專利名稱：定向增殖并表達(dá)白介素12的人樹突狀細(xì)胞腫瘤免疫治療制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤免疫治療制劑及其制備方法，更具體地，本發(fā)明涉及定向增殖的并表達(dá)白介素12的人樹突狀細(xì)胞腫瘤免疫治療制劑及其制備方法。本發(fā)明還涉及一種新的白介素12(IL-12)的p40亞基基因，該基因來自中國(guó)人。
樹突狀細(xì)胞(DC)是新近被認(rèn)識(shí)的最有效的抗原呈遞細(xì)胞，在其進(jìn)行抗原的提呈過程中，因其表面表達(dá)的淋巴細(xì)胞共刺激分子以及分泌的細(xì)胞因子，調(diào)控著T、B淋巴細(xì)胞的分化及功能的發(fā)揮，被認(rèn)為是進(jìn)行抗原應(yīng)答的天然佐劑。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，DC在其早期非成熟階段，能有效地吞噬其周圍環(huán)境中的抗原性物質(zhì)，隨后加工處理成抗原性的多肽，呈遞給T細(xì)胞而激活Th細(xì)胞的免疫應(yīng)答。近年來的免疫學(xué)研究還證明，DC也能夠通過吞噬外源性的抗原物質(zhì)，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞MHC-I類分子的加工途徑中，激活機(jī)體的CTL反應(yīng)。由此可以看出DC可作為腫瘤疫苗的佐劑具有較廣闊的應(yīng)用前景。1979年Katz(Nature282234)直至今日的Frank(Nature Med.4,328-332(1998))等人均采用抗CD34的抗體從骨髓或外周血中分離純化得到多能造血干細(xì)胞，用以培養(yǎng)得到足夠量的DC。但是采用抗CD34的抗體的方法存在異種抗原的刺激問題。
機(jī)體的CD8+CTL細(xì)胞通過識(shí)別腫瘤特異性抗原肽而產(chǎn)生的對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒作用是機(jī)體發(fā)揮抗腫瘤免疫功能的有效作用因素。然而，特異性CTL的產(chǎn)生依賴于CD4+T淋巴細(xì)胞主要是Th1細(xì)胞及其所分泌的細(xì)胞因子，影響機(jī)體Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子主要是IL-12。IL-12是由p40和p35兩個(gè)亞單位所組成的異二聚體。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-12能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和特異性CTL的產(chǎn)生，增強(qiáng)特異性CTL和非特異性NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，誘導(dǎo)具有重要抗腫瘤效應(yīng)的細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生等作用。在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IL-12能夠使腫瘤的發(fā)生過程延緩，乃至使已發(fā)生的腫瘤消失，是目前所發(fā)現(xiàn)的最有效的抗腫瘤免疫的細(xì)胞因子。然而，人體的臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-12具有明顯的毒性作用，如發(fā)熱、轉(zhuǎn)氨酶升高、白細(xì)胞減少以及產(chǎn)生對(duì)肺動(dòng)脈的毒性等。因此探討IL-12的局部應(yīng)用是目前各國(guó)學(xué)者研究的重點(diǎn)之一，國(guó)外有學(xué)者報(bào)導(dǎo)，采用IL-12進(jìn)行自身腫瘤細(xì)胞(黑色素瘤)的基因修飾，以此作為腫瘤疫苗用于腫瘤的治療，收到了一定的療效。然而，IL-12主要的免疫生物學(xué)功能是在抗原的提呈局部影響著免疫細(xì)胞的分化與發(fā)育。在抗原提呈的局部，抗原提呈細(xì)胞(APCs)通過局部所分泌的IL-12能促進(jìn)Th1細(xì)胞的發(fā)育與分化，從而有利于特異性CTL的發(fā)育與產(chǎn)生。然而，APCs在抗原遞呈的過程中自然分泌的IL-12不能有效地拮抗IL-4的作用，致使Th1的發(fā)育受到阻礙。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在用IL-12基因修飾樹突狀細(xì)胞(DC)后，其負(fù)載腫瘤細(xì)胞的酸性洗脫抗原對(duì)小鼠的保護(hù)作用明顯高于單純的DC所負(fù)載腫瘤細(xì)胞的酸性洗脫抗原，認(rèn)為IL-12具有很好的免疫佐劑效應(yīng)，能加強(qiáng)DC細(xì)胞遞呈抗原的功能。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，必須在實(shí)驗(yàn)中解決以下幾個(gè)問題首先克隆中國(guó)人自己的IL-12基因，并構(gòu)建能進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的IL-12基因表達(dá)載體。其次，獲得足夠量的人DC細(xì)胞。第三，具有成熟的能夠高效將外源性的基因引入到DC中的可靠方法。本發(fā)明人基于于上述研究設(shè)想，通過不斷努力，終于完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供定向增殖的并表達(dá)白介素12的人樹突狀細(xì)胞腫瘤免疫治療制劑及其制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種新的來自中國(guó)人的IL-12的p40亞基基因。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種含有裝載并表達(dá)白介素12的人樹突狀細(xì)胞的腫瘤免疫治療制劑，所述的IL-12的p40亞基基因是本發(fā)明人所克隆的新基因，其具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。