專利名稱：新的人黑素瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子及其編碼序列,及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的多肽被命名為黑素瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子2(melanoma growth related factor-2，簡(jiǎn)稱為“MGRF-2”)。
視黃酸(RA)可引起多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯及分化(Amos B.，et al，1990，Methods Enzymol 190217-225)。經(jīng)RA處理的小鼠黑色素瘤細(xì)胞株S91在24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，然后重新分化為良性的黑色素細(xì)胞(Lotan R.，et al，1981 Ann.N.Y.Acad.Sci.359150-170)。RA的抑制效應(yīng)通過(guò)與特殊的核內(nèi)受體RAR—視黃酸受體(retinoic acid receptor)結(jié)合而介導(dǎo)。在此途徑中，RAR通常還與RxR(retinoid X receptor)形成異二聚體復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物通過(guò)與特定靶基因上的RA響應(yīng)元件結(jié)合從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平(Glass C.K.，et al，1991，DNA Cell Biol 10623-638)。目前對(duì)RAR靶基因還知之甚少，而鑒定此類靶基因?qū)榻沂竞谏亓瞿酥疗渌┌Y的致病機(jī)制提供重要依據(jù)。
為了鑒定此類受RA調(diào)控的靶基因，1997年Spanjaard等人用視黃酸處理小鼠S91黑色素瘤細(xì)胞株，然后運(yùn)用消減雜交的方法尋找在視黃酸處理前后S91細(xì)胞中差別表達(dá)的基因(Spanjaard R.A.et al，1997，Cancer Research 575122-5128)。在找到的四個(gè)表達(dá)有差異的基因中，表達(dá)下調(diào)的基因有兩個(gè)(克隆5d和克隆10d)克隆5d是已知的細(xì)胞周期蛋白cyclinD1基因；克隆10d與人BM28(CDCL1)基因同源。兩個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因是克隆7u和克隆13u，這是兩個(gè)全新的基因，分別編碼了含244和300個(gè)氨基酸的兩個(gè)蛋白。基因7u在增殖的黑色素瘤細(xì)胞中幾乎不能檢測(cè)到表達(dá)，而在經(jīng)視黃酸處理后生長(zhǎng)停滯的S91細(xì)胞中表達(dá)量增大了7.1倍；對(duì)于基因13u，表達(dá)量增大了2.3倍。Northern雜交分析表明，基因7u主要在大腸中表達(dá)而基因13u主要在睪丸中表達(dá)。盡管基因7u和13u是否是受RA直接作用的靶基因以及它們是否對(duì)黑色素瘤具有抑制作用還不清楚，但它們的受RA誘導(dǎo)的表達(dá)現(xiàn)象以及其組織特異性的表達(dá)模式說(shuō)明這兩個(gè)基因可能在黑色素瘤的生成過(guò)程中發(fā)揮重要的生理作用(Spanjaard R.A.et al，1997，CancerResearch 575122-5128)，是小鼠黑色素瘤的相關(guān)基因。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼人黑素瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子-2的蛋白，本發(fā)明新的人類基因被命名為人MGRF-2。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人黑素瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子，該蛋白被命名為人MGRF-2蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人MGRF-2的方法。
本發(fā)明還涉及這種人MGRF-2核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人MGRF-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3從核苷酸44-805位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人MGRF-2蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人MGRF-2蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人MGRF-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人MGRF-2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人MGRF-2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人MGRF-2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人MGRF-2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長(zhǎng)為845個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.3，其中開(kāi)放讀框位于44-805位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人MGRF-2蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人MGRF-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中44-805位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框44-805位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.3中44-805位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，較佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與人MGRF-2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人MGRF-2蛋白多肽”指具有人MGRF-2蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人MGRF-2相同功能的、SEQ IDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人MGRF-2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人MGRF-2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人MGRF-2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人MGRF-2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還提供了人MGRF-2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人MGRF-2多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人MGRF-2蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人MGRF-2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還可以包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人MGRF-2保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1<
