專利名稱：乙型肝炎病毒x蛋白結(jié)合抑制蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的蛋白，以及利用所述多核苷酸生產(chǎn)蛋白的方法。更具體的說，本發(fā)明的蛋白是一種新的乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合抑制蛋白。
乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)是一種小的DNA病毒，僅能特異地在人類及少數(shù)高等靈長類動(dòng)物中復(fù)制，可引起人類乙型肝炎，并與原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)密切相關(guān)。在HBV的基因組中已確認(rèn)的開放閱讀框(ORF)有四個(gè)，它們分別編碼病毒核殼蛋白(C)，包膜蛋白(S)，病毒多聚酶蛋白(P)和X蛋白(X)。
X蛋白是一個(gè)由154個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活因子，是HBV在體內(nèi)復(fù)制所必須的蛋白質(zhì)，它能通過與細(xì)胞因子相互作用反式激活HBV感染細(xì)胞的基因異常表達(dá)，其中包括細(xì)胞原癌基因c-myc，c-ras，c-fos，c-src等。除此之外，X蛋白還具有另外一些重要的功能，例如它能(1)通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子橋作用影響細(xì)胞對損傷DNA的核苷酸切除修復(fù)功能(NER)，(2)激活細(xì)胞內(nèi)的PKC途徑，而PKC途徑已被證明與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有密切關(guān)系。有關(guān)X蛋白基因在細(xì)胞和整體水平的轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果顯示X蛋白可以使c-myc基因的表達(dá)增加數(shù)倍，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長加快，呈腫瘤樣轉(zhuǎn)化，并可明顯地加快c-myc引起的腫瘤的發(fā)展。據(jù)此，人們認(rèn)為乙肝病毒的X蛋白是導(dǎo)致已感染HBV細(xì)胞發(fā)生癌變的主要因素，在HCC發(fā)生中起重要作用。
基于X蛋白的反式轉(zhuǎn)錄激活功能及其與HCC發(fā)生的密切關(guān)系，許多學(xué)者對能與X蛋白相互作用的人體蛋白進(jìn)行了大量的研究，并試圖尋找能阻止X蛋白反式轉(zhuǎn)錄激活作用的物質(zhì)。
1996年，Nadrajan K.等(Nucleic Acids Res.1996，234741-4750)利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以含有l(wèi)exA-X融合基因的質(zhì)粒為探針，從人外周淋巴細(xì)胞cDNA文庫中篩選到一個(gè)編碼330個(gè)氨基酸的X相關(guān)蛋白(XAP2)基因，并發(fā)現(xiàn)XAP2超表達(dá)時(shí)能抑制X蛋白的表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄激活作用。XAP2是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)能直接抑制X蛋白反式激活作用的人體蛋白。
1997年，Lucy A.等在研究配體激活的芳香烴受體(AHR)識(shí)別及相互作用的下游信號(hào)傳導(dǎo)因子時(shí)，也利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以一個(gè)含有l(wèi)exA-AHR融合片段(缺失轉(zhuǎn)錄激活域)的質(zhì)粒為探針，從人B淋巴細(xì)胞cDNA文庫中篩選到了XAP2基因，但由于篩選和克隆的方式及途徑不同，所闡明的功能也不同，故將其命名為芳香烴受體相關(guān)蛋白(ARA9)基因。Lucy A.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ARA9與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)因子Immunophilin的基因高度同源。在ARA9蛋白的N端有兩個(gè)區(qū)域與作為細(xì)胞激動(dòng)素在細(xì)胞與細(xì)胞信號(hào)交流方面起作用的FKBp12蛋白同源，C端有二個(gè)區(qū)域同參與引導(dǎo)活化受體向核內(nèi)轉(zhuǎn)移的FKBp52蛋白的TPB1，2，3區(qū)域同源?；谶@三個(gè)基因重要功能和彼此間具有同源結(jié)構(gòu)的特征，而僅從這三個(gè)基因已闡明的功能又不能很好的解釋它們之間彼此功能上的關(guān)系，因此本發(fā)明人推測人體內(nèi)可能還具有類似功能的基因存在。通過不斷的嘗試，本發(fā)明人終于發(fā)現(xiàn)了一種新的乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合抑制蛋白基因。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼一種新的乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合抑制蛋白，本發(fā)明的蛋白命名為HUMAIPH(GenBank Accession No.AF038437)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合抑制蛋白，命名為HUMAIPH。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合抑制蛋白的方法。