本發(fā)明的腫瘤免疫治療制劑的制備方法包括如下步驟1)用人干細(xì)胞刺激因子(SCF)包被固相載體培養(yǎng)板；2)獲得抗凝人外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，并制成所述細(xì)胞的懸液；3)將所述細(xì)胞懸液加到步驟1)的培養(yǎng)板的孔中，于37℃、5％CO2中孵育細(xì)胞1-2小時(shí)；4)洗滌細(xì)胞，然后加入含SCF20ng/ml、Flt-3L50ng/ml和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)100ng/ml的培養(yǎng)基刺激粘壁的細(xì)胞48-50小時(shí)；5)用含IL-12基因的載體轉(zhuǎn)染步驟4)得到的細(xì)胞；6)采用Flt-3L，SCF，GM-CSF，白介素-4(IL-4)，腫瘤壞死因子(TNFα)定向擴(kuò)增培養(yǎng)步驟5)中所處理的細(xì)胞，由此獲得表達(dá)IL-12的樹突狀細(xì)胞，獲得腫瘤免疫治療制劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用新生兒臍帶血作為步驟2)中人外周血的來源。
本發(fā)明還涉及一種新的IL-12的p40亞基基因，其具有SEQ IDNO1的核苷酸序列。本發(fā)明的基因是從中國(guó)人臍帶血DC中克隆得到，序列分析發(fā)現(xiàn)所述的基因第210位密碼子有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)為GCC(Ala)，并且第239和291位密碼子與已報(bào)道的NKSFp40序列(WolfSF等，J.Immunol 1991，1463074)不同，而與CLMF序列相同(SternAS等，PNAS USA 1990，876808)，另外，所述序列中用黑體下劃線所示三個(gè)密碼子的組成反映了中國(guó)人的IL-12p40的結(jié)構(gòu)特征。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)(1)通過固相SCF純化造血干細(xì)胞后進(jìn)行DC的定向擴(kuò)增培養(yǎng)，可獲得足夠量的具有較高純度的可適用于臨床治療的DC。采用固相SCF分離純化多能造血干細(xì)胞，其獨(dú)到之處在于SCF不僅僅純化濃縮了干細(xì)胞，并且在純化的同時(shí)給予增殖刺激，以提供基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)會(huì)。同樣重要的是，此方法消除了抗CD34抗體所帶來的異種抗原的刺激問題。(2)本發(fā)明的從中國(guó)人臍帶血DC中所克隆的IL-12p40基因具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，用此基因片段與現(xiàn)有的p35基因片段所構(gòu)建的hIL-12雙亞基共表達(dá)載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后可表達(dá)出既具有IL-12生物學(xué)活性又具有IL-12免疫化學(xué)特征的蛋白。(3)本發(fā)明方法中采用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)可實(shí)現(xiàn)IL-12的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC能夠顯著性地增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的識(shí)別功能，使DC的抗原提呈能力顯著提高，從而有效地誘導(dǎo)出抗原特異性的CTL細(xì)胞，并使其活性增加。這些結(jié)果均預(yù)示著本發(fā)明的用IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC作為腫瘤免疫治療制劑可以有效應(yīng)用于臨床。
根據(jù)本發(fā)明方法，為獲得足夠數(shù)量的人DC，本發(fā)明人采用預(yù)先將SCF包被吸附于一固相載體即塑料培養(yǎng)板上，從而純化C-kit陽性的造血干細(xì)胞。采用CD34抗體染色隨后進(jìn)行FACS分析表明，用本發(fā)明方法所獲得的CD34陽性細(xì)胞在90％以上。在獲得上述造血干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過SCF、GM-CSF、IL-4和TNF-α定向擴(kuò)增培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)增殖培養(yǎng)后的DC數(shù)量比起始CD34+細(xì)胞數(shù)增加近20倍。表型檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明方法所培養(yǎng)的DC表面具有豐富的HLA-I、HLA-II類分子，并用較多的共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)，T、B淋巴細(xì)胞的標(biāo)志CD3、CD19均陰性。功能分析發(fā)現(xiàn)，其對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的刺激能力。上述結(jié)果表明，從純化的CD34+、C-Kit+細(xì)胞基數(shù)出發(fā)，加入rhSCF、rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α進(jìn)行DC的定向培養(yǎng)，可以獲得較大量的有較高純度的對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)刺激功能的DC細(xì)胞。
