨機(jī)分為7組，每組5只，開始腹腔注射給藥，一組為對照組，每日腹腔注射生理鹽水0.1ml；二組為hEST21組，每日給藥500ug/0.1ml；三組為hEST24組，每日給藥500ug/0.1ml；四組為hEST29組，每日給藥500ug/0.1ml；五組為hEST212組，每日給藥500ug/0.1ml；六組hEST217組，每日給藥500ug/0.1ml；七組為hEST218組，每日給藥500ug/0.1ml。定期測量腫瘤大小，共給藥18天。處死裸鼠，測量腫瘤大小，稱量鼠重、瘤體重。
從圖2可以看出，hEST21、hEST24、hEST29、hEST212、hEST217和hEST218各組裸鼠腫瘤生長均小于對照組，尤其是hEST21、hEST24和hEST212反義寡核苷酸給藥組腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長速度明顯低于對照組。但hEST217組接近于對照組。圖3顯示了各條反義寡核苷酸對裸鼠腫瘤重量的抑制狀況，hEST21、hEST24、hEST29、hEST212、hEST217和hEST218的抑制率分別為87.6％、76.4％、49.4％、89.9％、4.5％和34.8％。圖4顯示了各條反義寡核苷酸對接種HepG2細(xì)胞裸鼠腫瘤形成的作用，對照組成瘤率為100％，hEST21、hEST24、hEST29、hEST212、hEST217和hEST218各組的成瘤率分別為60％、80％、60％、60％、100％和60％。圖5顯示了各組裸鼠體重增長狀況，組間無顯著差異。圖6給出了各組腫瘤圖片。以上結(jié)果說明端粒酶hEST2硫代反義寡核苷酸對接種HepG2肝癌細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)腫瘤生長具有抑制作用，可應(yīng)用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
權(quán)利要求
1.包含或由一個(gè)寡核苷酸順序組成的寡核苷酸，其特征是它具有與編碼人端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性蛋白質(zhì)亞基(hEST2)的一部分基因雜交的能力，而且當(dāng)此寡核苷酸與所述的那部分基因雜交后會阻止人端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性蛋白質(zhì)亞基的合成，其中編碼人端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性蛋白質(zhì)亞基的基因是信使核糖核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的寡核苷酸，其長度為10～30個(gè)核苷酸，可以包括以下序列反義寡核苷酸序列及性質(zhì)
A反義hEST2人端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性蛋白質(zhì)亞基
3.根據(jù)權(quán)利要求2中的寡核苷酸，其優(yōu)選序列為hEST211，hEST24，hEST212。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中的寡核苷酸及其修飾物，可以用于惡性腫瘤的治療。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述寡核苷酸的磷酸酯基團(tuán)，其特征是該基團(tuán)在磷酸二酯鍵部分的單鍵氧位置可以是氧、或硫、或甲基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一權(quán)項(xiàng)的寡核苷酸可以制成各種不同的劑型，通過不同的給藥途徑用于惡性腫瘤的治療，如果合適的話，還可含有治療上可接受的載體物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程產(chǎn)品及其用途,具體地說是根據(jù)編碼人端粒酶hEST2蛋白質(zhì)亞基基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了反義寡核苷酸序列。這類寡核苷酸與所述部分基因雜交后會阻止人端粒酶hEST2蛋白質(zhì)亞基的合成,從而抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生長。該寡核苷酸及其硫代物均可以抑制人端粒酶hEST2蛋白質(zhì)亞基的合成,并可以抑制培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的生長和接種腫瘤細(xì)胞裸鼠惡性腫瘤的生長。故此發(fā)現(xiàn)該寡核苷酸在抑制惡性腫瘤細(xì)胞生長中有良好的作用,是一種用于抑制表達(dá)端粒酶活性的惡性腫瘤生長的新型藥物。
文檔編號C12N15/12GK1253179SQ9812446
公開日2000年5月17日 申請日期1998年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月9日
發(fā)明者王升啟, 鄭曉飛, 朱寶珍, 邢瑞云, 管偉, 孫志賢 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所