本發(fā)明的又一目的是所述的多核苷酸和蛋白在制備抑制X蛋白反式轉(zhuǎn)錄激活作用進(jìn)而抑制原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及一種新的分離的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的蛋白，以及利用所述多核苷酸生產(chǎn)所述蛋白的方法。更具體地說，本發(fā)明的是一種新的乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合抑制蛋白，本發(fā)明的蛋白命名為HUMAIPH(GenBank Accession No.AF038437)。編碼本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式和DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發(fā)明還包括了能與SEQ ID NO1雜交的核酸片段、類似物和衍生物。
在本發(fā)明中，術(shù)語“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下的多核苷酸和蛋白是沒有分離的，但同樣的多核苷酸或蛋白如從天然狀態(tài)中同存的其他物質(zhì)中分開，則為分離的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸全長為1239個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO1，其中開放讀框位于15-995位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人視網(wǎng)膜λgt10cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物5’-CTGAACGTGGAAGGGGTCAAGAA-3’和反向引物5’-GGCAGTAGTTGAGGATCAGAGTA-3’，進(jìn)行PCR，獲得694bp的目的片段。然后標(biāo)記該片段，以該標(biāo)記片段為探針與擴(kuò)增后的人視網(wǎng)膜λgt10cDNA文庫雜交，挑取陽性克隆，經(jīng)同樣的探針及篩選過程對得到的陽性克隆進(jìn)行復(fù)篩后，最終得到若干陽性單克隆。鑒定測序后得到SEQ ID NO1的全長cDNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的HUMAIPH蛋白。一般來說有以下步驟用本發(fā)明的編碼HUMAIPH的DNA片段(或變異體)或含有該DNA片段的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞；在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的多核苷酸序列的表達(dá)載體及用所述的表達(dá)載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和翻譯控制元件。多種表達(dá)載體可從商業(yè)途徑得到。常用的載體包括(但不限于)質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，酵母表達(dá)載體，病毒，Ti質(zhì)粒等，但最常用的載體首選質(zhì)粒。常用的宿主細(xì)胞包括(但不限于)細(xì)菌，酵母，昆蟲細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞等，但最常用的宿主細(xì)胞為細(xì)菌，尤其是大腸桿菌。另一個(gè)較常用的表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如Hela，COS細(xì)胞系或CHO細(xì)胞系等。
可用本領(lǐng)域中熟練人員已知的方法構(gòu)建含HUMAIPH編碼序列的重組表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，DNA合成技術(shù)，體內(nèi)重組技術(shù)等(J Sambrook等1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明的的多核苷酸和蛋白可用于制備抑制X蛋白反式轉(zhuǎn)錄激活作用進(jìn)而抑制原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生的藥物。同源比較結(jié)果顯示本發(fā)明的HUMAIPH與XAP2的氨基酸序列存在著很高的同源度，氨基酸一致率為49％，相似率高達(dá)61％。Nadrajank.等人1996年的研究證明HBX的14-26位氨基酸是其與XAP2結(jié)合的必需片段。HBX的氨基酸順序與XAP2同源比較分析結(jié)果顯示HBX該區(qū)段與XAP2的149-161位氨基酸具有較高的同源性(相似率46％)。該結(jié)果提示該結(jié)合域一級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性與兩蛋白的結(jié)合有一定的關(guān)系。而HUMAIPH與XAP2該區(qū)段的150-160位氨基酸同源相似率達(dá)84.6％。另外，HUMAIPH的134-151位氨基酸與XAP2的264-275位氨基酸(該段與HBX的反式轉(zhuǎn)錄激活區(qū)107-118位結(jié)合，并擬制HBX的氨基酸反式轉(zhuǎn)錄激活作用。)相似率高達(dá)72％。因此推測HUMAIPH可能具有與XAP2(抑制HBX反式轉(zhuǎn)錄激活作用)相似的功能，并因此可用于制備抑制X蛋白反式轉(zhuǎn)錄激活作用進(jìn)而抑制原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生的藥物。