隨后，采用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，使IL-12雙亞基共表達(dá)載體有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)了人DC的前體細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后通過rhFlt-3L、rhSCF、rhGM-CSF、rhIL4和TNF-α的體外定向培養(yǎng)后，可發(fā)育成具有特征性DC形態(tài)的細(xì)胞。經(jīng)IL-12p70抗體染色后FACS分析表明50％以上的DC能夠表達(dá)IL-12，細(xì)胞分泌上清中IL-12的產(chǎn)量可達(dá)到400-600pg/ml/106，其局部水平相當(dāng)于IL-12全身注射的毒性耐受劑量。表型分析表明轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表面具有豐富的MHC-I、II類分子和CD80、CD86分子的表達(dá)，CD3、CD19均陰性，CD14分子陽性細(xì)胞數(shù)少于10％。與未轉(zhuǎn)導(dǎo)DC相比無明顯差異。同種異體混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)觀察到，IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞的刺激水平明顯高于相同數(shù)量的未轉(zhuǎn)導(dǎo)DC細(xì)胞。通過篩選HLA-A201型個(gè)體，利用DC負(fù)載能夠與HLA-A201分子相結(jié)合的多肽p53264-272及能夠與HLA-II類分子相結(jié)合的多肽HBcAg50-69進(jìn)行自身混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)了IL-12的DC在負(fù)載多肽p53264-272后其對(duì)自體淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)高于未轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC，并且，當(dāng)加入HLA-II類分子限制的Th細(xì)胞的抗原表位多肽HBcAg50-69后，其刺激指數(shù)高于不加此表位者。收集這些多肽所誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，利用T2細(xì)胞負(fù)載p53264-272多肽作為靶細(xì)胞，檢測(cè)TNF-β的釋放，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-12轉(zhuǎn)染的DC所誘導(dǎo)的CTL與T2作用后釋放的TNF-β水平高于未轉(zhuǎn)染DC。
以下將通過附圖和實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，其中

圖1示出IL-12雙基因表達(dá)載體pL35P40SN的構(gòu)建。
圖2示出用本發(fā)明方法進(jìn)行的人樹突狀細(xì)胞體外增殖的倍數(shù)，圖中A為開始培養(yǎng)時(shí)，B為7-10天DC的平均增殖倍數(shù)，C為最高增殖特例。
圖3示出對(duì)體外增殖的DC的表型檢測(cè)結(jié)果，其中圖3a和3b為培養(yǎng)細(xì)胞用抗I類分子HLA A、B、C及II類分子HLA-DR抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記后的FACS分析結(jié)果；圖3c和3d為培養(yǎng)細(xì)胞用抗輔助刺激分子CD80和CD86抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記后的FACS分析結(jié)果；圖3e、3f、3g為培養(yǎng)細(xì)胞用抗T細(xì)胞標(biāo)志CD3、B細(xì)胞標(biāo)志CD19和單核巨噬細(xì)胞標(biāo)志CD14進(jìn)行熒光標(biāo)記后的FACS分析結(jié)果。
實(shí)施例1新的IL-12 p40基因的克隆及IL-12雙基因共表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例是從北京地區(qū)人臍帶血DC中克隆了一個(gè)新的IL-12 p40基因，構(gòu)建了IL-12雙基因共表達(dá)載體，在肝癌細(xì)胞株中表達(dá)出了具有生物學(xué)及免疫學(xué)活性的人IL-12。
1·材料和方法1.1菌株與載體大腸桿菌DH5α及表達(dá)載體pcDNA3.1(5.4kb)購(gòu)自Invitrogen。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXPXSN(6.4kb)為一雙基因表達(dá)載體，由NIH的Richard Morgan惠贈(zèng)。
1.2克隆質(zhì)粒p35NKSF14-1-1由ATCC提供。NotI/SalI酶切1.3kb片段包含IL-12 p35的完整編碼基因。
1.3引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的序列，共設(shè)計(jì)4條引物用于克隆IL-12p40cDNA，其中590435’-GCCCAGAGCAAGATGTG-3’(2-18)，590445’-GTCTATTCCGTTGTGTC-3′(1077-1061)為p40的外套引物。556845′-CAGAGCAAGATGTGTCAC-3′(5-22)，556855′-TGGTCAGAACCTAACTG-3′(1011-994)為p40的內(nèi)套引物。上述引物均在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行復(fù)檢，委托CyberSyn公司合成。