本發(fā)明還包括人MGRF-2多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人MGRF-2的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針或引物的核苷酸分子，該分子通常具有人MGRF-2核苷酸序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人MGRF-2的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)人MGRF-2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人MGRF-2多肽的編碼序列，可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人MGRF-2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人MGRF-2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人MGRF-2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人MGRF-2蛋白的分子，也包括那些并不影響人MGRF-2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人MGRF-2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人MGRF-2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人MGRF-2或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人MGRF-2功能的抗體以及不影響人MGRF-2功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人MGRF-2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人MGRF-2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
本發(fā)明的人MGRF-2核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸全長(zhǎng)為845個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.3，其中開(kāi)放讀框位于44-805位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的以SUPERSCRIPTTM人胎腦cDNA文庫(kù)(這是質(zhì)粒庫(kù)，購(gòu)自Gibco公司)為模板，合成正向引物A15′TCTAGTGTGATGAAGGAGGCGAC-3′和反向引物B15′-GCAGTTCATTTCACATAAATATCTGG-3′，進(jìn)行PCR，獲得約0.85kb的目的片段。測(cè)序后得到SEQ ID NO.3的全長(zhǎng)cDNA序列。
同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的基因同小鼠黑素瘤相關(guān)基因13u高度同源。在氨基酸水平上它與小鼠的黑色素瘤相關(guān)基因13u的一致性和相似性都約為95％(

圖1)?？梢酝茰y(cè)本發(fā)明的基因是小鼠黑色素瘤相關(guān)基因13u在人體中的同源基因。小鼠13u基因在視黃酸處理后表達(dá)量上升，提示它可能是一個(gè)RAR-RxR復(fù)合物的靶基因，在視黃酸的誘導(dǎo)下表達(dá)，從而抑制黑色素瘤的發(fā)生。由此可以推測(cè)，本發(fā)明的MGRF-2基因也可能具有抑制黑色素瘤生成的功能，是人體內(nèi)的黑色素瘤發(fā)生的調(diào)控基因。
在附圖中，圖1為本發(fā)明的人MGRF-2蛋白(下方)與小鼠13u蛋白(上方)的氨基酸序列同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“·”或“”標(biāo)出。在序列上方的“.”用于標(biāo)出編號(hào)為10的倍數(shù)的氨基酸。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人MGRF-2的cDNA序列的克隆和測(cè)定1.引物擴(kuò)增以SUPERSCRIPTTM人胎腦cDNA文庫(kù)(這是質(zhì)粒庫(kù)，購(gòu)自Gibco公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A15′-TCTAGTGTGATGAAGGAGGCGAC-3′(SEQID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B15′-GCAGTTCATTTCACATAAATATCTGG-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR.PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到的PCR片斷為約0.85kb的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)⑷缟汐@得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共845bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.3，其中開(kāi)放讀框位于44-805位核苷酸。
根據(jù)得到的全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出人MGRF-2的氨基酸序列，共253個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQ ID NO.4。
實(shí)施例2同源比較用本發(fā)明的人MGRF-2的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundant+GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基因同小鼠黑素瘤相關(guān)基因13u高度同源。在氨基酸水平上它與小鼠的黑色素瘤相關(guān)基因13u的相同性和相似性都約為95％(圖1)?？梢源_定本發(fā)明的MGRF-2基因是小鼠黑色素瘤相關(guān)基因13u在人體中的同源基因。小鼠13u基因在視黃酸處理后表達(dá)量上升，提示它可能是一個(gè)RAR-RxR復(fù)合物的靶基因，在視黃酸的誘導(dǎo)下表達(dá)，從而抑制黑色素瘤的發(fā)生。由此可以推測(cè)，本發(fā)明的MGRF-I基因也可能具有抑制黑色素瘤生成的功能，是人體內(nèi)的黑色素瘤發(fā)生的調(diào)控基因。