以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但實(shí)施例僅是舉例性的，并非對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 HUMAIPH的cDNA的克隆和測序1.引物擴(kuò)增以人視網(wǎng)膜λgt10cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用寡核苷酸5’-CTGAACGTGGAAGGGGTCAAGAA-3’為正向引物，寡核苷酸5’-GGCAGTAGTTGAGGATCAGAGTA-3’為反向引物，進(jìn)行PCR，PCR條件為93℃3分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的694bp目的片段。2.探針及其標(biāo)記以上述PCR目的片段為探針，用α-32P-dATP(DuPont公司)對其進(jìn)行隨機(jī)引物標(biāo)記，條件為37℃1小時(shí)，具體操作見MegaprimeDNA標(biāo)記系統(tǒng)說明書(Amersham)。3.cDNA文庫擴(kuò)增及印跡標(biāo)記(篩選文庫)將人視網(wǎng)膜λgt10cDNA文庫進(jìn)行擴(kuò)增，克隆數(shù)達(dá)50萬個(gè)，然后將擴(kuò)增好的cDNA文庫印跡到Hybond TM-N+尼龍膜上(Amersham)，再將標(biāo)記好的探針變性后與印跡膜雜交，洗膜，放入帶增感屏的片夾，與FUJI MEDIAI X光膠片于-80℃下進(jìn)行放射自顯影，72小時(shí)后沖片。4.挑取克隆及初篩克隆的復(fù)篩通過上述雜交篩選獲得200個(gè)初篩陽性克隆。用正向引物和反向引物分別同λgt10左右臂上的引物EF及ER(EF5’-AGCAGCCAGTCAACACTTACG-3’；ER5’-GAGTTTGCATATCGCCTCCATC-3’)進(jìn)行搭配擴(kuò)增。然后用正向引物與反向引物對上述搭配擴(kuò)增的產(chǎn)物再進(jìn)行PCR，能得到擴(kuò)增產(chǎn)物的即為陽性克隆，總共得到36克隆。5.單克隆的鑒定和測序以上述步驟4中得到的單克隆噬菌體為模板，用上述步驟1的兩個(gè)正反引物分別與λgt10左右臂上的引物EF及ER(EF5’-AGCAGCCAGTCAACACTTACG-3’；ER5’-GAGTTTGCATATCGCCTCCATC-3’)進(jìn)行搭配擴(kuò)增，將各克隆的EF、ER擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1239bp，詳細(xì)序列見SEQID NO1，其中開放讀框位于15-995位核苷酸。
根據(jù)得到的cDNA序列推導(dǎo)出HUMAIPH的氨基酸序列，共326個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO2。實(shí)施例2 HUMAIPH的表達(dá)譜分析多種組織Northern(MNTTM)印跡膜(16種組織)購自Clontech公司，以上實(shí)施例1步驟中的一個(gè)插入片段大小為1.2克隆片段為探針，探針的標(biāo)記方法同實(shí)施例1步驟2，Northern雜交按用戶手冊操作。
16種組織的Northern雜交結(jié)果顯示HUMAIPH基因?yàn)樘禺愋员磉_(dá)基因，僅在骨骼肌中有表達(dá)、在脾、胸腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血、心臟、腦、胎盤、肺、肝、腎及胰腺15種組織中均無表達(dá)。
實(shí)施例3 HUMAIPH在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中的PCR產(chǎn)物A2/B為模版，將編碼HUMAIPH的cDNA序列(GenBank Accession No.AF038437)用對應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，以人視網(wǎng)膜λgt10cDNA文庫為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得HUMAIPH cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-CGTTGTCGACATGGATGCCGCTCTGCTCC-3’，該引物含有SalI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的HUMAIPH編碼序列的19個(gè)核苷酸；3’端引物序列為5’-ACAGAAGCTTTCAGCATGTTCCGGCAGCG-3’，該引物含有HindIII限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和HUMAIPH的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗(yàn)證人Rab24的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人Rab24。用6M鹽酸胍(PH5.0)從柱中洗脫人Rab24。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(PH0.5)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約38KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與推測的蛋白序列一致。