1.4主要試劑IFN-γ，抗IL-12p70特異性單抗MAB611(IL-12捕捉抗體)，MAB219(IL-12中和抗體)BAF 219(生物素標(biāo)記的羊抗人IL-12p70免疫血清)均購(gòu)自R&D公司。LPS購(gòu)自Sigma；限制性內(nèi)切酶及其它酶類為華美公司和Promega的產(chǎn)品；TA克隆試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品。
1.5逆轉(zhuǎn)錄(RT)和巢式PCR進(jìn)行IL-12p40基因擴(kuò)增與克隆培養(yǎng)來自北京地區(qū)的人成熟臍血DC，加入IFN-γ刺激16-18小時(shí)，LPS刺激4小時(shí)，一步法提取細(xì)胞總RNA。采用PE公司的GeneAmp RNAPCR試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄成IL-12p40 cDNA第一條鏈，所用引物為59044，然后巢式PCR擴(kuò)增IL-12p40鏈。第一次PCR所用引物為59043和59044，第二次PCR所用引物為55684和55685。第二次PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)在相應(yīng)位置上出現(xiàn)明顯的條帶后，將此新鮮產(chǎn)物插入到TA克隆載體pCRTM2.1中，具體操作按說明書進(jìn)行。因p40基因內(nèi)存在一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，故在小量提取質(zhì)粒DNA后采用EcoRI酶切鑒定。然后用PCR確定方向。
1.6p40克隆質(zhì)粒的序列分析采用Promega公司W(wǎng)izard試劑盒小量提取質(zhì)粒DNA，委托北京賽因思公司采用T7 Promoter和M13Reverse primer引物在ABI 377自動(dòng)序列分析儀進(jìn)行正反兩個(gè)方向的序列分析。
1.7p35和p40基因表達(dá)載體的構(gòu)建從p35質(zhì)粒和p40質(zhì)粒上酶切獲得p35和p40的編碼基因，分別克隆到pcDNA3.1表達(dá)載體上，構(gòu)建成p35和p40基因表達(dá)載體pC35，pC40。經(jīng)鑒定后提取質(zhì)粒DNA，PEG純化后用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
1.8IL-12雙基因表達(dá)載體pL35P40SN的構(gòu)建見圖1及說明。
1.9IL-12在人肝癌細(xì)胞中的表達(dá)采用GIBCO/BRL的Lipofectin進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，操作按說明書進(jìn)行。表達(dá)pL35P40SN經(jīng)PEG純化后轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株7701。轉(zhuǎn)染72h后收集上清，加G418篩選。在有明顯克隆形成后，撤去G418。數(shù)天后收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，進(jìn)行IL-12的生物及免疫活性的檢測(cè)。
1.10IL-12生物活性的檢測(cè)IL-12特異性捕捉抗體MAB6115ug/ml稀釋于碳酸鹽/碳酸氫鹽(pH9.5)緩沖液中，100ul/孔加入到Falcon96孔培養(yǎng)板中室溫下過夜；PBS洗滌后，加入1％BSA-PBS 200ul/孔，37℃1h，洗滌后加入標(biāo)準(zhǔn)IL-12及待測(cè)樣品。部分細(xì)胞上清先與MAB219抗體37℃作用30m后加入。室溫下放置3小時(shí)，洗滌后加入經(jīng)PHA刺激的淋巴母細(xì)胞，37℃，5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入3H-TdR后繼續(xù)培養(yǎng)18h，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)同位素?fù)饺肓俊?br> 1.11Western blot經(jīng)MAB611濃縮的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞上清及未經(jīng)濃縮轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞裂解物通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用生物素標(biāo)記的羊抗人IL-12免疫血清(BAF219)作為第一抗體，按ABC法顯色。2.結(jié)果2.1北京地區(qū)人臍帶血DC IL-12p40cDNA的克隆采用IFN-γ和LPS對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)后獲得高豐度IL-12 p40 mRNA，經(jīng)IL-12p40外套下游特異性引物59044逆轉(zhuǎn)錄合成其cDNA第一條鏈，然后進(jìn)行巢式PCR。第二次PCR后在略大于1000bp位置上出現(xiàn)高亮度條帶。
2.2IL-12p40克隆的序列分析對(duì)兩個(gè)經(jīng)鑒定有正確插入的p40cDNA克隆分別進(jìn)行正反兩個(gè)方向的序列分析，結(jié)果完全一致，所述序列見SEQ ID NO1。將所得序列與NKSF(Accession#M65290)和CLMF(Accession#M65272)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們所克隆的p40基因有一完整讀碼框架，其絕大部分與上述序列一致，但在第210位密碼子上存在著獨(dú)特結(jié)構(gòu)，是GCC(Ala)而非GTC(Val)。此外，在239和239密碼子子也各有異同。將此質(zhì)粒命名為phDCp40。