本發(fā)明的人MGRF-2除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人MGRF-2還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人MGRF-2的C端與小鼠的13u蛋白的C端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明人MGRF-2的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人MGRF-2核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人MGRF-2的表達(dá)水平或者抑制人MGRF-2的過(guò)度表達(dá)。本發(fā)明的人MGRF-2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人MGRF-2缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。尤其是因?yàn)樵谟靡朁S酸處理前后S91細(xì)胞中，小鼠13u基因是表達(dá)上調(diào)的差別表達(dá)基因(Spanjaard R.A.et al，1997，Cancer Research 575122-5128)，因此本發(fā)明的人MGRF-2可作為疾病預(yù)后判斷的一種標(biāo)志。
實(shí)施例3人MGRF-2在大腸桿菌中的表達(dá)編碼人MGRF-2的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用實(shí)施例1中引物A1B1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCGGATCCATGGGGACGCCGGGGGAGG(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開(kāi)始的人MGRF-2編碼序列的19個(gè)核苷酸；3’寡核苷酸引物序列為5’-GTTCGTCGACTCAGAGAGCTTCTGCAGGT-3’(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，一個(gè)翻譯終止子和人MGRF-2的編碼序列。
限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和SalI消化pQE-9載體、插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開(kāi)放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購(gòu)自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子克隆。抽提質(zhì)粒，用BstXI酶切鑒定插入片段大小及方向，測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明人MGRF-2的cDNA插入片段已正確裝入載體。
過(guò)夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過(guò)使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過(guò)在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人MGRF-2。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人MGRF-2?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為26KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例4人MGRF-2在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼人MGRF-2的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，實(shí)施例1中引物A1B1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以合成插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TTGCGAGCTCATGGGGACGCCGGGGGAGG(SEQ ID NO.7)，該引物含有SacI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，接之是由起始密碼子開(kāi)始的人MGRF-2編碼序列的19個(gè)核苷酸；
3′端引物序列為5’-GTTCGGATCCTCAGAGAGCTTCTGCAGGT-3’(SEQ ID NO.8)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人MGRF-2的編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用SacI、BamHI消化pcDNA3載體、插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明人MGRF-2的cDNA插入片段已正確裝入載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽(yáng)性亞克隆。48小時(shí)后，開(kāi)始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為26KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來(lái)免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人MGRF-2基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱新的人黑素瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子及其編碼序列，及制法和用途(iii)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1CTAAGAAATC CGAGCGGTTG GTG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TTCTCCAGTT CTGAGCAGGA CAC 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度845bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3CTAAGAAATC CGAGCGGTTG GAGGGGGAGT CTGTGTGGAT GGGATGGGGA CGCCGGGGGA 60GGGGCTGGGC CGCTGCTCCC ATGCCCTGAT CCGGGGAGTC CCAGAGAGCC TGGCGTCGGG 120GGAAGGTGCG GGGGCTGGCC TTCCCGCTCT GGATCTGGCC AAAGCTCAAA GGGAGCACGG 180GGTGCTGGGA GGTAAACTGA GGCAACGACT GGGGCTACAG CTGCTAGAAC TGCCACCTGA 240GGAGTCATTG CCGCTGGGAC CGCTGCTTGG CGACACGGCC