實(shí)施例4 HUMAIPH在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例一中的PCR產(chǎn)物為模版，將編碼HUMAIPH的cDNA序列用對應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物，以人視網(wǎng)膜λgt10cDNA文庫為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得HUMAIPH cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-CGTTAAGCTTatggatgccgctctgctcc-3’該引物含有HindIII限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的HUMAIPH編碼序列的19個(gè)核苷酸；3’端引物序列為5’-ACAGGAATTCTCAGCATGTTCCGGCAGCG-3’該引物含有EcoRI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人HUMAIPH的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用EcoRI和HindIII消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證人Rab24的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(PH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(PH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(PH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(PH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為38KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與推測的蛋白序列一致。
根據(jù)上文教導(dǎo)，本發(fā)明可有各種改進(jìn)和變動(dòng)，因此，在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)，本發(fā)明可以與具體所述不同的方式實(shí)施。
序列表(1) 一般信息(i)申請人復(fù)旦大學(xué)(ii) 發(fā)明名稱細(xì)胞因子信號(hào)傳遞抑制蛋白IV(ii) 序列數(shù)2(iii) 聯(lián)系地址(A) 收信人永新專利商標(biāo)代理有限公司(B) 街道金融大街27號(hào)投資廣場A座10層(C) 城市北京市(D) 國家中國(E) 郵政編碼100032(vi) 本申請資料(A) 申請?zhí)?B) 申請日(C) 分類號(hào)(viii) 律師/代理人信息(A) 姓名林曉紅(B) 注冊號(hào)72002027(C) 卷號(hào)I98601CB(ix) 電訊信息(A) 電話8610-66211834(B) 傳真8610-66211845(2) SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A) 長度1239bp(B) 類型核酸(C) 鏈性單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii) 分子型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO11 TTTCTCCTGCAGCCATGGATGCCGCTCTGCTCCTGAACGTGGAAGGGGTCAAGAAAACCA61 TTCTGCACGGGGGCACGGGCGAGCTCCCAAACTTCATCACCGGATCCCGAGTGATCTTTC121 ATTTCCGCACCATGAAATGTGATGAGGAGCGGACAGTCATTGACGACAGTCGGCAGGTGG181 GCCAGCCCATGCACATCATCATCGGAAACATGTTCAAGCTCGAGGTCTGGGAGATCCTGC241 TTACCTCCATGCGGGTGCACGAGGTGGCCGAGTTCTGGTGCGACACCATCCACACGGGGG301 TCTACCCCATCCTGTCCCGGAGCCTGAGGCAGATGGCCCAGGGCAAGGACCCCACAGAGT361 GGCACGTGCACACGTGCGGGCTGGCCAACATGTTCGCCTACCACACGCTGGGCTACGAGG421 ACCTGGACGAGCTGCAGAAGGAGCCTCAGCCTCTGGTCTTTGTGATCGAGCTGCTGCAGG481 TTGATGCCCCGAGTGATTACCAGAGGGAGACCTGGAACCTGAGCAATCATGAGAAGATGA541 AGGCGGTGCCCGTCCTCCACGGAGAGGGAAATCGGCTCTTCAAGCTGGGCCGCTACGAGG601 