2.3IL-12的表達(dá)及其生物學(xué)活性鑒定對(duì)人肝癌細(xì)胞株7701分別進(jìn)行了pC35，pC40，pC35+pC40的轉(zhuǎn)染，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72h收集其上清進(jìn)行生物學(xué)活性的鑒定。結(jié)果見表1。單獨(dú)的pC35或pC40基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后均不能產(chǎn)生有功能的IL-12，即使將表達(dá)產(chǎn)物的上清預(yù)先混合后仍不能產(chǎn)生有功能的IL-12。pC35和pC40基因只有在等量共轉(zhuǎn)染時(shí)才能測(cè)出有功能的IL-12，其對(duì)淋巴母細(xì)胞的刺激水平與2.5ng/ml的參照IL-12相當(dāng)。我們又進(jìn)一步構(gòu)建了IL-12的雙亞基共表達(dá)載體pL35P40SN(見圖1)，用其轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞并經(jīng)G418選擇后，上清中的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)淋巴母細(xì)胞的刺激能力顯著超過12.5ng/ml參照IL-12的效應(yīng)。在與抗IL-12的中和性單克隆抗體(MAB219)作用后，其活性大大減弱。表1轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清對(duì)PHA活化的淋巴母細(xì)胞的增殖作用IL-123H-TdR 摻入用于轉(zhuǎn)染的3H-TdR(ng/ml) (×103) 質(zhì)粒 摻入(×103)0 26.30±0.60 pCDNA3 25.48±0.100.132.56±0.16 pC3526.39±0.190.537.44±0.25 pC4025.63±0.222.539.23±0.52 pC35+pC40 39.83±0.4412.5 42.51±0.16 pL35P40SN 53.47±0.32pLXPXSN 28.43±0.222.4IL-12的免疫學(xué)鑒定對(duì)經(jīng)免疫濃縮的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞上清及未經(jīng)濃縮的細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果在70KD處可見有特異性蛋白條帶。濃縮上清產(chǎn)物加入2-巰基乙醇后，此70KD的條帶消失。實(shí)施例2人臍帶血樹突狀細(xì)胞的體外定向增殖A、方法細(xì)胞因子rhSCF、rhGM-CSF、rhFlt-3L、rhIL-4，抗人HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD14、CD19、CD80、CD86均為DAKO公司產(chǎn)品。rhTNF-α為北方同正公司產(chǎn)品。部分rhGM-CSF由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院沈倍奮教授贈(zèng)送。
將rhSCF溶解入0.1M pH 8.5的Na2HPO4溶液中使其終濃度達(dá)到25ng/ml，取0.5ml置于35mm2的六孔培養(yǎng)板中(Costar)，濕盒中放置，4℃過夜，一周內(nèi)使用。無菌收集肝素抗凝的新生兒臍帶血約30-40ml，加入等量含青霉素500U/ml，鏈霉素500ug/ml的PBS稀釋，并加入EDTA使其終濃度達(dá)到0.02％(W/V)。然后通過淋巴細(xì)胞分離液分離其血中的單個(gè)核細(xì)胞，用含有2％胎牛血清(FBS)的Hanks’液洗滌三次后，加入含12％FBS、10％HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清及100u/ml的青霉素、100ug/ml的鏈霉素、40ng/ml的二性霉素的1640完全培養(yǎng)液充分懸浮細(xì)胞、調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)到5×106/ml，每孔1.5ml加入到上述SCF預(yù)包被的細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中。在37℃C，5％CO2中孵育1-2h，粘壁細(xì)胞用溫?zé)岬暮?％FBS的Hanks’液輕柔洗滌三次，使粘壁不牢的細(xì)胞洗去。然后，加入上述完全培養(yǎng)液，并在其中加入rhSCF-20ng/ml、rhFlt-3L 50ng/ml、rhGM-CSF100ng/ml，第六天撤掉rhSCF和rhFlt-3L，追加IL-4 50ng/ml。第九天追加TNF-α100u/ml。在上述培養(yǎng)過程中，每隔2-3天進(jìn)行對(duì)半換液。第12-14天收獲懸浮細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定及功能測(cè)定。
流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型分析收集上述經(jīng)過與SCF包被板作用后并經(jīng)洗滌后的粘壁細(xì)胞、新分離的人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行CD34染色，測(cè)定其陽性細(xì)胞的比值。收獲12-14天的培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD14、CD19、CD80、CD86的間接免疫熒光染色，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行其表型分析。