GTGATCCAAG GGGACACGGC 300CCTAATCACG CGGCCCTGGA GCCCCGCTCG TAGGCCAGAG GTCGATGGAG TCCGCAAAGC 360CCTGCAAGAC CTGGGGCTCC GAATTGTGGA AATAGGAGAC GAGAACGCGA CGCTGGATGG 420CACTGACGTT CTCTTCACCG GCCGGGAGTT TTTCGTAGGC CTCTCCAAAT GGACCAATCA 480CCGAGGAGCT GAGATCGTGG CGGACACGTT CCGGGACTTC GCCGTCTCCA CTGTGCCAGT 540CTCGGGTCCC TCCCACCTGC GCGGTCTCTG CGGCATGGGG GGACCTCGCA CTGTTGTGGC 600AGGCAGCAGC GACGCTGCCC AAAAGGCTGT CCGGGCAATG GCAGTGCTGA CAGATCACCC 660ATATGCCTCC CTGACCCTCC CAGATGACGC AGCTGCTGAC TGTCTCTTTC TTCGTCCTGG 720GTTGCCTGGT GTGCCCCCTT TCCTCCTGCA CCGTGGAGGT GGGGATCTGC CCAACAGCCA 780GGAGGCACCT GCAGAAGCTC TCTGATGTCA CCCTGGTACC TGTGTCCTGC TCAGAACTGG 840AGAAA 845(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度253個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Gly Thr Pro Gly Glu Gly Leu Gly Arg Cys Ser His Ala Leu 15Ile Arg Gly Val Pro Glu Ser Leu Ala Ser Gly Glu Gly Ala Gly 30Ala Gly Leu Pro Ala Leu Asp Leu Ala Lys Ala Gln Arg Glu His 45Gly Val Leu Gly Gly Lys Leu Arg Gln Arg Leu Gly Leu Gln Leu 60Leu Glu Leu Pro Pro Glu Glu Ser Leu Pro Leu Gly Pro Leu Leu 75Gly Asp Thr Ala Val Ile Gln Gly Asp Thr Ala Leu Ile Thr Arg 90Pro Trp Ser Pro Ala Arg Arg Pro Glu Val Asp Gly Val Arg Lys 105Ala Leu Gln Asp Leu Gly Leu Arg Ile Val Glu Ile Gly Asp Glu 120Asn Ala Thr Leu Asp Gly Thr Asp Val Leu Phe Thr Gly Arg Glu 135Phe Phe Val Gly Leu Ser Lys Trp Thr Asn His Arg Gly Ala Glu 150Ile Val Ala Asp Thr Phe Arg Asp Phe Ala Val Ser Thr Val Pro 165Val Ser Gly Pro Ser His Leu Arg Gly Leu Cys Gly Met Gly Gly 180Pro Arg Thr Val Val Ala Gly Ser Ser Asp Ala Ala Gln Lys Ala 195Val Arg Ala Met Ala Val Leu Thr Asp His Pro Tyr Ala Ser Leu 210Thr Leu Pro Asp Asp Ala Ala Ala Asp Cys Leu Phe Leu Arg Pro 225Gly Leu Pro Gly Val Pro Pro Phe Leu Leu His Arg Gly Gly Gly 240Asp Leu Pro Asn Ser Gln Glu Ala Pro Ala Glu Ala Leu 253(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGCGGATCC ATGGGGACGC CGGGGGAGG29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6GTTCGTCGAC TCAGAGAGCT TCTGCAGGT29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGCGAGCTC ATGGGGACGC CGGGGGAGG29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8GTTCGGATCC TCAGAGAGCT TCTGCAGGT29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人MGRF-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位的核苷酸序列。
4.一種分離的人MGRF-2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有人MGRF-2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人MGRF-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人MGRF-2蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人MGRF-2蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人MGRF-2蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人MGRF-2蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸44-805位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的人MGRF-2蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針?lè)肿樱涮卣髟谟?，它含有?quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的黑素瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子。本發(fā)明的蛋白被命名為黑素瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子2(melanoma growthrelated factor－2,簡(jiǎn)稱為“MGRF－2”)。本發(fā)明提供了該MGRF－2蛋白的cDNA編碼序列、該序列編碼的多肽,以及利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人MGRF－2蛋白的方法。本發(fā)明還提供了這種新的人MGRF－2蛋白的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1257921SQ9812552
公開(kāi)日2000年6月28日 申請(qǐng)日期1998年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月18日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 張宏來(lái), 屠強(qiáng), 趙勇 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)