AGGCCTCTTCCAAGTACCAGGAGGCCATCATCTGCCTAAGGAACCTGCAGACCAAGGAGA661 AGCCATGGGAGGTGCAGTGGCTGAAGCTGGAGAAGATGATCAATACTCTGATCCTCAACT721 ACTGCCATTGCCTGCTGAAGAAGGAGGAGTACTATGAGGTGCTGGAGCACACCAGTGATA781 TTCTCCGGCACCACCCAGGCATCGTGAAGGCCTACTACGTGCGTGCCCGGGCTCACGCAG841 AGGTGTGGAATGAGGCCGAGGCCAAGGCGGACCTCCAGAAAGTGCTGGAGCTGGAGCCGT901 CCATGCAGAAGGCGGTGCGCAGGGAGCTGAGGCTGCTGGAGAACGCATGGCGGAGAAGCA961 GGAGGAGGAGCGGCTGCGCTGCCGGAACATGCTGAGCCAGGGTGCCACGCAGCCTCCCGC1021 AGAGCCACCCACAGAGCCACCCGCTACAGTCATCCACAGAGCCACCTGCAGAGCCACCCA1081 CAGCACCATCTGCAGAGCTGTCCTGCAGGGCCCCCTGCAGAGCCAGCCACAGAGCCACCC1141 CCGTCCCCAGGGCACTCGCTGCAGCACTGAGCCCCCTGAGGCCCACAGCCACCCAGGCAG1201 GGAGCAAGTGGCCTGGTCACTTCTGGTTCGATTGACCAG(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A) 長度326個(gè)氨基酸(B) 類型氨基酸(C) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii) 分子型蛋白(xi) 序列描述SEQ ID NO21 MDAALLLNVEGVKKTILHGGTGELPNFITGSRVIFHFRTMKCDEERTVIDDSRQVGQPMH61 IIIGNMFKLEVWEILLTSMRVHEVAEFWCDTIHTGVYPILSRSLRQMAQGKDPTEWHVHT121 CGLANMFAYHTLGYEDLDELQKEPQPLVFVIELLQVDAPSDYQRETWNLSNHEKMKAVPV181 LHGEGNRLFKLGRYEEASSKYQEAIICLRNLQTKEKPWEVQWLKLEKMINTLILNYCHCL241 LKKEEYYEVLEHTSDILRHHPGIVKAYYVRARAHAEVWNEAEAKADLQKVLELEPSMQKA301 VRRELRLLENAWRRSRRRSGCAAGTC
權(quán)利要求
1.一種分離出的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的蛋白或者所述蛋白的片段、類似物或衍生物，所述的片段、類似物或衍生物具有與全長蛋白相同的生物學(xué)功能。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是基因組DNA。
5.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的蛋白。
6.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1所示的編碼序列。
7.含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸的載體。
8.一種宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求7的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
11.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為COS-7、CHO、Hela細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。
14.生產(chǎn)蛋白的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8-13的宿主細(xì)胞，使之表達(dá)所述的蛋白。
15.一種蛋白，所述的蛋白是具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的蛋白或所述蛋白的片段、類似物或衍生物，所述的片段、類似物或衍生物具有與全長蛋白相同的生物學(xué)功能。
16.如權(quán)利要求15所述的蛋白，所述的蛋白具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求15或16所述蛋白在制備抑制乙型肝炎病毒X蛋白反式轉(zhuǎn)錄激活作用進(jìn)而抑制原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的多核苷酸,由該多核苷酸編碼的蛋白,以及利用所述多核苷酸生產(chǎn)蛋白的方法。更具體的說,本發(fā)明的蛋白是乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合抑制蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1257919SQ9812569
公開日2000年6月28日 申請日期1998年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月21日
發(fā)明者余龍, 王小柯, 傅強(qiáng), 張宏來, 趙勇 申請人:復(fù)旦大學(xué)