同種異體混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)淋巴細(xì)胞為正常人外周血PBMC，其HLA配型與待測(cè)DC的HLA配型完全不一致。刺激細(xì)胞為培養(yǎng)14天的DC。實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組，每組刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞之比分別為1∶10，1∶100，1∶1000和1∶10000。混勻后放置于37℃培養(yǎng)，4天后加入3H-TdR 0.5uci/孔，繼續(xù)培養(yǎng)16-18h，最后收集于玻璃纖維素濾紙上，進(jìn)行β計(jì)數(shù)。B、結(jié)果下表2列舉了5個(gè)樣品細(xì)胞增殖過程，數(shù)值分別為1毫升臍帶血培養(yǎng)所得DC細(xì)胞數(shù)表2
>細(xì)胞經(jīng)7-10天的培養(yǎng)，細(xì)胞增殖達(dá)到頂峰，平均增殖約20倍，最高特例可達(dá)158倍(見圖2)。人臍帶血中富含造血干細(xì)胞，用人的leukopak可達(dá)到上述同樣的目的。人樹突狀細(xì)胞的表型檢測(cè)對(duì)經(jīng)GM-CSF、SCF和rIL-4誘導(dǎo)擴(kuò)增的樹突樣細(xì)胞進(jìn)行表型分析，結(jié)果顯示，這些細(xì)胞幾乎不表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)志CD3、B細(xì)胞標(biāo)志CD19和單核細(xì)胞標(biāo)志CD14(圖3e、3f、3g)。說明這是一個(gè)非T非B以及非單核巨噬細(xì)胞的獨(dú)立細(xì)胞群體。圖3a和圖3b顯示，此細(xì)胞表達(dá)豐富的HLA-I類和II類分子，共刺激分子CD80和CD86也高度表達(dá)(圖3c、3d)。實(shí)施例3含有裝載并表達(dá)IL-12的人樹突狀細(xì)胞的腫瘤免疫治療制劑的制備A、方法1.載體人IL-12雙亞基共表達(dá)載體pL35P40SN，如實(shí)施例1所述構(gòu)建。
2·細(xì)胞174CEMT2細(xì)胞株由美國(guó)NCI贈(zèng)送。此細(xì)胞的TAP基因異常，抗原加工功能缺失，表面僅表達(dá)低水平的HLA-A201分子。當(dāng)用與HLA-A201分子有親和性的多肽處理時(shí)，可誘導(dǎo)A201分子的高水平表達(dá)。
3·抗原性多肽p53264-272(CD8+T細(xì)胞表位，能夠與HLA-A201分子進(jìn)行結(jié)合)由美國(guó)NCI贈(zèng)送，HBcAg50-69(CD4+T細(xì)胞表位)由濰坊醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送。
4·主要試劑細(xì)胞因子SCF、GM-CSF、Flt-3L、IL-4，抗人IL-12p70單克隆抗體MAB611、MAB219均為R&D產(chǎn)品?？谷薍LA-ABC、HLA-DR、CD3、CD14、CD19、CD80、CD86均為DAKO公司產(chǎn)品。TGF-β檢測(cè)試劑為R&D產(chǎn)品。TNF-α為北方同正公司產(chǎn)品。
5·樹突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)25ng/ml SCF溶于0.1M pH9.0Na2HPO3中，每孔0.5ml加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，4℃過夜。經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離的新生兒臍帶血(產(chǎn)后12h內(nèi))單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)加入到上述細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃孵育1-2h，粘壁細(xì)胞加入Flt-3L、GM-CSF、SCF刺激48-50h，進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，試劑DOTAP為德國(guó)BM公司產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑與DNA之比比為4∶1，轉(zhuǎn)染過程中常規(guī)加入細(xì)胞因子。第一次轉(zhuǎn)染共進(jìn)行6-8h，此后于培養(yǎng)的第5、第8天再轉(zhuǎn)染兩次，每次2-3h。轉(zhuǎn)染終止后加入含F(xiàn)lt-3L，干細(xì)胞刺激因子，粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子，白介素—4，腫瘤壞死因子-α的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)后的12-14天收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子的表達(dá)檢測(cè)及功能測(cè)定。
6·同種異體混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)淋巴細(xì)胞為正常人外周血PBMC，其HLA配型與待測(cè)DC的HLA配型完全不一致。刺激細(xì)胞為常規(guī)培養(yǎng)14天的DC和轉(zhuǎn)染IL-12的DC。實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組，每組刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞之比分別為1∶10，1∶100，1∶1000和1∶10000?；靹蚝蠓胖糜?7℃培養(yǎng)，4天后加入3H-TdR 0.5uci/孔，繼續(xù)培養(yǎng)16-18h，最后收集于玻璃纖維素濾紙上，進(jìn)行β計(jì)數(shù)。
7·多肽特異性CTL的體外誘導(dǎo)從預(yù)先經(jīng)PCR-SSP進(jìn)行HLA-A2型及亞型分析所確定的臍帶血中分離PBMC，按前述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染及培養(yǎng)。去除前體細(xì)胞的PBMC用含有10％DMSO的凍存液凍存待用。培養(yǎng)7天的DC及經(jīng)過IL-12基因轉(zhuǎn)染的DC經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)24h后，收集并用不含有血清的培養(yǎng)液洗滌，懸浮于AIM-V中，置于24孔板中，加入多肽，每種多肽的終濃度為50ug/ml。37℃孵育2h，此種細(xì)胞作為誘導(dǎo)特異性CTL的刺激細(xì)胞。另瓶培養(yǎng)的凍存復(fù)蘇PBMC經(jīng)洗滌后加入到上述刺激細(xì)胞孔中，于37℃CO2孵箱中孵育24h后加入等體積的含有20U IL-2的AIM-V培養(yǎng)液培養(yǎng)7-8天后，按上述方法重復(fù)刺激一次。由此所獲得的增殖細(xì)胞作為肽特異性的CTL細(xì)胞。
8·CTL活性的檢測(cè)174CEM T2細(xì)胞株于檢測(cè)的前一天換液，收集細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液洗滌，按前述方法進(jìn)行肽的結(jié)合，作為CTL的靶細(xì)胞。上述經(jīng)過多肽誘導(dǎo)的細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，兩者共同培養(yǎng)36h，收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清，檢測(cè)其TNF-β分泌的能力。
9·TNF-β的檢測(cè)按廠商說明書進(jìn)行。B、結(jié)果1·IL-12表達(dá)載體在人臍帶血培養(yǎng)細(xì)胞中的高效表達(dá)采用上述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)人臍帶血造血前體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，經(jīng)IL-12抗體染色、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)情況，R&D的HS IL-12 Immunoassay檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞分泌上清中的IL-12的產(chǎn)量，結(jié)果表明50％的臍帶血培養(yǎng)細(xì)胞中有IL-12的表達(dá)，其上清中IL-12的表達(dá)量為400-600pg/ml/106。
2·人IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)后的DC表型的分析收集轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)了12-14天的細(xì)胞，采用間接免疫熒光染色法進(jìn)行熒光標(biāo)記染色，洗滌后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面有豐富的MHC-I、MHC-II類分子的表達(dá)，CD3、CD19分子均陰性、CD14分子弱陽性，并且細(xì)胞表面有較多的CD80和CD86分子，與未經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比無明顯差異。綜合分析上述分子的表達(dá)情況，并結(jié)合其特征性的形態(tài)表現(xiàn)，判斷上述細(xì)胞為DC。
3·IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)后DC對(duì)抗原提呈功能的影響同種異體混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)重要的反映DC抗原遞呈作用的指標(biāo)。為此，我們比較了IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞對(duì)同種異體混合淋巴細(xì)胞的刺激功能。發(fā)現(xiàn)IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC具有較強(qiáng)的對(duì)同種異體淋巴細(xì)胞的的刺激功能，反映了IL-12能夠增強(qiáng)DC的抗原提呈功能。
4·IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC對(duì)CTL活性的影響篩選HLA-A201陽性的DC細(xì)胞，負(fù)載上能夠與HLA-A201分子相結(jié)合的多肽p53264-272進(jìn)行多肽特異性CTL的誘導(dǎo)，其活性通過檢測(cè)其TNF-β釋放來進(jìn)行反映，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC在負(fù)載了p53264-272后所誘導(dǎo)的CTL活性比未轉(zhuǎn)染的DC負(fù)載了p53264-272后所誘導(dǎo)的CTL活性有增高。
5·IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響篩選出HLA-A201型的DC，利用DC負(fù)載能夠與HLA-A201分子相結(jié)合的多肽p53264-272及能夠與HLA-II分子相結(jié)合的多肽HBcAg50-69進(jìn)行自身混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC在負(fù)載了p53264-272后其對(duì)自體淋巴細(xì)胞的刺激水平高于未轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC，并且，當(dāng)加入HLA-II類分子限制的Th細(xì)胞的抗原表位后，其刺激指數(shù)高與不加此表位者，可見IL-12對(duì)Th的發(fā)育具有重要的促進(jìn)作用。
上述結(jié)果表明IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC能夠顯著性地增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的識(shí)別功能，使DC的抗原提呈能力顯著提高，從而有效地誘導(dǎo)出抗原特異性的CTL細(xì)胞，并使其活性增加。這一結(jié)果預(yù)示著IL-12轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC可以作為腫瘤免疫治療制劑。序列表SEQ ID NO1的信息序列長(zhǎng)度977bp序列類型核酸分子類型cDNA序列描述1 ATG TGT CAC CAG CAG TTG GTC ATC TCT TGG TTT TCC CTG GTT TTT CTG GCA TCT55 CCC CTC GTG GCC ATA TGG GAA CTG AAG AAA GAT GTT TAT GTC GTA GAA TTG GAT109 TGG TAT CCG GAT GCC CCT GGA GAA ATG GTG GTC CTC ACC TGT GAC ACC CCT GAA163 GAA GAT GGT ATC ACC TGG ACC TTG GAC CAG AGC AGT GAG GTC TTA GGC TCT GGC217 AAA ACC CTG ACC ATC CAA GTC AAA GAG TTT GGA GAT GCT GGC CAG TAC ACC TGT271 CAC AAA GGA GGC GAG GTT CTA AGC CAT TCG CTC CTG CTG CTT CAC AAA AAG GAA325 GAT GGA ATT TGG TCC ACT GAT ATT TTA AAG GAC CAG AAA GAA CCC AAA AAT AAG379 ACC TTT CTA AGA TGC GAG GCC AAG AAT TAT TCT GGA CGT TTC ACC TGC TGG TGG433 CTG ACG ACA ATC AGT ACT GAT TTG ACA TTC AGT GTC AAA AGC AGC AGA GGC TCT487 TCT GAC CCC CAA GGG GTG ACG TGC GGA GCT GCT ACA CTC TCT GCA GAG AGA GTC541 AGA GGG GAC AAC AAG GAG TAT GAG TAC TCA GTG GAG TGC CAG GAG GAC AGT GCC595 TGC CCA GCT GCT GAGGAGAGT CTG CCC ATT GAG GCC ATG GTG GAT GCC GTT CAC649 AAG CTC AAG TAT GAA AAC TAC ACC AGC AGC TTC TTC ATC AGG GAC ATC ATC AAA703 CCT GAC CCA CCCAAGAAC TTG CAG CTG AAG CCA TTA AAG AAT TCT CGG CAG GTG757 GAG GTC AGC TGG GAG TAC CCT GAC ACC TGG AGT ACT CCA CAT TCC TAC TTC TCC811 CTG ACA TTC TGC GTT CAG GTC CAG GGC AAG AGC AAG AGA GAA AAG AAA GAT AGA865 GTC TTCACGGAC AAG ACC TCA GCC ACG GTC ATC TGC CGC AAA AAT GCC AGC ATT919 AGC GTG CGG GCC CAG GAC CGC TAC TAT AGC TCA TCT TGG AGC GAA TGG GCA TCT963 GTG CCC TGC AGT TAG
權(quán)利要求
1.一種腫瘤免疫治療制劑，其包括裝載并表達(dá)白介素-12的人樹突狀細(xì)胞，其中編碼所述的白介素-12的p40亞基的基因具有SEQID NO1所示序列。
2.制備權(quán)利要求1的腫瘤免疫治療制劑的方法，包括如下步驟1)用人干細(xì)胞刺激因子包被固相載體培養(yǎng)板；2)獲得抗凝的人外周血單個(gè)核細(xì)胞，并制成所述細(xì)胞的懸液；3)將所述細(xì)胞懸液加到步驟1)的培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃、5％CO2中孵育細(xì)胞1-2小時(shí)；4)洗滌細(xì)胞，加入含干細(xì)胞因子、Flt-3L和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的培養(yǎng)基刺激粘壁的細(xì)胞48小時(shí)，5)用含白介素-12基因的載體轉(zhuǎn)染步驟4)得到的細(xì)胞，6)采用含F(xiàn)lt-3L，干細(xì)胞刺激因子，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，白介素-4，腫瘤壞死因子-α的培養(yǎng)基定向擴(kuò)增步驟5)所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，獲得數(shù)量可達(dá)到107以上水平的表達(dá)白介素-12的樹突狀細(xì)胞，作為腫瘤免疫治療制劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中步驟5)中所述的載體中所包含的白介素-12的p40亞基基因具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
4.一種編碼白介素-12p40亞基的基因，其具有SEQ ID NO1的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫瘤免疫治療制劑及其制備方法,更具體地講,本發(fā)明涉及一種定向增殖的并表達(dá)具有中國(guó)人結(jié)構(gòu)特征的白介素12的人樹突狀細(xì)胞腫瘤免疫治療制劑及其制備方法。
文檔編號(hào)C12N15/19GK1260396SQ98125868
公開日2000年7月19日 申請(qǐng)日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者孫宗堂, 曲春楓, 顧培娣 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所